ANEXO I

Determinação do teor em peso de amido, seus produtos de degradação incluindo a glicose

1.   OBJECTO E DOMÍNIO DE APLICAÇÃO

a)

O método permite determinar o teor, em peso, de amido ou fécula, e seus produtos de degradação incluindo a glicose, abaixo mencionado «amido».

b)

O teor em peso de «amido» mencionado na alínea a) é igual ao valor E conforme se calcula na alínea a) do ponto 6 do presente anexo.

2.   PRINCÍPIO

A amostra desagrega-se com hidróxido de sódio e o «amido» cindido em unidades de glucose com a amiloglicosidase. O doseamento da glicose é efectuado por via enzimática.

3.   REAGENTES

(Utilizar água bidestilada).

3.1.   Solução de hidróxido de sódio 0,5 N (0,5 mol/l).

3.2.   Ácido acético (glacial) a 96 %, pelo menos.

3.3.   Solução de amiloglucosidase:

imediatamente antes do emprego, dissolver cerca de 10 mg de amiloglucosidase (EC 3.2.1.3) (60 U/mg) em 1 ml de água (1).

3.4.   Tampão trietanolamina:

dissolver 14,0 g de cloridrato de trietanolamina, cloreto de [tris(2-hidroxietil)amónio] e 0,25 g de sulfato de magnésio (MgSO47H2O) em 80 ml de água, adicionar-lhe cerca de 5 ml de solução de hidróxido de sódio 5 N (5 mol/l) e ajustar o pH a 7,6 por meio de uma solução de hidróxido de sódio 1 N (1 mol/l).

Perfazer 100 ml com água. Este tampão conserva-se durante, pelo menos, quatro semanas a 4 °C.

3.5.   Solução de NADP (Nicotinamide Adenine Dinicleotide phosfate, sal dissódico):

dissolver 60 mg de NADP em 6 ml de água. Esta solução conserva-se durante, pelo menos, quatro semanas a 4 °C.

3.6.   Solução de ATP (Adenosine 5′-triphosphate, sal dissódico):

dissolver 300 mg de ATP. 3H2O e 300 mg de hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3) em 6 ml de água. Esta solução conserva-se durante, pelo menos, quatro semanas a 4 °C.

3.7.   Suspensão HK/G6P-DH (Hexokinase-EC 2.7.1.1) e de glucose-6-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.49):

colocar em suspensão 280 U HK e 140 U G6P-DH em 1 ml de solução de sulfato de amónio (C = 3,2 mol/l). Esta suspensão conserva-se durante, pelo menos, um ano a 4 °C.

4.   APARELHAGEM

4.1.   Agitador magnético com banho-maria a 60 °C.

4.2.   Barras magnetizadas.

4.3.   Espectrofotómetro U. V. equipado com cubas de 1 cm.

4.4.   Pipetas para a análise enzimática.

5.   METODOLOGIA

5.1.   Desagregar por meio de hidróxido de sódio e hidrólise enzimática de «amido»

5.1.1.

Segundo o teor esperado de «amido», escolher as seguintes pesagens (o teor de «amido» não deve exceder 0,4 g por pesagem): Teor esperado de «amido» do produto em g/100 g Pesagem aproximativa em g (p) Volume do balão calibrado em ml Factor de diluição até ao litro (f) > 70 0,35-0,4 500 2 20-70 max. 0,5 500 2 5-20 max. 1 250 4 < 5 max. 2 200 5

5.1.2.

Pesar (com uma precisão de 0,1 mg) a amostra.

5.1.3.

Adicionar ao resíduo 50 ml de solução de hidróxido de sódio 0,5 N (ponto 3.1.) e manter sob agitação constante durante 30 minutos em banho-maria com agitador magnético (ponto 4.1.) a 60 °C.

5.1.4.

Ajustar o pH a 4,6-4,8 com alguns ml de ácido acético concentrado (ponto 3.2.).

5.1.5.

Colocar em banho-maria com agitador magnético (ponto 4.1.) a 60 °C, adicionar 1,0 ml de solução da enzima (ponto 3.3.) e deixar actuar durante 30 minutos, sob agitação.

5.1.6.

Após arrefecimento, transferir quantitativamente para o balão calibrado (ponto 5.1.1.) e perfazer até à marca com água.

5.1.7.

Se necessário, filtrar através de um filtro plissado (ver observação n.o 1).

5.2.   Doseamento da glicose

5.2.1.

A solução de ensaio deve conter 100-1 000 mg de glucose por litro, o que corresponde a um ΔΕ340 que se situa entre 0,1-1,0. A solução de ensaio diluída numa proporção de 1 + 30 com água não deve apresentar, a 340 nm, uma absorvência que ultrapasse 0,4 (medida em relação ao ar).

5.2.2.

Levar o tampão (ponto 3.4.) à temperatura ambiente (20 °C).

5.2.3.

A temperatura dos reagentes e da amostra deve ser de 20 °C a 25 °C.

5.2.4.

Medir a absorvência a 340 nm em relação ao ar (sem cuba no trajecto óptico de referência).

5.2.5.

Execução segundo o esquema de pipetagem a seguir indicado: Introduzir nas cubas Ensaio em branco (ml) Ensaio (ml) Tampão (reagente 3.4.) 1,00 1,00 NADP (reagente 3.5.) 0,10 0,10 ATP (reagente 3.6.) 0,10 0,10 Solução de ensaio (5.1.6. ou 5.1.7.) — 0,10 Água bidestilada 2,00 1,90 Misturar, passados cerca de 3 minutos, medir a absorvência das soluções (E1). Desencadear a reacção através da adição de: HK/G6P-DH (reagente 3.7.) 0,02 0,02 Misturar, esperar o fim da reacção (cerca de 15 minutos) e medir a absorvência das soluções (E2). Ter em conta eventuais reacções secundárias. Se a reacção não estiver completada após 15 minutos, continuar a ler as absorvências de 5 em 5 minutos até que o aumento da absorvência seja constante durante 5 minutos e, em seguida, extrapolar a absorvência ao tempo da adição da suspensão (referida no ponto 3.7) (ver observação n.o 2).

5.2.6.

Para o ensaio em branco e o ensaio, calcular a diferença de absorvência E2—E1. Subtrair a diferença de absorvência do ensaio em branco da do ensaio (= ΔΕ): ΔΕ = ΔΕ ensaio — ΔΕ ensaio em branco A partir desta diferença, obtém-se o teor de glucose da solução de ensaio: Teor de glucose, em g/l, da solução de ensaio Gl = ((3,22 × 180,16)/(6,3 × 1 × 0,1 × 1 000)) × ΔΕ340 = 0,921 × ΔΕ340 (3,22 = volume da solução a medir (ml); 1 = trajectória da luz no recipiente (cm); 0,1 = volume da solução da amostra (ml); massa molecular da glucose = 180,16)

5.2.7.

Se a medida de absorvência a 340 nm não for possível, a medida pode ser efectuada no comprimento de onda de 365 nm ou 334 nm. Nesse caso, o algarismo 6,3 da fórmula Gl acima é substituído pelo algarismo 3,5 ou 6,18, respectivamente.

6.   CÁLCULO DO TEOR EM «AMIDO» (E) OU EM «GLICOSE» Z EM g/100 g

a)	E = ((100 × 0,9 × Gl)/(p × f))

b)	Z = ((100 × Gl)/(p × f))

em que:

Gl	=	glicose, em g/l (5.2.6.),
f	=	factor de diluição (5.1.1.),
p	=	pesagem da amostra, em g,
0,9	=	factor de conversão da glucose em amido.

Observações:

1.	Em caso de se constatar que a solução não pode ser filtrada segundo o ponto 5.1.7, o químico toma as medidas apropriadas.

2.	Em caso de se constatar uma inibição das enzimas, aconselha-se o método das «adições» utilizando-se o amido puro.

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(1)  Em que U é unidade internacional da actividade enzimática.

ANEXO II

Determinação do teor de amidos ou féculas, dextrina ou outros amidos ou féculas modificados contidos nas mercadorias dos códigos NC 3505 20 10 a 3505 20 90 , bem como das matérias amiláceas contidas nas mercadorias dos códigos NC 3809 10 10 a 3809 10 90

I.   PRINCÍPIO

Por hidrólise ácida, o amido é transformado em açúcares redutores que são doseados volumetricamente por meio do licor de Fehling.

II.   INSTRUMENTOS E REAGENTES

1.

Balão de cerca de 250 ml;

2.

Frasco graduado de 200 ml;

3.

Bureta graduada de 25 ml;

4.

Ácido clorídrico de densidade 1,19;

5.

Solução de potassa cáustica;

6.

Carvão descorante;

7.

Licor de Fehling;

8.

Solução de azul de metileno a 1 %.

III.   MODO OPERATÓRIO

Num balão de cerca de 250 ml, introduzir uma amostra correspondente a uma quantidade de amido de cerca de 1 grama. Juntar 100 ml de água destilada e 2 ml de ácido clorídrico. Levar à ebulição com refluxo durante 3 horas.

Transvasar o conteúdo do balão assim como o produto da sua enxaguadura para um frasco graduado de 200 ml e juntar a isto a solução de potassa cáustica, até obter uma reacção ligeiramente ácida. Completar o volume de 200 ml com água destilada e filtrar tudo num pouco de carvão descorante.

Deitar em seguida a solução numa bureta graduada e reduzir 10 ml de licor de Fehling, segundo o método a seguir indicado:

Num balão de fundo chato de cerca de 250 ml, deitar 10 ml de licor de Fehling (5 ml de solução A e 5 ml de solução B). Agitar até obter uma solução clara, depois de juntar 40 ml de água destilada, assim como uma pequena quantidade de quartzo ou de pedra pomes.

Colocar o balão sobre a placa de amianto quadrada com uma abertura circular de cerca de 6 cm de diâmetro ao meio, assentando sobre uma rede metálica. Aquecer o balão de maneira a que o líquido comece a ferver ao fim de cerca de 2 minutos.

Juntar ao líquido em ebulição, com a ajuda de uma bureta, quantidades sucessivas da solução de açúcar, até que a cor azul de licor de Fehling mal seja perceptível; juntar então, a título de indicador, 2 ou 3 gotas de solução de azul de metileno e depois, completar a titulação juntando gota a gota uma nova quantidade de solução de açúcar até ao desaparecimento da cor azul do indicador.

Para maior precisão, repetir a titulação nas mesmas condições, juntando no entanto de uma só vez a quase totalidade da solução de açúcar necessária à redução do licor de Fehling. Nesta segunda titulação a redução do licor de Fehling deve operar-se no espaço de tempo de 3 minutos. Continuar a ebulição durante exactamente dois minutos. Efectuar a titulação ajustando gota a gota durante o terceiro minuto até ao desparecimento da cor azul do indicador.

A percentagem, em peso, de amido da amostra é determinada por meio da seguinte fórmula:

% de amido = ((T × 200 × 100)/(n × p)) × 0,95

sendo:

T	=	A quantidade em gramas de dextrose anidra correspondente a 10 ml de licor de Fehling (5 ml de solução A + 5 ml de solução B). Este título é de 0,04945 g de dextrose anidra, contendo a solução A 17,636 g de cobre por litro.
n	=	O número de ml da solução de açúcar utilizada para a titulação.
p	=	O peso da amostra.
0,95	=	A taxa de conservação da dextrose anidra em amido.

IV.   PREPARAÇÃO DO LICOR DE FEHLING

Solução A	:	Dissolver, num frasco de vidro graduado, em água destilada, 69,278 g de sulfato do cobre cristalizado puro para análises (CuSO4 5H2O) isento de ferro e ajustar a solução para o volume de um litro com água destilada. O título exacto desta solução deverá ser verificado por meio de uma determinação quantitativa do cobre.
Solução B	:	Dissolver, num frasco de vidro graduado, por meio de água destilada, 100 g de hidróxido de sódio e 346 g de tartarato duplo de sódio e potássio (sal de Seignette) e ajustar a solução para o volume de um litro com água destilada.

As duas soluções A e B devem ser misturadas, em volumes iguais, imediatamente antes da sua utilização, 10 ml de licor de Fehling (5 ml de solução A + 5 ml de solução B) são completamente reduzidos, se se operar nas condições indicadas em III, por 0,04945 g de dextrose anidra.

ANEXO III

Pesquisa da presença de farinha ou de sêmola de trigo mole nas massas alimentícias

(segundo o método de Young e Gilles, modificado por Bernaerts e Gruner)

I.   PRINCÍPIO

Prepara-se um extracto de amostra das massas alimentícias a analisar utilizando-se um solvente não polar.

Este extracto é cromatografado em camada fina de silicagel, de modo a separar os esteróides presentes em diferentes fracções sob a forma de bandas.

Segundo o número de bandas intensas reveladas, é possível determinar se o produto examinado é fabricado quer a partir exclusivamente de trigo duro ou de trigo mole, quer a partir de uma mistura destes dois produtos. É igualmente possível determinar se se juntaram ovos a estas matérias-primas.

II.   APARELHAGEM E REAGENTES

1.

Homogeneizador ou triturador que permita obter uma moedura que passe através de um peneiro normalizado com uma abertura de malhas de 0,200 mm.

2.

Peneiro normalizado com uma abertura de malhas de 0,200 mm.

3.

Evaporador sob pressão reduzida com banho-maria.

4.

Placa de vidro, folha de alumínio ou outro suporte apropriado, de 20 cm × 20 cm, coberto com uma camada fina de silicagel. Se for o próprio a preparar a camada fina, deverá utilizar silicagel misturada com cerca de 13 % de gesso que aplicará sobre a placa de vidro em camada de 0,25 mm com instrumentos adequados e seguindo as instruções dos fabricantes.

5.

Micropipeta que permita medir 20 microlitros.

6.

Cuba com tampa adequada para a revelação dos cromatogramas.

7.

Vaporizador.

8.

Éter de petróleo com o ponto de ebulição então 40° e 60 °C redestilado antes de usar.

9.

Éter etílico anidro para análises.

10.

Tetracloreto de carbono para cromatograma redestilado antes de usar.

11.

Ácido fosfomolíbdico para análises.

12.

Álcool etílico a 94°.

III.   MODO OPERATÓRIO

Moer 20 g da amostra a analisar, de forma a que passem na sua totalidade através do peneiro. Introduzir a amostra moída num balão Erlenmeyer e cobrir com 150 ml de éter de petróleo. Deixar à temperatura ambiente até ao dia seguinte. Agitar de vez em quando.

Filtrar em seguida sobre um funil Büchner munido de uma camada de adjuvante de filtração ou sobre um filtro plissado. Transvasar pouco a pouco a solução límpida assim obtida para um balão tarado de 100 ml. Evaporar o solvente sob pressão reduzida, aquecendo o balão em banho-maria de 40°-50 °C. Depois de evaporação do solvente, continuar a aquecer sob pressão reduzida durante 10 minutos.

Depois do arrefecimento do balão, determinar o peso do extracto. Diluir o extracto em éter etílico à razão de 1 ml de éter etílico para 60 mg de extracto.

Activar as camadas finas levando-as à temperatura de 130 °C durante 3 horas. Deixar arrefecer num exsicador contendo silicagel as placas que não são utilizadas imediatamente.

Aplicar sobre uma camada fina, de preferência acabada de activar, 20 microlitros da solução límpida sob a forma de uma banda de largura constante de 3 cm constituída por gotícolas justapostas. Deixar evaporar o solvente.

Revelar o cromatograma à temperatura ambiente com o tetracloreto de carbono utilizando uma câmara cromatográfica interiormente revestida com tiras de papel de filtro embebido em solvente. Cerca de 1 hora depois, o solvente terá atingido uma altura de 18 cm. Tirar a placa e deixar evaporar o solvente ao ar. Revelar de novo o cromatograma de maneira a melhor separar as zonas. Deixar evaporar de novo o solvente ao ar.

Vaporizar a camada fina de silicagel com uma solução de 20 % de ácido fosfomolíbdico no álcool etílico. A cor da camada deve ser uniformemente amarela. Revelar as zonas colocando a placa vaporizada durante 5 minutos a 110 °C.

IV.   INTERPRETAÇÃO DO CROMATOGRAMA

Se o cromatograma apresentar uma só banda principal intensa possuindo um Rf de cerca de 0,4 a 0,5, o trigo utilizado para o fabrico da massa alimentícia foi trigo duro. Se, pelo contrário, aparecerem duas bandas principais de igual intensidade, a matéria-prima utilizada foi trigo mole. As misturas de trigo duro e trigo mole podem ser verificadas calculando a intensidade relativa das duas bandas.

Se se constata a presença de três bandas (duas bandas à altura das bandas principais do trigo mole, mais uma banda intermediária), houve adição de ovos à massa. Neste caso, a matéria-prima utilizada foi trigo duro se a banda superior for menos intensa que a banda intermédia. Pelo contrário, se a banda superior for mais intensa que a banda intermédia, a matéria-prima utilizada foi trigo mole.

ANEXO IV

Regulamento revogado com a alteração

Regulamento (CEE) n.o 4154/87 da Comissão	(JO L 392 de 31.12.1987, p. 19)
Regulamento (CE) n.o 203/98 da Comissão	(JO L 21 de 28.1.1998, p. 6)

ANEXO V

Quadro de correspondência

Regulamento (CEE) n.o 4154/87	Presente regulamento
Artigos 1.o a 4.o	Artigos 1.o a 4.o
Artigo 5.o	—
—	Artigo 5.o
Artigo 6.o	Artigo 6.o
Anexos I, II e III	Anexos I, II e III
—	Anexo IV
—	Anexo V