LIITE I

Tärkkelyspitoisuuden ja tärkkelyksen hajoamistuotteiden, glukoosi mukaan luettuna, määritys

1   TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

a)

Menetelmällä on mahdollista määrittää tärkkelyspitoisuus sekä sen hajoamistuotteiden pitoisuus, glukoosi mukaan luettuna, jäljempänä ’tärkkelys’.

b)

Edellä a alakohdassa tarkoitettu ”tärkkelys” pitoisuus on yhtä suuri kuin arvo E laskettuna tämän liitteen 6 kohdan a alakohdan mukaisesti.

2   PERIAATE

Näyte hajotetaan natriumhydroksidilla ja ”tärkkelys” jaetaan glukoosiyksiköihin amyloglukosidaasin avulla. Glukoosi määritetään entsymaattisesti.

3   REAGENSSIT

(Käytetään kahdesti tislattua vettä).

3.1   0,5 N Natriumhydroksidiliuos (0,5 mol/l).

3.2   (vähintään) 96 % jääetikka.

3.3   Amyloglukosidaasiliuos:

Välittömästi ennen käyttöä liuotetaan noin 10 mg amyloglukosidaasia (EC 3.2.1.3) (60 U/mg) 1 millilitraan vettä (1).

3.4   Trietanoliamiinipuskuriliuos:

Liuotetaan 14,0 g trietanoliamiinihydrokloridia [tris(2-hydroksietyyli)ammoniumkloridi] ja 0,25 g magnesiumsulfaattia (MgSO47H2O) 80 ml:aan vettä, lisätään noin 5 ml 5 N natriumhydroksidiliuosta (5 mol/l) ja säädetään pH:ksi 7,6 1 N natriumhydroksidiliuosta (1 mol/l) käyttäen.

Täytetään 100 ml:ksi vedellä. Puskuriliuosta voidaan säilyttää vähintään 4 viikkoa 4 °C:ssa.

3.5   NADP (nikotinamidiadeniinidinukleotidifosfaatti, dinatriumsuola) -liuos:

Liuotetaan 60 mg NADP 6 ml:aan vettä. Tätä liuosta voidaan säilyttää vähintään neljä viikkoa 4 °C:ssa.

3.6   ATP (adenosiini-5′-trifosfaatti, dinatriumsuola) -liuos:

Liuotetaan 300 mg ATP, 3H2O ja 300 mg natriumvetykarbonaattia (NaHCO3) 6 ml:aan vettä. Liuosta voidaan säilyttää vähintään 4 viikkoa 4 °C:ssa.

3.7   HK/G6P-DH [Heksokinaasi (EC 2.7.1.1) ja glukoosi-6-fosfaatti-dehydrogenaasi (EC 1.1.1.49)]-suspensio:

suspendoidaan 280 U HK ja 140 U G6P-DH 1 ml:ssa 3,2 M ammoniumsulfaattiliuosta. Suspensiota voidaan säilyttää vähintään vuosi 4 °C:ssa.

4   VÄLINEISTÖ

4.1   Magneettisekoittaja vesihauteessa 60 °C:ssa.

4.2   Magneettisauvoja.

4.3   UV-spektrofotometri 1 cm optisin kyvetein.

4.4   Pipettejä entsymaattista määritystä varten.

5   MENETELMÄ

5.1   Näyte uutetaan lämmittäen natriumhydroksidilla ja ”tärkkelys” hydrolysoidaan entsymaattisesti

5.1.1

Näytteen paino valitaan seuraavasti oletetun ”tärkkelys” pitoisuuden (”tärkkelys” pitoisuus saa olla enintään 0,4 g näytettä kohden) mukaisesti: Tuotteen oletettu ”tärkkelys” pitoisuus,g/100 g Näytteen paino grammoina noin (p) Mittapullon tilavuus, ml Laimennoskerroin yhdeksi litraksi (f) > 70 0,35–0,4 500 2 20–70 enintään 0,5 500 2 5–20 enintään 1 250 4 < 5 enintään 2 200 5

5.1.2

Punnitaan näytettä täsmälleen 0,1 mg.

5.1.3

Lisätään 50 ml 0,5 N natriumhydroksidiliuosta (3.1 kohta) ja sekoitetaan jatkuvasti 30 minuuttia vesihauteessa (4.1 kohta) magneettisekoittajalla 60 °C:ssa.

5.1.4

Lisätään muutama ml väkevää etikkahappoa (3.2 kohta) ja saatetaan pH:ksi 4,6–4,8.

5.1.5

Asetetaan vesihauteeseen magneettisekoittajan kanssa (4.1 kohta) 60 °C:seen, lisätään 1,0 ml entsyymiliuosta (3.3 kohta) ja annetaan reagoida samalla jatkuvasti sekoittaen 30 minuuttia.

5.1.6

Jäähdytyksen jälkeen siirretään kvantitatiivisesti mittapulloon (5.1.1 kohta) ja täytetään merkkiin vedellä.

5.1.7

Tarvittaessa suodatetaan laskostetun suodattimen läpi (ks. huomautus 1).

5.2   Glukoosin kvantitatiivinen määritys

5.2.1

Koeliuoksessa on oltava 100–1 000 mg glukoosia litraa kohden, mikä vastaa ΔΕ340 -arvoa 0,1–1,0. Koeliuoksen absorbanssi laimennoksena 1 + 30 veden kanssa ei saa olla suurempi kuin 0,4 (mitattuna suhteessa ilmaan) aallonpituudella 340 nm.

5.2.2

Saatetaan puskuriliuos (3.4 kohta) huoneenlämpöiseksi (20 °C).

5.2.3

Reagenssien ja näytteen lämpötilan on oltava 20–25 °C.

5.2.4

Mitataan absorbanssi aallonpituudella 340 nm suhteessa ilmaan (eli vertailuvälissä ei optista kyvettiä).

5.2.5

Pipetoidaan seuraavan taulukon mukaisesti: Kaadetaan optisiin kyvetteihin: Kontrolli (ml) Koe (ml) Puskuriliuos (3.4 reagenssi) 1,00 1,00 NADP (3.5 reagenssi) 0,10 0,10 ATP (3.6 reagenssi) 0,10 0,10 Koeliuos (5.1.6 tai 5.1.7) — 0,10 Kahdesti tislattu vesi 2,00 1,90 Sekoitetaan ja noin 3 minuutin kuluttua mitataan liuosten absorbanssi (E1). Aloitetaan reaktio lisäämällä: HK/G6P-DH (3.7 reagenssi) 0,02 0,02 Sekoitetaan, annetaan reaktion edetä loppuun (noin 15 minuuttia) ja mitataan liuosten absorbanssi (E2). Otetaan huomioon mahdolliset jatkoreaktiot. Jos reaktio ei ole pysähtynyt 15 minuutin kuluttua, absorbanssit luetaan 5 minuutin välein, kunnes nousunopeus on vakio. Tämän jälkeen ekstrapoloidaan taaksepäin 3.7 kohdassa tarkoitetun suspension lisäämishetkeen (ks. huomautus 2).

5.2.6

Lasketaan absorbanssierot nollareagenssille ja näytteelle (E2 – E1). Vähennetään nollareagenssin absorbanssiero (ΔΕnollareagenssi) näytteen vastaavasta (ΔΕnäyte): ΔΕ = ΔΕnäyte – ΔΕnollareagenssi Tämä erotus antaa koeliuoksen glukoosipitoisuuden: Koeliuoksen sisältämä glukoosipitoisuus, g/l Gl = ((3,22 × 180,16)/(6,3 × 1 × 0,1 × 1 000)) × ΔΕ340 = 0,921 × ΔΕ340 (3,22: mitattavan liuoksen tilavuus; 1: kyvetin paksuus; 0,1: näyteliuoksen tilavuus; Glukoosin moolimassa on 180,16 (g/mol).

5.2.7

Jos mittausta ei jostakin syystä voida tehdä aallonpituudella 340 nm, se voidaan tehdä aallonpituudella 365 nm tai 334 nm, luku 6,3 edellisessä Gl:n kaavassa on sitten korvattava luvulla 3,5 tai vastaavasti luvulla 6,18.

6   LASKUTAPA JA TULOSTEN ILMAISEMINEN

a)	E = ”Tärkkelys” pitoisuus ilmaistuna g/100 g: E = ((100 × 0,9 × Gl)/(p × f))

b)	Z = ”Glukoosi” pitoisuus ilmaistuna g/100 g: Z = ((100 × Gl)/(p × f))

joissa

Gl	=	glukoosi ilmaistuna g/l (5.2.6);
f	=	laimennoskerroin (5.1.1);
p	=	näytteen paino grammoina;
0,9	=	glukoosin muunnoskerroin tärkkelykseksi.

Huomautukset:

1)	Jos koeliuosta ei voida suodattaa 5.1.7 kohdan mukaisesti, on tehtävä asianmukaiset toimenpiteet.

2)	Jos esiintyy entsyymien inhibitiota, suositellaan käytettäväksi menetelmää, jossa lisätään tunnettuja määriä puhdasta tärkkelystä.

---

(1)  U on entsyymiaktiivisuuden kansainvälinen yksikkö.

LIITE II

CN-koodeihin 3505 20 10 –3505 20 90 kuuluvien tavaroiden tärkkelysten tai dekstriinien tai muiden muunnettujen tärkkelysten pitoisuuden ja CN-koodeihin 3809 10 10 –3809 10 90 kuuluvien tavaroiden amylaasisten aineiden pitoisuuden määritys

I   PERIAATE

Tärkkelys muutetaan happohydrolyysilla pelkistäviksi sokereiksi, jotka määritetään tilavuuteen perustuen Fehlingin liuosta käyttäen.

II   VÄLINEISTÖ JA REAGENSSIT

1.

Noin 250 ml:n pullo;

2.

200 ml mittapullo;

3.

25 ml mittabyretti;

4.

Vetykloridihappo, tiheys 1,19;

5.

Kaliumhydroksidiliuos;

6.

Väriä poistava puuhiili;

7.

Fehlingin liuos;

8.

Metyleenisininen liuos (1 %).

III   MENETELMÄ

Noin 1 g tärkkelystä sisältävä näyte laitetaan 250 ml:n pulloon. Lisätään 100 ml tislattua vettä ja 2 ml vetykloridihappoa. Saatetaan kiehuvaksi ja refluksoidaan 3 tuntia.

Siirretään pullon sisältö ja huuhtelunesteet 200 ml:n mittapulloon. Jäähdytetään ja tehdään lähes neutraaliksi kaliumhydroksidiliuoksella. Lisätään tislattua vettä 200 ml:ksi ja suodatetaan pienen määrän väriä poistavan puuhiilen läpi.

Tämän jälkeen liuos kaadetaan mittabyrettiin ja pelkistetään 10 ml Fehlingin liuosta seuraavalla menetelmällä:

Noin 250 ml:n tasapohjaiseen pulloon kaadetaan 10 ml Fehlingin liuosta (5 ml liuosta A ja 5 ml liuosta B). Ravistetaan, kunnes liuos on kirkas ja lisätään 40 ml tislattua vettä ja pieni määrä kvartsia tai hohkakiveä.

Asetetaan pullo neliön muotoiselle asbestilevylle, jossa on halkaisijaltaan noin 6 cm pyöreä reikä keskellä, asbestin ollessa puolestaan metallilankaverkkopalan päällä. Kuumennetaan pulloa sellaisella nopeudella, että neste alkaa kiehua noin 2 minuutin kuluttua.

Byretistä lisätään kiehuvaan nesteeseen vähitellen sokeriliuosta, kunnes Fehlingin liuoksen sininen väri tulee tuskin havaittavaksi; sitten lisätään 2 tai 3 pisaraa metyleenisinistä liuosta indikaattoriksi ja titrataan loppuun lisäämällä edelleen sokeriliuosta tipoittain, kunnes indikaattorin sininen väri häviää.

Suurempaa tarkkuutta varten toistetaan titraus samoissa olosuhteissa, mutta lisäämällä katkoitta lähes koko määrä Fehlingin liuoksen pelkistämiseksi tarvittavasta sokeriliuoksesta. Tässä toisessa titrauksessa Fehlingin liuoksen olisi pelkistyttävä 3 minuutissa. Jatketaan kiehuttamista edelleen täsmälleen 2 minuuttia lisäten reagenssi minuutissa tipoittain kiehuvaan liuokseen, kunnes sininen väri katoaa.

Näytteen sisältämän tärkkelyksen painoprosentti määritetään seuraavalla kaavalla:

% tärkkelystä = ((T × 200 × 100)/(n × p)) × 0,95

jossa:

T	=	on vedettömän dekstroosin määrä grammoina, joka vastaa 10 ml Fehlingin liuosta (5 ml liuosta A ja 5 ml liuosta B). Tämä tiitteri vastaa 0,04945 g vedetöntä dekstroosia, kun liuos A sisältää 17,636 g kuparia litraa kohden;
n	=	on titraukseen käytetyn sokeriliuoksen ml-määrä;
p	=	on näytemäärän paino;
0,95	=	on vedettömän dekstroosin muunnostekijä tärkkelykseksi.

IV   FEHLINGIN LIUOSTEN VALMISTUS

Liuos A	:	Mittapullossa liuotetaan 69,278 g puhdasta kiteistä kuparisulfaattia – analyysilaatua (CuSO4 5H2O) – jossa ei ole rautaa, veteen ja täytetään tilavuudeksi 1 litra tislatulla vedellä. Tämän liuoksen täsmällinen pitoisuus on tarkastettava kuparin kvantitatiivisella määrityksellä.
Liuos B	:	Mittapullossa liuotetaan 100 g natriumhydroksidia ja 346 g natriumkaliumtartraattia (Rochellen suolaa) tislattuun veteen ja täytetään tilavuudeksi 1 litra tislatulla vedellä.

Nämä kaksi liuosta A ja B sekoitetaan yhtä suurina määrinä välittömästi ennen käyttöä. 10 ml Fehlingin liuosta (5 ml liuosta A ja 5 ml liuosta B) pelkistetään täysin III kohdassa kuvatuissa olosuhteissa 0,04945 g:lla vedetöntä dekstroosia.

LIITE III

Hienojen tai karkeiden vehnäjauhojen havaitseminen makaronissa, spagetissa ja vastaavissa tuotteissa (pasta)

(Youngin ja Gillesin menetelmän mukaisesti, Bernaertsin ja Grunerin muuttamana)

I   PERIAATE

Määritettävän pastanäytteen uute valmistetaan käyttäen polaaritonta liuotinta.

Tämä uute kromatografoidaan silikageelin ohutkerroksesta jakeiden eri vyöhykkeissä esiintyvien sterolien erottamiseksi.

Kirkkaanväristen vyöhykkeiden määrän mukaan on mahdollista määrittää, onko tutkittava tuote valmistettu ainoastaan durumvehnästä vai hienosta vehnäjauhosta vai näiden kahden seoksesta. On myös mahdollista määrittää, onko lisätty munia.

II   VÄLINEISTÖ JA REAGENSSIT

1.

Homogenisaattori tai jauhin rouheen saamiseksi, joka läpäisee 0,200 mm silmäisen standardiseulan;

2.

Standardiseula, jossa 0,200 mm silmäkoko;

3.

Haihdutin vesihauteella alennetussa paineessa haihduttamiseksi;

4.

Lasilevy, alumiinilevy tai muu soveltuva tausta kooltaan 20 cm × 20 cm, päällystettynä ohuella silikageelikerroksella. Jos ohutkerros on valmistettava, olisi käytettävä silikageeliä sekoitettuna noin 13 % kipsilaastin kanssa, ja se olisi levitettävä 0,25 mm kerroksena soveltuvan laitteen avulla valmistajan ohjeiden mukaisesti;

5.

Mikropipetti 20 mikrolitran mittaamiseksi;

6.

Kannellinen säiliö, joka soveltuu kromatogrammien kehittämiseen;

7.

Sumutuskoje;

8.

Petrolieetteriä, jonka kiehumispiste on välillä 40–60 °C, toistotislattuna ennen käyttöä;

9.

Vedetöntä etyylieetteriä määritystä varten;

10.

Hiilitetrakloridia kromatografiaa varten, toistotislattuna ennen käyttöä;

11.

Fosfomolybdeenihappoa määritystä varten;

12.

94° etyylialkoholia.

III   MENETELMÄ

Jauhetaan noin 20 g määritettävää näytettä siten, että se läpäisee kokonaisuudessaan seulan. Laitetaan näyte Erlenmeyer-pulloon ja peitetään 150 ml:lla petrolieetteriä. Jätetään normaaliin lämpötilaan seuraavaksi päiväksi. Ravistellaan silloin tällöin.

Tämän jälkeen suodatetaan Buchner-suppilon läpi, jossa on suodatuksen apuainetta tai sintrattu suodatin. Näin saatu kirkas liuos siirretään asteittain 100 ml:n kalibroituun pulloon. Haihdutetaan liuotin alennetussa paineessa kuumentamalla pulloa vesihauteessa 40–50 °C:ssa. Kun liuotin on haihtunut, kuumennetaan alennetussa paineessa edelleen 10 minuuttia.

Kun pullo on jäähtynyt, määritetään uutteen paino. Laimennetaan uute etyylieetterillä suhteessa 1 ml etyylieetteriä 60 mg uutetta kohden.

Aktivoidaan ohutkerrokset nostamalla niiden lämpötila 130 °C:seen 3 tunniksi. Annetaan jäähtyä silikageeliä sisältävässä eksikaattorissa. Levyt, joita ei käytetä välittömästi voidaan säilyttää samassa eksikaattorissa.

Lisätään tipoittain 20 mikrolitraa kirkasta liuosta vakioleveyksisen vyöhykkeen muodostamiseksi, pituudeltaan 3 cm, mieluiten vasta aktivoidun kerroksen päälle. Annetaan liuottimen haihtua.

Kehitetään kromatogrammi normaalissa lämpötilassa hiilitetrakloridilla käyttäen kromatogrammisäiliötä, jonka seinämät on peitetty liuottimessa liotetulla suodatinpaperilla. Noin tunnin kuluttua liuotin saavuttaa 18 cm korkeuden. Poistetaan levy ja jätetään liuotin haihtumaan avonaisesti. Vyöhykkeiden paremmin erottamiseksi kromatogrammi kehitetään toiseen kertaan. Annetaan liuottimen jälleen haihtua avonaisesti.

Sumutetaan ohut silikageelikerros etyylialkoholissa olevalla 20 % fosfomolybdeenihappoliuoksella. Kerroksen värin on oltava tasaisen keltainen. Kehitetään vyöhykkeet kuumentamalla sumutettua levyä 110 °C:ssa 5 minuuttia.

IV   KROMATOGRAMMIN TULKINTA

Jos kromatogrammissa esiintyy 1 pääasiallinen kirkasvärinen vyöhyke, jonka Rf on noin 0,4–0,5, kyseisen pastan valmistukseen käytetty vehnä on durumvehnää. Toisaalta, jos esiintyy 2 pääasiallista kirkkaudeltaan yhtäläistä vyöhykettä, käytetty raaka-aine on ollut hienoa vehnäjauhoa. Durumvehnän ja hienon vehnäjauhon seokset voidaan määrittää arvioimalla 2 vyöhykkeen suhteellista kirkkautta.

Jos esiintyy 3 vyöhykettä (löydetään 2 vyöhykettä korkeudella, jossa hienon vehnäjauhon pääasialliset vyöhykkeet sijaitsevat, sekä vyöhyke näiden välissä), pastaan on lisätty munia. Tällöin käytetty raaka-aine on durumvehnää, jos keskimmäinen vyöhyke on kirkkaampi kuin ylempi vyöhyke. Toisaalta, jos ylempi vyöhyke on keskimmäistä vyöhykettä kirkkaampi, käytetty raaka-aine on ollut hienoa vehnäjauhoa.

LIITE IV

Kumottu asetus ja sen muutos

Komission asetus (ETY) N:o 4154/87	(EYVL L 392, 31.12.1987, s. 19).
Komission asetus (EY) N:o 203/98	(EYVL L 21, 28.1.1998, s. 6).

LIITE V

Vastaavuustaulukko

Asetus (ETY) N:o 4154/87	Tämä asetus
1–4 artikla	1–4 artikla
5 artikla	—
—	5 artikla
6 artikla	6 artikla
Liitteet I, II ja III	Liitteet I, II ja III
—	Liite IV
—	Liite V