ZAŁĄCZNIK I

Oznaczanie zawartości skrobi i produktów jej degradacji włącznie z glukozą

1.   CEL I OBSZAR STOSOWANIA

a)

Metoda umożliwia oznaczenie zawartości skrobi, produktów jej degradacji, włącznie z glukozą, zwanych dalej „skrobią”.

b)

Zawartość „skrobi” wymienionej w lit. a) jest równa wartości E, obliczonej zgodnie z pkt 6 lit. a) niniejszego załącznika.

2.   ZASADA

Próbka jest poddawana reakcji z wodorotlenkiem sodu, w wyniku czego „skrobia” skupia się w grupy glukozy z amyloglukozydazą. Oznaczenia glukozy dokonuje się sposobem enzymatycznym.

3.   ODCZYNNIKI

(Stosować wodę podwójnie destylowaną).

3.1.   Roztwór 0,5 N wodorotlenku sodu (0,5 mol/l).

3.2.   Kwas octowy lodowaty 96 % (minimum).

3.3.   Roztwór amyloglukozydazy:

Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić 10 mg amyloglukozydazy (WE 3.2.1.3) (60 U na mg) w jednym ml wody (1).

3.4.   Roztwór buforowy trietanoloaminy:

Rozpuścić 14,0 g chlorowodorku trietanoloaminy (chlorek tri(2-hydroksyetyl) amonu) oraz 0,25 g siarczanu magnezu (MgSO47H2O) w 80 ml wody, dodać około 5 ml roztworu 5 N wodorotlenku sodu (5 mol/l) i ustalić poziom pH 7,6, stosując roztwór 1 N wodorotlenku sodu (1 mol/l).

Uzupełnić wodą do 100 ml. Otrzymany roztwór buforowy można przechowywać przez co najmniej cztery tygodnie w temperaturze 4 °C.

3.5.   Roztwór NADP (fosforanu dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego, sól disodu):

Rozpuścić 60 mg NADP w 6 ml wody. Otrzymany roztwór buforowy można przechowywać przez co najmniej cztery tygodnie w temperaturze 4 °C.

3.6.   Roztwór ATP (trifosforanu 5′-adenozynowego, sól disodu):

Rozpuścić 300 mg ATP, 3H2O i 300 mg wodorowęglanu sodu (NaHCO3) w 6 ml wody. Otrzymany roztwór buforowy można przechowywać przez co najmniej cztery tygodnie w temperaturze 4 °C.

3.7.   Zawiesina HK/G6P-DH (heksokinaza (WE 2.7.1.1) i dehydrogenaza glukozo-6-fosforowa (WE 1.1.1.49):

Wymieszać 280 U HK i 140 U G6P-DH w 1 ml roztworu 3,2 M siarczanu amonu. Otrzymany roztwór buforowy można przechowywać przez co najmniej cztery tygodnie w temperaturze 4 °C.

4.   APARATURA

4.1.   Łaźnia wodna z mieszadłem indukcyjnym w temp. 60 °C.

4.2.   Pręty indukcyjne.

4.3.   Spektrofotometr UV z 1 cm komórkami optycznymi.

4.4.   Pipety do analizy enzymatycznej.

5.   METODA

5.1.   Próbka jest roztwarzana w wodorotlenku sodu, i „skrobia” poddawana jest hydrolizie enzymatycznej

5.1.1.

Dobrać masę próbki na podstawie poniższej tabeli, zgodnie z zakładaną zawartością „skrobi” (zawartość „skrobi” w próbce nie może przekraczać 0,4 g): Zakładana zawartość „skrobi” w produkcie w g/100 g Przeciętna masa próbki w g (p) Objętość kolby mierniczej w ml Współczynnik rozcieńczenia do 1 litra (f) > 70 0,35–0,4 500 2 20–70 maks. 0,5 500 2 5–20 maks. 1 250 4 < 5 maks. 2 200 5

5.1.2.

Odważyć dokładnie 0,1 mg próbki.

5.1.3.

Dodać 50 ml roztworu 0,5 N wodorotlenku sodu (pkt 3.1) i mieszać bez przerwy przez 30 minut w łaźni wodnej (ppkt 4.1) z mieszadłem indukcyjnym w temp. 60 °C.

5.1.4.

Dodać niewielką ilość ml stężonego kwasu octowego (pkt 3.2) i ustalić poziom pH w zakresie 4,6–4,8.

5.1.5.

Wlać do łaźni wodnej z mieszadłem indukcyjnym (pkt 4.1) w temp. 60 °C, dodać 1,0 ml roztworu enzymu (pkt 3.3) i mieszając bez przerwy, przez 30 minut prowadzić reakcję.

5.1.6.

Po schłodzeniu przelać ilościowo do kolby mierniczej (pkt 5.1.1) i uzupełnić wodą do poziomu oznaczenia na kolbie.

5.1.7.

Jeżeli jest to konieczne, przefiltrować przez sączek karbowany (zob. uwaga 1).

5.2.   Ilościowe oznaczenie glukozy

5.2.1.

Roztwór do badania musi zawierać 100–1 000 mg glukozy na litr, co odpowiada wartości ΔΕ340 między 0,1 i 1,0. Absorpcja roztworu do badania rozpuszczonego w wodzie w stosunku 1 + 30 nie może przekraczać 0,4 (mierzone w stosunku do powietrza) przy 340 nm.

5.2.2.

Doprowadzić roztwór buforowy (pkt 3.4) do temperatury otoczenia (20 °C).

5.2.3.

Temperatura odczynników próbki musi zawierać się w przedziale 20–25 °C.

5.2.4.

Zmierzyć absorpcję przy 340 mm do powietrza (tj. bez komórki optycznej na ścieżce referencyjnej).

5.2.5.

Postępować zgodnie z poniższą tabelą pipetowania: Przelać do komórek optycznych Kontrola (ml) Badanie (ml) Bufor (odczynnik z pkt 3.4) 1,00 1,00 NADP (odczynnik z pkt 3.5) 0,10 0,10 ATP (odczynnik z pkt 3.6) 0,10 0,10 Roztwór do badania (z pkt 5.1.6 lub 5.1.7) — 0,10 Woda podwójnie destylowana 2,00 1,90 Wymieszać i po około trzech minutach zmierzyć absorpcję roztworów (E1). Rozpocząć reakcję, dodając: HK/G6P.DH (odczynnik z pkt 3.7) 0,02 0,02 Wymieszać, odstawić do całkowitego zakończenia reakcji (około 15 minut) i zmierzyć absorpcję roztworów (E2). Jeżeli reakcja nie zakończyła się po upływie 15 minut, odczytywać wartość absorpcji w przedziałach pięciominutowych do momentu, gdy wzrost wartości ustabilizuje się. Następnie dokonać ekstrapolacji wstecznej do momentu dodania zawiesiny (określona w pkt 3.7) (zob. uwaga 2).

5.2.6.

Obliczyć różnice absorpcji dla odczynnika ślepego i próbki (E2 – E1). Wydzielić różnicę absorpcji odczynnika ślepego (ΔΕ odczynnika ślepego) od tej samej wartość próbki (ΔΕ próbki): ΔΕ = ΔΕ próbki – ΔΕ odczynnika ślepego Różnica ta określa zawartość glukozy w roztworze do badania: Zawartość glukozy w roztworze do badania, g/l Gl = ((3,22 × 180,16)/(6,3 × 1 × 0,1 × 1 000)) × ΔΕ340 = 0,921 × ΔΕ340 (3,22: objętość mierzonego roztworu; 1: grubość komórki; 0,1: objętość roztworu próbki; masa cząsteczkowa glukozy wynosi 180,16 g/mol).

5.2.7.

Jeżeli z jakiegokolwiek powodu pomiar nie może zostać wykonany przy 340 nm, można go wykonać przy długości fali 365 nm lub 334 nm, liczba 6,3 w powyższym wzorze powinna zostać zastąpiona odpowiednio liczbami 3,5 lub 6,18.

6.   OBLICZANIE I POSTAĆ WYNIKÓW

a)	E = zawartość „skrobi” w g/100 g: E = ((100 × 0,9 × Gl)/(p × f))

b)	Z = zawartość „glukozy” w g/100 g: Z = ((100 × Gl)/(p × f))

gdzie:

Gl	=	glukoza w g/l (5.2.6.);
f	=	współczynnik rozcieńczenia (ppkt 5.1.1.);
p	=	masa próbki w g;
0,9	=	współczynnik przemiany glukozy dla skrobi.

Uwagi:

1.	Jeżeli nie można przefiltrować roztworu badania stosowanie do pkt 5.1.7, należy zastosować odpowiednie metody w celu otrzymania czystego roztworu.

2.	W przypadku wystąpienia zatrzymania enzymów zaleca się zastosowanie metody polegającej na dodaniu ustalonych ilości czystych skrobi.

---

(1)  U oznacza międzynarodową jednostkę aktywności enzymu.

ZAŁĄCZNIK II

Oznaczanie ilości skrobi, dekstryn lub innych skrobi modyfikowanych w wyrobach objętych kodami CN 3505 20 10 do 3505 20 90 oraz ilości substancji skrobiowych w wyrobach objętych kodami CN 3809 10 10 do 3809 10 90

I.   ZASADA

Skrobia jest przekształcana w wyniku hydrolizy kwasowej w cukry redukujące, które oznaczane są objętościowo z zastosowaniem roztworu Fehlinga.

II.   APARATURA I ODCZYNNIKI

1.

Kolba 250 ml.

2.

Kolba miernicza 200 ml.

3.

Biureta skalowana 25 ml.

4.

Kwas solny o gęstości 1,19.

5.

Roztwór wodorotlenku potasu.

6.

Węgiel drzewny odbarwiający.

7.

Roztwór Fehlinga.

8.

Roztwór błękitu metylowego (1 %).

III.   METODA

W kolbie 250 ml umieścić próbkę zawierającą około 1 g skrobi. Dodać 100 ml wody destylowanej i 2 ml kwasu solnego. Doprowadzić do wrzenia i wykraplać przez trzy godziny.

Przenieść zawartość kolby wraz z wypłuczynami do kolby mierniczej 200 ml. Schłodzić i doprowadzić do odczynu prawie obojętnego roztworem wodorotlenku potasu. Uzupełnić wodą destylowaną do objętości 200 ml i przefiltrować przez niewielką ilość odbarwiającego węgla drzewnego.

Następnie przelać roztwór do skalowanej biurety i zredukować 10 ml roztworu Fehlinga w następujący sposób:

Do naczynia o płaskim dnie i objętości około 250 ml wlać 10 ml roztworu Fehlinga (5 ml roztworu A i 5 ml roztworu B). Wstrząsnąć do uzyskania jasnej barwy roztworu i dodać 40 ml wody destylowanej oraz niewielką ilość kwarcu lub pumeksu.

Umieścić kolbę na czworokątnej płytce azbestowej z okrągłym otworem o średnicy ok. 6 cm pośrodku, tak aby azbest z kolei spoczywał na kawałku siatki drucianej. Podgrzać kolbę w takiej temperaturze, aby znajdująca się w środku ciecz zaczęła wrzeć po około dwóch minutach.

Z biurety dodawać do wrzącej cieczy stopniowo roztwór cukru do chwili aż błękitny kolor roztworu Fehlinga stanie się trudno dostrzegalny; wówczas dodać 2 do 3 kropel błękitu metylenowego jako wskaźnika i dokończyć miareczkowanie, dodając dalsze ilości roztworu cukru, kropla po kropli, aż zginie błękitny kolor roztworu wskaźnikowego.

W celu uzyskania większej dokładności powtórzyć miareczkowanie zgodnie z tymi samymi warunkami, lecz dodając od razu prawie cały roztwór cukru wymagany do zredukowania roztworu Fehlinga. Podczas drugiego miareczkowania redukcja roztworu Fehlinga powinna nastąpić w ciągu trzech minut. Podtrzymywać wrzenie dokładnie przez kolejne dwie minuty, dodając przez minutę odczynnik kropla po kropli do wrzącego roztworu aż błękitny kolor zniknie.

Wagowy udział procentowy skrobi w próbce jest określany za pomocą następującego wzoru:

skrobia % = ((T × 200 × 100)/(n × p)) × 0,95

gdzie:

T	:	oznacza liczbę gramów bezwodnej dekstrozy odpowiadającą 10 ml roztworu Fehlinga (5 ml roztworu A i 5 ml roztworu B). Miano to odpowiada 0,04945 g bezwodnej dekstrozy, kiedy roztwór A zawiera 17,636 g miedzi na litr;
n	:	oznacza liczbę ml roztworu cukru użytego do miareczkowania;
p	:	oznacza wagę próbki;
0,95	:	oznacza stopień przekształcenia dekstrozy w skrobię.

IV.   PRZYGOTOWANIE ROZTWORU FEHLINGA

Roztwór A	:	W kolbie mierniczej rozpuścić w wodzie destylowanej 69,278 g czystego krystalicznego siarczanu miedzi – odczynnik analityczny (CuSO4 5 H2O) – wolnego od żelaza i uzupełnić wodą destylowaną do objętości 1 litra. Właściwa moc tego roztworu musi zostać sprawdzona poprzez ilościowe określenie miedzi.
Roztwór B	:	W kolbie mierniczej rozpuścić w wodzie destylowanej 100 g wodorotlenku sodu i 346 g podwójnego winianu sodowo-potasowego (sól Rochelle’a) i uzupełnić wodą destylowaną do objętości 1 litra.

Obydwa roztwory A i B muszą zostać zmieszane w równych ilościach bezpośrednio przed zastosowaniem. 10 ml roztworu Fehlinga (5 ml roztworu A i 5 ml roztworu B) zostaje całkowicie zredukowane, zgodnie z warunkami opisanymi w pkt III, przez 0,04945 g bezwodnej dekstrozy.

ZAŁĄCZNIK III

Wykrywanie zwyczajnej mąki lub mączki pszennej w makaronie, spaghetti i produktach pokrewnych (pasta)

(na podstawie metody Younga i Gillesa, zmodyfikowanej przez Bernaertsa i Grunera)

I.   ZASADA

Ekstrakt próbki makaronu do analizy jest przygotowywany z wykorzystaniem rozpuszczalnika niepolarnego.

Ekstrakt ten jest poddawany chromatografii na cienkiej warstwie żelu silikonowego, tak aby oddzielić sterole obecne w różnych częściach formy pasma.

Na podstawie liczby jaskrawo kolorowych pasm możliwe jest określenie, czy badany produkt został wyprodukowany wyłącznie z pszenicy durum czy z pszenicy zwyczajnej, ewentualnie z mieszanki obydwu odmian. Możliwe jest także określenie, czy zostały dodane jaja.

II.   APARATURA I ODCZYNNIKI

1.

Homogenizator lub rozcieracz pozwalający uzyskać granulat przechodzący przez standardowe sito 0,200 mm.

2.

Standardowe sito 0,200 mm.

3.

Parownik z kąpielą wodną w celu odparowywania pod zmniejszonym ciśnieniem.

4.

Płytka szklana, blaszka aluminiowa lub inna podkładka o rozmiarach 20 cm × 20 cm pokryta cienką warstwą żelu silikonowego. W przypadku konieczności przygotowania warstwy silikonowej zmieszać żel silikonowy z ok. 13 % gipsu i uformować warstwę o grubości 0,25 mm zgodnie z zaleceniami producenta aparatury.

5.

Mikropipeta do odmierzenia 20 mikrolitrów.

6.

Pojemnik z pokrywą do prowadzenia chromatogramów.

7.

Rozpylacz.

8.

Eter naftowy o punkcie wrzenia między 40 a 60 °C, ponownie destylowany przed zastosowaniem.

9.

Eter etylu bezwodnego do analizy.

10.

Tetrachlorometan do chromatografii, ponownie destylowany przed zastosowaniem.

11.

Kwas fosfomolibdenowy do analizy.

12.

Alkohol etylowy 94°.

III.   METODA

Zetrzeć około 20 g próbki do analizy, tak aby całość mogła zostać przesiana przez sito. Umieścić próbkę w kolbie Erlenmeyera i dodać 150 ml eteru naftowego. Pozostawić w temperaturze pokojowej do następnego dnia. Od czasu do czasu wstrząsnąć.

Następnie przefiltrować przez lejek Büchnera z sitkiem lub filtrem spiekanym. Stopniowo przenosić tak otrzymywany czysty roztwór do kolby mierniczej 100 ml. Odparować rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, podgrzewając kolbę w kąpieli wodnej w temperaturze 40 °C do 50 °C. Kiedy rozpuszczalnik wyparuje, ogrzewać pod zmniejszonym ciśnieniem przez następne 10 minut.

Po wystudzeniu kolby określić wagę ekstraktu. Rozpuścić ekstrakt w eterze etylowym na bazie 1 ml eteru etylowego na 60 mg ekstraktu.

Uaktywnić cienkie warstwy, podgrzewając je do temp. 130 °C przez trzy godziny. Pozostawić do ostudzenia w eksykatorze zawierającym żel silikonowy. Płytki, które nie zostaną bezpośrednio wykorzystane, mogą zostać przechowane w tym samym ekstykatorze.

Wpuścić, kropla po kropli, 20 mikrolitrów czystego roztworu w celu uformowania pasma o stałej szerokości i długości 3 cm, na warstwie najlepiej nowo aktywizowanej. Pozostawić rozpuszczalnik do wyparowania.

Przeprowadzić chromatogram w temperaturze pokojowej z tetrachlorometanem przy użyciu pojemnika chromatograficznego, którego ściany pokryte zostały papierem filtrującym zamoczonym w rozpuszczalniku. Po około godzinie rozpuszczalnik osiągnie wysokość 18 cm. Usunąć płytkę i pozostawić rozpuszczalnik do wyparowania. W celu lepszego odseparowania pasm przeprowadzić chromatogram po raz drugi. Ponownie pozostawić rozpuszczalnik otwarty do wyparowania.

Rozpylić cienką warstwę żelu silikonowego z 20-procentowym roztworem kwasu fosfomolibdenowego w alkoholu etylowym. Kolor warstwy musi być jednolicie żółty. Wyzwolić pasma ogrzewając płytkę z rozpylonym żelem w temperaturze 110 °C przez pięć minut.

IV.   INTERPRETACJA CHROMATOGRAMU

Jeżeli chromatogram wykazuje pojedyncze główne jaskrawokolorowe pasmo o wartościach Rf 0,4–0,5, do produkcji makaronu zastosowano pszenicę durum. Jeżeli, z drugiej strony, pojawią się dwa główne pasma jednakowo jaskrawe, surowcem użytym do produkcji jest pszenica zwyczajna. Mieszanki pszenicy durum i pszenicy zwyczajnej można określić, porównując względną jaskrawość obydwu pasm.

Jeżeli pojawią się trzy pasma (dwa pasma na wysokości występowania głównego pasma dla pszenicy zwyczajnej oraz jedno dodatkowe pasmo między nimi), do makaronu zostały dodane jaja. W takim przypadku użyta została pszenica durum, jeśli środkowe pasmo jest jaskrawsze od pasma górnego. Z drugiej strony, jeżeli górne pasmo jest jaskrawsze od pasma środkowego, do produkcji użyto pszenicy zwyczajnej.

ZAŁĄCZNIK IV

Uchylone rozporządzenie i jego zmiana

Rozporządzenie Komisji (EWG) nr 4154/87	(Dz.U. L 392 z 31.12.1987, s. 19).
Rozporządzenie Komisji (WE) nr 203/98	(Dz.U. L 21 z 28.1.1998, s. 6).

ZAŁĄCZNIK V

Tabela korelacji

Rozporządzenie (EWG) nr 4154/87	Niniejsze rozporządzenie
Artykuły 1–4	Artykuły 1–4
Artykuł 5	—
—	Artykuł 5
Artykuł 6	Artykuł 6
Załączniki I, II i III	Załączniki I, II i III
—	Załącznik IV
—	Załącznik V