„PRILOGA I

METODE VZORČENJA

1.   NAMEN IN PODROČJE UPORABE

Vzorci za uradni nadzor krme se jemljejo v skladu s spodaj opisanimi metodami. Tako dobljeni vzorci se obravnavajo kot reprezentativni za vzorčene deleže.

Namen reprezentativnega vzorčenja je pridobiti majhen delež iz lota, pri čemer opredelitev katere koli značilnosti tega deleža pomeni srednjo vrednost značilnosti lota. Lot se vzorči tako, da se večkrat odvzamejo posamični vzorci na različnih mestih v lotu. Posamični vzorci se z mešanjem združijo v zbirni vzorec, iz katerega se pripravijo reprezentativni končni vzorci z reprezentativno delitvijo.

Če se na podlagi vizualnega pregleda deležev krme za vzorčenje ali na podlagi drugih ustreznih informacij ugotovi, da se ti po kakovosti razlikujejo od preostale krme iz istega lota, se taki deleži ločijo od preostale krme in obravnavajo kot ločeni sublot. Če krme ni mogoče razdeliti v ločene sublote, se vzorči kot en lot. V takih primerih je to treba navesti v zapisniku o vzorčenju.

Kadar se ugotovi, da krma, ki je vzorčena v skladu z določbami te uredbe, ne izpolnjuje zahtev EU in je del lota krme iz iste kategorije ali z istim opisom, se domneva, da je enako neustrezna vsa krma v zadevnem lotu, razen če po podrobni oceni ni nobenega dokaza, da preostanek lota ne izpolnjuje zahtev EU.

Vzorčenje lahko vključuje krmo, ki jo nosilci dejavnosti poslovanja s krmo ponujajo za prodajo prek sredstev za komuniciranje na daljavo v skladu s členom 11(3) Uredbe (ES) št. 767/2009 Evropskega parlamenta in Sveta (1). Za vzorčenje krme, ponujene za prodajo prek sredstev za komuniciranje na daljavo, se načeloma uporabljajo točke iz te priloge. Posebni vidiki vzorčenja vzorcev pri prodaji na daljavo so opisani v točki 11.

2.   OPREDELITEV POJMOV

—

Lot (ali serija): določena količina krme s skupnimi značilnostmi, kot so izvor, sorta, vrsta pakiranja, izvajalec pakiranja, pošiljatelj ali označevanje, in v primeru proizvodnega postopka enota proizvodnje iz posameznega obrata, pri kateri so uporabljeni enotni proizvodni parametri, ali več takšnih enot, kadar se proizvedejo v zaporednem vrstnem redu in se skupaj skladiščijo.

—	Vzorčeni delež: lot ali opredeljeni del lota oziroma sublota.

—	Zapečateni vzorec: vzorec, ki je zapečaten na način, ki preprečuje kakršen koli dostop do vzorca, pri katerem se pečat ne bi zlomil ali odstranil.

—	Posamični vzorec: količina, ki se vzame iz ene točke vzorčenega deleža.

—	Zbirni vzorec: skupek posamičnih vzorcev, vzetih iz istega vzorčenega deleža.

—	Zmanjšani vzorec: del zbirnega vzorca, pridobljen z reprezentativnim zmanjšanjem istega vzorca.

—	Končni vzorec: del zbirnega vzorca (mešan), zmanjšanega vzorca ali homogeniziranega zbirnega vzorca, odvisno od vrste nadzora (glej točko 9.4).

—	Laboratorijski vzorec: vzorec, namenjen za laboratorij (kakor ga sprejme laboratorij), in je lahko končni vzorec, zmanjšani vzorec oziroma zbirni vzorec.

—	Vzorec pri prodaji na daljavo: Vzorec lota ali serije krme, ponujene za prodajo prek sredstev za komuniciranje na daljavo.

3.   SPLOŠNE DOLOČBE

—	Vzorce jemljejo osebe, ki jih za ta namen pooblasti pristojni organ.

—	Pristojni organ prek sredstev za komuniciranje na daljavo od nosilca dejavnosti poslovanja s krmo zaprosi količino krme za vzorce pri prodaji na daljavo.

—	Vzorec mora biti zapečaten tako, da se vanj ne more poseči, ne da bi se pri tem zlomil ali odstranil pečat.

Oznaka na pečatu mora biti jasno razpoznavna in vidna.

—	Identifikacija vzorca: vzorec mora biti neizbrisno označen in identificiran tako, da je nedvoumno povezan z zapisnikom o vzorčenju.

—

Iz vsakega zbirnega vzorca ali zmanjšanega vzorca se odvzamejo naslednji končni vzorci: odvzeti se morata en vzorec za nadzor (uradni nadzor) in en za nosilca dejavnosti poslovanja s krmo (dopolnilno izvedensko mnenje). Lahko se odvzame tudi en dodatni končni vzorec za referenčne namene. Če je ves zbirni vzorec homogeniziran, se končni vzorci odvzamejo iz homogeniziranega zbirnega vzorca, razen če je tak postopek v nasprotju s pravili držav članic o pravicah nosilca dejavnosti poslovanja s krmo.

—

Kadar je to potrebno za izvajanje uradnega vzorčenja in kadar tako zahtevajo pristojni organi, nosilci dejavnosti poslovanja s krmo v skladu s členom 15, odstavka 1 in 2, Uredbe (EU) 2017/625: — osebju pristojnih organov zagotovijo dostop do opreme pod njihovim nadzorom, po potrebi vključno z dajanjem na voljo ustrezne opreme za vzorčenje in osebne zaščitne opreme, — pomagajo in sodelujejo z osebjem pristojnih organov, da omogočijo vzorčenje, vključno z dostopom osebja pristojnih organov do krme.

4.   NAPRAVA

4.1   Naprava za vzorčenje mora biti izdelana iz snovi, ki ne morejo onesnažiti proizvodov, ki se vzorčijo. Naprava, ki je namenjena večkratni uporabi, mora biti preprosta za čiščenje, da se prepreči navzkrižno onesnaženje.

4.2   Priporočena naprava za vzorčenje trdne krme.

4.2.1   Ročno vzorčenje

4.2.1.1

Lopatka za vzorčenje z ravnim dnom in navpičnimi stranicami.

4.2.1.2

Sonda za vzorčenje z dolgo režo ali razdelki. Dimenzije sonde za vzorčenje morajo ustrezati značilnostim vzorčenega deleža (globina posode, velikost vreče itd.) in velikosti delcev krme. Če ima sonda za vzorčenje več rež, morajo biti te ločene z razdelki ali zaporedno razporejenimi odprtinami, da se zagotovi, da se vzorec odvzame na različnih mestih sonde.

4.2.2   Mehansko vzorčenje

Za vzorčenje premikajoče se krme se lahko uporablja ustrezna mehanska naprava. Mehanska naprava se šteje za ustrezno, kadar se vzorči vsaj celotni del pretoka.

Vzorčenje premikajoče se krme (pri visokih hitrostih pretoka) se lahko opravi z avtomatskimi napravami za vzorčenje.

4.2.3   Razdelilnik

Če je to mogoče in primerno, se mora naprava, namenjena za delitev vzorca na približno enake dele, uporabiti za pripravo reprezentativnih zmanjšanih vzorcev.

5.   KOLIČINSKE ZAHTEVE GLEDE ŠTEVILA POSAMIČNIH VZORCEV

—

Količinske zahteve v točkah 5.1 in 5.2 glede števila posamičnih vzorcev se uporabljajo za velikosti vzorčenih deležev do največ 500 ton, ki se lahko reprezentativno vzorčijo. Opisani postopek vzorčenja velja tudi za količine, večje od predpisane največje velikosti vzorčenega deleža, če se ne upošteva največje število posamičnih vzorcev, navedeno v naslednjih tabelah v točkah 5.1.1, 5.1.3 in 5.1.5, pri čemer se število posamičnih vzorcev določi s formulo kvadratnega korena, navedeno v ustreznem delu postopka (glej točko 5.3), najmanjša velikost zbirnega vzorca pa se sorazmerno poveča. To ne onemogoča delitve večjega lota v manjše sublote, pri čemer se vsak sublot vzorči v skladu s postopkom iz točk 5.1 in 5.2.

—	Velikost vzorčenega deleža mora biti takšna, da se lahko vzorči vsak njegov sestavni del.

—	Za zelo velike lote ali sublote (> 500 ton) in za lote, ki se prevažajo ali skladiščijo tako, da ni mogoče opraviti vzorčenja v skladu s postopkom vzorčenja iz točk 5.1 in 5.2 te točke, se uporabi postopek vzorčenja iz točke 5.3.

—	Za vzorce pri prodaji na daljavo pristojni organ običajno ni seznanjen z velikostjo lota, iz katerega se zahteva količina. Zato se postopek iz točk 5.1 in 5.2 ne more uporabljati. V tem primeru se uporabi postopek, opisan v točki 11.

—

Če zakonodaja določa, da mora nosilec dejavnosti poslovanja s krmo ravnati v skladu s to uredbo v okviru obveznega sistema spremljanja, lahko nosilec dejavnosti poslovanja s krmo zaradi upoštevanja operativnih značilnosti odstopa od količinskih zahtev iz te točke, pod pogojem, da pristojnemu organu predloži dokaz o enakovrednosti postopka vzorčenja, s katerim se pristojni organ strinja.

—

V izjemnih primerih, če ni mogoče izvesti metode vzorčenja z opredeljenimi količinskimi zahtevami zaradi nesprejemljive komercialne škode lota (zaradi oblik pakiranja, prevoznih sredstev, načina skladiščenja itd.), se lahko uporabi alternativna metoda vzorčenja, če je čim bolj reprezentativna ter v celoti opisana in dokumentirana.

5.1   Količinske zahteve glede posamičnih vzorcev pri nadzoru snovi ali proizvodov, ki so enakomerno porazdeljeni po krmi

5.1.1   Razsuta trdna krma

Velikost vzorčenega deleža	Najmanjše število posamičnih vzorcev
≤ 2,5  tone	7
> 2,5  tone	√ (20 -kratnik mase v tonah vzorčenega deleža) (*1) , do največ 40 posamičnih vzorcev

5.1.2   Razsuta tekoča krma

Velikost vzorčenega deleža	Najmanjše število posamičnih vzorcev
≤ 2,5 tone ali ≤ 2 500 litrov	4  (*2)
> 2,5 tone ali > 2 500 litrov	7  (*2)

5.1.3   Pakirana krma

Krma (trdna in tekoča) je lahko pakirana v torbe, vreče, pločevinke, sode itd., ki so v naslednji tabeli navedeni kot enote. Velike enote (≥ 500 kg ali l) je treba vzorčiti v skladu z določbami za razsuto krmo (glej točki 5.1.1 in 5.1.2).

Velikost vzorčenega deleža	Najmanjše število enot, iz katerih je treba vzeti (vsaj) en posamični vzorec (*3)
1 do 20 enot	1 enota (*4)
21 do 150 enot	3 enote (*4)
151 do 400 enot	5 enot (*4)
> 400 enot	¼ √ (število enot vzorčenega deleža) (*5) , do 40 enot

5.1.4   Krmni bloki in mineralni lizalni kamni

Vzorči se najmanj en blok ali lizalni kamen na vzorčeni delež s 25 enotami, do največ štirih blokov ali lizalnih kamnov.

Pri blokih ali lizalnih kamnih, ki posamično ne tehtajo več kot 1 kg, je vsebina posamičnega vzorca en blok ali en kamen.

5.1.5   Voluminozna krma/sveža krma

Velikost vzorčenega deleža	Najmanjše število posamičnih vzorcev (*6)
≤ 5 ton	5
> 5 ton	√ (5 -kratnik mase v tonah vzorčenega deleža) (*7) , do največ 40 posamičnih vzorcev

5.2   Količinske zahteve glede posamičnih vzorcev pri nadzoru sestavin ali snovi, za katere obstaja verjetnost, da so neenakomerno porazdeljene po krmi

Te količinske zahteve glede posamičnih vzorcev se morajo uporabljati v naslednjih okoliščinah:

—	nadzor nad aflatoksini, rženimi rožički, drugimi mikotoksini in škodljivimi botaničnimi nečistočami v posamičnih krmilih,

—	nadzor nad navzkrižnim onesnaženjem s sestavino, vključno z gensko spremenjenimi snovmi, ali snovjo, za katero obstaja verjetnost, da je neenakomerno porazdeljena po krmi.

Če nadzorni organ utemeljeno sumi, da velja taka neenakomerna porazdelitev tudi v primeru navzkrižnega onesnaženja s sestavino ali snovjo v krmni mešanici, se lahko uporabijo količinske zahteve iz naslednje tabele.

Velikost vzorčenega deleža	Najmanjše število posamičnih vzorcev
< 80 ton	Glej količinske zahteve iz točke 5.1. Število posamičnih vzorcev, ki jih je treba vzeti, je treba pomnožiti z 2,5.
≥ 80 ton	100

5.3   Količinske zahteve glede posamičnih vzorcev v primeru zelo velikih lotov

V primeru velikih vzorčenih deležev (vzorčeni deleži > 500 ton) je treba vzeti 40 posamičnih vzorcev + √ton pri nadzoru snovi ali proizvodov, ki so enakomerno porazdeljeni po krmi, ali 100 posamičnih vzorcev + √ton pri nadzoru sestavin ali snovi, za katere obstaja verjetnost, da so neenakomerno porazdeljene po krmi.

6.   KOLIČINSKE ZAHTEVE GLEDE ZBIRNEGA VZORCA

Zahteva se en zbirni vzorec na vzorčeni delež.

	Vrsta krme	Najmanjša velikost zbirnega vzorca (*8)  (*9)
6.1	Razsuta krma:	4 kg
6.2	Pakirana krma:	4 kg (*10)
6.3	Tekoča ali poltekoča krma:	4 litri
6.4	Krmni bloki ali mineralni lizalni kamni:
6.4.1	mase več kot 1 kg po kosu	4 kg
6.4.2	mase največ 1 kg po kosu	masa štirih izvirnih blokov ali lizalnih kamnov
6.5	Voluminozna krma/sveža krma:	4 kg (*11)

7.   KOLIČINSKE ZAHTEVE GLEDE KONČNIH VZORCEV

Končni vzorci

Zahteva se analiza vsaj enega končnega vzorca. Količina končnega vzorca za analizo ne sme biti manjša od:

Trdna krma	500  g (*12)  (*13)  (*14)  (*15)
Tekoča ali poltekoča krma	500  ml (*12)

8.   METODA VZORČENJA ZA ZELO VELIKE LOTE ALI LOTE, KI SE SKLADIŠČIJO ALI PREVAŽAJO TAKO, DA NI MOGOČE VZORČENJE PO CELOTNEM LOTU

8.1   Splošna načela

Če način prevoza ali skladiščenja lota ne omogoča odvzema posamičnih vzorcev po celotnem lotu, se vzorčenje takih lotov po možnosti opravi ob pretoku lota.

V primeru velikih skladišč, namenjenih skladiščenju krme, je treba nosilce dejavnosti spodbujati, da v skladišče vgradijo opremo, ki omogoča (avtomatsko) vzorčenje celotnega skladiščenega lota.

Če se uporabljajo postopki vzorčenja, določeni v tej točki, se nosilec dejavnosti poslovanja s krmo obvesti o postopku vzorčenja. Če nosilec dejavnosti poslovanja s krmo ali njegov predstavnik izrazi dvom o postopku vzorčenja, pristojnemu organu omogoči, da na njegove stroške vzorči celotni lot.

8.2   Veliki loti, ki se prevažajo z ladjo

8.2.1   Dinamično vzorčenje velikih lotov, ki se prevažajo z ladjo

Vzorčenje velikih lotov na ladjah se po možnosti izvaja med samim pretokom proizvoda (dinamično vzorčenje).

Vzorčenje se izvaja po posamičnih ladijskih skladiščih (fizično ločenih enotah). Ladijska skladišča se sicer praznijo drugo za drugo tako, da po prenosu v skladiščne prostore prvotne fizične ločitve ni več. Vzorčenje se zato lahko izvede glede na začetno fizično ločitev ali glede na ločitev po izvedenem prenosu v skladiščne prostore.

Raztovarjanje ladje lahko traja več dni. Običajno je treba vzorčenje izvesti v rednih presledkih med celotnim trajanjem raztovarjanja. Vendar ni vedno mogoče ali primerno, da je uradni inšpektor prisoten za vzorčenje med celotnim trajanjem raztovarjanja. Zato je dovoljeno vzorčenje za del (vzorčeni delež) celotnega lota. Število posamičnih vzorcev se določi ob upoštevanju velikosti vzorčenega deleža.

V primeru vzorčenja dela lota krme iz iste kategorije ali z istim opisom, za katerega je ugotovljeno, da ne izpolnjuje zahtev EU, se domneva, da je enako neustrezna vsa krma v zadevnem lotu, razen če po podrobni oceni ni nobenega dokaza, da preostanek lota ne izpolnjuje zahtev EU.

Inšpektor mora biti prisoten tudi, če se uradni vzorec odvzame avtomatsko. Pri avtomatskem vzorčenju s prednastavljenimi parametri, ki jih ni mogoče spremeniti med vzorčenjem, in če se posamični vzorci zbirajo v zapečateni zbiralni posodi, da se preprečijo morebitne goljufije, mora biti inšpektor prisoten le na začetku vzorčenja, vsakokrat, ko je treba zamenjati posodo za zbiranje vzorcev, in na koncu vzorčenja.

8.2.2   Statično vzorčenje lotov, ki se prevažajo z ladjo

Če se izvaja statično vzorčenje, je treba uporabiti enak postopek, kot je določen za skladiščne prostore (silose), ki so dostopni od zgoraj (glej točko 8.4.1).

Vzorčenje je treba izvajati na dostopnem delu (od zgoraj) lota/ladijskega skladišča. Število posamičnih vzorcev se določi ob upoštevanju velikosti vzorčenega deleža. V primeru vzorčenja dela lota krme iz iste kategorije ali z istim opisom, za katerega je ugotovljeno, da ne izpolnjuje zahtev EU, se domneva, da je enako neustrezna vsa krma v zadevnem lotu, razen če po podrobni oceni ni nobenega dokaza, da preostanek lota ne izpolnjuje zahtev EU.

8.3   Vzorčenje velikih lotov, ki se skladiščijo v skladiščih

Vzorčenje je treba izvajati na dostopnem delu lota. Število posamičnih vzorcev se določi ob upoštevanju velikosti vzorčenega deleža. V primeru vzorčenja dela lota krme iz iste kategorije ali z istim opisom, za katerega je ugotovljeno, da ne izpolnjuje zahtev EU, se domneva, da je enako neustrezna vsa krma v zadevnem lotu, razen če po podrobni oceni ni nobenega dokaza, da preostanek lota ne izpolnjuje zahtev EU.

8.4   Vzorčenje skladiščnih prostorov (silosov)

8.4.1   Vzorčenje silosov, (zlahka) dostopnih od zgoraj

Vzorčenje je treba izvajati na dostopnem delu lota. Število posamičnih vzorcev se določi ob upoštevanju velikosti vzorčenega deleža. V primeru vzorčenja dela lota krme iz iste kategorije ali z istim opisom, za katerega je ugotovljeno, da ne izpolnjuje zahtev EU, se domneva, da je enako neustrezna vsa krma v zadevnem lotu, razen če po podrobni oceni ni nobenega dokaza, da preostanek lota ne izpolnjuje zahtev EU.

8.4.2   Vzorčenje silosov, ki niso dostopni od zgoraj (zaprti silosi)

8.4.2.1   Silosi, ki niso dostopni od zgoraj (zaprti silosi), velikosti > 100 ton

Krme, ki se skladišči v takih silosih, ni mogoče statično vzorčiti. Če je treba krmo v silosu vzorčiti in pošiljke ni mogoče premakniti, se je treba z nosilcem dejavnosti dogovoriti, da inšpektorja obvesti, kdaj se bo silos raztovoril, da se omogoči vzorčenje med pretokom krme.

8.4.2.2   Silosi, ki niso dostopni od zgoraj (zaprti silosi), velikosti < 100 ton

Postopek vzorčenja vključuje prenos od 50 kg do 100 kg krme v zbiralno posodo in odvzem vzorca iz nje. Velikost zbirnega vzorca ustreza celotnemu lotu, število posamičnih vzorcev pa je povezano s količino iz silosa, preneseno v zbiralno posodo za vzorčenje. V primeru vzorčenja dela lota krme iz iste kategorije ali z istim opisom, za katerega je ugotovljeno, da ne izpolnjuje zahtev EU, se domneva, da je enako neustrezna vsa krma v zadevnem lotu, razen če po podrobni oceni ni nobenega dokaza, da preostanek lota ne izpolnjuje zahtev EU.

8.5   Vzorčenje razsute krme v velikih zaprtih zabojnikih

Taki loti se pogosto lahko vzorčijo šele ob raztovarjanju. V nekaterih primerih ni mogoče opraviti raztovarjanja na točki uvoza ali kontrolni točki, zato se mora vzorčenje izvesti ob raztovarjanju takih zabojnikov.

9.   NAVODILA ZA JEMANJE, PRIPRAVO IN PAKIRANJE VZORCEV

9.1   Splošno

Vzorci se morajo jemati in pripravljati brez nepotrebnega odlašanja, pri tem pa se morajo upoštevati vsi potrebni previdnostni ukrepi za preprečitev spremembe ali onesnaženja proizvoda. Instrumenti ter površine in zabojniki, namenjeni za sprejem vzorcev, morajo biti čisti in suhi.

9.2   Posamični vzorci

Posamične vzorce je treba vzeti naključno in enakomerno porazdeljeno iz celotnega vzorčenega deleža ter morajo biti približno enako veliki.

Velikost posamičnega vzorca je najmanj 100 g oziroma 25 g v primeru voluminozne krme/sveže krme z majhno specifično gostoto.

Če je treba v skladu s pravili za postopek vzorčenja iz točke 8 vzeti manj kot 40 posamičnih vzorcev, se velikost posamičnih vzorcev določi glede na zahtevano velikost zbirnega vzorca (glej točko 6).

Če se vzorčijo majhni loti pakirane krme, pri katerih je treba v skladu s količinskimi zahtevami vzeti omejeno število posamičnih vzorcev, je vsebina posamičnega vzorca ena izvirna enota, ki ne presega 1 kg ali 1 litra.

Če se vzorči pakirana krma, ki je sestavljena iz majhnih enot (npr. < 250 g), je velikost posamičnega vzorca odvisna od velikosti enote.

V primeru vzorcev pri prodaji na daljavo je velikost posamičnega vzorca odvisna od velikosti enote in lahko vsebuje manj kot 100 g ali 100 ml v posameznih primerih.

9.2.1   Razsuta krma

Kadar je ustrezno, se lahko vzorčenje opravi med premikanjem (natovarjanjem ali raztovarjanjem) vzorčenega deleža.

9.2.2   Pakirana krma

Po izbiri zahtevanega števila enot za vzorčenje, kot je navedeno v točki 5, se del vsebine vsake enote odstrani s sondo ali lopatko. Po potrebi se enote izpraznijo ločeno in šele nato odvzamejo vzorci.

9.2.3   Homogenizirana ali za homogeniziranje primerna tekoča ali poltekoča krma

Po izbiri zahtevanega števila enot za vzorčenje, kot je navedeno v točki 5, se vsebina po potrebi homogenizira in iz vsake enote se odvzame določena količina.

Posamični vzorci se lahko odvzamejo, ko se enota izprazni.

9.2.4   Tekoča ali poltekoča krma, ki ni primerna za homogeniziranje

Po izbiri zahtevanega števila enot za jemanje vzorcev, kot je navedeno v točki 5, se vzorci odvzamejo z različnih ravni.

Vzorci se lahko odvzamejo tudi, ko se enota prazni, vendar se prvi deli zavržejo.

Vsa odvzeta količina v nobenem primeru ne sme biti manjša od 10 litrov.

9.2.5   Krmni bloki in mineralni lizalni kamni

Po izbiri zahtevanega števila blokov ali lizalnih kamnov za vzorčenje, kot je navedeno v točki 5, se odvzame del vsakega bloka ali lizalnega kamna. Če obstaja sum, da je blok ali lizalni kamen nehomogeniziran, se lahko kot vzorec vzame cel blok ali lizalni kamen.

Pri blokih ali lizalnih kamnih, ki posamično ne tehtajo več kot 1 kg, je vsebina posamičnega vzorca en blok ali en kamen.

9.3   Priprava zbirnih vzorcev

Posamični vzorci se zmešajo, da sestavljajo zbirni vzorec.

9.4   Priprava končnih vzorcev

Material v zbirnem vzorcu se previdno zmeša (2).

Vsak vzorec se shrani v ustrezen zabojnik/zbiralno posodo. Sprejeti je treba vse potrebne previdnostne ukrepe, da se med prevozom ali skladiščenjem prepreči kakršna koli sprememba sestave vzorca, onesnaženje ali mešanje.

9.4.1   Enakomerno porazdeljene snovi

Pri nadzoru sestavin ali snovi, ki so enakomerno porazdeljene po krmi, se lahko zbirni vzorec reprezentativno zmanjša na vsaj 2,0 kg ali 2,0 l (zmanjšani vzorec) (3), po možnosti z uporabo mehanskega ali avtomatskega razdelilnika. Za nadzor nad vsebnostjo ostankov pesticidov v stročnicah, žitnih zrnih in lupinarjih je najmanjša velikost zmanjšanega vzorca 3 kg. Če zaradi vrste krme ni mogoče uporabiti razdelilnika ali če ta ni na voljo, se lahko vzorec zmanjša z metodo četrtinjenja.

Iz zbirnih vzorcev ali zmanjšanih vzorcev se nato odvzamejo končni vzorci (za uradni nadzor, dopolnilno izvedensko mnenje in morebitne referenčne namene) približno enake količine, ki izpolnjujejo količinske zahteve iz točke 7.

9.4.2   Neenakomerno porazdeljene snovi

Pri nadzoru sestavin, vključno z gensko spremenjenimi snovmi, ali snovi, za katere obstaja verjetnost, da so neenakomerno porazdeljene po krmi, se zbirni vzorec:

(i)	popolnoma homogenizira. Nato se iz homogeniziranega zbirnega vzorca odvzamejo končni vzorci (za uradni nadzor, dopolnilno izvedensko mnenje in morebitne referenčne namene) približno enake količine, ki izpolnjujejo količinske zahteve iz točke 7, ali

(ii)

zmanjša na najmanj 2 kg ali 2 l (4) z uporabo mehanskega ali avtomatskega razdelilnika. Samo v primeru, ko zaradi vrste krme ni mogoče uporabiti razdelilnika, se vzorec po potrebi lahko zmanjša z metodo četrtinjenja. Pri nadzoru glede prisotnosti gensko spremenjenih snovi v okviru Uredbe (EU) št. 619/2011 mora zmanjšani vzorec vsebovati najmanj 35 000 semen/zrn, da se lahko pridobijo končni vzorci za uradni nadzor, dopolnilno izvedensko mnenje in morebitne referenčne namene, ki vsebujejo najmanj 10 000 semen/zrn (glej opombo (**) v točki 6 in opombo (*) v točki 7).

Iz zmanjšanega vzorca se nato odvzamejo končni vzorci približno enake količine, ki izpolnjujejo količinske zahteve iz točke 7.

9.5   Pakiranje vzorcev

Zabojniki ali pakiranja se zapečatijo in označijo z etiketami tako, da jih ni mogoče odpreti, ne da bi se pri tem poškodoval pečat. Celotna etiketa mora biti vključena v pečat. Lahko pa se vzorec položi tudi v sprejemno posodo, ki se lahko zapre tako, da je ni mogoče odpreti, ne da bi se pri tem nepopravljivo poškodovala zbiralna posoda ali zabojnik, s čimer se prepreči ponovna uporaba zbiralne posode ali zabojnika.

9.6   Pošiljanje vzorcev v laboratorij

Vzorec se brez nepotrebnega odlašanja pošlje v pooblaščeni analizni laboratorij skupaj z vsemi informacijami, ki jih potrebuje oseba, ki izvaja analizo.

10.   ZAPISNIK O VZORČENJU

Ob odvzemu vzorca se napiše zapisnik o vzorčenju, ki omogoča nedvoumno prepoznavanje vsakega vzorčenega deleža in njegove velikosti.

V zapisniku je treba navesti tudi kakršno koli odstopanje od postopka vzorčenja, določenega v tej uredbi.

Izvod zapisnika prejme laboratorij za uradni nadzor ter nosilec dejavnosti poslovanja s krmo in/ali laboratorij, ki ga določi nosilec dejavnosti poslovanja s krmo.

11.   VZOREC PRI PRODAJI NA DALJAVO

—

Od nosilca dejavnosti poslovanja s krmo se prek sredstev za komuniciranje na daljavo zaprosi krma za vzorce pri prodaji na daljavo. V tem primeru se pristojnemu organu, ko zahteva krmo, nosilcu dejavnosti poslovanja s krmo ni treba identificirati z uradno identiteto in lahko uporabi tudi skrivno identiteto.

—

Zbirni vzorec in končni vzorci iz vzorca pri prodaji na daljavo morajo biti odvzeti takoj, ko osebe, ki so pooblaščene za ta namen, prejmejo pošiljko. Za pripravo zbirnega vzorca je treba naključno in enakomerno porazdeljeno iz skupne dobljene in previdno zmešane/homogenizirane količine odvzeti ustrezno število posamičnih vzorcev v skladu, kolikor je to mogoče, z načeli iz točke 5 ter točk 9.2 in 9.3. Če je krma pakirana v posamičnih enotah je treba pridobiti vsaj 4 enote, iz katerih je treba odvzeti vsaj en posamični vzorec. Če se izkaže za vsak primer posebej, da pridobljene enote izhajajo iz različnih lotov, se mora število enot, ki jih je treba vzorčiti, zmanjšati in omejiti na tiste enote, ki izvirajo iz istega lota. V primeru analize vzorca pri prodaji na daljavo za sestavine ali snovi, ki niso enakomerno porazdeljene po krmi, mora biti število posamičnih vzorcev vsaj 2,5-krat večje kot za vzorce, ki se analizirajo za snovi, enakomerno porazdeljene po celotni krmi. Iz zbirnega vzorca se nato odvzamejo ustrezni končni vzorci (za uradni nadzor, dopolnilno izvedensko mnenje in morebitne referenčne namene) v skladu, kolikor je to izvedljivo, z načeli iz točke 9.4, v zapisniku o vzorčenju pa je navedeno, da gre pri vzorcu za vzorec pri prodaji na daljavo. Pristojni organ nato nosilca dejavnosti poslovanja s krmo nemudoma obvesti o vzorčenju. Nosilca dejavnosti poslovanja s krmo se obvesti tudi, da pristojni organ, kadar je mogoče, obdrži en vzorec (za dopolnilno izvedensko mnenje), ki jim je na voljo, in sicer na opredeljeni lokaciji za dopolnilno izvedensko mnenje, ali da se pošlje nosilcu dejavnosti poslovanja s krmo ali da se pošlje laboratoriju, ki ga določi nosilec dejavnosti poslovanja s krmo v skladu z veljavnimi nacionalnimi pravili. Če se vzorec pošlje neposredno uradnemu laboratoriju, morajo končni vzorec v laboratoriju pripraviti in zapečatiti osebe, ki so pooblaščene za ta namen, ali v prisotnosti oseb, ki so pooblaščene za ta namen. Zapisnik o vzorčenju vzorca pri prodaji na daljavo je treba takoj po oblikovanju končnih vzorcev poslati pristojnemu organu, ki nosilca dejavnosti poslovanja s krmo obvesti o vzorčenju. Šteje se, da količina, ki jo nosilec dejavnosti poslovanja s krmo pošlje pristojnemu organu, predstavlja del lota krme iz iste kategorije ali z istim opisom. V skladu s členom 15 Uredbe (ES) št. 178/2002 Evropskega parlamenta in Sveta (5), če se za navedeni lot ugotovi, da ne izpolnjuje zahtev EU, se domneva, tudi v primeru vzorca pri prodaji na daljavo, da je enako neustrezna vsa krma v zadevnem lotu, razen če po podrobni oceni (kadar je ustrezno, z inšpekcijo na kraju samem) ni nobenega dokaza, da preostanek lota ne izpolnjuje zahtev EU.

„PRILOGA II

SPLOŠNE DOLOČBE O ANALIZNIH METODAH ZA KRMO

A.   PRIPRAVA VZORCEV ZA ANALIZO

1.   Namen

Postopki, opisani v tej prilogi, zadevajo pripravo vzorcev za analizo, ki se pošljejo kontrolnim laboratorijem po vzorčenju v skladu z določbami iz Priloge I.

Laboratorijski vzorci se morajo pripraviti tako, da so natehtane količine, določene za analizne metode, homogene in reprezentativne za končne vzorce.

Poleg postopkov, opisanih v tej prilogi, se upoštevajo tudi smernice za pripravo vzorca, kot so določene v standardu EN ISO 6498.

2.   Previdnostni ukrepi

Postopek za pripravo vzorca je odvisen od uporabljene analizne metode in od sestavin ali snovi, ki se nadzirajo. Zato je zelo pomembno, da je postopek za pripravo vzorca primeren za uporabljeno analizno metodo in sestavine ali snovi, ki se nadzirajo.

Vse potrebne operacije se morajo izvesti tako, da se čim bolj preprečita onesnaženje vzorca in sprememba njegove sestave.

Mletje, mešanje in presejanje se izvedejo brez odlašanja, tako da je vzorec čim manj izpostavljen zraku in svetlobi. Uporaba mlinov in drobilcev, pri katerih se vzorec močno segreje, ni dovoljena.

Krmo, ki je posebej občutljiva na toploto, je priporočljivo drobiti ročno. Pri delu z napravo se zagotovi, da ta ni vir onesnaženja.

Izkazalo se je, da homogenizacija vzorca s pripravo suspenzije z visokostrižnim mešalnikom z vodo v nekaterih primerih zagotavlja bolj homogene podvzorce kot suha homogenizacija/mletje, zlasti v primeru heterogeno porazdeljenih kemijskih snovi. Vendar tudi homogenizacija z zadostno suhim mletjem lahko zagotovi homogene podvzorce.

V nekaterih primerih, na primer za določanje rženih rožičkov, škodljivih botaničnih nečistoč itd., homogenizacija vzorca ni mogoča z mletjem, temveč z zadostnim mešanjem vzorca.

Če pri pripravi ni mogoče preprečiti bistvene spremembe vsebnosti vlage v vzorcu, je treba v skladu z metodo iz dela A Priloge III določiti vsebnost vlage pred pripravo in po njej.

3.   Postopek

3.1   Splošni postopek

Iz končnega homogeniziranega vzorca se odvzame testni alikvot. Stožčasta delitev vzorca ali delitev vzorca v četrtine nista priporočljivi, ker se lahko pojavijo hude napake v delitvi testnih alikvotov.

3.1.1   Krma, ki jo je mogoče mleti kot tako

—	Končni vzorec se premeša in zbere v primerno čisto in suho posodo z neprepustnim zamaškom. Tik preden se natehta količina za analizo (testni alikvot), se vzorec še enkrat premeša, da se zagotovi popolna homogenizacija.

3.1.2   Krma, ki jo je mogoče mleti po sušenju

—	Če v analizni metodi ni navedeno drugače, se končni vzorec v skladu s postopkom za predhodno sušenje iz točke 4.3 metode za določanje vsebnosti vlage iz dela A Priloge III suši toliko časa, da se vsebnost vlage zniža na 8–12 %. Nato se nadaljuje, kakor je navedeno v točki 3.1.1.

3.1.3   Tekoča ali poltekoča krma

—	Končni vzorec se zbere v primerno čisto in suho posodo z neprepustnim zamaškom. Tik preden se natehta količina za analizo (testni alikvot), se vzorec še enkrat dobro premeša, da se zagotovi popolna homogenizacija.

3.1.4   Druga krma

—	Končni vzorci, ki se ne morejo pripraviti v skladu z enim izmed zgoraj navedenih postopkov, se obdelajo po katerem koli drugem postopku, ki zagotavlja, da bo količina vzorca, natehtana za analizo (testni alikvot), homogena in reprezentativna za končne vzorce.

3.2   Poseben postopek v primeru vizualnega pregleda ali mikroskopije ali kadar je homogeniziran celoten zbirni vzorec

—	V primeru vizualnega pregleda (brez uporabe mikroskopa) se za pregled uporabi celoten zbirni ali končni vzorec.

—	V primeru mikroskopskega pregleda lahko laboratorij zmanjša zbirni vzorec ali dodatno zmanjša zmanjšani vzorec. Končni vzorci za dopolnilno izvedensko mnenje in morebitne referenčne namene se odvzamejo v skladu s postopkom, ki je enakovreden postopku za jemanje končnega vzorca za uradni nadzor.

—	Če je celoten zbirni vzorec homogeniziran, se končni vzorci odvzamejo iz homogeniziranega zbirnega vzorca.

—

Za določitev rženega rožička in škodljivih botaničnih nečistoč se mora končni vzorec razdeliti na 2 podvzorca z enako maso po približno 500 gramov. Pregleda se en podvzorec. Če je rezultat podvzorcev enak ali manjši od 50 % (analizni prag) mejne vrednosti, je vzorec skladen z mejno vrednostjo. Če je rezultat nad 50 % mejne vrednosti, je treba pregledati še en podvzorec in za preverjanje skladnosti z mejno vrednostjo uporabiti povprečje rezultatov dveh podvzorcev.

4.   Shranjevanje vzorcev

Vzorci se morajo hraniti pri temperaturi, ki ne bo spremenila njihove sestave. Vzorci, namenjeni za analizo vitaminov ali snovi, ki so posebno občutljive na svetlobo, se hranijo pod pogoji, ki preprečujejo škodljiv učinek svetlobe na vzorec.

B.   DOLOČBE O REAGENTIH IN NAPRAVI, KI SE UPORABLJAJO PRI ANALIZNIH METODAH

1.

Če v analiznih metodah ni posebej določeno, morajo biti vsi reagenti za analizo analizno čisti (a.č.). Pri analiziranju sledov se mora čistost reagentov preveriti s slepim preskusom. Glede na dobljene rezultate je morda potrebno dodatno čiščenje reagentov.

2.

Pri vseh postopkih analiznih metod, ki vključujejo pripravo raztopin, razredčevanje, spiranje ali izpiranje in pri katerih vrsta uporabljenega topila ali razredčila ni navedena, se mora uporabiti voda. Praviloma je voda demineralizirana ali destilirana. V posameznih primerih, ki so posebej navedeni v analiznih metodah, jo je treba prečistiti s posebnimi postopki.

3.

V zvezi z opremo, ki je običajno v kontrolnih laboratorijih, so pri analiznih metodah navedeni le posebni instrumenti in naprave ali tisti, ki zahtevajo posebno uporabo. Biti morajo čisti, zlasti pri določanju zelo majhnih količin snovi.

C.   UPORABA ANALIZNIH METOD IN PRIKAZ REZULTATOV

1.   Postopek ekstrakcije

Pri številnih metodah je določen poseben postopek ekstrakcije. Praviloma se lahko uporabijo postopki ekstrakcije, ki se razlikujejo od postopka iz metode, če je za uporabljeni postopek učinkovitost ekstrakcije za analiziran matriks dokazano enakovredna postopku iz metode.

2.   Postopek čiščenja

Pri številnih metodah je določen poseben postopek čiščenja. Praviloma se lahko uporabijo drugi postopki čiščenja, ki se razlikujejo od postopka iz metode, če je za uporabljeni postopek analizna učinkovitost čiščenja za analiziran matriks dokazano enakovredna postopku iz metode.

3.   Število določanj

Če je pri analizi nezaželenih snovi rezultat prvega določanja bistveno (> 50 %) nižji od specifikacije, ki se nadzira, dodatna določanja niso potrebna, če so bili uporabljeni ustrezni postopki kakovosti. V drugih primerih je potrebna dvakratna analiza (drugo določanje), da se izključi možnost internega navzkrižnega onesnaženja ali naključne zamenjave vzorcev. Za nadaljnjo oceno se uporabi povprečje dveh določanj.

Če so pri nadzoru minimalnih ali maksimalnih ravni krmnih dodatkov rezultati prvega določanja nad minimalno ravnjo ali pod maksimalno ravnjo, dodatna določanja niso potrebna, če so bili uporabljeni ustrezni postopki kakovosti. V drugih primerih je potrebna dvakratna analiza (drugo določanje), da se izključi možnost internega navzkrižnega onesnaženja ali naključne zamenjave vzorcev. Za nadaljnjo oceno se uporabi povprečje dveh določanj.

Pri nadzoru navedene vsebnosti snovi ali sestavine, če rezultat prvega določanja potrdi navedeno vsebnost, tj. rezultat analize je znotraj sprejemljivih meja odstopanja navedene vsebnosti, dodatna določanja niso potrebna, če so bili uporabljeni ustrezni postopki kakovosti. V drugih primerih je potrebna dvakratna analiza (drugo določanje), da se izključi možnost internega navzkrižnega onesnaženja ali naključne zamenjave vzorcev. Za nadaljnjo oceno se uporabi povprečje dveh določanj (povprečni rezultat analize je znotraj sprejemljivih meja odstopanja navedene vsebnosti ali ne).

V nekaterih primerih so te sprejemljive meje odstopanja opredeljene v zakonodaji, ko sta Uredba (ES) št. 767/2009 in Uredba (EU) 2019/4 Evropskega parlamenta in Sveta (1).

4.   Poročanje o uporabljeni analizni metodi

V poročilu o analizi se navede uporabljena analizna metoda.

5.   Poročanje o rezultatih analize

Rezultat analize se prikaže tako, kakor je navedeno v analizni metodi, na primerno število decimalnih mest, in se po potrebi popravi glede na vsebnost vlage v končnem vzorcu pred pripravo.

Večina regulativnih ravni (npr. maksimalna raven, minimalna raven) v zakonodaji EU o krmi je določena glede na krmo z vsebnostjo vlage 12 %. Zato je treba v teh primerih za ocenitev rezultata analize, izmerjen na vzorcu glede na regulativno raven, rezultat analize najprej deliti z vsebnostjo suhe snovi v vzorcu (v %), pomnoženo z 88, kot je navedeno v naslednji formuli:

pri čemer je:

Mc	:	vsebnost vlage v vzorcu (v %). 100 – Mc tako predstavlja vsebnost suhe snovi v vzorcu (v %).
Rana	:	rezultat analize, izmerjen na vzorcu.
R12 %	:	rezultat za krmo z vsebnostjo vlage 12 %; oceni se glede na regulativno raven.

Poleg tega, če so izpolnjeni naslednji pogoji:

—	rezultat analize je bistveno (> 50 %) nižji ali višji od označenih informacij/specifikacije, ki se nadzira(-jo) (odvisno od tega, ali je na označenih informacijah/v specifikaciji navedena maksimalna ali minimalna raven),

—

vsebnost vlage v vzorčeni krmi je znana in lahko se določi, da popravek za vsebnost vlage ne bo spremenil ocene; potem se pod pogojem, da se uporabijo ustrezni postopki kakovosti in analiza služi samo preverjanju skladnosti s pravnimi določbami, popravek za vsebnost vlage lahko izpusti (npr. v primerih, kadar ni specifikacije ali regulativne ravni), razen če se zahteva za interpretacijo.

Če se rezultat analize popravi za vsebnost vlage, se mora v istem postopku popraviti tudi ustrezna merilna negotovost.

V primeru določanja rženega rožička ali škodljivih botaničnih nečistoč z vizualnim/mikroskopskim pregledom popravek za vsebnost vlage ni potreben.

6.   Analizna merilna negotovost in stopnja izkoristka pri analizi nezaželenih snovi

V zvezi z nezaželenimi snovmi po Direktivi 2002/32/ES se proizvod, namenjen za krmo, šteje za neskladnega z določeno najvišjo vsebnostjo, če rezultat analize kot povprečje dveh neodvisnih določanj za krmo z vsebnostjo vlage 12 % presega najvišjo vsebnost ob upoštevanju razširjene merilne negotovosti z uporabo faktorja zajetja 2, ki pomeni stopnjo zaupanja približno 95 %, in popravka za izkoristek. To pomeni, da se za oceno skladnosti uporabi analizirana koncentracija, popravljena za izkoristek, od katere se odšteje razširjena analizna merilna negotovost. Ta postopek se uporablja samo v primerih, kadar analizna metoda omogoča oceno razširjene analizne merilne negotovosti in popravka za izkoristek (npr. se ne zahteva v primeru vizualnega/mikroskopskega pregleda).

Če rezultat analize vzorca, odvzetega za dopolnilno izvedensko mnenje, presega najvišjo vsebnost (brez upoštevanja razširjene analizne merilne negotovosti), to potrjuje neskladnost, ugotovljeno s kontrolnim vzorcem, če ne obstajajo specifična nacionalna pravila v zvezi s tem.

O rezultatu analize se poroča (če uporabljena analizna metoda omogoča oceno razširjene analizne merilne negotovosti) na naslednji način:

(a)

kadar je to primerno in ustrezno, se mora navesti popravek za izkoristek in kdaj je bil ta popravek opravljen. Stopnjo izkoristka je treba navesti, razen če je dejanski popravek zaradi odstopanja del postopka, pri čemer je odstopanje razlika med izmerjeno vrednostjo in referenčno koncentracijo. Popravek za izkoristek ni potreben, če je stopnja izkoristka med 90–110 %;

(b)	kot ‚x +/– U‘, pri čemer je x rezultat analize in U razširjena analizna merilna negotovost, ob uporabi faktorja za zajetje 2 (2), zaradi katerega je stopnja zaupanja približno 95-odstotna.

Vendar če je rezultat analize bistveno (> 50 %) nižji od specifikacije, ki se nadzira, in je bil uporabljen ustrezni postopek kakovosti ter je namen analize le preverjanje skladnosti z zakonodajnimi določbami, se lahko poročanje o stopnji izkoristka in razširjeni analizni merilni negotovosti izpusti (npr. v primerih, kadar ni specifikacije ali regulativne ravni), razen če je merilna negotovost potrebna za interpretacijo.

7.   Analizna merilna negotovost in stopnja izkoristka pri analizi vsebnosti krmnih dodatkov

Za preverjanje skladnosti z odobreno najnižjo in najvišjo vsebnostjo krmnih dodatkov se prisotnost krmnega dodatka šteje za neskladno z določeno najnižjo in najvišjo vsebnostjo, če se za rezultat analize kot povprečja dveh neodvisnih določanj glede na krmo z vsebnostjo vlage 12 % šteje:

—

da presega najvišjo vsebnost, ob upoštevanju razširjene analizne merilne negotovosti in popravka za izkoristek. To pomeni, da se za oceno skladnosti uporabi analizirana koncentracija (tj. povprečje dveh določanj), popravljena za izkoristek, od katere se odšteje razširjena analizna merilna negotovost,

—

da je nižji od najnižje vsebnosti, ob upoštevanju razširjene analizne merilne negotovosti in popravka za izkoristek. To pomeni, da se za oceno skladnosti uporabi analizirana koncentracija (tj. povprečje dveh določanj), popravljena za izkoristek, ki se ji prišteje razširjena analizna merilna negotovost.

Če rezultat analize vzorca, odvzetega za dopolnilno izvedensko mnenje, presega najvišjo vsebnost (brez upoštevanja razširjene analizne merilne negotovosti), to potrjuje neskladnost, ugotovljeno s kontrolnim vzorcem, če ne obstajajo specifična nacionalna pravila v zvezi s tem.

O rezultatu analize se poroča (če uporabljena analizna metoda omogoča oceno razširjene analizne merilne negotovosti) na naslednji način:

(a)

kadar je to primerno in ustrezno, se mora navesti popravek za izkoristek in kdaj je bil ta popravek opravljen. Stopnjo izkoristka je treba navesti, razen če je dejanski popravek zaradi odstopanja del postopka, pri čemer je odstopanje razlika med izmerjeno vrednostjo in referenčno koncentracijo. Popravek za izkoristek ni potreben, če je stopnja izkoristka med 90–110 %;

(b)	kot ‚x +/– U‘, pri čemer je x rezultat analize (povprečje dveh določanj) in U razširjena analizna merilna negotovost, ob uporabi faktorja za zajetje 2 (3), zaradi katerega je stopnja zaupanja približno 95-odstotna.

„PRILOGA III

ANALIZNE METODE ZA NADZOR SESTAVE POSAMIČNIH KRMIL IN KRMNIH MEŠANIC

A.   DOLOČANJE VLAGE

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje vsebnosti vlage v krmi. Kadar krma vsebuje hlapne snovi, kot so organske kisline, je treba upoštevati, da se pri določanju vsebnosti vlage zajame tudi bistveno število hlapnih snovi.

Ta metoda ne zajema analizo mlečnih proizvodov kot posamičnih krmil in krmnih mešanic, sestavljenih predvsem iz mlečnih proizvodov, analizo živalskih in rastlinskih maščob in olj ali analizo oljnih semen in oljnatega sadja.

Vsebnost vlage v oljnicah se določi z metodo, kot je opredeljena v standardu EN ISO 665 Določevanje vlage in hlapnih snovi, ob upoštevanju, da je sojina zrna treba zmleti pred določevanjem vsebnosti vlage.

2.   Načelo

Vzorec se osuši pri določenih pogojih, ki se spreminjajo glede na vrsto krme. Izguba mase se določi s tehtanjem. Pri trdni krmi z visoko vsebnostjo vlage je treba izvesti predhodno sušenje.

3.   Naprava

3.1

Drobilec iz materiala, ki ne absorbira vlage, in se lahko enostavno čisti, omogoča hitro in enakomerno drobljenje brez pregretja, v največji možni meri preprečuje stik z zunanjim zrakom ter ustreza zahtevam iz točk 4.1.1 in 4.1.2 (npr. udarni ali vodno hlajeni mikrodrobilci, konusni mlini, počasni drobilniki ali drobilniki na zobata kolesa).

3.2

Analizna tehtnica, natančna na 1 mg.

3.3

Suhe posode iz nerjaveče kovine ali stekla s pokrovi, ki omogočajo zapiranje, neprepustno za zrak; delovna površina, ki omogoča razprostrtje preskusnega vzorca na približno 0,3 g/cm2.

3.4

Električno ogrevan izotermični sušilnik (± 2 oC) s primerno ventilacijo in ki zagotavlja hitro uravnavanje temperature (1).

3.5

Nastavljiv električni vakuumski sušilnik, opremljen z oljno črpalko in mehanizmom za dovajanje suhega vročega zraka ali s sušilnim sredstvom (npr. kalcijevim oksidom).

3.6

Eksikator z debelo kovinsko ali porcelansko perforirano ploščo, ki vsebuje učinkovito sušilno sredstvo.

4.   Postopek

Opomba:

Postopki, opisani v tem oddelku, se morajo izvajati takoj po odprtju pakiranj z vzorci. Analiza se mora izvesti vsaj dvakrat.

4.1   Priprava

4.1.1   Krma, razen tiste iz točk 4.1.2 in 4.1.3

Vzame se vsaj 50 g vzorca. Po potrebi se zdrobi ali razdeli tako, da se prepreči vsakršna sprememba vsebnosti vlage (glej točko 6).

4.1.2   Žita in drobljenci

Vzame se vsaj 50 g vzorca. Zdrobi se tako, da najmanj 50 % delcev preide skozi sito z odprtinami velikosti 0,5 mm in jih na situ z okroglimi odprtinami velikosti 1 mm ostane največ 10 %.

4.1.3   Tekoča ali kašasta krma in krma, sestavljena predvsem iz olj in maščob

Približno 25 g vzorca se natehta na 10 mg natančno, doda se primerna količina brezvodnega peska, stehtanega na 10 mg natančno, in se meša do nastanka homogene mase.

4.2   Sušenje

Posoda (točka 3.3) s pokrovom se 30 min +/– 1 min suši v sušilniku, nastavljenem na 103 °C. Odstrani se iz sušilnika in ohladi na sobno temperaturo v eksikatorju (točka 3.6).

4.2.1   Krma, razen tiste iz točk 4.2.2 in 4.2.3

Posoda s pokrovom se stehta na 1 mg natančno. V stehtano posodo se natehta približno 5 g vzorca na 1 mg natančno, ki se enakomerno porazdeli. Posoda brez pokrova se postavi v sušilnik, segret na 103 oC. Posoda se postavi v sušilnik v najkrajšem možnem času, da se prepreči prevelik padec temperature. Sušenje traja štiri ure od trenutka, ko je temperatura v sušilniku ponovno 103 oC. Sušilnik se odpre, posoda se takoj pokrije s pokrovom in vzame iz peči, pusti se 30 do 45 minut v eksikatorju (točka 3.6), da se ohladi, in stehta na 1 mg natančno.

Krma, sestavljena predvsem (> 50 %) iz olj in maščob živalskega in rastlinskega izvora, se suši v sušilniku nadaljnjih 30 minut pri 103 oC. Razlika med obema tehtanjema ne sme presegati 0,1 % vlage.

4.2.2   Žita, moka, drobljenci in zdrob

Posoda s pokrovom se stehta na 0,5 mg natančno. V stehtano posodo se natehta približno 5 g zdrobljenega vzorca na 1 mg natančno, ki se enakomerno porazdeli. Posoda brez pokrova se postavi v sušilnik, segret na 130 oC. Posoda se postavi v sušilnik v najkrajšem možnem času, da se prepreči prevelik padec temperature. Sušenje traja dve uri od trenutka, ko je temperatura v sušilniku ponovno 130 oC. Sušilnik se odpre, posoda se takoj pokrije s pokrovom in vzame iz peči, pusti se 30 do 45 minut v eksikatorju (točka 3.6), da se ohladi, in stehta na 1 mg natančno.

4.2.3   Krmne mešanice, ki vsebujejo več kot 4 % saharoze ali laktoze: posamična krmila, kot so rožiči, hidrolizirani žitni proizvodi, fermentirana semena, posušena mleta pesa, ribe in raztopine sladkorja.

Posoda s pokrovom se stehta na 0,5 mg natančno. V stehtano posodo se natehta približno 5 g vzorca na 1 mg natančno, ki se enakomerno porazdeli. Posoda brez pokrova se postavi v vakuumski sušilnik (točka 3.5), segret na 80 oC–85 oC. Posoda se postavi v sušilnik v najkrajšem možnem času, da se prepreči prevelik padec temperature.

Počaka se, da tlak naraste do 100 torov in pri tem tlaku sušenje traja štiri ure na vročem suhem zraku ali s sušilnim sredstvom (približno 300 g za 20 vzorcev). V zadnjem primeru se vakuumska črpalka izklopi, ko je želeni tlak dosežen. Čas sušenja se računa od trenutka, ko je temperatura v sušilniku ponovno 80 oC–85 oC. Tlak v sušilniku se previdno izenači z atmosferskim. Sušilnik se odpre, posoda se takoj pokrije s pokrovom in vzame iz peči, pusti se 30 do 45 minut v eksikatorju (točka 3.6), da se ohladi, in stehta na 1 mg natančno. Suši se nadaljnjih 30 minut v vakuumskem sušilniku pri 80 oC–85 oC in ponovno stehta. Razlika med obema tehtanjema ne sme presegati 0,1 % vlage.

4.3   Predhodno (delno) sušenje

‚Mokro‘ krmo z masnim deležem manj kot 85 % suhe snovi (npr. sveža krma, skupni mešani obroki, netekoča hrana) je treba pred finim mletjem delno posušiti, da se analizirajo njene stabilne snovi; za nestabilne snovi delno sušenje ni mogoče.

Delno sušenje se lahko izvede v sušilniku s prisilnim zračnim tokom ali mikrovalovni pečici ali s sušenjem z zamrzovanjem. Razen pri delnem sušenju z zamrzovanjem je namen tega sušiti krmo ter hkrati ohraniti temperaturo vzorca pod 60 °C, tako da to le minimalno učinkuje na kemijsko sestavo. Sušenje pri temperaturah, višjih od 60 °C, povzroča kemijske spremembe v krmi (npr. razgradnja beljakovin). Posušena krma se uravnoteži na sobni temperaturi za približno 15 minut, preden se izmeri delna suha snov, tako da se čim bolj zmanjša morebitna sprememba vlage, do katere lahko pride med mletjem in shranjevanjem. S sušenjem pri temperaturah, nižjih od 60 °C, se ne odstrani vsa voda iz krme, zato (začetno) delno sušenje ne omogoča določanja skupne suhe snovi v krmi. Po sušenju se podvzorec zmelje in analizira za (končno) suho snov delno suhega vzorca (preostala vsebnost vlage 3 %–15 %), ko se določijo druge kemijske sestavine.

Zato se priporoča dvostopenjski postopek za določanje suhe snovi. Najprej se določi delna vsebnost suhe snovi (če je manj kot 85 % suhe snovi), nato se določi preostala vsebnost suhe snovi na zmletem preskusnem vzorcu ter pomnoži delna suha snov s preostalo suho snovjo, da se določi skupna vsebnost suhe snovi.

5.   Izračun rezultatov

Vsebnost vlage (X), izražena kot masni delež vzorca, se izračuna po naslednji formuli:

5.1   Sušenje brez predhodnega sušenja

pri čemer je:

m	=	začetna masa preskusnega vzorca v gramih;
m0	=	masa suhega preskusnega vzorca v gramih.

5.2   Sušenje s predhodnim sušenjem (2)

pri čemer je:

m	=	začetna masa preskusnega vzorca v gramih;
m1	=	masa preskusnega vzorca po predhodnem sušenju v gramih;
m2	=	masa preskusnega vzorca po drobljenju ali mletju v gramih;
m0	=	masa suhega preskusnega vzorca v gramih.

5.3   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne presega 0,2 % absolutne vrednosti vlage, razen za mokro hrano za hišne živali in pasje žvečilke, pri katerih razlika ne presega 0,5 % absolutne vrednosti vlage.

6.   Opomba

Če se izkaže, da je potrebno drobljenje, in če se izkaže, da se pri tem spremeni vsebnost vlage v proizvodu, se morajo rezultati analize sestavin krme popraviti za vsebnost vlage v vzorcu v prvotnem stanju.

B.   DOLOČANJE VLAGE V MAŠČOBAH IN OLJIH ŽIVALSKEGA IN RASTLINSKEGA IZVORA

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti vode in hlapnih snovi v maščobah in oljih živalskega in rastlinskega izvora.

2.   Načelo

Vzorec se posuši do konstantne mase (izguba mase med dvema zaporednima tehtanjema ne sme presegati 1 mg) pri 103 oC. Izguba mase se določi s tehtanjem.

3.   Naprava

3.1

Posoda z ravnim dnom iz nerjavečega materiala s premerom 8 cm do 9 cm in višino približno 3 cm.

3.2

Termometer z utrjeno bučko in podaljškom na zgornjem delu, s skalo od približno 80 oC do vsaj 110 oC in dolžino približno 10 cm.

3.3

Peščena kopel ali električna kuhalna plošča

3.4

Eksikator, ki vključuje učinkovito sušilno sredstvo.

3.5

Analizna tehtnica.

4.   Postopek

Približno 20 g homogeniziranega vzorca se natehta na 1 mg natančno in prenese v suho, stehtano posodo (točka 3.1), v kateri je termometer (točka 3.2). Ob nenehnem mešanju s termometrom se segreva na peščeni kopeli ali električni kuhalni plošči (točka 3.3) tako, da temperatura doseže 90 oC v približno 7 minutah.

Temperatura se zniža, pri čemer se opazuje pogostost dviganja mehurčkov z dna posode. Temperatura ne sme preseči 105 °C. Nadaljuje se z mešanjem in pri tem se drgne dno posode, dokler mehurčki ne prenehajo izhajati.

Da se zagotovi popolna odstranitev vlage, se večkrat segreje na 103 oC ± 2 oC ob ohlajevanju na 93 oC med zaporednimi segrevanji. Nato se pusti, da se vzorec v eksikatorju (točka 3.4) ohladi na sobno temperaturo, in se stehta. Postopek se ponavlja, dokler izguba mase med dvema zaporednima tehtanjema ni manjša od 2 mg.

Opomba

Povečanje mase vzorca po ponovljenem segrevanju kaže na oksidacijo maščobe, v tem primeru je treba upoštevati rezultat tehtanja, izvedenega neposredno pred začetkom povečevanja mase.

5.   Izračun rezultatov

Masni delež vlage (X) v vzorcu se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

m	=	masa preskusnega vzorca v gramih;
m1	=	masa posode z vsebino pred segrevanjem v gramih;
m2	=	masa posode z vsebino po segrevanju v gramih.

Rezultati, nižji od 0,05 %, se navedejo kot ‚manj kot 0,05 %‘.

Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 0,1 % v absolutni vrednosti.

C.   DOLOČANJE VSEBNOSTI DUŠIKA IN IZRAČUN VSEBNOSTI SUROVIH BELJAKOVIN

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti surovih beljakovin v krmi na podlagi vsebnosti dušika, določenega po Kjeldahlovi metodi (3).

2.   Načelo

Vzorec se razkroji z žveplovo kislino v prisotnosti katalizatorja. Raztopina natrijevega hidroksida se doda kisli raztopini, da postane bazična. Amonijak se destilira in zbere v odmerjeno količino žveplove kisline, katere presežek se titrira s standardno raztopino natrijevega hidroksida.

Sproščeni amonijak se lahko destilira v presežek raztopine borove kisline ter nato titrira z raztopino klorovodikove ali žveplove kisline.

3.   Reagenti

3.1

Kalijev sulfat.

3.2

Katalizator: bakrov (II) oksid CuO ali bakrov (II) sulfat pentahidrat, CuSO4 5H2O.

3.3

Cink v zrncih.

3.4

Žveplova kislina, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5

Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(H2SO4) = 0,25 mol/l

3.6

Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(H2SO4) = 0,10 mol/l

3.7

Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(H2SO4) = 0,05 mol/l

3.8

Indikator metil rdeče; 300 mg metil rdečega se raztopi v 100 ml etanola, σ = 95 %–96 % (v/v).

3.9

Raztopina natrijevega hidroksida (lahko se uporabi tehnična) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10

Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11

Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12

Zdrobljen plovec, opran v klorovodikovi kislini in prežaren.

3.13

Acetanilid (tališče = 114 oC, N-vsebnost = 10,36 %).

3.14

Saharoza (brez dušika).

3.15

Borova kislina (H3BO3).

3.16

Raztopina indikatorja metil rdeče: 100 mg metil rdečega se raztopi v 100 ml etanola ali metanola.

3.17

Raztopina bromokrezol zelenega: 100 mg bromokrezol zelenega se raztopi v 100 ml etanola ali metanola.

3.18

Raztopina borove kisline (10 g/l–40 g/l glede na uporabljeno napravo). Pri določanju s kolorimetrično ekvivalentno točko se morata raztopinam borove kisline dodati indikatorja metil rdeče in bromokrezol. Pri pripravi 1 litra raztopine borove kisline se pred uravnavanjem volumna doda 7 ml raztopine indikatorja metil rdeče (točka 3.16) in 10 ml raztopine bromokrezol zelenega (točka 3.17). Glede na uporabljeno vodo se lahko pH raztopine borove kisline med serijami razlikuje. Vrednost pH raztopine borove kisline mora biti med 4,3 in 4,7. Pogosto je za doseganje pozitivnega slepega vzorca treba dodati majhen volumen baze. Opomba: 3 ml do 4 ml NaOH (točka 3.11) v 1 liter borove kisline v koncentraciji 10 g/l običajno zadošča. Raztopina se shrani pri sobni temperaturi ter zaščiti pred svetlobo in viri amonijevih hlapov.

3.19

Klorovodikova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(HCl) = 0,10 mol/l. Opomba: Druge koncentracije volumetričnih raztopin (točke 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 in 3.19) se lahko uporabljajo, če se upoštevajo v izračunih. Koncentracije se vedno izrazijo na štiri decimalke natančno.

4.   Naprava

Naprava, primerna za izvajanje razklopa, destilacije in titracije po Kjeldahlovi metodi.

5.   Postopek

5.1   Razklop

1 g vzorca se natehta na 0,001 g natančno in se prenese v bučko naprave za razklop. Doda se 15 g kalijevega sulfata (točka 3.1), ustrezna količina katalizatorja (točka 3.2) (0,3 g–0,4 g bakrovega (II) oksida ali 0,9 g–1,2 g bakrovega (II) sulfat pentahidrata), 25 ml žveplove (VI) kisline (točka 3.4) in po potrebi nekaj zrnc plovca (točka 3.12) ter vse skupaj premeša.

Bučka se najprej zmerno segreva in po potrebi občasno obrne, dokler masa ne zogleni in pena ne izgine; nato se močneje segreva do enakomernega vretja tekočine. Segrevanje je ustrezno, če se vrela kislina kondenzira na stenah bučke. Paziti je treba, da se stene bučke ne pregrejejo in da se organski delci ne sprimejo nanje.

Ko se raztopina zbistri in obarva rahlo zeleno, se pusti vreti še dve uri, nato pa pusti, da se ohladi.

5.2   Destilacija

Previdno se doda toliko vode, da se sulfati povsem raztopijo. Pusti se, da se ohladi, nato pa se po potrebi doda nekaj zrnc cinka (točka 3.3). Nadaljuje se v skladu s točko 5.2.1 ali 5.2.2.

5.2.1   Destilacija v žveplovo kislino

V zbirno bučko naprave za destilacijo se doda natančno 25 ml žveplove kisline (točka 3.5) ali (točka 3.7) glede na pričakovano vsebnost dušika. Doda se nekaj kapljic indikatorja metil rdeče (točka 3.8).

Bučka za razklop se poveže s kondenzatorjem naprave za destilacijo in konica kondenzatorja se potopi v tekočino v zbirni bučki vsaj do globine 1 cm (glej točko 8.3). V bučko za razklop se počasi vlije 100 ml raztopine natrijevega hidroksida (točka 3.9) tako, da ne pride do izgube amonijaka (glej točko 8.1). Bučka se segreva do popolne destilacije amonijaka.

5.2.2   Destilacija v borovo kislino

Pri ročni titraciji amonijaka iz destilata se uporablja spodaj navedeni postopek. Kadar je destilacijska enota v celoti avtomatizirana in vključuje titracijo amonijaka iz destilata, se upoštevajo navodila proizvajalca za upravljanje z destilacijsko enoto.

Zbirna bučka s 25 ml–30 ml raztopine borove kisline (točka 3.18) se postavi pod izhodno odprtino kondenzatorja tako, da je dovodna cev pod površino presežka raztopine borove kisline. Destilacijska enota se nastavi tako, da se dovaja 50 ml raztopine natrijevega hidroksida (točka 3.9). Destilacijska enota se upravlja v skladu z navodili proizvajalca, sproščeni amonijak pa se destilira z raztopino natrijevega hidroksida. Destilat se zbere v raztopino borove kisline. Količina destilata (čas parne destilacije) je odvisna od količine dušika v vzorcu. Upoštevati je treba navodila proizvajalca.

Opomba:

V polavtomatski destilacijski enoti sta dodajanje presežka natrijevega hidroksida in parna destilacija avtomatizirana postopka.

5.3   Titracija

Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.1 ali 5.3.2.

5.3.1   Žveplova kislina

Presežek žveplove kisline v zbirni bučki se titrira do ekvivalentne točke z raztopino natrijevega hidroksida (točka 3.10 ali 3.11) glede na koncentracijo uporabljene žveplove kisline.

5.3.2   Borova kislina

Vsebina zbirne bučke se titrira s standardno volumetrično raztopino klorovodikove kisline (točka 3.19) ali standardno volumetrično raztopino žveplove kisline (točka 3.6), pri čemer se uporabi bireta in odčita količina uporabljene titracijske snovi.

Pri določanju s kolorimetrično ekvivalentno točko je ekvivalentna točka dosežena pri prvem znaku rožnatega obarvanja vsebine. Volumen birete se odčita na 0,05 ml natančno. Magnetna mešalna plošča z osvetlitvijo ali fotometrični detektor lahko pripomoreta k določanju ekvivalentne točke.

Parni destilator z avtomatsko titracijo lahko to opravi avtomatsko.

Upoštevati je treba navodila proizvajalca za upravljanje specifičnega destilatorja ali destilatorja/titratorja.

Opomba:

Pri avtomatskem sistemu titriranja se titracija začne takoj po začetku destilacije, uporabi pa se 1-odstotna raztopina borove kisline (točka 3.18).

Pri popolnoma avtomatizirani destilacijski enoti se lahko izvaja avtomatična titracija amonijaka, ekvivalentna točka pa se lahko določa s potenciometričnim pH sistemom.

V tem primeru se uporablja avtomatski titrator s pH metrom. Ta pH meter se ustrezno umeri med pH 4 in pH 7 z običajnimi laboratorijskimi postopki za umerjanje pH.

Ekvivalentna točka pH pri titraciji je dosežena pri pH 4,6, ko je naklon titracijske krivulje največji (točka pregiba).

5.4   Slepi preskus

Slepi preskus (razklop, destilacija in titracija), v katerem se namesto vzorca uporabi 1 g saharoze (točka 3.14), se izvede za potrditev, da reagenti ne vsebujejo dušika.

6.   Izračun rezultatov

Izračuni se izvedejo v skladu s točko 6.1 ali 6.2.

6.1   Izračun za titracijo v skladu s točko 5.3.1

Vsebnost surovih beljakovin, izražena kot masni delež, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

V0	=	volumen (v ml) NaOH (točka 3.10 ali 3.11), uporabljen pri slepem preskusu;
V1	=	volumen (v ml) NaOH (točka 3.10 ali 3.11), uporabljen pri titraciji vzorca;
c	=	koncentracija (v mol/l) natrijevega hidroksida (točka 3.10 ali 3.11);
m	=	masa vzorca (v g).

6.2   Izračun za titracijo v skladu s točko 5.3.2

6.2.1   Titracija s klorovodikovo kislino

Vsebnost surovih beljakovin, izražena kot masni delež, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

m	=	masa preskusnega deleža (v g);
c	=	koncentracija (v mol/l) standardne volumetrične raztopine klorovodikove kisline (točka 3.19);
V0	=	volumen (v ml) klorovodikove kisline, uporabljen pri slepem preskusu;
V1	=	volumen (v ml) klorovodikove kisline, uporabljen v preskusnem deležu.

6.2.2   Titracija s žveplovo kislino

Vsebnost surovih beljakovin, izražena kot masni delež, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

m	=	masa preskusnega deleža (v g);
c	=	koncentracija (v mol/l) standardne volumetrične raztopine žveplove kisline (točka 3.6);
V0	=	volumen (v ml) žveplove kisline (točka 3.6), uporabljen v slepem preskusu;
V1	=	volumen (v ml) žveplove kisline (točka 3.6), uporabljen v preskusnem deležu.

7.   Preverjanje metode

7.1   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določitev na istem vzorcu ne sme presegati:

—	0,4 % v absolutni vrednosti za vsebnosti surovih beljakovin pod 20 %,

—	2,0 % relativno glede na višjo vrednost za vsebnosti surovih beljakovin od 20 % do 40 %,

—	0,8 % v absolutni vrednosti za vsebnosti surovih beljakovin nad 40 %.

7.2   Obnovljivost

Razlika med rezultatoma dveh določitev, izvedena na istem vzorcu v različnih laboratorijih ne sme presegati:

—	1,8 % v absolutni vrednosti za vsebnosti surovih beljakovin pod 20 %,

—	9,0 % relativno glede na višjo vrednost za vsebnosti surovih beljakovin od 20 % do 40 %,

—	3,6 % v absolutni vrednosti za vsebnosti surovih beljakovin nad 40 %.

7.3   Točnost

Za analizo (razklop, destilacija, titracija) se uporabi ustrezna količina acetanilida (točka 3.13) (npr. 0,2 g do 0,3 g) ob navzočnosti 1 g saharoze (točka 3.14); za 1 g acetanilida se porabi 14,80 ml žveplove kisline (točka 3.5). Izkoristek mora biti najmanj 99-odstoten.

8.   Opombe

8.1

Naprava je lahko ročna, polavtomatska ali avtomatska. Če je pri napravi med razklopom in destilacijo potreben prenos, se ta prenos mora izvesti brez kakršne koli izgube. Če bučka naprave za destilacijo ni opremljena s kapalnim lijakom, se natrijev hidroksid doda tik pred povezavo bučke s kondenzatorjem, pri čemer se tekočina vliva počasi ob steni bučke.

8.2

Če se vsebina bučke strjuje, se določanje začne znova, vendar z večjo količino žveplove kisline (točka 3.4), kakor je navedeno v točki 5.1.

8.3

Pri proizvodih z nizko vsebnostjo dušika se lahko volumen žveplove kisline (točka 3.7), ki se doda v zbirno bučko, po potrebi zmanjša na 10 ml ali 15 ml, bučka pa se dopolni do 25 ml z vodo.

8.4

Pri redni analizi se lahko za določanje surovih beljakovin uporabi nadomestna analizna metoda, vendar je Kjeldahlova metoda, opisana v tem delu C, referenčna metoda. Za vsako matrico posebej je treba dokazati, da so rezultati, pridobljeni z nadomestno metodo (npr. DUMAS), enakovredni rezultatom, pridobljenim z referenčno metodo. V poročilu o analizi je treba navesti analizno metodo, uporabljeno za določanje surovih beljakovin, saj lahko rezultati, pridobljeni z nadomestno metodo, kljub potrditvi enakovrednosti, odstopajo od rezultatov, pridobljenih z referenčno metodo.

D.   DOLOČANJE SEČNINE

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni sečnine, ki se uporablja kot krmni dodatek v krmi za prežvekovalce.

2.   Načelo

Vzorec se suspendira v vodi s sredstvom za zbistritev. Suspenzija se filtrira. Doda se 4-dimetilaminobenzaldehid (4-DMAB), nato pa se določi vsebnost sečnine v filtratu z merjenjem optične gostote pri valovni dolžini 420 nm.

3.   Reagenti

3.1

Raztopina 4-dimetilaminobenzaldehida: 1,6 g 4-DMAB se raztopi v 100 ml 96-odstotnega etanola in doda 10 ml klorovodikove kisline (ρ20 1,19 g/ml). Ta reagent se lahko hrani največ dva tedna.

3.2

Raztopina Carrez I: 21,9 g cinkovega acetata Zn(CH3COO)2 2H2O in 3 g led-ocetne kisline se raztopijo v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.3

Raztopina Carrez II: 10,6 g kalijevega ferocianida K4Fe (CN)6 3H2O se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.4

Aktivno oglje, ki ne absorbira sečnine (treba je preveriti).

3.5

Sečnina, 0,1-odstotna raztopina (m/v).

4.   Naprava

4.1

Mešalec: približno 35 do 40 obr./min.

4.2

Epruvete: 160 mm × 16 mm z brušenimi zamaški.

4.3

Spektrofotometer

5.   Postopek

5.1   Analiza vzorca

2 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in skupaj z 1 g aktivnega oglja (točka 3.4) prenese v 500-mililitrsko merilno bučko. Doda se 400 ml vode in 5 ml raztopine Carrez I (točka 3.2), meša se približno 30 sekund in doda 5 ml raztopine Carrez II (točka 3.3). Meša se trideset minut v mešalcu. Dopolni se z vodo do oznake, pretrese in filtrira.

5 ml prozornega brezbarvnega filtrata se odstrani in prenese v epruvete z brušenimi zamaški, doda se 5 ml raztopine 4-DMAB (točka 3.1) ter premeša. Epruvete se postavijo v kopel z vodo pri 20 °C (+/– 4 °C). Po petnajstih minutah se izmeri optična gostota vzorčne raztopine s spektrofotometrom pri 420 nm. Rezultat se primerja z raztopino reagentov iz slepega preskusa.

5.2   Umeritvena krivulja

V 100-mililitrske merilne bučke se prenese 1, 2, 4, 5 in 10 ml raztopine sečnine (točka 3.5), nato pa se dopolnijo z vodo do oznake. Od vsake raztopine se odpipetira 5 ml, vsaki se doda 5 ml raztopine 4-DMAB (točka 3.1), homogenizira se in izmeri optična gostota, kakor je opisano zgoraj s primerjavo s kontrolno raztopino, ki vsebuje 5 ml 4-DMAB in 5 ml vode brez sečnine. Pripravi se umeritvena krivulja.

6.   Izračun rezultatov

Količina sečnine v vzorcu se določi iz umeritvene krivulje.

Rezultat se izrazi v mg sečnine na kg vzorca.

7.   Ocena metode

7.1   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh določanj, ki se izvedeta na istem vzorcu v istem laboratoriju in ju izvede isti izvajalec dejavnosti, ne sme presegati:

—	pri 420 nm — 50 % relativno glede na višjo vrednost za vsebnosti sečnine od 3 000 mg/kg do manj kot 5 000 mg/kg, — 25 % relativno glede na višjo vrednost za vsebnosti sečnine od 5 000 mg/kg do manj kot 7 000 mg/kg, — 20 % relativno glede na višjo vrednost za vsebnosti sečnine 7 000 mg/kg ali več;

—	pri 435 nm — 40 % relativno glede na višjo vrednost za vsebnosti sečnine od 3 000 mg/kg do manj kot 5 000 mg/kg; — 25 % relativno glede na višjo vrednost za vsebnosti sečnine od 5 000 mg/kg do manj kot 9 000 mg/kg; — 5 % relativno glede na višjo vrednost za vsebnosti sečnine 9 000 mg/kg ali več.

7.2   Obnovljivost

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki se izvedeta na istem vzorcu v različnih laboratorijih in/ali ju izvedejo različni izvajalci dejavnosti ne sme presegati:

—	pri 420 nm — 3 000 mg/kg v absolutni vrednosti za vsebnosti sečnine od 3 000 mg/kg do manj kot 12 000 mg/kg, — 4 500 mg/kg v absolutni vrednosti za vsebnosti sečnine 12 000 mg/kg ali več;

—	pri 435 nm — 50 % relativno glede na višjo vrednost za vsebnosti sečnine od 3 000 mg/kg do manj kot 8 000 mg/kg, — 25 % relativno glede na višjo vrednost za vsebnosti sečnine 8 000 mg/kg ali več.

8.   Rezultati medlaboratorijske študije

Organizirana je bila medlaboratorijska primerjava EU, v kateri je sodelovalo 18 laboratorijev. Analiziranih je bilo pet pozitivnih vzorcev krmnih mešanic za prežvekovalce (v tabelah 1 in 2 navedenih kot MAT) (ena analiza) v slepih dvojnih vzorcih, medtem ko je bil en slepi vzorec krmne mešanice za prežvekovalce analiziran enkrat.

Izračuni mejnih vrednosti za ponovljivost (r) in obnovljivost (R), kot je določeno v mednarodnih smernicah, so bili opravljeni po odstranitvi atipičnih vrednosti z analizo variance veljavnih vrednosti.

Izračunani podatki o učinkovitosti metode (ponovljivost, obnovljivost) so predstavljeni v naslednjih tabelah. Med rezultati vseh preskušenih vzorcih, vključno s slepim materialom, ni bilo nobenih lažno pozitivnih ali lažno negativnih.

Tabela 1

Značilnosti učinkovitosti metode za sečnino, izmerjeno pri λ = 420 nm v vseh materialih

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Ovce	Govedo	Ovce	Ovce	Govedo
Ciljni masni delež (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Povprečni masni delež (mg kg-1)	4 241	6 993	7 830	9 962	12 071
Standardni odklon obnovljivosti sR (mg kg-1)	1 141	1 303	985	994	1 711
Standardni odklon ponovljivosti sr (mg kg-1)	723	601	549	712	737
Relativni standardni odklon obnovljivosti RSDR (%)	27	19	13	10	14
Relativni standardni odklon ponovljivosti RSDr (%)	17	9	7	7	6
Mejna vrednost obnovljivosti, R [R = 2.8 × sR ]	3 195	3 649	2 759	2 784	4 790
Mejna vrednost ponovljivosti, r [r = 2.8 × sr ]	2 024	1 684	1 536	1 994	2 064

Tabela 2

Značilnosti učinkovitosti metode za sečnino, izmerjeno pri λ = 435 nm v vseh materialih

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Ovce	Govedo	Ovce	Ovce	Govedo
Ciljni masni delež (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Povprečni masni delež (mg kg-1)	4 101	6 467	7 890	10 062	11 642
Standardni odklon obnovljivosti sR (mg kg-1)	706	1 194	675	745	1 378
Standardni odklon ponovljivosti sr (mg kg-1)	570	628	613	196	167
Relativni standardni odklon obnovljivosti RSDR (%)	17	18	9	7	12
Relativni standardni odklon ponovljivosti RSDr (%)	14	10	8	2	1
Mejna vrednost obnovljivosti, R [R = 2.8 × sR ]	1 977	3 344	1 889	2 087	3 859
Mejna vrednost ponovljivosti, r [r = 2.8 × sr ]	1 596	1 759	1 715	549	467

9.   Opombe

9.1

Če vsebnost sečnine presega 3 %, se vzorec zmanjša na 1 g ali se prvotna raztopina razredči, tako da v 500 ml ni več kot 50 mg sečnine.

9.2

Če je vsebnost sečnine nizka, se vzorec poveča, dokler je filtrat še prozoren in brezbarven.

9.3

Zgornji rezultati iz medlaboratorijskih preskušanj ne kažejo bistvene razlike pri natančnosti med sečnino, izmerjeno pri 420 nm, ali sečnino, izmerjeno pri 435 nm.

E.   DOLOČANJE AMINOKISLIN (RAZEN TRIPTOFANA)

Analizne metode, ki se uporabljajo za določanje aminokislin (razen triptofana) so naslednje:

—	EN ISO 13903 Krma – Določevanje aminokislin,

—	EN ISO 17180 Živalska krma – Določevanje lizina, metionina in treonina v komercialnih aminokislinskih izdelkih in premiksih (4),

—	analizna metoda, opisana v naslednjih točkah 1 do 10.

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje prostih (sintetičnih in naravnih) in celotnih (vezanih s peptidi in prostih) aminokislin v posamičnih krmilih, krmnih mešanicah in premiksih, ki vsebujejo manj kot 10 % (5) vsake aminokisline, z uporabo analizatorja aminokislin. Uporablja se za naslednje aminokisline: cist(e)in, metionin, lizin, treonin, alanin, arginin, aspartat, glutaminsko kislino, glicin, histidin, izolevcin, levcin, fenilalanin, prolin, serin, tirozin in valin.

Z metodo ni možno ločevati med različnimi solmi aminokislin ter med D in L oblikami aminokislin. Ne uporablja se za določanje triptofana ali hidroksi-analogov aminokislin.

2.   Načelo

2.1   Proste aminokisline

Proste aminokisline se ekstrahirajo z razredčeno klorovodikovo kislino. Soekstrahirane dušikove makromolekule se oborijo s sulfosalicilno kislino in odstranijo s filtriranjem. Vrednost pH filtrirane raztopine se uravna na 2,20. Aminokisline se ločijo z ionskoizmenjevalno kromatografijo in določijo z reakcijo z ninhidrinom s fotometrično detekcijo pri 570 nm.

2.2   Celotne aminokisline

Postopek se izbere glede na preiskovane aminokisline. Cist(e)in in metionin se morata pred hidrolizo oksidirati v cisteinsko kislino oz. metionin-sulfon. Tirozin se mora določiti v hidrolizatih neoksidiranih vzorcev. Vse druge aminokisline, navedene v točki 1 (Namen in področje uporabe), se lahko določajo v oksidiranem ali neoksidiranem vzorcu.

Oksidacijo izvedemo pri temperaturi 0 °C z mešanico peroksimravljinčne kisline in fenola. Presežek oksidacijskega reagenta se razgradi z natrijevim disulfitom. Oksidiran ali neoksidiran vzorec se 23 ur hidrolizira s klorovodikovo kislino (točka 3.20). Vrednost pH hidrolizata se uravna na 2,20. Aminokisline se ločijo z ionskoizmenjevalno kromatografijo in določijo z reakcijo z ninhidrinom s fotometrično detekcijo pri 570 nm (440 nm za prolin).

3.   Reagenti

Uporabiti je treba dvojno destilirano vodo ali vodo enakovredne kakovosti (prevodnost < 10 μS).

3.1

Vodikov peroksid, m (m/m) = 30 %.

3.2

Mravljinčna kislina, m (m/m) = 98 %-100 %.

3.3

Fenol.

3.4

Natrijev disulfit.

3.5

Natrijev hidroksid.

3.6

5-sulfosalicilna kislina dihidrat.

3.7

Klorovodikova kislina, gostota približno 1,18 g/ml.

3.8

Tri-natrijev citrat dihidrat.

3.9

2,2’-tiodietanol (tiodiglikol).

3.10

Natrijev klorid.

3.11

Ninhidrin.

3.12

Petroleter, vrelišče 40 °C–60 °C.

3.13

Norlevcin ali druga spojina, primerna za uporabo kot interni standard.

3.14

Plinasti dušik (< 10 ppm kisika).

3.15

1-oktanol.

3.16

Aminokisline.

3.16.1

Standardne snovi aminokisline, navedene pod točko 1 (Namen in področje uporabe). Čiste spojine, ki ne vsebujejo kristalne vode. Pred uporabo se suši 1 teden pod vakuumom s P2O5 ali H2SO4.

3.16.2

Cisteinska kislina.

3.16.3

Metionin-sulfon.

3.17

Raztopina natrijevega hidroksida, c = 7,5 mol/l: 300 g NaOH (točka 3.5) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra.

3.18

Raztopina natrijevega hidroksida, c = 1 mol/l: 40 g NaOH (točka 3.5) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra.

3.19

Raztopina mravljinčne kisline in fenola: 889 g mravljinčne kisline (točka 3.2) se zmeša s 111 g vode ter se doda 4,73 g fenola (točka 3.3).

3.20

Hidrolizna mešanica, c = 6 mol HCl/l, ki vsebuje 1 g fenola/l: 1 g fenola (točka 3.3) se doda k 492 ml HCl (točka 3.7) in dopolni z vodo do 1 litra.

3.21

Mešanica ekstrakcije, c = 0,1 mol HCl/l, ki vsebuje 2 % tiodiglikola: 8,2 ml HCl (točka 3.7) se razredči s približno 900 ml vode, doda se 20 ml tiodiglikola (točka 3.9) in dopolni z vodo do 1 litra (točki 3.7 in 3.9 se ne smeta zmešati neposredno).

3.22

5-sulfosalicilna kislina, ß = 6 %: 60 g 5-sulfosalicilne kisline (točka 3.6) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra.

3.23

Oksidacijska mešanica (peroksimravljinčna kislina in fenol): 0,5 ml vodikovega peroksida (točka 3.1) se zmeša s 4,5 ml raztopine mravljinčne kisline in fenola (točka 3.19) v majhni čaši. Inkubira se 1 uro pri 20 °C–30 °C, da nastane peroksimravljinčna kislina, nato se ohladi v ledeni kopeli (15 min), preden se doda vzorcu. Opozorilo: Izogibati se je treba stiku s kožo in nositi je treba zaščitna oblačila.

3.24

Citratni pufer, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: v približno 800 ml vode se raztopi 19,61 g natrijevega citrata (točka 3.8), 5 ml tiodiglikola (točka 3.9), 1 g fenola (točka 3.3) in 16,50 ml HCl (točka 3.7). Vrednost pH se uravna na 2,20. Dopolni se z vodo do 1 litra.

3.25

Pufri za eluiranje, pripravljeni v skladu s pogoji za uporabljeni analizator (točka 4.9).

3.26

Reagent ninhidrin, pripravljen v skladu s pogoji za uporabljeni analizator (točka 4.9).

3.27

Standardne raztopine aminokislin. Te raztopine se hranijo pri temperaturi do 5 °C.

3.27.1

Osnovna standardna raztopina aminokislin (točka 3.16.1). C = 2,5 μmol/ml za vsako v klorovodikovi kislini. Lahko se priskrbi iz proste prodaje.

3.27.2

Osnovna standardna raztopina cisteinske kisline in metionin-sulfona, c = 1,25 μmol/ml. V litrski merilni bučki se raztopi 0,2115 g cisteinske kisline (točka 3.16.2) in 0,2265 g metionin-sulfona (točka 3.16.3) v citratnem pufru (točka 3.24) ter dopolni s citratnim pufrom do oznake. Hrani se največ 12 mesecev pri temperaturi do 5 °C. Ta raztopina se ne uporablja, če osnovna standardna raztopina (točka 3.27.1) vsebuje cisteinsko kislino in metionin-sulfon.

3.27.3

Osnovna standardna raztopina internega standarda, npr. norlevcina, c = 20 μmol/ml. V merilni bučki se raztopi 0,6560 g norlevcina (točka 3.13) v citratnem pufru (točka 3.24) in dopolni s citratnim pufrom do 250 ml. Hrani se največ 6 mesecev pri temperaturi do 5 °C.

3.27.4

Raztopina za umerjanje standardnih aminokislin, ki se uporablja s hidrolizati, c = 5 nmol/50 μl za cisteinsko kislino in metionin-sulfon ter c = 10 nmol/50 μl za druge aminokisline. V 100-mililitrski čaši se raztopi 2,2 g natrijevega klorida (točka 3.10) s 30 ml citratnega pufra (točka 3.24). Dodajo se 4,00 ml osnovne standardne raztopine aminokisline (točka 3.27.1), 4,00 ml osnovne standardne raztopine cisteinske kisline in metionin-sulfona (točka 3.27.2) ter 0,50 ml osnovne standardne raztopine internega standarda (točka 3.27.3), če se uporablja. Vrednost pH se uravna na 2,20 z natrijevim hidroksidom (točka 3.18). Vsebina se prenese v 50-mililitrsko merilno bučko, dopolni se s citratnim pufrom (točka 3.24) do oznake in premeša. Hrani se največ 3 mesece pri temperaturi do 5 °C. Glej tudi opombe pod točko 9.1.

3.27.5

Raztopina za umerjanje standardnih aminokislin, ki se uporablja s hidrolizati, se pripravi v skladu s točko 5.3.3.1, za ekstrakte pa v skladu s točko 5.2. Raztopina za umerjanje se pripravi v skladu s točko 3.27.4, vendar brez natrijevega klorida. Hrani se največ 3 mesece pri temperaturi do 5 °C.

4.   Naprava

4.1

100- ali 250-mililitrska bučka z okroglim dnom in povratnim hladilnikom.

4.2

100-mililitrska steklenica iz borosilikatnega stekla s pokrovčkom z navojem in ovita v gumo/teflon (npr. Duran, Schott) za uporabo v sušilniku.

4.3

Sušilnik s prisilnim prezračevanjem in regulatorjem temperature z natančnostjo, boljšo od ± 2 °C.

4.4

pH meter (na tri decimalke).

4.5

Membranski filter (0,22 μm).

4.6

Centrifuga.

4.7

Rotavapor.

4.8

Mehanični stresalnik ali magnetno mešalo.

4.9

Aminokislinski analizator ali HPLC-oprema z ionskoizmenjevalno kolono, pripravo za ninhidrin, derivatizacijo po koloni in fotometričnim detektorjem. Kolona se napolni s smolo sulfoniranega polistirena, ki lahko loči aminokisline med seboj in od drugih materialov, ki vsebujejo ninhidrin. Črpalki s stabilnim tokom ± 0,5 % zagotavljata tok v pufrski in ninhidrinski črti pri standardnem umerjanju in analizi vzorca. Za nekatere aminokisline se lahko uporabi hidroliza v analizatorju, pri čemer je koncentracija natrija v hidrolizatu c = 0,8 mol/l in v hidrolizatu je vsa mravljinčna kislina, ki nastane pri oksidaciji. Druge metode ne zagotavljajo zadovoljive ločitve nekaterih aminokislin, če je v hidrolizatu preveč mravljinčne kisline in/ali visoka koncentracija natrijevih ionov. V tem primeru se volumen kisline po hidrolizi in pred uravnavanjem pH zmanjša z uparevanjem na približno 5 ml. Uparevanje se izvede pod vakuumom pri največ 40 °C.

5.   Postopek

5.1   Priprava vzorca

Vzorec se zdrobi, tako da lahko preide skozi 0,5 mm sito. Vzorce z visoko vlago je treba pred drobljenjem osušiti na zraku ali pri temperaturi, ki ne presega 50 °C, ali osušiti z zmrzovanjem. Vzorci z visoko vsebnostjo maščobe se pred drobljenjem ekstrahirajo s petroletrom (točka 3.12).

5.2   Določanje prostih aminokislin

Primerna količina (1 g–5 g) pripravljenega vzorca (točka 5.1) se natehta na 0,2 mg natančno in prenese v erlenmajerico, temu pa se doda 100,0 ml mešanice ekstrakcije (točka 3.21). Z mehaničnim stresalnikom ali magnetnim mešalom (točka 4.8) se mešanica stresa 60 minut. Pusti se, da se usedlina usede na dno, in odpipetira 10,0 ml supernatanta v 100-mililitrsko čašo.

Med mešanjem se doda 5,0 ml raztopine sulfosalicilne kisline (točka 3.22) in 5 minut nadaljuje z mešanjem s pomočjo magnetnega mešala. Supernatant se filtrira ali centrifugira, da se odstrani ves precipitat. 10,0 ml te raztopine se prenese v 100-mililitrsko čašo in pH uravnava na 2,20 z raztopino natrijevega hidroksida (točka 3.18), s citratnim pufrom (točka 3.24) se prenese v merilno bučko ustreznega volumna in dopolni s pufrsko raztopino (točka 3.24) do oznake.

Če se uporablja interni standard, se za vsakih 100 ml končne raztopine doda 1,00 ml internega standarda (točka 3.27.3) ter dopolni s pufrsko raztopino (točka 3.24) do oznake.

Nadaljuje se s kromatografijo v skladu s točko 5.4.

Če se ekstrakti ne pregledajo isti dan, se morajo hraniti pri temperaturi do 5 °C.

5.3   Določanje celotnih aminokislin

5.3.1   Oksidacija

0,1 g–1 g pripravljenega vzorca (točka 5.1) se natehta na 0,2 mg natančno in prenese v:

—	100-mililitrsko bučko z okroglim dnom (točka 4.1) za odprto hidrolizo (točka 5.3.2.3) ali

—	250-mililitrsko bučko z okroglim dnom (točka 4.1), če je zahtevana nizka koncentracija natrija (točka 5.3.3.1), ali

—	100-mililitrsko steklenico s pokrovčkom z navojem (točka 4.2) (za zaprto hidrolizo točka 5.3.2.4).

V natehtanem vzorčenem deležu mora biti vsebnost dušika približno 10 mg, vsebnost vlage pa ne sme preseči 100 mg.

Bučka/steklenica se postavi v ledeno kopel in ohladi na 0 °C, doda se 5 ml oksidacijske mešanice (točka 3.23) in meša s stekleno lopatico z ukrivljeno konico. Bučka/steklenica z lopatico se nepredušno zapre s filmom, ledena kopel, ki vsebuje nepredušno zaprto posodo, pa se postavi v hladilnik s temperaturo 0 °C in pusti 16 ur. Po 16 urah se posoda vzame iz hladilnika, presežni oksidacijski reagent pa se razgradi z dodatkom 0,84 g natrijevega disulfita (točka 3.4).

Nadaljuje se s točko 5.3.2.1.

5.3.2   Hidroliza

5.3.2.1

Hidroliza oksidiranih vzorcev Oksidiranemu vzorcu, pripravljenemu v skladu s točko 5.3.1, se doda 25 ml hidrolizne mešanice (točka 3.20), pri čemer je treba pazljivo sprati kakršne koli ostanke vzorca s stene posode in lopatice. Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4, odvisno od uporabljenega postopka hidrolize.

5.3.2.2

Hidroliza neoksidiranih vzorcev V 100- ali 250-mililitrsko bučko z okroglim dnom (točka 4.1) ali 100-mililitrsko steklenico s pokrovčkom z navojem (točka 4.2) se natehta 0,1 g–1 g pripravljenega vzorca (točka 5.1) na 0,2 mg natančno. V natehtanem vzorčenem deležu mora biti vsebnost dušika približno 10 mg. Pazljivo se doda 25 ml hidrolizne mešanice (točka 3.20) in zmeša z vzorcem. Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4.

5.3.2.3

Odprta hidroliza Mešanici v bučki (pripravljeni v skladu s točko 5.3.2.1 ali 5.3.2.2) se dodajo 3 steklene kroglice, nato se pusti vreti z neprestanim mehurčenjem pri povratnem toku 23 ur. Po zaključku hidrolize se kondenzator spere s 5 ml citratnega pufra (točka 3.24). Bučka se odstrani in ohladi v ledeni kopeli. Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.3.

5.3.2.4

Zaprta hidroliza Steklenica, ki vsebuje mešanico, pripravljeno v skladu s točko 5.3.2.1 ali 5.3.2.2, se postavi v sušilnik (točka 4.3) pri 110 °C. V prvi uri se za preprečitev povečanja tlaka (zaradi nastanka plinastih snovi) in eksplozije pokrovček z navojem postavi čez vrh steklenice. Steklenica se ne sme zapreti s pokrovčkom. Po eni uri se steklenica zapre s pokrovčkom in pusti v sušilniku (točka 4.3) 23 ur. Po zaključku hidrolize se steklenica odstrani iz sušilnika, pokrovček steklenice se pazljivo odpre, steklenica pa položi v ledeno kopel. Pusti se, da se ohladi. Odvisno od postopka za uravnavanje pH (točka 5.3.3) se vsebina steklenice z uporabo citratnega pufra (točka 3.24) prenese v 250-mililitrsko čašo ali 250-mililitrsko bučko z okroglim dnom. Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.3.

5.3.3   Uravnavanje pH

Glede na odstopanje analizatorja aminokislin (točka 4.9) za natrij se za uravnavanje pH nadaljuje v skladu točko 5.3.3.1 ali 5.3.3.2.

5.3.3.1

Kromatografski sistemi (točka 4.9), pri katerih je zahtevana nizka koncentracija natrija Ko se uporabljajo analizatorji aminokislin, pri katerih je zahtevana nizka koncentracija natrija (ko je treba zmanjšati volumen kisline), je priporočljivo uporabiti raztopino internega osnovnega standarda (točka 3.27.3). V tem primeru se hidrolizatu pred uparevanjem dodata 2,00 ml raztopine internega osnovnega standarda (točka 3.27.3). Hidrolizatu, pridobljenemu v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4, se dodata 2 kapljici 1-oktanola (točka 3.15). Z rotavaporjem (točka 4.7) se pod vakuumom pri 40 °C volumen zmanjša na 5 ml–10 ml. Če se volumen nenamerno zmanjša na manj kot 5 ml, se mora hidrolizat izločiti in analiza začeti znova. Vrednost pH se uravna na 2,20 z raztopino natrijevega hidroksida (točka 3.18), nato pa se nadaljuje v skladu s točko 5.3.4.

5.3.3.2

Za vse druge analizatorje aminokislin (točka 4.9) Hidrolizati, pridobljeni v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4, se delno nevtralizirajo, tako da se med mešanjem pazljivo doda 17 ml raztopine natrijevega hidroksida (točka 3.17), pri čemer se mora ohranjati temperatura pod 40 °C. Pri sobni temperaturi se pH uravna na 2,20 z raztopino natrijevega hidroksida (točka 3.17) in nato raztopino natrijevega hidroksida (točka 3.18). Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.4.

5.3.4   Vzorčna raztopina za kromatografijo

Hidrolizat (točka 5.3.3.1 ali 5.3.3.2), uravnan na pH, se s citratnim pufrom (točka 3.24) prenese v 200-mililitrsko merilno bučko in dopolni s pufrom (točka 3.24) do oznake.

Če interni standard še ni bil uporabljen, se dodata 2,00 ml internega standarda (točka 3.27.3), nato pa se dopolni s citratnim pufrom (točka 3.24) do oznake. Temeljito se premeša.

Nadaljuje se s kromatografijo (točka 5.4).

Če se vzorčne raztopine ne pregledajo še isti dan, se morajo shraniti pri temperaturi pod 5 °C.

5.4   Kromatografija

Pred kromatografijo mora biti temperatura ekstrakta (točka 5.2) ali hidrolizata (točka 5.3.4) enaka sobni temperaturi. Mešanica se stresa, primerna količina pa se filtrira skozi membranski filter 0,22 μm (točka 4.5). S to bistro raztopino se opravi ionskaizmenjevalna kromatografija z analizatorjem aminokislin (točka 4.9).

Vbrizgavanje je lahko ročno ali avtomatično. Pomembno je, da se ista količina raztopine (± 0,5 %) doda koloni za analizo standardov in vzorcev, razen ko se uporablja interni standard, ter da je razmerje med natrijem in aminokislino v standardnih in vzorčnih raztopinah takšno, kot se uporablja običajno.

Na splošno je pogostost umerjanja odvisna od stabilnosti reagenta ninhidrina in analiznega sistema. Standard ali vzorec se razredči s citratnim pufrom (točka 3.24), da se doseže površina vrha standarda, ki je 30 %–200 % površine vrha aminokislin v vzorcu.

Kromatografija aminokislin se nekoliko razlikuje glede na vrsto uporabljenega analizatorja in smole. Izbrani sistem mora imeti možnost ločitve aminokisline med seboj in od materialov, ki vsebujejo ninhidrin. V delovnem območju se mora kromatografski sistem odzivati linearno na spremembe količin aminokislin, dodanih koloni.

Pri kromatografiji se uporabljajo spodaj navedena razmerja med najnižjimi in najvišjimi vrednostmi, ko se analizira ekvimolarna raztopina (aminokislin, ki se določajo). Ekvimolarna raztopina mora vsebovati vsaj 30 % največje vsebnosti vsake aminokisline, ki se lahko natančno izmeri s sistemom za analizo aminokislin (točka 4.9).

Za ločevanje treonina od serina razmerje med najnižjo in najvišjo vrednostjo za aminokislino z nižjo vrednostjo izmed dveh prekrivajočih se aminokislin na kromatogramu ne sme presegati 2:10. (Če se določajo le cistein, metionin, treonin in lizin, bo neustrezna ločitev od sosednjih vrhov negativno vplivala na določanje.) Za vse druge aminokisline mora biti ločevanje boljše od 1:10.

Sistem mora zagotavljati, da se lizin loči od „lizinskih artefaktov“ in ornitina.

6.   Izračun rezultatov

Za vsako posamezno aminokislino se izračuna površina vrha vzorca in standarda ter količina (X), izražena v g aminokislin na kg vzorca.

Če se uporablja interni standard, se pomnoži z:

A	=	površina vrha hidrolizata ali ekstrakta
B	=	površina vrha standardne raztopine za umerjanje
C	=	površina vrha hidrolizata ali ekstrakta kot internega standarda
D	=	površina vrha standardne raztopine za umerjanje kot internega standarda
M	=	molska masa aminokisline, ki se določa
c	=	koncentracija standarda v μmol/ml
m	=	masa vzorca v gramih (popravljena na prvotno maso, če je vzorec posušen ali razmaščen)
V	=	ml celotnega hidrolizata (točka 5.3.4) ali izračunani celotni volumen razredčitve ekstrakta (točka 6.1) v ml

Cistin in cistein se določata kot cisteinska kislina v hidrolizatih oksidiranega vzorca, vendar se izračunata kot cistin (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) z uporabo molske mase 120,15 g/mol (= 0,5 x 240,30 g/mol).

Metionin se določa kot metionin-sulfon v hidrolizatih oksidiranega vzorca, vendar se izračuna kot metionin, pri čemer se uporabi molska masa metionina: 149,21 g/mol.

Dodani prosti metionin se določa po ekstrakciji kot metionin, za izračun pa se uporabi ista molska masa.

6.1

Celotni volumen razredčitve ekstraktov (F) za določanje prostih aminokislin (točka 5.2) se izračuna: V = volumen končnega ekstrakta

7.   Ocena metode

Metoda je bila preskušena v mednarodni medlaboratorijski primerjavi, ki je bila izvedena leta 1990 s štirimi različnimi vrstami krme (mešana prašičja krma, mešanica za pitovne piščance, beljakovinski koncentrat, premiks).

Opomba:

Metoda je bila preskušena v drugi mednarodni medlaboratorijski študiji leta 2003 z uporabo slepih dvojnih parov vzorcev krme za pitanje brojlerjev, starterjev za brojlerje, koruze, ribje in perutninske moke. Za podrobnosti glej standard EN ISO 13903.

Rezultati primerjave iz leta 1990, brez izjem, s srednjimi vrednostmi in standardnimi odmiki so prikazani v tabeli v tej točki:

Srednje vrednosti v g/kg

Referenčni material	Aminokislina
	Treonin	Cist(e)in	Metionin	Lizin
Mešana prašičja krma	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Krmna mešanica za brojlerje	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Beljakovinski koncentrat	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Premiks	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = število sodelujočih laboratorijev

7.1   Ponovljivost

Ponovljivost, izražena kot „standardni odklon v laboratoriju“, za primerjavo iz predhodne tabele, je prikazana v spodnji tabeli:

Koeficient variacije (%) za ponovljivost (CVr)

Referenčni material	Aminokislina
	Treonin	Cist(e)in	Metionin	Lizin
Mešana prašičja krma	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Krmna mešanica za brojlerje	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Beljakovinski koncentrat	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Premiks	2,2 n = 16	–	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = število sodelujočih laboratorijev

7.2   Obnovljivost

Rezultati zgoraj navedene primerjave, izraženi kot standardni odklon med laboratoriji, so prikazani v spodnji tabeli:

Koeficient variacije (%) za obnovljivost(CVr)

Referenčni material	Aminokislina
	Treonin	Cist(e)in	Metionin	Lizin
Mešana prašičja krma	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Krmna mešanica za brojlerje	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Beljakovinski koncentrat	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Premiks	4,3 n = 16	–	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = število sodelujočih laboratorijev

8.   Uporaba referenčnih materialov

Pravilna uporaba metode se preveri s ponovljenimi merjenji na potrjenih referenčnih materialih, kadar so na voljo. Priporočeno je umerjanje s potrjeno raztopino za umerjanje aminokislin.

9.   Opombe

9.1

Zaradi razlik med analizatorji aminokislin se kot smernica obravnavajo končne koncentracije raztopin standardnih aminokislin za umerjanje (glej točki 3.27.4 in 3.27.5) in hidrolizata (glej točko 5.3.4). Za vse aminokisline je treba preveriti območje naprave, v katerem je odziv linearen. Standardna raztopina se razredči s citratnim pufrom, da je površina vrha na sredini tega območja.

9.2

Kadar se za analizo hidrolizatov uporablja oprema za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti, se morajo eksperimentalni pogoji optimizirati v skladu s priporočili proizvajalca.

9.3

Pri uporabi metode za krmne mešanice ali premikse, ki vsebujejo več kot 1 % klorida (koncentrat, mineralna krma, dopolnilna krmna mešanica), se lahko pojavi prenizka vrednost vsebnosti metionina in zato se izvede posebna obdelava.

10.   Izvedbena merila

Z obdelavo rezultatov (razen za tirozin) iz dveh medlaboratorijskih študij (iz leta 1990, navedena v zgornji točki 7, in iz leta 2005, navedena v standardu EN/ISO 13903) so bila zagotovljena naslednja merila za ponovljivost in obnovljivost. Vrednosti, ki izhajajo iz teh dveh medlaboratorijskih preskusov, mogoče ne bodo ustrezale razponom koncentracij in matriksom, ki se od danih razlikujejo.

10.1   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh določanj, ki se izvedeta na istem vzorcu v istem laboratoriju in ju izvede isti izvajalec dejavnosti, ne sme presegati:

—	6 % relativno glede na višjo vrednost za celotne aminokisline v primeru glicina, alanina, lizina, prolina, glutaminske kisline, izolevcina in histidina;

—	8 % relativno glede na višjo vrednost za celotne aminokisline v primeru treonina, fenilalanina, metionina, asparaginske kisline in levcina;

—	10 % relativno glede na višjo vrednost za celotne aminokisline v primeru arginina in valina;

—	12 % relativno glede na višjo vrednost za celotno aminokislino serin;

—	15 % relativno glede na višjo vrednost za celotno aminokislino cist(e)in.

10.2   Obnovljivost

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki se izvedeta na istem vzorcu v različnih laboratorijih in/ali ju izvedejo različni izvajalci dejavnosti ne sme presegati:

—	15 % relativno glede na višjo vrednost za celotne aminokisline v primeru glicina, alanina in treonina,

—	20 % relativno glede na višjo vrednost za celotne aminokisline v primeru lizina, prolina, fenilalanina, metionina in asparaginske kisline,

—	22 % relativno glede na višjo vrednost za celotne aminokisline v primeru glutaminske kisline in levcina,

—	27 % relativno glede na višjo vrednost za celotno aminokislino arginin,

—	32 % relativno glede na višjo vrednost za celotno aminokislino izolevcin,

—	35 % relativno glede na višjo vrednost za celotne aminokisline v primeru valina in serina,

—	40 % relativno glede na višjo vrednost za celotno aminokislino histidin,

—	50 % relativno glede na višjo vrednost za celotno aminokislino cist(e)in.

F.   DOLOČANJE TRIPTOFANA

Analizne metode, ki se uporabljajo za določanje triptofana so naslednje:

—	EN ISO 13904 Krma – Določevanje triptofana;

—	analizna metoda, opisana v naslednjih točkah 1 do 9.

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje celotnega in prostega triptofana v krmi. Ne omogoča pa ločevanja med oblikama D in L.

2.   Načelo

Za določanje celotnega triptofana se vzorec hidrolizira pri bazičnih pogojih z nasičeno raztopino barijevega hidroksida in 20 ur segreva do 110 °C. Po hidrolizi se doda interni standard.

Za določanje prostega triptofana se vzorec ekstrahira pri rahlo kislih pogojih v prisotnosti internega standarda.

Triptofan in interni standard v hidrolizatu ali ekstraktu se določata s HPLC s fluorescenčno detekcijo.

3.   Reagenti

3.1

Uporabljati je treba dvakrat destilirano vodo ali vodo enake kakovosti (prevodnost < 10 μS/cm).

3.2

Standardna snov: triptofan (čistoča/vsebnost ≥ 99 %), osušen pod vakuumom nad fosforjevim pentoksidom.

3.3

Snov, ki je interni standard: α-metil-triptofan (čistoča/vsebnost ≥ 99 %), osušen pod vakuumom nad fosforjevim pentoksidom.

3.4

Barijev hidroksid oktahidrat (paziti je treba, da Ba(OH)2 .8 H2O ni pretirano izpostavljen zraku, da se ne bi tvoril BaCO3, ki lahko moti določanje) (glej točko 9.3).

3.5

Natrijev hidroksid.

3.6

Ortofosforna kislina, m (m/m) = 85 %.

3.7

Klorovodikova kislina, ρ20 1,19 g/ml.

3.8

Metanol, za HPLC.

3.9

Petroleter, vrelišče 40 °C–60 °C.

3.10

Raztopina natrijevega hidroksida, c = 1 mol/l: 40,0 g NaOH (točka 3.5) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra (točka 3.1).

3.11

Klorovodikova kislina, c = 6 mol/l: 492 ml HCl (točka 3.7) se dopolni z vodo do 1 litra.

3.12

Klorovodikova kislina, c = 1 mol/l: 82 ml HCl (točka 3.7) se dopolni z vodo do 1 litra.

3.13

Klorovodikova kislina, c = 0,1 mol/l: 8,2 ml HCl (točka 3.7) se dopolni z vodo do 1 litra.

3.14

Ortofosforna kislina, c = 0,5 mol/l: 34 ml ortofosforne kisline (točka 3.6) se dopolni z vodo (3.1) do 1 litra.

3.15

Koncentrirana raztopina triptofana (točka 3.2), c = 2,50 μmol/ml: v 500-mililitrski merilni bučki se raztopi 0,2553 g triptofana (točka 3.2) v klorovodikovi kislini (točka 3.13) in dopolni s klorovodikovo kislino (točka 3.13) do oznake. Pri –18 °C se shrani največ 4 tedne.

3.16

Koncentrirana raztopina internega standarda, c = 2,50 μmol/ml: v 500-mililitrski merilni bučki se raztopi 0,2728 g α-metil-triptofana (točka 3.3) v klorovodikovi kislini (točka 3.13) in dopolni se s klorovodikovo kislino (točka 3.13) do oznake. Pri –18 °C se shrani največ 4 tedne.

3.17

Standardna raztopina triptofana in internega standarda za umerjanje: pripravi se 2,00 ml koncentrirane raztopine triptofana (točka 3.15) in 2,00 ml koncentrirane raztopine internega standarda (α-metil-triptofan) (točka 3.16). Razredči se z vodo (točka 3.1) in metanolom (točka 3.8) na približno enaka volumna in na približno enako koncentracijo metanola (10 %–30 %) kot pri končnem hidrolizatu. Ta raztopina se mora pripraviti sveža pred uporabo. Med pripravo jo je treba zaščititi pred neposredno sončno svetlobo.

3.18

Ocetna kislina.

3.19

1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol.

3.20

Etanolamin, m (m/m) > 98 %.

3.21

1 g 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanola (točka 3.19) se raztopi v 100 ml metanola (točka 3.8).

3.22

Mobilna faza za HPLC: 3,00 g ocetne kisline (točka 3.18) in 900 ml vode (točka 3.1) + 50,0 ml raztopine (točka 3.21) 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanola (točka 3.19) v metanolu (točka 3.8) (1 g/100 ml). Naravnamo pH na 5,00 z uporabo etanolamina (točka 3.20). Dopolni se z vodo do 1 000 ml (točka 3.1).

4.   Naprava

4.1

Oprema HPLC s spektrofluorometričnim detektorjem.

4.2

Kolona za tekočinsko kromatografijo, 125 mm x 4 mm C18, polnitev 3 μm ali enakovredna.

4.3

pH meter.

4.4

Bučka iz polipropilena, volumna 125 ml, s širokim vratom in pokrovčkom z navojem.

4.5

Membranski filter, 0,45 μm.

4.6

Avtoklav, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar.

4.7

Mehanični stresalnik ali magnetno mešalo.

4.8

Vorteks mešalnik.

5.   Postopek

5.1   Priprava vzorcev

Vzorec se zdrobi, tako da lahko preide skozi 0,5 mm sito. Vzorce z visoko vlago je treba pred drobljenjem osušiti na zraku ali pri temperaturi, ki ne presega 50 °C, ali osušiti z zmrzovanjem. Vzorci z visoko vsebnostjo maščobe se pred drobljenjem ekstrahirajo s petroletrom (točka 3.9).

5.2   Določanje prostega triptofana (ekstrakt)

Primerna količina (1 g–5 g) pripravljenega vzorca (točka 5.1) se natehta na 1 mg natančno in prenese v erlenmajerico. Doda se 100,0 ml klorovodikove kisline (točka 3.13) in 5,00 ml koncentrirane raztopine internega standarda (točka 3.16). Z mehaničnim stresalnikom ali magnetnim mešalom (točka 4.7) se stresa ali meša 60 minut. Pusti se, da se usedlina usede na dno, nato pa se odpipetira 10,0 ml supernatanta v čašo. Doda se 5 ml ortofosforne kisline (točka 3.14). Vrednost pH se uravna na 3 z natrijevim hidroksidom (točka 3.10). Doda se dovolj metanola (točka 3.8), da se v končnem volumnu dobi koncentracija metanola med 10 % in 30 %. Prenese se v merilno bučko primernega volumna in razredči z vodo na volumen, potreben za kromatografijo (približno enak volumen kot pri standardni raztopini za umerjanje (točka 3.17)).

Pred vbrizganjem na HPLC kolono se nekaj ml raztopine prefiltrira skozi 0,45 μm membranski filter (točka 4.5). Nadaljuje se s kromatografijo v skladu s točko 5.4.

Standardna raztopina in ekstrakti se zaščitijo pred neposredno sončno svetlobo. Če ni možno analizirati ekstraktov istega dne, se lahko hranijo največ 3 dni pri 5 °C.

5.3   Določanje celotnega triptofana (hidrolizat)

0,1 g–1 g pripravljenega vzorca (točka 5.1) se natehta na 0,2 mg natančno in prenese v bučko iz polipropilena (točka 4.4). Vsebnost dušika v natehtanem delu vzorca je približno 10 mg. Doda se 8,4 mg barijevega hidroksid oktahidrata (točka 3.4) in 10 ml vode. Meša se na vorteks mešalniku (točka 4.8) ali z magnetnim mešalom (točka 4.7). S teflonom prevlečeni magnet pustimo v mešanici. Stene posode se sperejo s 4 ml vode. Zapre se s pokrovčkom z navojem, bučka pa se rahlo zapre. Prenese se v avtoklav (točka 4.6), kjer je vrela voda, in pusti v pari 30–60 minut. Zapre se avtoklav in 20 ur avtoklavira pri 110 (± 2) °C.

Pred odprtjem avtoklava se temperatura zmanjša nekoliko pod 100 °C. Da se prepreči kristalizacija Ba(OH)2 .8 H2O, se topli mešanici doda 30 ml vode sobne temperature. Rahlo se pretresa ali meša. Doda se 2,00 ml koncentrirane raztopine internega standarda (α-metil-triptofana) (točka 3.16). Posode se 15 minut hladijo na vodni/ledeni kopeli.

Nato se doda 5 ml ortofosforne kisline (točka 3.14). Posoda se zadrži v hladilni kopeli, med mešanjem nevtralizira s HCl (točka 3.11), pH pa se s HCl (točka 3.12) uravna na 3,0. Doda se dovolj metanola, da se v končnem volumnu dobi koncentracija metanola med 10 % in 30 %. Prenese se v merilno bučko primernega volumna in razredči z vodo do volumna, potrebnega za kromatografijo (na primer 100 ml). Dodatek metanola ne povzroči obarjanja.

Pred vbrizganjem na HPLC kolono se nekaj ml raztopine prefiltrira skozi 0,45 μm membranski filter (točka 4.5). Nadaljuje se s kromatografijo v skladu s točko 5.4.

Standardna raztopina in hidrolizati se zaščitijo pred neposredno sončno svetlobo. Če ni možno analizirati ekstraktov istega dne, se lahko hranijo največ 3 dni pri 5 °C.

5.4   Določanje s HPLC

Za izokratsko eluiranje se lahko kot smernica uporabljajo naslednji pogoji; lahko se uporabljajo tudi drugi pogoji, če zagotavljajo enakovredne rezultate (glej tudi točki 9.1 in 9.2).

Tekočinska kromatografija (točka 4.2):	125 mm x 4 mm, C18, polnitev 3 μm alienakovredna kolona
Temperatura kolone:	sobna temperatura
Mobilna faza (točka 3.22):	3,00 g ocetne kisline (točka 3.18) + 900 ml vode (točka 3.1) + 50,0 ml raztopine (točka 3.21) 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanola (točka 3.19) v metanolu (točka 3.8) (1 g/100 ml). Vrednost pH se uravna na 5,00 z uporabo etanolamina (točka 3.20). Dopolni se z vodo do 1 000 ml (točka 3.1).
Hitrost pretoka:	1 ml/min
Skupni čas izvedbe:	približno 34 min
Valovna dolžina detektorja:	ekscitacija: 280 nm, emisija: 356 nm
Vbrizgani volumen	20 μl

6.   Izračun rezultatov

Količina triptofana (X), izražena v g na 100 g vzorca, se izračuna po naslednji formuli:

A	=	površina vrha internega standarda, standardne raztopine za umerjanje (3.17)
B	=	površina vrha triptofana, ekstrakta (točka 5.2) ali hidrolizata (točka 5.3)
V1	=	volumen, v ml (2 ml), koncentrirane raztopine triptofana (točka 3.15), dodane raztopini za umerjanje (točka 3.17)
c	=	koncentracija, v μmol/ml (= 2,50), koncentrirane raztopine triptofana (točka 3.15), dodane raztopini za umerjanje (točka 3.17)
V2	=	volumen, v ml, koncentrirane raztopine internega standarda (točka 3.16), dodane pri ekstrakciji (točka 5.2) (= 5,00 ml) ali hidrolizatu (točka 5.3) (= 2,00 ml)
C	=	površina vrha internega standarda, ekstrakta (točka 5.2) ali hidrolizata (točka 5.3)
D	=	površina vrha triptofana, standardne raztopine za umerjanje (točka 3.17)
V3	=	volumen, v ml (= 2,00 ml), koncentrirane raztopine internega standarda (točka 3.16), dodane standardni raztopini za umerjanje (točka 3.17)
m	=	masa vzorca v g (popravljena na prvotno maso, če je vzorec posušen in/ali razmaščen)
M	=	molska masa triptofana (= 204,23 g/mol)

7.   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 10 % relativno glede na najvišji rezultat.

8.   Rezultati medlaboratorijske študije

Organizirana je bila medlaboratorijska študija EU (četrta medlaboratorijska primerjava), pri kateri je 12 laboratorijev analiziralo tri vzorce, da se potrdi metoda za hidrolizo. Vsak vzorec je bil analiziran petkrat. Rezultati so navedeni v spodnji tabeli:

	Vzorec 1 Prašičja krma	Vzorec 2 Prašičja krma z dodanim L-triptofanom	Vzorec 3 Koncentrat prašičje krme
L	12	12	12
n Srednja vrednost [g/kg]	50 2,42	55 3,40	50 4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [%]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVR [%]	6,3	6,0	2,2
L = število laboratorijev, ki so predložili rezultate n = število pridobljenih posameznih rezultatov, po izločitvi izjem (identificiranih s preskusom za izjeme po Cochranu in Dixonu) sr = standardni odmik ponovljivosti SR = standardni odmik obnovljivosti r = ponovljivost R = obnovljivost CVr = koeficient variacije ponovljivosti v % CVR = koeficient variacije obnovljivosti v %

Organizirana je bila še ena medlaboratorijska študija EU (tretja medlaboratorijska primerjava), v kateri je 13 laboratorijev analiziralo dva vzorca, da se potrdi metoda za ekstrakcijo prostega triptofana. Vsak vzorec je bil analiziran petkrat. Rezultati so navedeni v spodnji tabeli:

	Vzorec 4 Mešanica pšenice in soje	Vzorec 5 Mešanica pšenice in soje (= vzorec 4) z dodanim triptofanom (0,457 g/kg)
L n	12 55	12 60
Srednja vrednost [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [%]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [%]	4,71	5,11
L = število laboratorijev, ki so predložili rezultate n = število pridobljenih posameznih rezultatov, po izločitvi izjem (identificiranih s preskusom za izjeme po Cochranu in Dixonu) sr = standardni odmik ponovljivosti SR = standardni odmik obnovljivosti r = ponovljivost R = obnovljivost CVr = koeficient variacije ponovljivosti v % CVR = koeficient variacije obnovljivosti v %

Organizirana je bila še ena medlaboratorijska študija EU, v kateri je do 7 laboratorijev analiziralo štiri vzorce, da se potrdi metoda za hidrolizo triptofana. Rezultati so v spodnji tabeli. Vsak vzorec je bil analiziran petkrat.

	Vzorec 1 Mešana prašičja krma (CRM 117)	Vzorec 2 Ribja moka z nizko vsebnostjo maščob (CRM 118)	Vzorec 3 Sojina moka (CRM 119)	Vzorec 4 Posneto mleko v prahu (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Srednja vrednost [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [%]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [%]	1,48	4,69	4,11	4,22
L = število laboratorijev, ki so predložili rezultate n = število pridobljenih posameznih rezultatov, po izločitvi izjem (identificiranih s preskusom za izjeme po Cochranu in Dixonu) sr = standardni odmik ponovljivosti SR = standardni odmik obnovljivosti r = ponovljivost R = obnovljivost CVr = koeficient variacije ponovljivosti v % CVR = koeficient variacije obnovljivosti v %

9.   Opombe

9.1

Ločevanje triptofana in α-metil-triptofana lahko izboljšajo naslednji posebni kromatografski pogoji. Izokratsko eluiranje, ki mu sledi gradientno čiščenje kolone: Kolona za tekočinsko kromatografijo: 125 mm x 4 mm, C18, polnitev 5 μm ali enakovredna Temperatura kolone: 32 °C Mobilna faza: A: 0,01 mol/l KH2PO4/Metanol, 95+5 (V+V) B: Metanol Gradientni program: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Hitrost pretoka: 1,2 ml/min Skupni čas izvedbe: približno 33 min

9.2

Kromatografija se spreminja glede na vrsto HPLC in uporabljeni material za polnitev kolone. Izbrani sistem mora zagotavljati ločevanje bazne linije triptofana in internega standarda. Poleg tega je pomembno, da se produkti razgradnje dobro ločijo od triptofana in internega standarda. Izvede se postopek s hidrolizatom brez internega standarda, da se preveri bazna linija internega standarda za nečistoče. Pomembno je, da je čas izvedbe dovolj dolg, da se eluirajo vsi produkti razgradnje, sicer lahko zapozneli vrhovi eluiranja motijo nadaljnje kromatografiranje. Kromatografski sistem se v delovnem območju odziva linearno. Linearni odziv se izmeri s konstantno (običajno) koncentracijo internega standarda in različnimi koncentracijami triptofana. Zelo pomembno je, da so velikosti vrhov triptofana in internega standarda v linearnem območju HPLC/fluorescenčnega sistema. Če so vrhovi triptofana in/ali internega standarda prenizki ali previsoki, se analiza ponovi z drugačno količino vzorca in/ali drugačnim končnim volumnom.

9.3   Barijev hidroksid

Topnost barijevega hidroksida se s staranjem zmanjša. Posledica tega je motna raztopina za določitev HPLC, kar lahko povzroči nizke rezultate za triptofan.

G.   DOLOČANJE SUROVIH OLJ IN MAŠČOB

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje vsebnosti surovih olj in maščob v krmi.

Vrsta in sestava krme ter namena izvajanja analize vplivata na uporabo spodaj opisanih postopkov.

Za določanje vsebnosti surovih olj in maščob v oljnih semenih in oljnatem sadju ter v krmi, v kateri je vsebnost surovih olj/maščob večja od 15 %, bi bilo treba ekstrakcijo opraviti s postopkom A, ponovno ekstrakcijo pa s postopkom B (točka 5.3).

1.1   Postopek A – Surova olja in maščobe, ki se ekstrahirajo neposredno

Ta metoda se uporablja za posamična krmila rastlinskega izvora, razen tistih, ki so zajeta v področje uporabe postopka B.

1.2   Postopek B – Celotna surova olja in maščobe

Ta metoda se uporablja za posamična krmila živalskega izvora in za vse krmne mešanice. Uporablja se za vsa posamična krmila, iz katerih ni mogoče povsem ekstrahirati olj in maščob brez predhodne hidrolize (npr. gluten, kvasovke, krompirjeve beljakovine in proizvodi, pri katerih se izvaja ekstrudiranje, kosmičenje in segrevanje).

1.3   Razlaga rezultatov

Vedno kadar je rezultat pri postopku B višji od rezultata pri postopku A, se kot prava vrednost sprejme rezultat, dobljen pri postopku B.

2.   Načelo

2.1   Postopek A

Vzorec se ekstrahira s petroletrom. Topilo se oddestilira, ostanek pa osuši in stehta.

2.2   Postopek B

Vzorec se med segrevanjem obdela s klorovodikovo kislino. Mešanica se ohladi in filtrira. Ostanek se spere in osuši, nato pa se izvede določanje v skladu s postopkom A.

3.   Reagenti

3.1

Petroleter, vrelišče: 40 do 60 °C. Bromno število mora biti nižje od 1 in ostanek pri uparevanju nižji od 2 mg/100 ml.

3.2

Natrijev sulfat, brezvodni.

3.3

Klorovodikova kislina, c = 3 mol/l.

3.4

Filtracijsko sredstvo, npr. Kieselguhr, Hyflo-supercel.

4.   Naprava

4.1

Naprava za ekstrakcijo. Če je opremljena s sifonom (naprava Soxhlet), je hitrost povratnega toka približno 10 ciklov na uro; če ni opremljena s sifonom, je hitrost povratnega toka približno 10 ml na minuto.

4.2

Kartuše za ekstrakcijo, ki ne vsebujejo materialov, topnih v petroletru, in s poroznostjo, ki je v skladu z zahtevami iz točke 4.1.

4.3

Sušilnik, vakuumski, nastavljen na 75 °C ± 3 °C, ali zračni, nastavljen na 100 °C ± 3 °C.

5.   Postopek

5.1   Postopek A (glej točko 8.1)

5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno, prenese v kartušo za ekstrakcijo (točka 4.2) in pokrije s čepkom iz vate, ki ne vsebuje maščobe.

Kartuša se postavi v ekstraktor (točka 4.1) in šest ur ekstrahira s petroletrom (točka 3.1). Ekstrakt petroletra se zbere v suho stehtano bučko, v kateri so delci plovca (6).

Topilo se oddestilira. Ostanek se osuši tako, da se bučka za uro in pol postavi v sušilnik (točka 4.3). Pusti se, da se ohladi v eksikatorju, in stehta. Ponovno se suši 30 minut, da se zagotovi ohranitev konstantne mase olj in maščob (izguba mase med dvema zaporednima tehtanjema ne sme presegati 1 mg).

5.2   Postopek B

2,5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno (glej točko 8.2), prenese v 400-mililitrsko čašo ali 300-mililitrsko erlenmajerico ter dodajo 100 ml klorovodikove kisline (točka 3.3) in delci plovca. Čaša se pokrije z urnim steklom ali pa se erlenmajerica spoji s povratnim hladilnikom. Pri nizkem plamenu ali na električni kuhalniki plošči se mešanica počasi zavre in se pusti rahlo vreti eno uro. Paziti je treba, da se vzorec ne oprijema sten posode.

Ohladi se in doda toliko filtracijskega sredstva (točka 3.4), da med filtracijo ne pride do izgub olja in maščob. Filtrira se skozi navlažen, dvojni filtrirni papir, ki ne vsebuje maščob. Ostanek se spere s hladno vodo, dokler filtrat ni nevtralen. Prepričati se je treba, da filtrat ne vsebuje nobenih olj ali maščob. Njihova prisotnost pomeni, da se mora vzorec pred hidrolizo ekstrahirati s petroletrom po postopku A.

Dvojni filtrirni papir, na katerem je ostanek, se prenese na urno steklo in se uro in pol suši v sušilniku (točka 4.3) pri 100 °C ± 3 °C.

Dvojni filtrirni papir s suhim ostankom se prenese v kartušo za ekstrakcijo (točka 4.2) in pokrije s čepkom iz vate, ki ne vsebuje maščob. Kartuša se postavi v ekstraktor (točka 4.1), nato pa se nadaljuje, kakor je navedeno v drugem in tretjem odstavku točke 5.1.

5.3   Postopek A in ponovna ekstrakcija s postopkom B

Za določanje vsebnosti surovih olj in maščob v oljnih semenih in oljnatem sadju ter v krmi, v kateri je vsebnost surovih olj/maščob večja od 15 %, bi bilo treba ekstrakcijo opraviti s postopkom A, ponovno ekstrakcijo pa s postopkom B.

To pomeni, da je po ekstrakciji s petroletrom (postopek A), ostanek ali del ostanka ponovno ekstrahirajo s klorovodikovo kislino (postopek B). Vsebnost surovih olj in maščob je vsota rezultata postopkov A in B.

6.   Prikaz rezultatov

Masa ostanka se izrazi kot masni delež vzorca.

7.   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, ki jih na istem vzorcu izvaja isti analitik, ne presega:

—	0,2 % v absolutni vrednosti za vsebnosti surovih olj in maščobe, nižje od 5 %,

—	4,0 % relativno glede na najvišji rezultat, za vsebnosti med 5 % do 10 %,

—	0,4 % v absolutni vrednosti za vsebnosti nad 10 %.

8.   Opombe

8.1

Pri proizvodih z visoko vsebnostjo olj in maščob, ki jih je težko zdrobiti ali so neprimerni za pripravo homogenega zmanjšanega preskusnega vzorca, se uporabi naslednji postopek. 20 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in zmeša z 10 g ali več brezvodnega natrijevega sulfata (točka 3.2). Ekstrahira se s petroletrom (točka 3.1), kakor je navedeno v točki 5.1. Ekstrakt se dopolni s petroletrom do 500 ml (točka 3.1) in premeša. 50 ml raztopine se prenese v majhno suho stehtano bučko, v kateri so delci plovca. Oddestilira se topilo, se osuši, nato pa se nadaljuje, kakor je določeno v zadnjem odstavku točke 5.1. Iz ostanka po ekstrakciji v kartuši se odstrani topilo, ostanek se zdrobi do velikosti delcev 1 mm, vrne v kartušo za ekstrakcijo (natrijev sulfat se ne doda), nato pa se nadaljuje, kakor je določeno v drugem in tretjem odstavku točke 5.1. Vsebnost olj in maščob kot masni delež vzorca se izračuna po naslednji formuli: pri čemer je: m1 = masa ostanka po prvi ekstrakciji (alikvot ekstrakta) v gramih m2 = masa ostanka po drugi ekstrakciji v gramih

8.2

Pri nekaterih proizvodih (npr. z nizko vsebnostjo olj in maščob) se lahko preskusni vzorec poveča.

8.3

Hrano za hišne živali, ki vsebuje veliko vode, je treba včasih pred hidrolizo in ekstrakcijo po postopku B zmešati z brezvodnim natrijevim sulfatom.

8.4

Pri točki 5.2 je za spiranje ostanka po filtraciji morda učinkoviteje uporabiti vročo vodo namesto hladne.

8.5

Pri nekateri krmi je morda treba podaljšati čas sušenja na več kot uro in pol. Odvečnemu sušenju se je treba izogibati, saj lahko povzroči nizke rezultate. Uporabi se lahko tudi mikrovalovna pečica.

H.   DOLOČANJE SUROVIH VLAKEN

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje organskih snovi brez maščob v krmi, ki so netopne v kislih in baznih medijih ter so običajno opisane kot surova vlakna.

Metoda se ne uporablja v primeru lesne celuloze in rastlinskega oglja (delci so predrobni).

2.   Načelo

Vzorec se po potrebi razmasti in zaporedno obdela s specificiranimi koncentracijami vrelih raztopin žveplove kisline in kalijevega hidroksida. Ostanek se loči s filtracijo skozi filter iz sintranega stekla, spere, posuši, stehta in upepeli pri 475 oC–500 oC. Izguba teže pri upepeljevanju ustreza vsebnosti surovih vlaken v preskusnem vzorcu.

3.   Reagenti

3.1

Žveplova kislina, c = 0,13 mol/l

3.2

Sredstvo proti penjenju (npr. n-oktanol)

3.3

Filtrirno sredstvo (Celite 545 ali enakovredno), segreto na 500 oC za štiri ure (točka 8.6)

3.4

Aceton

3.5

Petroleter, vrelišče 40 oC–60 oC

3.6

Klorovodikova kislina, c = 0,5 mol/l

3.7

Raztopina kalijevega hidroksida, c = 0,23 mol/l

4.   Naprava

4.1

Enota za segrevanje za razklop z žveplovo kislino in raztopino kalijevega hidroksida, opremljena z dodatkom za filtrirni lonček (točka 4.2) in odtočno cevjo, ki je preko zamaška priklopljena na tekočino in vakuum, po možnosti s stisnjenim zrakom. Pred vsako uporabo se enota pet minut segreva z vrelo vodo.

4.2

Stekleni filtrirni lonček z nameščeno filtrirno ploščo iz sintranega stekla in velikosti por 40 μm–90 μm. Pred prvo uporabo ga je treba za nekaj minut segreti na 500 oC in ohladiti (točka 8.6).

4.3

Valj, volumna vsaj 270 ml, s povratnim hladilnikom, primernim za vretje

4.4

Sušilnik s termostatom

4.5

Žarilna peč s termostatom

4.6

Enota za ekstrakcijo, sestavljena iz podporne plošče za filtrirni lonček (točka 4.2) in odtočne cevi, ki je preko zamaška priklopljena na vakuum in tekočino

4.7

Obročki, ki povežejo enoto za segrevanje (točka 4.1), lonček (točka 4.2) in valj (točka 4.3) ter enoto za hladno ekstrakcijo (točka 4.6) in lonček

5.   Postopek

1 g pripravljenega vzorca se natehta na 1 mg natančno in prenese v lonček (točka 4.2) (glej točke 9.1, 9.2 in 9.3), čemur se doda 1 g filtrirnega sredstva (točka 3.3).

Najprej se povežeta enota za segrevanje (točka 4.1) in filtrirni lonček (točka 4.2), nato pa valj (točka 4.3) in lonček. V povezana valj in lonček se nalije 150 ml vrele žveplove kisline (točka 3.1) in po potrebi nekaj kapljic sredstva proti penjenju (točka 3.2).

Tekočina se zavre v 5 ± 2 minutah ter pusti močno vreti natančno 30 minut.

Odpre se zamašek na odtočni cevi (točka 4.1), žveplova kislina se pod vakuumom filtrira skozi filtrirni lonček, ostanek pa se trikrat zaporedoma spere s po 30 ml vrele vode, pri čemer se zagotovi, da je filtrirni ostanek po vsakem spiranju suh.

Odtočni zamašek se zapre, v povezana valj in lonček se nalije 150 ml vrele raztopine kalijevega hidroksida (točka 3.7), nato pa se doda nekaj kapljic sredstva proti penjenju (točka 3.2). Tekočina se zavre v 5 ± 2 minutah ter pusti močno vreti natančno 30 minut. To se filtrira, postopek spiranja pa se ponovi, kakor je bil uporabljen za žveplovo kislino.

Po končnem spiranju in sušenju se lonček z vsebino odklopi in priklopi na enoto za hladno ekstrakcijo (točka 4.6). Ostanek v lončku se pod vakuumom trikrat zaporedoma spere s po 25 ml acetona (točka 3.4), pri čemer se zagotovi, da je filtrirni ostanek po vsakem spiranju suh.

Lonček se suši v sušilniku pri 130 oC do konstantne mase. Po vsakem sušenju se ohladi v eksikatorju in hitro stehta. Lonček se postavi v žarilno peč in pri 475 oC–500 oC žari najmanj 30 minut do konstantne mase (izguba mase med dvema zaporednima tehtanjema ne sme presegati 2 mg).

Po vsakem segrevanju in pred merjenjem se lonček najprej ohladi v peči, nato pa še v eksikatorju.

Slepi preskus se izvede brez vzorca. Izguba mase pri upepeljevanju ne sme presegati 4 mg.

6.   Izračun rezultatov

Vsebnost surovih vlaken, izražena kot masni delež vzorca, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

m	=	masa vzorca v gramih
m0	=	izguba mase po upepeljevanju pri določanju v gramih
m1	=	izguba mase po upepeljevanju pri slepem preskusu v gramih

7.   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati:

—	0,6 % v absolutni vrednosti za vsebnosti surovih vlaken, manjše od 10 %,

—	6 % relativno glede na višji rezultat za vsebnosti surovih vlaken 10 % ali več.

8.   Obnovljivost

Razlika med rezultatoma dveh določitev, izvedena na istem vzorcu v različnih laboratorijih ne sme presegati:

—	1,0 % v absolutni vrednosti za vsebnosti surovih vlaken, manjše od 10 %,

—	10 % relativno glede na višji rezultat za vsebnosti surovih vlaken 10 % ali več.

9.   Opombe

9.1

Krmo, ki vsebuje več kakor 10 % surovih maščob, je treba pred analizo razmastiti s petroletrom (točka 3.5). Filtrirni lonček (točka 4.2) z vsebino se poveže z enoto za hladno ekstrakcijo (točka 4.6), ostanek pa se pod vakuumom trikrat zaporedoma spere s po 30 ml petroletra, pri čemer se zagotovi, da je ostanek suh. Lonček z vsebino se poveže z enoto za segrevanje (točka 4.1), nadaljuje pa se v skladu s točko 5.

9.2

Krmo, ki vsebuje maščobe, ki se ne morejo neposredno ekstrahirati s petroletrom (točka 3.5), je treba razmastiti, kakor je navedeno v točki 8.1, in ponovno razmastiti po vretju s kislino. Po vretju s kislino in nadaljnjim spiranjem se lonček z vsebino poveže z enoto za hladno ekstrakcijo (točka 4.6) ter trikrat spere s po 30 ml acetona, nato pa trikrat s po 30 ml petroletra. Filtrira se pod vakuumom do suhega stanja, nadaljuje pa se, kakor je navedeno v točki 5, pri čemer se začne z dodajanjem kalijevega hidroksida.

9.3

Če krma vsebuje več kot 5 % karbonatov, izraženih kot kalcijev karbonat, se lonček (točka 4.2) z natehtanim vzorcem poveže z enoto za segrevanje (točka 4.1). Vzorec se trikrat spere s po 30 ml klorovodikove kisline (točka 3.6). Po vsakem dodajanju je treba vzorec pustiti stati približno eno minuto, preden se filtrira. Enkrat se spere s 30 ml vode, nato pa se nadaljuje, kakor je navedeno v točki 5.

9.4

Če se uporablja naprava v obliki stojala (številni lončki, povezani na isto enoto za segrevanje), se v isti seriji ne smeta opraviti posamezni določanji na istem vzorcu za analizo.

9.5

Če je po vretju težko filtrirati kisle in bazične raztopine, se uporabi stisnjen zrak skozi odtočno cev enote za segrevanje in se nato nadaljuje s filtriranjem.

9.6

Temperatura upepeljevanja ne presega 500 oC, da se podaljša obstojnost steklenih filtrirnih lončkov. Potrebna je previdnost, da se preprečijo odvečni toplotni šoki med segrevanjem ali hlajenjem.

I.   DOLOČANJE SLADKORJA

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje količine reducirajočih sladkorjev in celotnih sladkorjev po inverziji, izraženih kot glukoza ali, kadar je to primerno, saharoza s faktorjem preračunavanja 0,95. Uporablja se za krmne mešanice. Za drugo krmo se uporabljajo posebne metode. Kadar je primerno, se laktoza izmeri ločeno in upošteva pri izračunu rezultata.

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti sladkorja za uporabo pri izračunu energijske vrednosti krme.

Kadar se vsebnost sladkorja določa za druge namene, se lahko uporabijo druge analizne metode.

2.   Načelo

Sladkorji se ekstrahirajo z razredčenim etanolom in raztopina se zbistri z raztopinama Carrez I in II. Po odstranitvi etanola se določijo količine pred inverzijo in po njej po Luff-Schoorlovi metodi.

3.   Reagenti

3.1

Etanol, 40-odstotna raztopina (v/v), gostota: 0,948 g/ml pri 20 °C, nevtraliziran proti fenolftaleinu

3.2

Raztopina Carrez I: 21,9 g cinkovega acetata Zn(CH3COO)2 2H2O in 3 g led-ocetne kisline se raztopijo v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.3

Raztopina Carrez II: 10,6 g kalijevega ferocianida K4Fe (CN)6 3H2O se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.4

Metil oranž, 0,1-odstotna raztopina (m/v)

3.5

Klorovodikova kislina, 4 mol/l

3.6

Klorovodikova kislina, 0,1 mol/l

3.7

Raztopina natrijevega hidroksida, 0,1 mol/l

3.8

Luff-Schoorlov reagent: Med previdnim mešanjem se v raztopino natrijevega karbonata (točka 3.8.3) vlije raztopina citronske kisline (točka 3.8.2). Doda se raztopina bakrovega sulfata (točka 3.8.1), nato pa se dopolni z vodo do 1 litra. Pusti se čez noč, da se usede, in nato filtrira. Preveri se koncentracija tako dobljenega reagenta (Cu 0,05 mol/litre; Na2 CO3 1 mol/litre), glej zadnji odstavek točke 5.4. Vrednost pH raztopine je približno 9,4.

3.8.1

Raztopina bakrovega sulfata: v 100 ml vode se raztopi 25 g bakrovega sulfata (Cu SO4 5H2O), ki ne vsebuje železa.

3.8.2

Raztopina citronske kisline: v 50 ml vode se raztopi 50 g citronske kisline (C6H8O7•H2O).

3.8.3

Raztopina natrijevega karbonata: v približno 300 ml tople vode se raztopi 143,8 g brezvodnega natrijevega karbonata. Pusti se, da se ohladi.

3.9

Raztopina natrijevega tiosulfata, 0,1 mol/l.

3.10

Raztopina škroba: v liter vrele vode se doda suspenzija 5 g topnega škroba v 30 ml vode. Pusti se vreti tri minute, nato se ohladi in po potrebi doda 10 mg živosrebrovega jodida kot konzervansa.

3.11

Žveplova kislina, 3 mol/l

3.12

Kalijev jodid, 30-odstotna raztopina (m/v)

3.13

Zdrobljen plovec, prevret v klorovodikovi kislini, opran z vodo in osušen

3.14

3-metilbutan-1-ol

4.   Naprava

Mešalec: približno 35 do 40 obr./min.

5.   Postopek

5.1   Ekstrakcija vzorca

2,5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in prenese v 250-mililitrsko merilno bučko. Doda se 200 ml etanola (točka 3.1) in v mešalniku meša eno uro. Doda se 5 ml raztopine Carrez I (točka 3.2) in meša približno 30 sekund. Doda se 5 ml raztopine Carrez II (točka 3.3) in ponovno meša eno minuto. Dopolni se z etanolom (točka 3.1) do oznake, homogenizira in filtrira. Odstrani se 200 ml filtrata in upari približno do polovice, da se odstrani skoraj ves etanol. Ostanek po uparevanju se s toplo vodo prenese v 200-mililitrsko merilno bučko, ohladi se, dopolni z vodo do oznake, homogenizira in po potrebi filtrira. Ta raztopina se uporabi za določanje količine reducirajočih sladkorjev, po inverziji pa celotnih sladkorjev.

5.2   Določanje reducirajočih sladkorjev

Odpipetira se največ 25 ml raztopine, ki vsebuje manj kot 60 mg reducirajočih sladkorjev, izraženih kot glukoza. Po potrebi se dopolni z destilirano vodo do 25 ml in določi vsebnost reducirajočih sladkorjev po Luff-Schoorlovi metodi. Rezultat se izrazi kot masni delež glukoze v vzorcu.

5.3   Določanje celotnih sladkorjev po inverziji

50 ml raztopine se odpipetira v 100-mililitrsko merilno bučko. Doda se nekaj kapljic raztopine metil oranža (točka 3.4), nato pa se previdno in ob neprestanem mešanju doda klorovodikova kislina (točka 3.5), dokler tekočina na postane izrazito rdeča. Doda se 15 ml klorovodikove kisline (točka 3.6), bučka se potopi v skoraj vrelo vodno kopel in v njej pusti 30 minut. Hitro se ohladi na približno 20 °C, nato pa se doda 15 ml raztopine natrijevega hidroksida (točka 3.7). Dopolni se z vodo do 100 ml in homogenizira. Odstrani se največ 25 ml raztopine, ki vsebuje manj kot 60 mg reducirajočih sladkorjev, izraženih kot glukoza. Po potrebi se dopolni z destilirano vodo do 25 ml in določi vsebnost reducirajočih sladkorjev po Luff-Schoorlovi metodi. Rezultat se izrazi kot masni delež glukoze ali, kadar je to ustrezno, saharoze tako, da se pomnoži s faktorjem 0,95.

5.4   Titracija po Luff-Schoorlovi metodi

25 ml Luff-Schoorlovega reagenta (točka 3.8) se odpipetira v 300-mililitrsko erlenmajerico; doda se natančno 25 ml zbistrene raztopine sladkorja. Dodata se 2 zrni plovca (točka 3.13) in med ročnim mešanjem se segreva nad prostim plamenom srednje višine tako, da raztopina zavre v približno dveh minutah. Erlenmajerica se takoj postavi na žično mrežico, prevlečeno z azbestom, ki ima odprtino s premerom približno 6 cm, pod katero je prižgan plamen. Plamen se naravna tako, da se segreva le dno erlenmajerice. Na erlenmajerico se namesti povratni hladilnik. Pustimo vreti natanko deset minut. Takoj se ohladi v mrzli vodi in čez približno pet minut titrira na naslednji način:

doda se 10 ml raztopine kalijevega jodida (točka 3.12) in takoj nato (previdno zaradi možnosti močnega penjenja) 25 ml žveplove kisline (točka 3.11). Z raztopino natrijevega tiosulfata (točka 3.9) se titrira do svetlorumene barve, doda se indikator škrob (točka 3.10), nato pa se titracija zaključi.

Enaka titracija se izvede brez vretja z natančno izmerjeno mešanico 25 ml Luff-Schoorlovega reagenta (točka 3.8) in 25 ml vode, potem ko se ji doda 10 ml raztopine kalijevega jodida (točka 3.12) in 25 ml žveplove kisline (točka 3.11).

6.   Izračun rezultatov

S pomočjo tabele se določi količina glukoze v mg, ki ustreza razliki med vrednostma obeh titracij, izraženi v ml natrijevega tiosulfata 0,1 mol/l. Rezultat se izrazi kot masni delež vzorca.

7.   Posebni postopki

7.1

Pri krmi, ki vsebuje veliko melase, in drugi krmi, ki ni zelo homogena, se natehta 20 g vzorca in s 500 ml vode prenese v litrsko merilno bučko. V mešalniku se meša eno uro. Raztopina se zbistri z uporabo raztopin Carrez I (točka 3.2) in II (točka 3.3), kakor je opisano v točki 5.1, vendar se uporabi štirikratna količina vsakega reagenta. Bučka se dopolni z 80-odstotnim etanolom (v/v) do oznake. Homogenizira se in filtrira. Etanol se odstrani, kakor je opisano v točki 5.1. Če ni dekstriniranega škroba, se dopolni do oznake z destilirano vodo.

7.2

V primeru melas in posamične krme, ki vsebujejo veliko sladkorja in so skoraj brez škroba (rožiči, posušene rezine pese itd.), se natehta 5 g in prenese v 250-mililitrsko merilno bučko, doda se 200 ml destilirane vode in eno uro ali po potrebi več meša v mešalniku. Raztopina se zbistri z uporabo raztopin Carrez I (točka 3.2) in II (točka 3.3), kakor je opisano v točki 5.1. Dopolni se z mrzlo vodo do oznake, homogenizira in filtrira. Za določanje količine celotnih sladkorjev se nadaljuje, kakor je opisano v točki 5.3.

8.   Opombe

8.1

Za preprečevanje penjenja je priporočljivo, da se pred vretjem z Luff-Schoorlovim reagentom doda (ne glede na volumen) približno 1 ml 3-metilbutan-1-ola (točka 3.14).

8.2

Razlika med vsebnostjo celotnih sladkorjev po inverziji, izraženih kot glukoza, in vsebnostjo reducirajočih sladkorjev, izraženih kot glukoza, pomnoženo z 0,95, je masni deleži saharoze.

8.3

Za določanje vsebnosti reducirajočih sladkorjev, razen laktoze, se lahko uporabljata dve metodi:

8.3.1

Za približen izračun se vsebnost laktoze, določena z drugo analizno metodo, pomnoži z 0,675, dobljeni rezultat pa se odšteje od vsebnosti reducirajočih sladkorjev.

8.3.2

Za natančen izračun reducirajočih sladkorjev, razen laktoze, je treba za dve končni določitvi uporabiti isti vzorec. Ena od analiz se izvede na delu raztopine, ki nastane pri postopku iz točke 5.1, druga pa na delu raztopine, ki nastane pri določanju laktoze z metodo, določeno za navedeni namen (po fermentiranju drugih vrst sladkorja in zbistritve). V obeh primerih se količina sladkorja določi z Luff-Schoorlovo metodo in izračuna v mg glukoze. Ena vrednost se odšteje od druge in razlika se izrazi kot masni delež vzorca. Primer Za vsako določanje oba uporabljena volumna ustrezata 250 mg vzorca. V prvem primeru porabimo 17 ml raztopine natrijevega tiosulfata 0,1 mol/l, kar ustreza 44,2 mg glukoze; v drugem pa 11 ml, kar ustreza 27,6 mg glukoze. Razlika je 16,6 mg glukoze. Vsebnost reducirajočih sladkorjev (razen laktoze), izračunana kot glukoza, je zato: Tabela vrednosti za 25 ml Luff-Schoorlovega reagenta ml Na2 S2 O3 0,1 mol/l, dve minuti segrevanja, deset minut vretja Na2 S2 O3 0,1 mol/l Glukoza, fruktoza, invertni sladkorji C6 H12 O6 Laktoza C12 H22 O11 Na2 S2 O3 0,1 mol/l ml mg razlika mg razlika ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

J.   DOLOČANJE LAKTOZE

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni laktoze v krmi, ki vsebuje več kot 0,5 % laktoze.

2.   Načelo

Sladkorji se raztopijo v vodi. Raztopina se fermentira s kvasovkami Saccharomyces cerevisiae, ki ne spreminjajo laktoze. Po zbistritvi in filtriranju se vsebnost laktoze v filtratu določi po Luff-Schoorlovi metodi.

3.   Reagenti

3.1

Suspenzija kvasovk Saccharomyces cerevisiae: 25 g svežih kvasovk se raztopi v 100 ml vode. Suspenzija je ob hranjenju v hladilniku uporabna največ en teden.

3.2

Raztopina Carrez I: 21,9 g cinkovega acetata Zn(CH3 COO)2 2H2O in 3 g led-ocetne kisline se raztopijo v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.3

Raztopina Carrez II: 10,6 g kalijevega ferocianida K4Fe (CN)6 3H2O se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.4

Luff-Schoorlov reagent: Med previdnim mešanjem se v raztopino natrijevega karbonata (točka 3.4.3) vlije raztopina citronske kisline (točka 3.4.2). Doda se raztopina bakrovega sulfata (točka 3.4.1), nato pa se dopolni z vodo do 1 litra. Pusti se čez noč, da se usede, in nato filtrira. Preveri se koncentracija tako dobljenega reagenta (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l). Vrednost pH raztopine je približno 9,4.

3.4.1

Raztopina bakrovega sulfata: v 100 ml vode se raztopi 25 g bakrovega sulfata (Cu SO4 5H2O), ki ne vsebuje železa.

3.4.2

Raztopina citronske kisline: v 50 ml vode se raztopi 50 g citronske kisline (C6H8O7•H2O).

3.4.3

Raztopina natrijevega karbonata: v približno 300 ml tople vode se raztopi 143,8 g brezvodnega natrijevega karbonata. Pusti se, da se ohladi.

3.5

Zdrobljen plovec, prevret v klorovodikovi kislini, opran z vodo in osušen

3.6

Kalijev jodid, 30-odstotna raztopina (m/v)

3.7

Žveplova kislina, 3 mol/l

3.8

Raztopina natrijevega tiosulfata, 0,1 mol/l

3.9

Škrobovica: v 1 liter vrele vode se doda suspenzija 5 g topnega škroba v 30 ml vode. Pusti se vreti tri minute, nato se ohladi in po potrebi doda 10 mg živosrebrovega jodida kot konzervansa.

4.   Naprava

Vodna kopel s termostatom, nastavljenim na 38 °C–40 °C

5.   Postopek

1 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in prenese v 100-mililitrsko merilno bučko. Doda se 25 ml–30 ml vode. Bučko za trideset minut postavimo v vrelo vodno kopel, nato ohladimo na približno 35 °C. Doda se 5 ml suspenzije kvasovk (točka 3.1) in homogenizira. Bučka se pusti dve uri v vodni kopeli pri temperaturi 38 °C–40 °C. Ohladi se na približno 20 °C.

Doda se 2,5 ml raztopine Carrez I (točka 3.2) in meša trideset sekund, nato se doda 2,5 ml raztopine Carrez II (točka 3.3) in ponovno meša trideset sekund. Dopolni se z vodo do 100 ml, premeša in filtrira. Del filtrata, ki ne presega 25 ml in ki priporočljivo vsebuje 40 mg do 80 mg laktoze, se odpipetira in prenese v 300-mililitrsko erlenmajerico. Po potrebi se dopolni z vodo do 25 ml.

Slepi preskus s 5 ml suspenzije kvasovk (točka 3.1) se izvede pri enakih pogojih. Vsebnost laktoze se določi po Luff-Schoorlovi metodi na naslednji način: doda se natančno 25 ml Luff-Schoorlovega reagenta (točka 3.4) in dve zrni plovca (točka 3.5). Med ročnim mešanjem se segreva nad prostim plamenom srednje jakosti tako, da tekočina zavre v približno dveh minutah. Erlenmajerica se takoj postavi na žično mrežico, prevlečeno z azbestom, ki ima odprtino s premerom približno 6 cm, pod katero je prižgan plamen. Plamen se naravna tako, da se segreva le dno erlenmajerice. Na erlenmajerico se namesti povratni hladilnik. Pustimo vreti natanko deset minut. Takoj se ohladi v mrzli vodi in čez približno pet minut titrira na naslednji način:

doda se 10 ml raztopine kalijevega jodida (točka 3.6) in takoj nato (previdno zaradi možnosti močnega penjenja) 25 ml žveplove kisline (točka 3.7). Z raztopino natrijevega tiosulfata (točka 3.8) se titrira do svetlorumene barve, doda se indikator škrob (točka 3.9), nato pa se titracija zaključi.

Enaka titracija se izvede brez vretja z natančno izmerjeno mešanico 25 ml Luff-Schoorlovega reagenta (točka 3.4) in 25 ml vode, potem ko se ji doda 10 ml raztopine kalijevega jodida (točka 3.6) in 25 ml žveplove kisline (točka 3.7).

6.   Izračun rezultatov

S pomočjo priložene tabele se določi količina laktoze v mg, ki ustreza razliki med rezultatoma dveh titracij, izraženima v ml natrijevega tiosulfata 0,1 mol/l.

Rezultat se izrazi kot masni delež brezvodne laktoze v vzorcu.

7.   Opomba

1.

Pri proizvodih, ki vsebujejo več kot 40 % fermentiranega sladkorja, se uporabi več kot 5 ml suspenzije kvasovk (točka 3.1).

2.

V krmi z zmanjšano vsebnostjo laktoze (npr. mačje mleko) se laktoza pretvori v fruktozo, ki ni popolnoma fermentirana v dveh urah, kar privede do višjih ali lažno pozitivnih rezultatov (ker ostanki fruktoze ostanejo v ekstraktu). Tabela vrednosti za 25 ml Luff-Schoorlovega reagenta ml Na2 S2 O3 0,1 mol/l, dve minuti segrevanja, deset minut vretja Na2 S2 O3 0,1 mol/l Glukoza, fruktoza, invertni sladkorji C6 H12 O6 Laktoza C12 H22 O11 Na2 S2 O3 0,1 mol/l ml mg razlika mg razlika ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   DOLOČANJE ŠKROBA

POLARIMETRIČNA METODA

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni škroba in visokomolekularnih produktov razgradnje škroba v krmi za preverjanje skladnosti z označeno energijsko vrednostjo (določbe iz Priloge VII) in Uredbo (ES) št. 767/2009.

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti škroba za uporabo pri izračunu energijske vrednosti krme.

Kadar se vsebnost škroba določa za druge namene, se lahko uporabijo druge analizne metode.

2.   Načelo

Metoda vključuje dve določanji. Pri prvi se vzorec obdela z razredčeno klorovodikovo kislino. Po zbistritvi in filtriranju se s polarimetrijo izmeri optična rotacija raztopine.

Pri drugi se vzorec ekstrahira s 40-odstotnim etanolom. Po zakisljevanju filtrata s klorovodikovo kislino ter zbistritvi in filtriranju se izmeri optična rotacija tako kot pri prvem določanju.

Razlika med dvema meritvama, pomnožena z znanim faktorjem, je vsebnost škroba v vzorcu.

3.   Reagenti

3.1

Klorovodikova kislina, 25-odstotna raztopina (m/v), gostota: 1,126 g/ml

3.2

Klorovodikova kislina, 1,13-odstotna raztopina (m/v) Koncentracija se mora preveriti s titracijo z 0,1 mol/l raztopino natrijevega hidroksida v prisotnosti 0,1-odstotnega (m/v) metil rdečega v 94-odstotnem (v/v) etanolu. Za nevtralizacijo 10 ml je potrebno 30,94 ml NaOH 0,1 mol/l.

3.3

Raztopina Carrez I: 21,9 g cinkovega acetata Zn(CH3COO)2 2H2O in 3 g led-ocetne kisline se raztopijo v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.4

Raztopina Carrez II: 10,6 g kalijevega ferocianida K4 Fe(CN)6 3H2O se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.5

Etanol, 40-odstotna raztopina (v/v), gostota: 0,948 g/ml pri 20 °C.

4.   Naprava

4.1

250 ml erlenmajerica s standardnim brušenim vratom in povratnim hladilnikom

4.2

Polarimeter ali saharimeter

5.   Postopek

5.1   Priprava vzorca

Vzorec se zdrobi tako, da vsi delci preidejo skozi sito z okroglimi luknjicami premera 0,5 mm.

5.2   Določanje celotne optične rotacije (P ali S) (glej točko 7.1)

2,5 g zdrobljenega vzorca se natehta na 1 mg natančno in prenese v 100-mililitrsko merilno bučko. Doda se 25 ml klorovodikove kisline (točka 3.2), pretrese se, da nastane enakomerna porazdelitev preskusnega vzorca, nato pa se doda nadaljnjih 25 ml klorovodikove kisline (točka 3.2). Bučka se potopi v vrelo vodno kopel in prve tri minute močno in enakomerno stresa, da se prepreči nastanek aglomeratov. V vodni kopeli mora biti toliko vode, da kopel ostane na točki vrelišča, ko se vanjo potopi bučka. Bučka se med stresanjem ne sme odstraniti iz kopeli. Po točno 15 minutah se odstrani iz kopeli, doda se 30 ml hladne vode in takoj ohladi na 20 °C.

Doda se 5 ml raztopine Carrez I (točka 3.3) in stresa približno 30 sekund. Nato se doda 5 ml raztopine Carrez II (točka 3.4) in ponovno stresa 30 sekund. Dopolni se z vodo do oznake, premeša in filtrira. Če filtrat ni popolnoma bister (kar je redko), se ponovi določanje z uporabo večje količine raztopin Carrez I in II, na primer 10 ml.

Optična rotacija raztopine v 200-milimetrski epruveti se izmeri s polarimetrom ali saharimetrom.

5.3   Določanje optične rotacije (P’ ali S’) snovi, ki so topne v 40-odstotnem etanolu

5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno, prenese v 100-mililitrsko merilno bučko in doda se približno 80 ml etanola (točka 3.5) (glej točko 7.2). Bučka se pusti stati 1 uro na sobni temperaturi; v tem času se šestkrat močno pretrese, da se preskusni vzorec temeljito premeša z etanolom. Dopolni se z etanolom (točka 3.5) do oznake, premeša in filtrira.

50 ml filtrata (kar ustreza 2,5 g vzorca) se odpipetira v 250-mililitrsko erlenmajerico, doda se 2,1 ml klorovodikove kisline (točka 3.1) in močno pretrese. Erlenmajerico spojimo s povratnim hladilnikom in jo potopimo v vrelo vodno kopel. Po točno 15 minutah odstranimo erlenmajerico iz kopeli, prenesemo vsebino v 100 ml merilno bučko, speremo z malo hladne vode in ohladimo na 20 °C.

Zbistrimo z uporabo raztopin Carrez I (točka 3.3.) in II (točka 3.4), dopolnimo do oznake z vodo, premešamo, filtriramo in izmerimo optično rotacijo, kot je navedeno v točki 5.2, drugi in tretji odstavek.

6.   Izračun rezultatov

Vsebnost škroba (%) se izračuna na naslednji način:

6.1   Meritve s polarimetrom

P	=	celotna optična rotacija v kotnih stopinjah
P’	=	optična rotacija snovi, ki so topne v 40-odstotnem (V/V) etanolu, v kotnih stopinjah
	=	specifična optična rotacija čistega škroba Numerične vrednosti, ki se običajno uporabljajo za ta faktor, so naslednje:

+ 185,9	:	rižev škrob
+ 185,7	:	krompirjev škrob
+ 184,6	:	koruzni škrob
+ 182,7	:	pšenični škrob
+ 181,5	:	ječmenov škrob
+ 181,3	:	ovseni škrob
+ 184,0	:	druge vrste škroba in škrobnih mešanic v krmnih mešanicah

6.2   Meritve s saharimetrom

S	=	celotna optična rotacija v stopinjah saharimetra
S’	=	optična rotacija snovi, ki so topne v 40-odstotnem (v/v) etanolu, v stopinjah saharimetra
N	=	masa (g) saharoze v 100 ml vode, pri kateri je optična rotacija 100 saharimetrskih stopinj, kadar se meri z uporabo 200-milimetrske epruvete 16,29 g za francoske saharimetre 26,00 g za nemške saharimetre 20,00 g za mešane saharimetre
	=	specifična optična rotacija čistega škroba (glej točko 6.1)

6.3   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 0,4 v absolutni vrednosti za vsebnost škroba, ki je nižja od 40 %, in 1 % relativno za vsebnost škroba, ki je enaka ali višja od 40 %.

7.   Opombe

7.1

Če vzorec vsebuje več kot 6 % karbonatov, izračunanih v obliki kalcijevega karbonata, se jih mora pred določanjem celotne optične rotacije razkrojiti z obdelavo z natančno ustrezno količino razredčene žveplove kisline.

7.2

V primeru proizvodov, ki imajo visoko vsebnost laktoze, kot je serum mleka v prahu ali posneto mleko v prahu, se po dodatku 80 ml etanola (točka 3.5) izvaja naslednje. Na bučko namestimo povratni hladilnik in jo za 30 minut potopimo v vodno kopel pri 50 °C. Pusti se, da se ohladi, in nadaljuje z analizo, kakor je navedeno v točki 5.3.

7.3

Naslednja posamična krmila, kadar so prisotna v znatni količini v krmi, povzročajo motnje pri določanju vsebnosti škroba s polarimetrično metodo, zaradi česar so lahko rezultati nepravilni: — proizvodi iz (sladkorne) pese, kot so pulpa (sladkorne) pese, melasa (sladkorne) pese, melasirana pulpa (sladkorne) pese, vinasa (sladkorne) pese, (pesni) sladkor, — pulpa citrusov, — laneno seme; pogača iz lanenih semen; ekstrahirano laneno seme, — seme oljne ogrščice; pogača iz semen oljne ogrščice; ekstrahirano seme oljne ogrščice; luščine oljne ogrščice, — sončnično seme; ekstrahirano sončnično seme; sončnično seme, delno oluščeno, ekstrahirano, — pogača iz kopre; ekstrahirana kopra, — krompirjeva pulpa, — suhe kvasovke, — proizvodi z visoko vsebnostjo inulina (npr. čips in moka iz topinamburja), — ocvirki, — sojini proizvodi. V teh primerih se lahko uporabi analizna metoda, določena z Uredbo Komisije (ES) št. 121/2008 (7). Ta metoda se lahko uporabi tudi za krmo, ki vsebuje manj kot 1 % škroba.

L.   DOLOČANJE SUROVEGA PEPELA

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje vsebnosti surovega pepela v krmi.

2.   Načelo

Vzorec se upepeli pri 550 °C; ostanek se stehta.

3.   Reagenti

Amonijev nitrat, 20-odstotna raztopina (m/v)

4.   Naprava

4.1

Električna kuhalna plošča

4.2

Električna žarilna peč s termostatom

4.3

Žarilni lončki za upepeljevanje iz kremena, porcelana ali platine, pravokotni (približno 60 mm × 40 mm × 25 mm) ali okrogli (premer: 60 mm do 75 mm, višina: 20 mm do 40 mm)

5.   Postopek

Približno 5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno (2,5 g pri proizvodih, ki lahko nabreknejo) in prenese v žarilni lonček za upepelitev, ki se predhodno segreje na 550 °C, ohladi in tarira. Lonček se postavi na električno kuhalno ploščo in postopoma segreva, da snov zogleni. Upepeli se v skladu s točko 5.1 ali 5.2.

5.1

Lonček se postavi v umerjeno žarilno peč, segreto na 550 °C. Pri tej temperaturi se pusti, dokler ne nastane bel, svetlosiv ali rdečkast pepel, ki je videti, da ne vsebuje ogljikovih delcev. Lonček se postavi v eksikator, pusti se, da se ohladi, in takoj stehta.

5.2

Lonček se postavi v umerjeno žarilno peč, segreto na 550 °C. Upepeljuje se 3 ure. Lonček se postavi v eksikator, pusti se, da se ohladi, in takoj stehta. Ponovno se upepeljuje za 30 minut, pri čemer mora biti masa pepela konstantna (izguba mase med dvema zaporednima tehtanjema ne sme presegati 1 mg).

6.   Izračun rezultatov

Masa ostanka se izračuna tako, da se odšteje tara.

Rezultat se izrazi kot odstotni delež vzorca.

7.   Opombe

7.1

Snovi, ki se težko upepelijo, je treba najprej najmanj tri ure upepeljevati, nato ohladiti in jim dodati nekaj kapljic 20-odstotne raztopine amonijevega nitrata ali vode (pazljivo, da se pepel ne razprši ali da ne nastanejo grudice). Po sušenju v sušilniku se nadaljuje s kalciniranjem. Postopek se po potrebi ponovi, dokler upepelitev ni popolna.

7.2

Pri snoveh, ki so odporne na obdelavo iz točke 7.1, se nadaljuje na naslednji način: po triurni upepelitvi se pepel prenese v toplo vodo in filtrira skozi majhen filter brez pepela. Filter in njegova vsebina se upepelita v istem lončku. Filtrat se prenese v ohlajen lonček, upari do suhega, upepeli in stehta.

7.3

Pri oljih in maščobah se 25 g vzorca natančno natehta v lonček ustrezne velikosti. Zogleni se tako, da se snov zažge s trakom iz filtrirnega papirja brez pepela. Po sežigu se navlaži s čim manj vode. Osuši in upepeli se, kakor je opisano v točki 5.

M.   DOLOČANJE PEPELA, NETOPNEGA V KLOROVODIKOVI KISLINI

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni mineralnih snovi v krmi, netopnih v klorovodikovi kislini. Glede na naravo vzorca se lahko uporabljata dve metodi.

1.1

Metoda A: uporablja se za organska posamična krmila in za večino krmnih mešanic;

1.2

Metoda B: uporablja se za mineralne spojine in mešanice ter krmne mešanice, ki vsebujejo več kot 1 % snovi, netopnih v klorovodikovi kislini in določenih po metodi A.

2.   Načelo

2.1

Metoda A: vzorec se upepeli, pepel se prevre v klorovodikovi kislini, netopni ostanek pa filtrira in stehta.

2.2

Metoda B: vzorec se obdela s klorovodikovo kislino. Raztopina se filtrira, ostanek se upepeli, tako dobljeni pepel pa se obdela v skladu z metodo A.

3.   Reagenti

3.1

Klorovodikova kislina, 3 mol/l

3.2

Trikloroocetna kislina, 20-odstotna raztopina (m/v)

3.3

Trikloroocetna kislina, 1-odstotna raztopina (m/v)

4.   Naprava

4.1

Električna kuhalna plošča

4.2

Električna žarilna peč s termostatom

4.3

Žarilni lončki za upepeljevanje iz kremena, porcelana ali platine, pravokotni (približno 60 × 40 × 25 mm) ali okrogli (premer: 60 do 75 mm, višina: 20 do 40 mm)

4.4

Filtri brez pepela

5.   Postopek

5.1   Metoda A

Vzorec se upepeli po metodi za določanje surovega pepela. Lahko se uporabi pepel, dobljen pri navedeni analizi.

Pepel se prenese v 250- do 400-mililitrsko čašo s 75 ml klorovodikove kisline (točka 3.1). Počasi segrejemo do vrenja in pustimo rahlo vreti petnajst minut. Topla raztopina se filtrira skozi filtrirni papir brez pepela, ostanek pa se spira s toplo vodo, dokler kisla reakcija ne preneha. Filter z ostankom in pepelom se posuši v tariranem žarilnem lončku pri najmanj 550 °C in največ 700 °C. Ohladi se v eksikatorju in stehta.

5.2   Metoda B

5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in prenese v 250- do 400-mililitrsko čašo. Doda se 25 ml vode in nato 25 ml klorovodikove kisline (točka 3.1), premeša se, nato pa se počaka, da se preneha peniti. Doda se še 50 ml klorovodikove kisline (točka 3.1). Počaka se, da se preneha izločati plin, nato pa se čaša postavi v vrelo vodno kopel za trideset minut ali po potrebi dlje, da se popolnoma hidrolizira kakršen koli škrob, ki je lahko prisoten. Vsebina, ki je še topla, se filtrira skozi filter brez pepela, filter pa se spere s 50 ml tople vode (glej točko 7). Filter, ki vsebuje ostanek, se prenese v žarilni lonček, posuši in upepeli pri najmanj 550 °C in največ 700 °C. Pepel se prenese v 250- do 400-mililitrsko čašo s 75 ml klorovodikove kisline (točka 3.1); nadaljuje se, kakor je opisano v drugem pododstavku točke 5.1.

6.   Izračun rezultatov

Masa ostanka se izračuna tako, da se odšteje tara. Rezultat se izrazi kot odstotni delež vzorca.

7.   Opomba

Če pri filtriranju nastopijo težave, se analiza ponovi, pri čemer se 50 ml klorovodikove kisline (točka 3.1) nadomesti s 50 ml 20-odstotne trikloroocetne kisline (m/v) (točka 3.2), filter pa se spere s toplo raztopino 1-odstotne trikloroocetne kisline (točka 3.3).

N.   DOLOČANJE CELOTNEGA FOSFORJA

Celotni fosfor se določi z naslednjim:

—	analizno metodo, opredeljeno v standardu EN 15510 Krma: metode vzorčenja in analize – Določevanje kalcija, natrija, fosforja, magnezija, kalija, železa, cinka, bakra, mangana, kobalta, molibdena in svinca z ICP-AES, ali

—	analizno metodo, opredeljeno v standardu EN 15621 Krma: metode vzorčenja in analize – Določevanje kalcija, natrija, fosforja, magnezija, kalija, žvepla, železa, cinka, bakra, mangana in kobalta po razklopu pod tlakom z ICP-AES, ali

—	fotometrično metodo, kot je opisana v nadaljevanju.

FOTOMETRIČNA METODA

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje celotne vsebnosti fosforja v krmi. Zlasti primerna je za analizo proizvodov z nizko vsebnostjo fosforja. V nekaterih primerih (pri proizvodih, ki vsebujejo veliko fosforja) se lahko uporabi gravimetrična metoda.

2.   Načelo

Vzorec se mineralizira s suhim sežigom (pri organski krmi) ali z razklopom s kislino (pri mineralnih spojinah in tekoči krmi) ter prenese v kislo raztopino. Raztopini se doda molibdovanadatni reagent. Optična gostota rumene raztopine, ki pri tem nastane, se meri s spektrofotometrom pri 430 nm.

3.   Reagenti

3.1

Kalcijev karbonat.

3.2

Klorovodikova kislina, ρ20 = 1,10 g/ml (približno 6 mol/l).

3.3

Dušikova kislina, ρ20 = 1,045 g/ml.

3.4

Dušikova kislina, ρ20 = 1,38 g/ml do 1,42 g/ml.

3.5

Žveplova kislina, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.6

Molibdovanadatni reagent: v litrski merilni bučki se zmeša 200 ml raztopine amonijevega heptamolibdata (točka 3.6.1), 200 ml raztopine amonijevega monovanadata (točka 3.6.2) in 134 ml dušikove kisline (točka 3.4). Dopolni se z vodo do oznake.

3.6.1

Raztopina amonijevega heptamolibdata: v vroči vodi se raztopi 100 g amonijevega heptamolibdata ((NH4) 6Mo7O24.4H2O). Doda se 10 ml amonijaka (gostota 0,91 g/ml) in dopolni z vodo do 1 litra.

3.6.2

Raztopina amonijevega monovanadata: v 400 ml vroče vode se raztopi 2,35 g amonijevega monovanadata (NH4VO3). Med neprestanim mešanjem se počasi doda 20 ml razredčene dušikove kisline (7 ml HNO3 (točka 3.4) + 13 ml H2O) in dopolni z vodo do 1 litra.

3.7

Standardna raztopina 1 mg fosforja na ml: v vodi se raztopi 4,387 g kalijevega dihidrogen fosfata (KH2PO4). Dopolni se z vodo do 1 litra.

4.   Naprava

4.1

Žarilni lončki iz kremena, porcelana ali platine.

4.2

Električna žarilna peč s termostatom, nastavljenim na 550 oC.

4.3

250-mililitrska Kjeldahlova bučka.

4.4

Merilne bučke in precizijske pipete.

4.5

Spektrofotometer.

4.6

Epruvete s premerom približno 16 mm, z brušenimi zamaški 14,5 mm; volumen: 25 ml do 30 ml.

5.   Postopek

5.1   Priprava raztopine

Glede na naravo vzorca se raztopina pripravi, kakor je navedeno v točki 5.1.1 ali 5.1.2.

5.1.1   Standardni postopek

1 g vzorca ali več se natehta na 1 mg natančno. Preskusni vzorec se prenese v Kjeldahlovo bučko, doda se 20 ml žveplove kisline (točka 3.5), pretrese se, da se vzorec popolnoma prepoji s kislino in da se ne sprijema sten bučke, nato se segreje in pusti vreti 10 minut. Pusti se, da se nekoliko ohladi, dodata se 2 ml dušikove kisline (točka 3.4), zmerno se segreje, pusti se, da se nekoliko ohladi, doda se še nekaj dušikove kisline (točka 3.4) in ponovno segreje do vretja. Postopek se ponavlja do nastanka brezbarvne raztopine. Ohladi se, doda nekaj vode, tekočina se prelije v 500-mililitrsko merilno bučko, Kjeldahlova bučka pa se spere z vročo vodo. Pusti se, da se ohladi, dopolni se z vodo do oznake, homogenizira in filtrira.

5.1.2   Vzorci, ki vsebujejo organske snovi in ne vsebujejo kalcijevih in magnezijevih dihidrogen fosfatov

V žarilni lonček se natehta približno 2,5 g vzorca na 1 mg natančno. Doda se 1 g kalcijevega karbonata (točka 3.1) in meša, da se snovi popolnoma premešata. Upepeljuje se v pečici pri 550 oC, da nastane bel ali siv pepel (majhna količina oglja ni problematična). Pepel se prenese v 250-mililitrsko čašo. Doda se 20 ml vode, nato pa se dodaja klorovodikova kislina (točka 3.2), dokler se ne preneha peniti. Doda se še 10 ml klorovodikove kisline (točka 3.2). Čaša se postavi na peščeno kopel in pusti uparevati do suhega, da kremen postane netopen. Ostanek se raztopi v 10 ml dušikove kisline (točka 3.3) in se na peščeni kopeli ali električni kuhalni plošči pusti vreti 5 minut, raztopina pa ne sme upariti v celoti. Tekočina se prelije v 500-mililitrsko merilno bučko, čaša pa se večkrat spere z vročo vodo. Pusti se, da se ohladi, dopolni se z vodo do oznake, homogenizira in filtrira.

5.2   Nastanek barve in merjenje optične gostote

Alikvot filtrata iz točke 5.1.1 ali 5.1.2 razredčimo tako, da dobimo koncentracijo fosforja do 40 μg/ml. 10 ml te raztopine se prenese v epruveto (točka 4.6) in doda 10 ml molibdovanadatnega reagenta (točka 3.6). Homogenizira se in pusti stati najmanj 10 minut pri 20 oC. Izmeri se optična gostota s spektrofotometrom pri 430 nm raztopine, ki se dobi z dodajanjem 10 ml molibdovanadatnega reagenta (točka 3.6) v 10 ml vode.

5.3   Umeritvena krivulja

Iz standardne raztopine (točka 3.7) se pripravijo raztopine, ki vsebujejo 5 μg, 10 μg, 20 μg, 30 μg oz. 40 μg fosforja na ml. V 10 ml vsake izmed teh raztopin se doda 10 ml molibdovanadatnega reagenta (točka 3.6). Homogenizira se in pusti stati najmanj 10 minut pri 20 °C. Izmeri se optična gostota, kakor je navedeno v točki 5.2. Umeritvena krivulja se pripravi tako, da se v diagram vnesejo izmerjene optične gostote ustreznih količin fosforja. Za koncentracije med 0 μg/ml in 40 μg/ml bo krivulja linearna.

6.   Izračun rezultatov

Količina fosforja v preskusnem vzorcu se določi iz umeritvene krivulje.

Rezultat se izrazi kot odstotni delež vzorca.

Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne presega:

—	3 % relativno glede na višji rezultat, če je vsebnost fosforja nižja od 5 %,

—	0,15 % v absolutni vrednosti, če je vsebnost fosforja 5 % ali več.

O.   DOLOČANJE KLORA IZ KLORIDOV

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanja količine klora v kloridih, topnih v vodi, ki so običajno izraženi kot natrijev klorid. Uporablja se za vso krmo.

2.   Načelo

Kloridi se raztopijo v vodi. Če proizvod vsebuje organske snovi, se zbistri. Raztopina se rahlo nakisa z dušikovo kislino in kloridi se oborijo v obliki srebrovega klorida z raztopino srebrovega nitrata. Presežek srebrovega nitrata se titrira z raztopino amonijevega tiocianata po Volhardovi metodi.

3.   Reagenti

3.1

Raztopina amonijevega tiocianata, 0,1 mol/l.

3.2

Raztopina srebrovega nitrata, 0,1 mol/l.

3.3

Nasičena raztopina amonij-železovega sulfata (NH4)Fe(SO4)2.

3.4

Dušikova kislina, gostota: 1,38 g/ml.

3.5

Dietileter.

3.6

Aceton.

3.7

Raztopina Carrez I: 21,9 g cinkovega acetata Zn(CH3 COO)2 2H2O in 3 g led-ocetne kisline se raztopijo v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.8

Raztopina Carrez II: 10,6 g kalijevega ferocianida K4Fe (CN)6 3H2O se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.9

Aktivno oglje, ki ne vsebuje kloridov in jih ne absorbira.

4.   Naprava

Mešalec: približno 35 do 40 obr./min.

5.   Postopek

5.1   Priprava raztopine

Glede na naravo vzorca se raztopina pripravi, kakor je navedeno v točki 5.1.1, 5.1.2 ali 5.1.3.

Hkrati se opravi slepi preskus brez vzorca, ki se analizira.

5.1.1   Vzorci brez organskih snovi

Največ 10 g vzorca, ki vsebuje največ 3 g klora v obliki kloridov, se natehta na 1 mg natančno. S 400 ml vode se prenese v 500-mililitrsko merilno bučko pri približno 20 °C. Trideset minut se meša v mešalcu, dopolni do oznake, premeša in filtrira.

5.1.2   Vzorci, ki vsebujejo organske snovi, razen proizvodov iz točke 5.1.3

Približno 5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in se skupaj z 1 g aktivnega oglja prenese v 500-mililitrsko merilno bučko. Doda se 400 ml vode s temperaturo približno 20 °C in 5 ml raztopine Carrez I (točka 3.7), meša se 30 sekund in nato doda 5 ml raztopine Carrez II (točka 3.8). Trideset minut se meša v mešalcu, dopolni do oznake, premeša in filtrira.

5.1.3   Kuhana krma, lanove pogače in moka, proizvodi, ki vsebujejo veliko lanene moke, in drugi proizvodi, ki vsebujejo veliko lepila ali koloidnih snovi (na primer dekstriniran škrob)

Raztopina se pripravi, kakor je opisano v točki 5.1.2, vendar se ne filtrira. Dekantira se (po potrebi centrifugira), 100 ml tekočega supernatanta pa se odstrani in prenese v 200-mililitrsko merilno bučko. Zmeša se z acetonom (točka 3.6) in z njim dopolni do oznake, homogenizira in filtrira.

5.2   Titracija

S pipeto se v erlenmajerico prenese 25 ml–100 ml filtrata (glede na pričakovano vsebnost klora), ki nastane pri postopku iz točke 5.1.1, 5.1.2 ali 5.1.3. Alikvot ne sme vsebovati več kot 150 mg klora (Cl). Po potrebi z vodo razredčimo na najmanj 50 ml, dodamo 5 ml dušikove kisline (točka 3.4), 2 ml nasičene raztopine amonij-železovega (III) sulfata (točka 3.3) in dve kapljici raztopine amonijevega tiocianata (točka 3.1), ki ga dodamo iz birete, napolnjene do oznake nič. Z bireto se doda raztopina srebrovega nitrata (točka 3.2), tako da nastane 5 ml presežka. Doda se 5 ml dietiletra (točka 3.5) in dobro se pretrese, da oborina koagulira. Presežek srebrovega nitrata se titrira z raztopino amonijevega tiocianata (točka 3.1), dokler ne nastane rdečkastorjavi odtenek, ki je obstojen eno minuto.

6.   Izračun rezultatov

Količina klora (X), izražena kot odstotni delež natrijevega klorida, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

V1	=	ml dodane raztopine srebrovega nitrata 0,1 mol/l
V2	=	ml za titracijo uporabljene raztopine amonijevega tiocianata 0,1 mol/l
m	=	g mase vzorca v alikvotu.

Če je pri slepem preskusu uporabljen srebrov nitrat 0,1 mol/l, se ta vrednost odšteje od volumna (V1–V2).

7.   Opombe

7.1

Titracija se lahko izvede tudi s potenciometrijo ali amperometrijo.

7.2

Proizvodi, ki vsebujejo veliko olj in maščob, se najprej razmastijo z dietiletrom ali petroletrom.

7.3

Pri ribji moki se titracija lahko izvede z Mohrovo metodo.