ANNESS I

Il-mod ta’ kif ikun iddeterminat il-kontenut f’lamtu u tad-degredazzjoni tal-prodotti tiegħu inkluż il-glukożju

1.   L-ISKOP U L-QASAM TA’ L-APPLIKAZZJONI

(a)

Dan il-metodu jippermetti d-determinazzjoni tal-kontenut f’lamtu, il-prodotti tad-degredazzjoni tiegħu li jinkludu l-glukożju li minn issa ’l quddiem huwa referut bħala “lamtu”.

(b)

Il-kontenut f’“lamtu” riferut f’punt (a) huwa ugwali għall-valur ta’ E, kif kalkolat f’punt 6 (a) ta’ dan l-Anness.

2.   IL-PRINĊIPJU

Il-kampjun jitkisser permezz ta’ l-idrossidu tas-sodju u l-“lamtu” jinqasam f’unitajiet ta’ glukożju ma’ l-amiloglukosidażju. Id-determinazzjoni tal-glukożju għandha ssir permezz tar-rotta enżimatika.

3.   KIMIKA

(Irid jintuża ilma distillat darbtejn).

3.1.   0,5 N soluzzjoni ta’ l-idrossidu tas-sodju (0,5 mol/l).

3.2.   Mill-inqas 96 % aċidu glaċċjali (aċidiku).

3.3.   Soluzzjoni ta’ amiloglukossidu:

Immedjatament qabel l-użu, għandu jinħall madwar 10 mg ta’ l-amiloglukossidu (KE 3.2.1.3) (60 U/mg) f’ ml wieħed ta’ l-ilma (1).

3.4.   Is-soluzzjoni ta’ barriera tat-tritanolamina:

Dewweb 14,0 tat-tritanolamina idroklorika (tris (2-idrosietilu) kloridu ammoniaku) u 0,25 g tas-sulfat tal-manjeżju (MgSO47H2O) fi 80 ml ta’ ilma, żid approssimament 5 ml ta 5 N soluzzjoni idrossidu tas-sodju (5 mol/l) u l-pH għandu jkun aġġustat sa 7,6, filwaqt li jintuża 1 N soluzzjoni ta’ l-idrossidu tas-sodju (1 mol/l).

Żid sakemm isiru 100 ml bl-ilma. Din is-soluzzjoni ta’ barriera tista’ tinżamm għal mill-inqas erba’ ġimgħat f’temperatura ta’ 4 °Ċ.

3.5.   Soluzzjoni ta’ NADP (nikotinamida adenina dinukleotida fosfat, melħ dissodju):

Dewweb 60 mg ta’ NADP f’ 6 ml ta’ l-ilma. Din is-soluzzjoni tista’ tinżamm għal mill-anqas erba’ ġimgħat f’temperatura ta’ 4 °Ċ.

3.6.   Soluzzjoni ta’ ATP (adenossina – 5 – trifosfata – melħ dissodju):

Iridu jinħallu 300 mg ATP. 3H2O fl-ilma u 300 mg ta’ sodju ta’ l-idroġenu karbonat (NaHCO3) f’ 6 ml ta’ l-ilma. Din is-soluzzjoni tista’ tinżamm mill-anqas għal erba’ ġimgħat f’temperatura ta’ 4 °Ċ.

3.7.   Is-sospensjoni ĦK/G6P-DĦ (Ħeksokinażi – KE 2.7.1.1) u glukożju-6-fosfat-deidroġinaże (KE 1.1.1.49):

issospendi 280 U ĦK u 140 U ta’ G6P-DĦ f’ml ta’ 3,2 M soluzzjoni tas-sulfat ta’ l-ammonju. Din is-sospensjoni tista’ tinżamm għal mill-inqas sena f’temperatura ta’ 4 °Ċ.

4.   APPARAT

4.1.   Banjumarija b’aġitatur manjetiku f’temperatura ta’ 60 °Ċ.

4.2.   Vireg manjetiċi.

4.3.   UV spettrofotometru b’ ċelloli ottiċi ta’ 1 ċm.

4.4.   Pipetti għal analiżi enżimatiċi.

5.   IL-METODU

5.1.   Il-kampjun jiġi maħsul bl-etanol, maħlul fis-sodju idrossidu u l-“lamtu” soġġett għall-idroliżi enżimatika:

5.1.1.

Il-piż tal-kampjun għandu jiġi magħżul kif ġej, skond il-kontenut “lamtu” (li ma jistax jeċċedi l-0,4 g kull kampjun kif ġej): Il-kontenut presunt f’ “lamtu” tal-prodott fi g/100 g Il-piż approssimattiv tal-kampjun fi g (p) Il-volum tal-garafina immarkata f’ ml Il-fattur tat-trattib sa litru wieħed (f) > 70 0,35-0,4 500 2 20-70 max. 0,5 500 2 5-20 max. 1 250 4 < 5 max. 2 200 5

5.1.2.

Iżen il-kampjun (eżattament sa 0,1 mg).

5.1.3.

Żid 50 ml ta’ 0,5 N soluzzjoni ta’ l-idrossidu tas-sodju (punt 3.1) u ħawwad kontinwament għal 30 minuta fil-banjumarija (punt 4.1) bi stikka manjetika fi 60 °Ċ.

5.1.4.

Żid ftit ml ta’ aċidu aċetiku kkonċentrat (punt 3.2) u wasal il-pH lejn 4,6 sa 4.8.

5.1.5.

Poġġi fil-banjumarija bl-istikka manjetika (punt 4.1) fi 60 °Ċ, żid 1,0 ml ta’ soluzzjoni ta’ l-enżimi (punt 3.3) u ħallihom bir-reazzjoni waqt li tħawwad kontinwament għal 30 minuta.

5.1.6.

Wara li jibirdu, trasferixxi l-kwantità f’garafina gradwata (punt 5.1.1) u żid bl-ilma sal-marka.

5.1.7.

Jekk meħtieġ, iffiltra minn filtru forma ta’ lembut (ara n-Nota 1).

5.2.   Determinazzjoni kwantitattiva tal-glukożju

5.2.1.

Is-soluzzjoni tat-test għandha jkun fiha 10 sa 1 000 mg ta’ glujkożju kull litru, li jikkorrispondi għal ΔΕ340 ta’ bejn 0,1 - 1,0. L-assorbenza tas-soluzzjoni tat-test fi 1 + 30 trattib bl-ilma m’għandhiex teċċedi 0,4 (imkejla kontra l-arja), fi 340 nm.

5.2.2.

Wassal is-soluzzjoni tal-barriera (punt 3.4) sat-temperatura ambjentali (20 °Ċ).

5.2.3.

It-temperatura tar-reaġenti u tal-kampjun għandha tkun ta’ bejn 20 °Ċ u 25 °Ċ.

5.2.4.

Kejjel l-assorbenza fi 340 nm kontra l-arja (i.e. bl-ebda ċellola ottika fil-passaġġ tar-referenza).

5.2.5.

Ipproċedi bi qbil mal-grafika tal-pipetta, ta’ hawn taħt: Ferra fiċ-ċelloli ottiċi Kontroll (ml) Test (ml) Barriera (reaġent 3.4) 1,00 1,00 NADP (reaġent 3.5) 0,10 0,10 ATP (reaġent 3.6) 0,10 0,10 Soluzzjoni tat-test (5.1.6 jew 5.1.7) — 0,10 Ilma iddistillat doppju 2,00 1,90 Ħallat u, wara madwar tliet minuti, kejjel l-assorbenza tas-soluzzjonijiet (E1). Ibda r-reazzjoni billi żżid: HK/G6P-DH (reaġent 3.7) 0,02 0,02 Ħallat. Ħalli r-reazzjoni tipproċedi sa kemm tkun lesta (madwar 15-il minuta) u kejjel l-assorbenza tas-soluzzjonijiet (E2). Jekk ir-reazzjoni ma tkunx waqfet wara 15-il minuta, aqra l-assorbenzi f’intervalli ta’ ħames minuti l-waħda sakemm ir-rata taż-żieda tkun kostanti. Imbagħad għamel extrapolazzjoni lura lejn il-ħin taż-żidiet tas-sospenzjoni kif imsemmi f’punt 3.7 (ara n-Nota 2).

5.2.6.

Għandhom imbagħad ikunu kkalkulati d-differenzi fl-assorbiment għall-kimika u l-kampjun E2 – E1. Naqqas id-differenza fl-assorbenza tal-kimika minn dak tal-kampjun (= ΔΕ): ΔΕ = ΔΕ sample – ΔΕ reagent blank Din id-differenza tagħti lill-kontenut fi glukożju s-soluzzjoni tat-test: Il-kontenut fi glukożju li jkun jinsab fis-soluzzjoni tat-test, g/l Gl = ((3,22 × 180,16)/(6,3 × 1 × 0,1 × 1 000)) × ΔΕ340 = 0,921 × ΔΕ340 (3,22: il-volum tas-soluzzjoni għandha tkun mwieżna; il-volum tas-soluzzjoni tal-kampjun; il-piż molekulari tal-glukożju huwa 180,16 (g/mol).

5.2.7.

Jekk, għal xi raġuni, ma jistax isir kejl ta’ 340 nm, il-kejl jista’ jsir b’tul ta’ mewġa ta’ 365 nm jew ta’ 334 nm. Il-figura 6,3 fil-formola ta’ G1 ta’ hawn fuq għandha tieħu post il-figura 3,5 jew 6,18 rispettivament.

6.   KALKOLAZZJONI U L-ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

(a)	E = il-kontenut f’“lamtu” fi g/100 g: E = ((100 × 0,9 × Gl)/(p × f))

(b)	Z = Il-Kontenut fi“Glukożju” kull g/100 g: Z = ((100 × Gl)/(p × f))

meta:

Gl	=	glukożju fi g/l (5.2.6);
f	=	il-fattur tat-trattib (5.1.1);
p	=	il-piż tal-kampjun fi g;
0,9	=	skond il-fattur tal-konverżjoni tal-glukożju għal-lamtu.

Noti:

1.	Meta s-soluzzjoni tat-test ma tistax tkun iffiltrata skond punt 5.1.7 għandhom jiġu adottati metodi xierqa biex tinħareġ soluzzjoni ċara.

2.	Meta jkun hemm inibizzjoni ta’ l-enżima, huwa konsiljabbli li jkun applikat metodu li jinvolvi ż-żieda ta’ ammonti magħrufin ta’ lamtu pur.

---

(1)  U hija l-unità internazzjonali ta’ l-attività ta’ l-enżima.

L-ANNESS II

Id-determinazzjoni tal-lamti jew tad-destrini jew tal-kontenut f’lamtu ieħor modifikat fil-prodotti tal-kodiċi NK 3505 20 10 sa 3505 20 90 u tal-kontenut amilaċeji tas-sustanzi fil-prodotti tal-kodiċi NK 3809 10 10 sa 3809 10 90

I.   PRINĊIPJU

Il-lamtu jiġi konvertit bl-aċidu idroliżu f’zokkor li huma determinati bil-volum bl-użu tas-soluzzjoni ta’ Fehling.

II.   L-APPARAT U L-KIMIKA

1.

Garafina ta’ madwar 250 ml;

2.

Garafina gradwata ta’ 200 ml;

3.

Buretta gradwata 25 ml;

4.

Aċtu idrokloriku b’densità ta’ 1,19;

5.

Soluzzjoni ta’ l-idrossidu tal-potassju;

6.

Faħam tal-kannol għad-dekolarizzazzjoni;

7.

Is-Soluzzjoni Fehling;

8.

Soluzzjoni blu tal-metilene (1 %).

III.   METODU:

Figarafina ta’ 250 ml poġġi kampjun li jkun fih madwar 1 g ta’ lamtu. Żid 100 ml ta’ l-ilma distillat u 2 ml ta’ aċidu idrokloriku. Wassal għat-togħlija u għal rifluss għal tliet sigħat.

Ittrasferixxi l-kontenut tal-garafina u tat-tlaħlil figarafina gradwata ta’ 200 ml. Berred u kważi nnewtralizza bis-soluzzjoni ta’ l-idrossidu tal-potassju. Żid ilma distillat sa 200 ml u ffiltrah fuq ftit faħam tal-kannol tal-dikolarizzazzjoni.

Ferra s-soluzzjoni f’buretta gradwata u naqqas għal 10 ml tas-soluzzjoni Fehling bil-metodu segwenti:

Figarafina bil-qiegħ ċatt ta’ madwar 250 ml ferra 10 ml tas-soluzzjoni Fehling (5 ml tas-soluzzjoni A u 5 ml tas-soluzzjoni B). Ħawwad sakemm isir ċar u żid 40 ml ta’ ilma distillat u kwantità żgħira ta’ kwarz jew ħaffiefa.

Il-garafina għandha titpoġġa fuq dixx kwadru ta’ l-asbestos li jkollu toqba tonda ta’ diametru ta’ madwar 6 ċm fiċ-ċentru, filwaqt li l-asbestos jitpoġġa fuq garża tal-fildiferru. Saħħan il-garafina fir-rata tali li l-likwidu jibda jagħli wara xi żewġ minuti.

Mill-buretta, żid mal-likwidu jagħli kwantitajiet suċċessivi tas-soluzzjoni taz-zokkor sakemm il-kulur blu tas-soluzzjoni ta’ Fehling bilkemm jibqa’ jintagħraf; imbagħad għandhom jiżdiedu 2 jew 3 qatriet tas-soluzzjoni blu tal-metilene bħala indikatur u, għandha titkompla t-titrazzjoni billi kwantitajiet oħra jiżiedu mas-soluzzjoni taz-zokkor, qatra wara qatra sakemm il-kulur blu ta’ l-indikatur jisparixxi.

Għal aktar eżattezza t-titrazzjoni għandha tirrepeti ruħha taħt l-istess kondizzjonijiet, pero’ għandha tinżied mingħajr ebda pawsa s-soluzzjoni taz-zokkor meħtieġa biex tirriduċi s-soluzzjoni ta’ Fehling. F’din it-tieni titrazzjoni, it-tnaqqis tas-soluzzjoni ta’ Fehling għandha ssir fi żmien tliet minuti. Għandha tkompli tagħli għal preċiżament żewġ minuti oħra, filwaqt li tinżied il-kimika f’ħin ta’ minuta qatra b’qatra għas-soluzzjoni tat-togħlija sakemm il-kulur blu jisparixxi.

Dan il-persentaġġ bil-piż tal-lamtu fil-kampjun għandu jiġi determinat skond il-formula li ġejja:

lamtu % = ((T × 200 × 100)/(n × p)) × 0,95

meta:

T	:	hija il-kwantita tal-grammi tad-destrożju anidrożju li jikkorrispondi sa 10 ml tas-soluzzjoni ta’ Fehling (5 ml tas-soluzzjoni A u 5 ml tas-soluzzjoni B). Din it-titrazzjoni tikkorrispondi għal 0,04945 g tad-destrożju androżju tas-soluzzjoni A li jkun fiha 17,636 g ta’ ramm għal kull litru;
n	:	hija in-numru ta’ ml tas-soluzzjoni taz-zokkor użata għat-titrazzjoni;
p	:	hija il-piż ta’ l-ammont tal-kampjun;
0,95	:	hija ir-rata tal-konverżjoni tad-destrożju anidruż fil-lamtu.

IV.   IL-PREPARAZZJONI TAS-SOLUZZJONIJIET TA’ FEHLING

Soluzzjoni A	:	F’garafina gradwata għandu jkun maħlul 69,278 g ta’ sulfat tar-ramm kristallizzat – Reaġent Analitiku (CuSO4 5H2O) - ħieles mill-ħadid f’ilma distillat u li jwassal il-volum ta’ litru wieħed bl-ilma distillat. Il-qawwa korretta ta’ din is-soluzzjoni għandha tkun verifikata b’determinazzjoni kwantitattiva tar-ramm.
Soluzzjoni B	:	F’garafina gradwata 100 g ta’ sodju idrossidu u 346 g ta’ tarttrat tas-sodju tal-potassju doppju (melħ ta’ Rochelle) għandhom jinħallu f’ilma distillat u l-volum għandu jiżdied għal-litru wieħed b’ilma distillat.

Iż-żewġ soluzzjoni A u B għandhom ikunu imħaltin bi kwantitajiet egwali immedjatament qabel l-użu. 10 ml ta’ soluzzjoni ta’ Fehling (5 ml tas-soluzzjoni A u 5 ml tas-soluzzjoni B) huma kompletament imnaqqsa, taħt il-kondizzjonijiet deskritti fil-punt III, bi 0,04945 g ta’ destrożju anidruż.

ANNESS III

Skoperta ta’ dqiq tal-qamħ komuni jew smida f’makkaroni, spagetti u prodotti simili (Għaġin)

(bil-metodu Young u Giles, modifikat minn Bernaerts u Gruner)

I.   PRINĊIPJU

Estratt tal-kampjun ta’ l-għaġin għall-analiżi li huwa ppreparat billi jintuża solvent mhux polari.

Dan l-estratt huwa kromatografat fuq saff irqiq ta’ ġel silika biex jiġu separati l-isterols preżenti fid-diversi frazzjonijiet tal-band form.

Huwa possibli li jiġi determinat jekk il-prodott eżaminat ġiex manifatturat esklużivament minn qamħ durum jew minn qamħ komuni, jew minn taħlita tat-tnejn skond in-numru ta’ bands b’kuluri vivaċi. Huwa possibli li jiġi determinat ukoll jekk ġewx miżjuda bajd.

II.   L-APPARAT U L-KIMIKA

1.

Omoġenizzatur jew mitħna biex jinkiseb qamħ għat-tħin li jkun jista’ jgħaddi minn passatur ta’ qies standard b’ xibka ta’ 0,200 mm.

2.

Passatur ta’ qies standard b’xibka ta’ 0,200 mm.

3.

Evaporatur b’banjumarija għall-evaporazzjoni taħt pressjoni mnaqqsa.

4.

Folja rqiqa tal-ħġieġ, pjanċa rqiqa ta’ l-aluminju jew rinforz xieraq ieħor b’qisien ta’ 20 ċm × 20 ċm miksi b’saff irqiq ta’ ġel silika. Jekk is-saff irqiq jrid jiġi ppreparat, għandu jiġi użat ġel silika mħallat b’13 % ġips, u għandu jiġi applikat f’saff ta’ 0,25 mm b’apparat xieraq skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur.

5.

Mikropipetta biex tqis 20 mikrolitri.

6.

Kontenitur bl-għatu tajjeb biex jiġu żviluppati il-kromatogrammi.

7.

Atomizzatur.

8.

Etere tal-petroleum b’punt tat-tgħollija bejn l-40 °Ċ u s-60 °Ċ, iddistillat mill-ġdid qabel jintuża.

9.

Etere etile anidru għall-analiżi.

10.

Karbonju tetrakloridu għall-kromatografija, iddistillat mill-ġdid qabel jintuża.

11.

Aċidu fosfomolibdiku għall-analiżi.

12.

94° alkoħol etile.

III.   METODU

Itħan madwar 20 g tal-kampjun għall-analiżi ħalli jgħaddi mill-passatur. Poġġi l-kampjun fi flixkun Erlenmeyer u iksi b’150 ml etere tal-petroleum. Ħallih f’temperatura normali sal-ġurnata ta’ wara. Ħawwad minn ħin għall-ħin.

Imbgħad iffiltra minn lembut Büchner li għandu apparat ta’ filtrazzjoni jew minn filtru sintered. Ittrasferixxi is-soluzzjoni ċara hekk miksuba bil-mod il-mod fi flixkun ikkalibrat ta’ 100 ml. Evaporizza s-solvent taħt pressjoni mnaqqsa billi ssaħħan il-flixkun f’banjumarija f’temperatura ta’ 40 °Ċ sa 50 °Ċ. Meta s-solvent ikun evaporizza, saħħan taħt pressjoni imnaqqsa għal-għaxar minuti oħra.

Meta l-flixkun jiksaħ, iddetermina il-piż ta’ l-estratt. Iddilwixxi l-estratt bl-etile etere fuq bażi ta’ 1 ml etile etere għal kull 60 mg ta’ l-estratt.

Attiva s-saffi rqaq billi twassalhom għal temperatura ta’ 130 °Ċ għal tlett sigħat. Ħallihom jiksħu f’dessikatur li jikkontjeni ġel silika. Folji li mhumiex użati mmedjatament jistgħu jiġu ppreservati fl-istess dessikatur.

Applika, qatra qatra, 20 mikrolitru tas-soluzzjoni ċara biex tifforma band ta’ wisa’ konstanti u tul ta’ 3 ċm fuq saff preferibbilment attivat riċentement. Ħalli s-solvent jevaporizza.

Uża kontenitur kromatografiku li l-ħitan tiegħu huma miksija b’karta li tiffiltra mxarrba kompletament bis-solvent biex tiżviluppa l-kromatogramma taħt temperatura normali b’karbonju tetrakloridu. Madwar xi siegħa wara s-solvent jilħaq għoli ta’ 18 ċm. Neħħi l-folja u ħalli s-solvent jevaporizza fil-miftuħ. Għall-separazzjoni aħjar tal-bands, żviluppa l-kromatogramma għat-tieni darba. Erġa’ ħalli s-solvent jevaporizza fil-miftuħ.

Sprejja s-saff irqiq tal-ġel silika b’soluzzjoni ta’ 20 % aċidu fosfomolibdiku f’alkoħol etile. Il-kulur tas-saff jrid ikun isfar uniformi. Żviluppa l-bands billi ssaħħan il-folja sprejjata b’temperatura 110 °Ċ għal ħames minuti.

IV.   INTERPRETAZZJONI TAL-KROMATOGRAMMA

Jekk il-kromatogramma turi band waħedha ewlenija b’kulur vivaċi b’Rf ta’ madwar 0,4 sa 0,5, il-qamħ użat għall-manifattura tal-għaġin in kwistjoni huwa qamħ durum. Jekk, minflok, jidhru żewġ bands ewlenin ta’ vivaċità ugwali, il-materja prima użata huwa il-qamħ komuni. Taħlitiet ta’ qamħ durum u qamħ komuni jistgħu jiġu assessjati b’valutazzjoni tal-vivaċità relatttiva taż-żewġ bands.

Jekk hemm tlett bands (żewġ bands ta’ għoli bħal-dak tal-bands ewlenin għal-qamħ kumuni u band oħra fosthom) ikun ġie miżjud bajd ma’ l-għaġin. F’dan il-każ, il-materja prima użata huwa qamħ durum jekk il-band tan-nofs hija iktar vivaċi mill-band ta’ fuq. Imma, jekk il-band ta’ fuq hija iktar vivaċi mill-band tan-nofs, il-materja prima użata huwa qamħ komuni.

ANNESS IV

Regolament imħassar flimkien mal-lista ta’ l-emendi suċċessivi tiegħu

Regolament tal-Kummissjoni (KEE) Nru 4154/87	(ĠU L 392, 31.12.1987, p. 19)
Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 203/98	(ĠU L 21, 28.1.1998, p. 6)

ANNESS V

Tabella ta’ Korrelazzjoni

Regolament (KEE) Nru 4154/87	Dan ir-Regolament
Artikoli 1 sa 4	Artikoli 1 sa 4
Artikolu 5	—
—	Artikolu 5
Artikolu 6	Artikolu 6
Annessi I, II u III	Annessi I, II u III
—	Anness IV
—	Anness V