„PRÍLOHA I

METÓDY ODBERU VZORIEK

1.   ÚČEL A ROZSAH PÔSOBNOSTI

Vzorky určené na úradnú kontrolu krmív sa odoberajú v súlade s metódami opísanými ďalej. Takto získané vzorky sa považujú za reprezentatívne pre vzorkované partie.

Účelom odberu reprezentatívnych vzoriek je získať malý podiel šarže tak, aby stanovenie každej konkrétnej vlastnosti tohto podielu predstavovalo priemernú hodnotu vlastnosti tejto šarže. Šarža sa vzorkuje opakovaným odberom čiastkových vzoriek z jednotlivých miest šarže. Tieto čiastkové vzorky sa spolu zmiešajú tak, aby tvorili súhrnnú vzorku, z ktorej sa reprezentatívnym delením pripravia konečné reprezentatívne vzorky.

Ak sa v partiách krmív určených na odber vzoriek pri vizuálnej kontrole alebo na základe iných relevantných informácií preukáže kvalitatívny rozdiel oproti ostatným krmivám z rovnakej šarže, takéto partie sa oddelia od ostatného krmiva a budú sa považovať za samostatnú čiastkovú šaržu. Ak krmivo nemožno rozdeliť na samostatné čiastkové šarže, odoberie sa z neho vzorka ako z jednej šarže. V takýchto prípadoch sa táto skutočnosť uvedie v správe o odbere vzoriek.

Ak sa stanovilo, že krmivo odobraté do vzorky v súlade s ustanoveniami tohto nariadenia nezodpovedá požiadavkám EÚ a je súčasťou šarže krmiva rovnakej triedy alebo rovnakého opisu, predpokladá sa, že toto zistenie sa týka celého množstva krmiva tejto šarže, pokiaľ z podrobného posúdenia nevyplynie, že neexistujú žiadne dôkazy o tom, že zvyšok tejto šarže nezodpovedá požiadavkám EÚ.

Odobratá vzorka môže zahŕňať aj krmivo, ktoré ponúkajú prevádzkovatelia krmivárskych podnikov na predaj prostriedkami diaľkovej komunikácie v súlade s článkom 11 ods. 3 nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 767/2009 (1). Odber vzoriek krmiva ponúkaného na predaj prostriedkami diaľkovej komunikácie sa v zásade riadi bodmi uvedenými v tejto prílohe. Opis špecifických aspektov odberu vzoriek z krmiva predávaného na diaľku sa nachádza v bode 11.

2.   VYMEDZENIE POJMOV

—

Šarža (alebo partia): je identifikovateľné množstvo krmiva, ktoré má vykazovať jednotné vlastnosti, ako sú napríklad pôvod, druh, typ balenia, baliareň, odosielateľ alebo označenie a v prípade výrobného procesu jednotka vyrobená v jednom zariadení s použitím jednotných výrobných parametrov, alebo viacero takýchto jednotiek, keď sú vyrobené v kontinuálnom poradí a skladované spolu.

—	Vzorkovaná partia: šarža alebo identifikovaná časť šarže alebo čiastkovej šarže.

—	Zapečatená vzorka: vzorka zapečatená tak, aby nebol možný prístup k vzorke bez porušenia alebo bez odstránenia pečate.

—	Čiastková vzorka: množstvo odobraté z jedného miesta vzorkovanej partie.

—	Súhrnná vzorka: súhrn všetkých čiastkových vzoriek odobratých z tej istej vzorkovanej partie.

—	Zredukovaná vzorka: časť súhrnnej vzorky získaná reprezentatívnym delením.

—	Konečná vzorka: časť súhrnnej vzorky (zmiešaná), zredukovanej vzorky alebo homogenizovanej súhrnnej vzorky, v závislosti od typu kontroly (pozri bod 9.4).

—	Laboratórna vzorka: vzorka určená pre laboratórium (v podobe prijatej laboratóriom), pričom môže ísť o konečnú, zredukovanú alebo súhrnnú vzorku.

—	Vzorka krmiva určeného na predaj na diaľku: vzorka šarže alebo partie krmiva ponúkaného na predaj prostriedkami diaľkovej komunikácie.

3.   VŠEOBECNÉ USTANOVENIA

—	Vzorky odoberajú osoby poverené príslušným orgánom na tento účel.

—	V prípade vzorky krmiva určeného na predaj na diaľku príslušný orgán požiada prevádzkovateľa krmivárskeho podniku o množstvo krmiva prostriedkami diaľkovej komunikácie.

—	Vzorka musí byť zapečatená tak, aby nebol možný prístup k vzorke bez porušenia alebo bez odstránenia pečate.

Značka pečate by mala byť zreteľne rozpoznateľná a jasne viditeľná.

—	Identifikácia vzorky: vzorka musí byť nezmazateľne označená a musí sa dať identifikovať tak, aby ju bolo možné jednoznačne prepojiť so správou o odbere vzoriek.

—

Z každej súhrnnej alebo zredukovanej vzorky sa musia odobrať tieto konečné vzorky: jedna vzorka je určená na kontrolu (vymáhanie práva) a jedna je pre prevádzkovateľa krmivárskeho podniku (vzorka na obhajobu). Jedna ďalšia konečná vzorka sa prípadne môže odobrať na referenčné účely. V prípade homogenizácie celej súhrnnej vzorky sa konečné vzorky odoberú z homogenizovanej súhrnnej vzorky, pokiaľ takýto postup nie je v rozpore s pravidlami členského štátu, pokiaľ ide o práva prevádzkovateľa krmivárskeho podniku.

—

V súlade s článkom 15 ods. 1 a 2 nariadenia (EÚ) 2017/625, keď je to nevyhnutné na vykonanie úradného odberu vzoriek, prevádzkovatelia krmivárskeho podniku, ak to požadujú príslušné orgány: — poskytnú personálu príslušných orgánov prístup k vybaveniu pod ich kontrolou, v prípade potreby vrátane sprístupnenia správneho vybavenia na odber vzoriek a osobných ochranných prostriedkov, — pomáhajú personálu príslušných orgánov a spolupracujú s ním s cieľom umožniť odber vzoriek, pričom mu sprístupnia aj krmivo.

4.   PRÍSTROJE A POMÔCKY

4.1.   Prístroje a pomôcky na odber vzoriek musia byť vyrobené z materiálov, ktoré nemôžu kontaminovať výrobky určené na odber vzoriek. Prístroje a pomôcky, ktoré sú určené na viacnásobné použitie, sa musia dať ľahko vyčistiť, aby sa zabránilo krížovej kontaminácii.

4.2.   Odporúčané prístroje a pomôcky na odber vzoriek zo suchých krmív

4.2.1.   Ručný odber vzoriek

4.2.1.1.

Lopatka s plochým dnom a vertikálnymi stranami.

4.2.1.2.

Vzorkovacia tyč s dlhou dutinou alebo priehradkami. Rozmery vzorkovacej tyče musia byť primerané vlastnostiam vzorkovanej partie (hĺbka nádoby, rozmery vreca atď.) a veľkosti častíc krmív. V prípade, že má vzorkovacia tyč niekoľko otvorov, by tieto otvory mali byť oddelené pomocou priehradiek alebo by mali byť usporiadané postupne, aby sa zabezpečilo odobratie vzorky na rôznych miestach pozdĺž tyče.

4.2.2.   Mechanický odber vzoriek

Na odber vzoriek z krmiva v pohybe sa môže používať vhodné mechanické vybavenie. Mechanické vybavenie sa považuje za vhodné, ak sa vzorkuje minimálne celá časť produktu v pohybe.

Odber vzoriek z krmiva v pohybe (pri vysokej prietokovej rýchlosti) možno vykonať pomocou automatických vzorkovačov.

4.2.3.   Delič vzorky

Ak je to možné a vhodné, zariadenie určené na delenie vzorky na približne rovnaké časti by sa malo používať na prípravu zredukovaných vzoriek reprezentatívnym spôsobom.

5.   KVANTITATÍVNE POŽIADAVKY TÝKAJÚCE SA POČTU ČIASTKOVÝCH VZORIEK

—

Kvantitatívne požiadavky uvedené v bodoch 5.1 a 5.2 týkajúce sa počtu čiastkových vzoriek sa vzťahujú na veľkosť vzorkovaných partií maximálne do 500 ton, z ktorých možno odoberať vzorky reprezentatívnym spôsobom. Opísaný postup odberu vzoriek platí rovnako aj pre množstvá väčšie, ako je predpísaná maximálna veľkosť vzorkovanej partie, za predpokladu, že sa nezohľadní maximálny počet čiastkových vzoriek stanovený v tabuľkách uvedených v bodoch 5.1.1, 5.1.3 a 5.1.5, pričom počet čiastkových vzoriek sa stanoví podľa druhej odmocniny vzorca uvedeného v príslušnej časti postupu (pozri bod 5.3) a minimálna veľkosť súhrnnej vzorky sa úmerne zvýši. To však nebráni tomu, aby sa veľká šarža rozdelila do menších čiastkových šarží a aby sa z každej čiastkovej šarže odobrala vzorka v súlade s postupom opísaným v bodoch 5.1 a 5.2.

—	Veľkosť vzorkovanej partie musí byť taká, aby v odobratej vzorke bola prítomná každá zložka krmiva.

—	Pri veľmi veľkých šaržiach alebo čiastkových šaržiach (> 500 ton) a pri šaržiach, ktoré sa prepravujú alebo skladujú spôsobom, že nie je možné odobrať vzorku v súlade s postupom odberu vzoriek uvedeným v bodoch 5.1 a 5.2, použije sa postup odoberania vzoriek uvedený v bode 5.3.

—	V prípade vzoriek krmiva určeného na predaj na diaľku príslušný orgán zvyčajne nepozná veľkosť šarže, z ktorej požaduje dané množstvo. Nie je preto možné použiť postup uvedený v bodoch 5.1 a 5.2. V tomto prípade sa uplatňuje postup opísaný v bode 11.

—

V prípade, že prevádzkovateľ krmivárskeho podniku je podľa právnych predpisov povinný dodržiavať toto nariadenie v rámci systému povinného monitorovania, prevádzkovateľ krmivárskeho podniku sa môže odchýliť od kvantitatívnych požiadaviek stanovených v tomto bode na účely zohľadnenia prevádzkových charakteristík pod podmienkou, že prevádzkovateľ krmivárskeho podniku príslušnému orgánu uspokojivo preukázal rovnocennosť postupu odberu vzoriek, pokiaľ ide o reprezentatívnosť, a po schválení zo strany príslušného orgánu.

—

Ak vo výnimočných prípadoch nie je možné použiť metódu odberu vzoriek v súvislosti s kvantitatívnymi požiadavkami z dôvodu neprijateľných obchodných následkov vyplývajúcich z poškodenia šarže (v dôsledku foriem balenia, dopravných prostriedkov, spôsobu skladovania atď.), môže sa použiť alternatívna metóda odberu vzoriek za predpokladu, že je čo najreprezentatívnejšia a je úplne opísaná a zdokumentovaná.

5.1.   Kvantitatívne požiadavky týkajúce sa čiastkových vzoriek v súvislosti s kontrolou látok alebo produktov rovnomerne rozložených v krmive.

5.1.1.   Voľné ložené suché krmivá

Veľkosť vzorkovanej partie	Minimálny počet čiastkových vzoriek
≤ 2,5 tony	7
> 2,5 tony	√ (20 -násobku počtu ton, ktoré tvoria vzorkovanú partiu) (*1) , až do 40 čiastkových vzoriek

5.1.2.   Voľné ložené tekuté krmivá

Veľkosť vzorkovanej partie	Minimálny počet čiastkových vzoriek
≤ 2,5 tony alebo ≤ 2 500 litrov	4  (*2)
> 2,5 tony alebo > 2 500 litrov	7  (*2)

5.1.3.   Balené krmivo

Krmivo (pevné a tekuté) môže byť balené vo vreckách, vrecúškach, plechovkách, sudoch atď., ktoré sú v tabuľke uvedené ako jednotky. Z veľkých jednotiek (≥ 500 kg alebo litrov) sa odber vzoriek musí vykonávať v súlade s ustanoveniami určenými pre voľné ložené krmivá (pozri body 5.1.1 a 5.1.2).

Veľkosť vzorkovanej partie	Minimálny počet jednotiek, z ktorých sa musí odobrať (aspoň) jedna čiastková vzorka (*3)
1 až 20 jednotiek	1 jednotka (*4)
21 až 150 jednotiek	3 jednotky (*4)
151 až 400 jednotiek	5 jednotiek (*4)
> 400 jednotiek	¼ √ (počtu jednotiek, ktoré predstavujú vzorkovanú partiu) (*5) , až do 40 jednotiek

5.1.4.   Bloky krmiva a minerálne lizy

Odoberie sa minimálne jeden blok alebo jeden liz na vzorkovanú partiu s počtom 25 jednotiek, najviac však štyri bloky alebo štyri lizy.

V prípade blokov alebo lizov s hmotnosťou najviac 1 kg sa za čiastkovú vzorku považuje obsah jedného bloku alebo jedného lizu.

5.1.5.   Objemové krmivá/krmoviny

Veľkosť vzorkovanej partie	Minimálny počet čiastkových vzoriek (*6)
≤ 5 ton	5
> 5 ton	√ (5 -násobku počtu ton, ktoré tvoria vzorkovanú partiu) (*7) , až do 40 čiastkových vzoriek

5.2.   Kvantitatívne požiadavky týkajúce sa čiastkových vzoriek v súvislosti s kontrolou zložiek alebo látok, ktoré by mohli byť nerovnomerne rozložené v krmive

Tieto kvantitatívne požiadavky týkajúce sa čiastkových vzoriek sa uplatňujú v týchto situáciách:

—	kontrola aflatoxínov, ražného námeľu, iných mykotoxínov a škodlivých botanických nečistôt v kŕmnych surovinách,

—	kontrola krížovej kontaminácie niektorou zo zložiek vrátane geneticky modifikovaného materiálu alebo látkou, v prípade ktorej sa v krmive predpokladá nerovnomerné rozloženie.

V prípade, že má kontrolný orgán silné podozrenie na takéto nerovnomerné rozloženie aj v prípade krížovej kontaminácie niektorou zo zložiek alebo látkou v kŕmnej zmesi, môžu sa uplatniť kvantitatívne požiadavky stanovené v tabuľke uvedenej ďalej.

Veľkosť vzorkovanej partie	Minimálny počet čiastkových vzoriek
< 80 ton	Pozri kvantitatívne požiadavky v bode 5.1. Počet čiastkových vzoriek, ktoré sa musia odobrať, sa musí vynásobiť koeficientom 2,5.
≥ 80 tony	100

5.3.   Kvantitatívne požiadavky týkajúce sa čiastkových vzoriek v prípade veľmi veľkých šarží

V prípade veľkých vzorkovaných partií (vzorkované partie > 500 ton) sa musí odobrať počet čiastkových vzoriek = 40 čiastkových vzoriek + √ ton v súvislosti s kontrolou látok alebo produktov rovnomerne rozložených v krmive alebo 100 čiastkových vzoriek + √ ton v súvislosti s kontrolou zložiek alebo látok, ktoré by mohli byť nerovnomerne rozložené v krmivách.

6.   KVANTITATÍVNE POŽIADAVKY TÝKAJÚCE SA SÚHRNNEJ VZORKY

Vyžaduje sa jedna súhrnná vzorka na vzorkovanú partiu.

	Charakter krmiva	Minimálna veľkosť súhrnnej vzorky (*8)  (*9)
6.1.	Voľne ložené krmivá	4 kg
6.2.	Balené krmivá:	4 kg (*10)
6.3.	Tekuté alebo polotekuté krmivá:	4 litre
6.4.	Bloky krmiva a minerálne lizy:
6.4.1.	každý s hmotnosťou viac ako 1 kg	4 kg
6.4.2.	každý s hmotnosťou do 1 kg	hmotnosť štyroch pôvodných blokov alebo lizov
6.5.	Objemové krmivo/krmoviny	4 kg (*11)

7.   KVANTITATÍVNE POŽIADAVKY TÝKAJÚCE SA KONEČNÝCH VZORIEK

Konečné vzorky

Vyžaduje sa analýza aspoň jednej konečnej vzorky. Množstvo konečnej vzorky na analýzu nie je menšie ako:

Suché krmivá	500 g (*12)  (*13)  (*14)  (*15)
Tekuté alebo polotekuté krmivá	500 ml (*12)

8.   METÓDA ODBERU VZORIEK PRE VEĽMI VEĽKÉ ŠARŽE ALEBO ŠARŽE USKLADNENÉ ALEBO PREPRAVOVANÉ SPÔSOBOM, PRI KTOROM NIE JE MOŽNÝ ODBER VZORKY Z CELEJ ŠARŽE

8.1.   Všeobecné zásady

V prípade, že spôsob prepravy alebo skladovania šarže neumožňuje odobrať čiastkové vzorky z celej šarže, odber vzoriek z takýchto šarží by sa mal prednostne uskutočniť, keď je šarža v pohybe.

V prípade veľkých skladov určených na skladovanie krmiva by prevádzkovatelia mali byť nabádaní na to, aby v sklade nainštalovali zariadenie, ktoré umožní (automatický) odber vzoriek z celej uloženej šarže.

V prípade používania postupov odberu vzoriek stanovených v tomto bode bude prevádzkovateľ krmivárskeho podniku alebo jeho zástupca informovaný o postupe odberu vzoriek. V prípade, že prevádzkovateľ krmivárskeho podniku alebo jeho zástupca tento postup odberu vzoriek spochybní, prevádzkovateľ krmivárskeho podniku alebo jeho zástupca umožní príslušnému orgánu odobrať vzorku z celej šarže na svoje náklady.

8.2.   Veľké šarže prepravované loďou

8.2.1.   Dynamický odber vzoriek z veľkých šarží prepravovaných loďou

Odber vzoriek z veľkých šarží na lodiach sa prednostne vykonáva, keď je produkt v pohybe (dynamický odber vzoriek).

Odber vzoriek sa má uskutočňovať podľa jednotlivých buniek (jednotky nákladného priestoru, ktoré možno fyzicky oddeliť). Bunky sa však vyprázdňujú po častiach jedna po druhej, takže pôvodné fyzické oddelenie už po preprave do skladovacích zariadení neexistuje. Odber vzoriek preto možno uskutočniť na základe pôvodného fyzického oddelenia alebo na základe oddelenia po preprave do skladovacích zariadení.

Vykládka lode môže trvať niekoľko dní. Odber vzoriek sa spravidla musí vykonávať v pravidelných intervaloch počas celého trvania vykládky. Nie je však vždy možné ani vhodné, aby bol pri odbere vzoriek počas celej vykládky prítomný úradný inšpektor. Z tohto dôvodu je možné odobrať vzorky len z časti celej šarže (vzorkovaná partia). Počet čiastkových vzoriek sa stanoví podľa veľkosti vzorkovanej partie.

V prípade, že sa vzorky odoberajú z časti šarže krmiva rovnakej triedy alebo rovnakého opisu a že sa zistilo, že táto časť šarže nespĺňa požiadavky EÚ, má sa za to, že sa to týka všetkého krmiva tejto šarže, pokiaľ z podrobného posúdenia nevyplynie, že neexistujú dôkazy o tom, že zvyšok šarže nie je v súlade s požiadavkami EÚ.

Prítomnosť inšpektora je nevyhnutná aj vtedy, keď sa úradná vzorka odoberá automaticky. V prípade, že sa automatický odber vzoriek vykonáva podľa vopred stanovených parametrov, ktoré počas odberu vzoriek nie je možné zmeniť, a čiastkové vzorky sa zhromažďujú v zapečatenej nádobe, aby sa predišlo prípadnému podvodu, prítomnosť inšpektora je potrebná len na začiatku odberu vzoriek, pri každej výmene nádoby so vzorkami a na konci odberu vzoriek.

8.2.2.   Odber vzoriek zo šarží prepravovaných loďou prostredníctvom statického odberu vzoriek

V prípade, že sa odber vzoriek vykonáva staticky, musí sa použiť rovnaký postup ako pre skladovacie zariadenia (silá) prístupné zhora (pozri bod 8.4.1).

Odber vzoriek sa musí vykonávať v prístupnej časti (zhora) šarže/bunky. Počet čiastkových vzoriek sa stanoví podľa veľkosti vzorkovanej partie. V prípade, že sa vzorky odoberajú z časti šarže krmiva rovnakej triedy alebo rovnakého opisu a že sa zistilo, že táto časť šarže nespĺňa požiadavky EÚ, má sa za to, že sa to týka všetkého krmiva tejto šarže, pokiaľ z podrobného posúdenia nevyplynie, že neexistujú dôkazy o tom, že zvyšok šarže nie je v súlade s požiadavkami EÚ.

8.3.   Odber vzoriek z veľkých šarží uložených v skladoch

Odber vzoriek sa musí vykonávať v prístupnej časti šarže. Počet čiastkových vzoriek sa stanoví podľa veľkosti vzorkovanej partie. V prípade, že sa vzorky odoberajú z časti šarže krmiva rovnakej triedy alebo rovnakého opisu a že sa zistilo, že táto časť šarže nespĺňa požiadavky EÚ, má sa za to, že sa to týka všetkého krmiva tejto šarže, pokiaľ z podrobného posúdenia nevyplynie, že neexistujú dôkazy o tom, že zvyšok šarže nie je v súlade s požiadavkami EÚ.

8.4.   Odber vzoriek zo skladovacích zariadení (síl)

8.4.1.   Odber vzoriek zo síl (ľahko) prístupných zhora

Odber vzoriek sa musí vykonávať v prístupnej časti šarže. Počet čiastkových vzoriek sa stanoví podľa veľkosti vzorkovanej partie. V prípade, že sa vzorky odoberajú z časti šarže krmiva rovnakej triedy alebo rovnakého opisu a že sa zistilo, že táto časť šarže nespĺňa požiadavky EÚ, má sa za to, že sa to týka všetkého krmiva tejto šarže, pokiaľ z podrobného posúdenia nevyplynie, že neexistujú dôkazy o tom, že zvyšok šarže nie je v súlade s požiadavkami EÚ.

8.4.2.   Odber vzoriek zo síl, ktoré nie sú prístupné zhora (uzatvorené silá)

8.4.2.1.   Silá, ktoré nie sú prístupné zhora (uzatvorené silá) s veľkosťou > 100 ton

Z krmiva skladovaného v takýchto silách sa nemôžu odoberať vzorky statickým spôsobom. Preto v prípade, keď sa musí odobrať vzorka krmiva v sile a keď neexistuje žiadna možnosť presunutia zásielky, musí sa s prevádzkovateľom uzatvoriť dohoda o tom, že bude inšpektora informovať o vyprázdnení sila s cieľom umožniť odber vzorky z krmiva v pohybe.

8.4.2.2.   Silá, ktoré nie sú prístupné zhora (uzatvorené silá) s veľkosťou < 100 ton

Pri odbere vzoriek sa do nádoby vypustí 50 až 100 kg, z ktorých sa odoberie vzorka. Veľkosť súhrnnej vzorky zodpovedá celej šarži a počet čiastkových vzoriek súvisí s množstvom vypusteným zo sila do nádoby na odber vzorky. V prípade, že sa vzorky odoberajú z časti šarže krmiva rovnakej triedy alebo rovnakého opisu a že sa zistilo, že táto časť šarže nespĺňa požiadavky EÚ, má sa za to, že sa to týka všetkého krmiva tejto šarže, pokiaľ z podrobného posúdenia nevyplynie, že neexistujú dôkazy o tom, že zvyšok šarže nie je v súlade s požiadavkami EÚ.

8.5.   Odber vzoriek z voľne ložených krmív vo veľkých uzavretých kontajneroch

Z takýchto šarží možno často odobrať vzorky len pri vykládke. V niektorých prípadoch nie je vykládka v čase dovozu alebo kontroly možná, a preto by sa mala vzorka odobrať pri vykladaní takýchto kontajnerov.

9.   POKYNY PRE ODBER, PRÍPRAVU A BALENIE VZORIEK

9.1.   Všeobecné pokyny

Vzorky sa musia odoberať a pripraviť bez zbytočného odkladu s ohľadom na preventívne opatrenia, ktoré sú potrebné na zabezpečenie toho, aby nedošlo k zámene ani ku kontaminácii produktu. Nástroje, plochy a nádoby určené na príjem vzoriek musia byť čisté a suché.

9.2.   Čiastkové vzorky

Čiastkové vzorky sa musia odobrať náhodne z celej vzorkovanej partie, v ktorej musia byť rovnomerne rozložené, a musia mať približne rovnakú veľkosť.

Veľkosť čiastkovej vzorky je najmenej 100 gramov alebo 25 gramov v prípade objemového krmiva alebo krmovín s nízkou špecifickou mernou hmotnosťou.

V prípade, že podľa pravidiel týkajúcich sa postupu odberu vzoriek stanovených v bode 8 sa musí odobrať menej ako 40 čiastkových vzoriek, veľkosť čiastkových vzoriek sa stanoví na základe požadovanej veľkosti súhrnnej vzorky, ktorá sa má dosiahnuť (pozri bod 6).

V prípade odberu vzoriek z malých šarží baleného krmiva, z ktorých sa podľa kvantitatívnych požiadaviek musí odobrať obmedzený počet čiastkových vzoriek, čiastkovou vzorkou je obsah jednej pôvodnej jednotky, ktorej obsah nepresahuje 1 kg alebo jeden liter.

V prípade odberu vzoriek z balených krmív, ktoré tvoria malé jednotky (napr. < 250 g), závisí veľkosť čiastkovej vzorky od veľkosti jednotky.

Veľkosť čiastkovej vzorky v prípade vzoriek krmiva určeného na predaj na diaľku závisí od veľkosti jednotky a v individuálnych prípadoch môže obsahovať aj menej než 100 g alebo 100 ml.

9.2.1.   Voľne ložené krmivá

Odber vzorky sa môže v prípade potreby vykonať počas pohybu vzorkovanej partie (nakladanie alebo vykladanie).

9.2.2.   Balené krmivo

Po výbere požadovaného počtu jednotiek na odber vzoriek podľa bodu 5 sa časť obsahu každej jednotky odoberá pomocou tyče alebo lopatky. V prípade potreby sa vzorky odoberú oddelene po vyprázdnení jednotiek.

9.2.3.   Homogénne alebo homogenizovateľné tekuté alebo polotekuté krmivá

Po výbere požadovaného počtu jednotiek na odber vzoriek podľa bodu 5 sa obsah v prípade potreby homogenizuje a z každej jednotky sa odoberie určité množstvo.

Čiastkové vzorky môžu byť odobraté počas vyprázdňovania obsahu jednotky.

9.2.4.   Nehomogenizovateľné, tekuté alebo polotekuté krmivá

Po výbere požadovaného počtu jednotiek na odber vzoriek podľa bodu 5 sa odoberú vzorky z rôznych vrstiev.

Vzorky môžu byť odobraté aj počas vyprázdňovania obsahu, ale prvé frakcie treba odstrániť.

V každom prípade celkový odobratý objem nesmie byť menší ako 10 litrov.

9.2.5.   Bloky krmiva a minerálne lizy

Po výbere požadovaného počtu blokov alebo lizov na odber vzoriek podľa bodu 5 sa odoberie časť z každého bloku alebo lizu. V prípade podozrenia na nehomogenizovaný blok alebo liz sa ako vzorka môže odobrať celý blok alebo liz.

V prípade blokov alebo lizov s hmotnosťou najviac 1 kg sa za čiastkovú vzorku považuje obsah jedného bloku alebo jedného lizu.

9.3.   Príprava súhrnných vzoriek

Čiastkové vzorky sa zmiešajú tak, aby vytvorili jednu súhrnnú vzorku.

9.4.   Príprava konečných vzoriek

Súhrnná vzorka sa má dôkladne premiešať (2).

Každá vzorka sa vloží do vhodnej nádoby/obalu. Urobia sa všetky potrebné preventívne opatrenia, aby počas prepravy alebo skladovania nedošlo k zmene zloženia vzorky, jej kontaminácii alebo znehodnoteniu.

9.4.1.   Látky rovnomerne rozložené v krmive

V prípade kontroly zložiek alebo látok rovnomerne rozložených v krmive možno súhrnnú vzorku reprezentatívne zredukovať na vzorku s hmotnosťou najmenej 2,0 kg alebo objemom najmenej 2,0 litre (zredukovaná vzorka) (3), a to podľa možnosti pomocou mechanického alebo automatického deliča. Pri kontrole prítomnosti rezíduí pesticídov v strukovinách, obilných zrnách a orechoch je minimálna veľkosť zredukovanej vzorky 3 kg. V prípade, že charakter krmiva neumožňuje použiť delič alebo v prípade, že delič nie je k dispozícii, možno vzorku zredukovať metódou štvrtenia.

Zo súhrnných alebo zredukovaných vzoriek sa odoberú konečné vzorky (na účely kontroly, obhajoby a prípadne referencie), a to približne v rovnakom množstve a v súlade s kvantitatívnymi požiadavkami stanovenými v bode 7.

9.4.2.   Látky nerovnomerne rozložené v krmive

V prípade kontroly zložiek vrátane geneticky modifikovaného materiálu alebo látok, ktoré by mohli byť nerovnomerne rozložené v krmive, súhrnná vzorka musí byť:

i)	úplne homogenizovaná. Následne sa z homogenizovanej súhrnnej vzorky odoberú konečné vzorky (na účely kontroly, obhajoby a prípadne referencie), a to približne v rovnakom množstve a v súlade s kvantitatívnymi požiadavkami stanovenými v bode 7, alebo

ii)

zredukovaná najmenej na 2 kg alebo 2 litre (4) pomocou mechanického alebo automatického deliča. Iba v prípade, keď charakter krmiva neumožňuje použiť delič, možno túto vzorku v prípade potreby zredukovať metódou štvrtenia. Na kontrolu prítomnosti geneticky modifikovaného materiálu v rámci nariadenia (EÚ) č. 619/2011 musí zredukovaná vzorka obsahovať najmenej 35 000 semien/zŕn, aby bolo možné získať konečné vzorky na účely vymáhania práva, obhajoby a prípadne referencie pri najmenej 10 000 semenách/zrnách [pozri poznámku pod čiarou (**) v bode 6 a poznámku pod čiarou (*) v bode 7].

Zo zredukovanej vzorky sa odoberú konečné vzorky, a to približne v rovnakom množstve a v súlade s kvantitatívnymi požiadavkami stanovenými v bode 7.

9.5.   Balenie vzoriek

Nádoby alebo balenia sa zapečatia a označia tak, aby ich nebolo možné otvoriť bez porušenia pečate. Celé označenie musí byť neoddeliteľnou súčasťou pečate. Vzorku možno prípadne umiestniť do nádoby, ktorá sa dá uzavrieť tak, aby ju nebolo možné otvoriť bez nezvratného poškodenia nádrže alebo nádoby, čím sa zabráni opätovnému použitiu tejto nádrže alebo nádoby.

9.6.   Zasielanie vzoriek do laboratória

Vzorka sa bez zbytočného odkladu zašle do určeného analytického laboratória spolu s informáciami, ktoré analytik potrebuje.

10.   ZÁZNAM O ODBERE VZORKY

Z každého odberu vzorky sa musí vypracovať záznam umožňujúci jednoznačnú identifikáciu každej vzorkovanej partie a jej veľkosti.

Tento záznam musí taktiež zahŕňať všetky odchýlky od postupu odberu vzoriek stanoveného v tomto nariadení.

Okrem sprístupnenia záznamu úradnému kontrolnému laboratóriu sa záznam sprístupní prevádzkovateľovi krmivárskeho podniku a/alebo laboratóriu určenému prevádzkovateľom krmivárskeho podniku.

11.   VZORKA KRMIVA URČENÉHO NA PREDAJ NA DIAĽKU

—

V prípade vzorky krmiva určeného na predaj na diaľku sa krmivo od prevádzkovateľa krmivárskeho podniku vyžiada prostriedkami diaľkovej komunikácie. Príslušný orgán sa v tomto prípade pri vyžiadaní krmiva nemusí prevádzkovateľovi krmivárskeho podniku preukázať oficiálnou totožnosťou a môže použiť utajenú totožnosť.

—

Súhrnnú vzorku a konečné vzorky zo vzorky krmiva určeného na predaj na diaľku musia odobrať hneď pri doručení zásielky pracovníci poverení na tento účel. Na vytvorenie súhrnnej vzorky sa musí náhodne odobrať primerané množstvo čiastkových vzoriek z celkového získaného množstva, v ktorom musia byť rovnomerne rozložené, a dôkladne sa premiešajú/homogenizujú čo najviac v súlade so zásadami stanovenými v bode 5 a v bodoch 9.2 a 9.3. Ak je krmivo balené v samostatných jednotkách, mali by sa získať aspoň štyri jednotky, z ktorých sa odoberie najmenej jedna čiastková vzorka. Ak sa v jednotlivých prípadoch ukáže, že získané jednotky pochádzajú z rôznych šarží, počet jednotiek, z ktorých sa odoberú vzorky, sa musí znížiť a zúžiť na jednotky pochádzajúce z rovnakej šarže. V prípade analýzy vzorky krmiva určeného na predaj na diaľku na účely detekcie zložiek alebo látok, ktoré sú v krmive nerovnomerne rozložené, počet čiastkových vzoriek musí byť najmenej dvaapolkrát vyšší ako v prípade analýzy vzoriek na látky rovnomerne rozložené v krmive. Zo súhrnnej vzorky sa následne odoberú zodpovedajúce konečné vzorky (na účely kontroly, obhajoby a prípadne referencie), pokiaľ možno v súlade so zásadami stanovenými v bode 9.4 a pokiaľ zo záznamu o odbere vzorky vyplýva, že ide o vzorku krmiva určeného na predaj na diaľku. Príslušný orgán potom o odbere vzorky okamžite informuje prevádzkovateľa krmivárskeho podniku. Prevádzkovateľ krmivárskeho podniku sa takisto upozorní na to, že jednu vzorku (na obhajobu), ak je to možné, uchováva príslušný orgán na určitom mieste na účely obhajoby, alebo sa táto vzorka posiela prevádzkovateľovi krmivárskeho podniku alebo do laboratória určeného prevádzkovateľom krmivárskeho podniku v súlade s platnými pravidlami členského štátu. Ak sa vzorka posiela priamo do úradného laboratória, konečnú vzorku musia pripraviť a zapečatiť v laboratóriu pracovníci poverení na tento účel alebo sa konečná vzorka pripraví a zapečatí v prítomnosti pracovníkov poverených na tento účel. Záznam o odbere vzorky krmiva určeného na predaj na diaľku sa musí poslať hneď po vytvorení konečných vzoriek príslušnému orgánu, ktorý o odbere vzorky informuje prevádzkovateľa krmivárskeho podniku. Predpokladá sa, že množstvo, ktoré prevádzkovateľ krmivárskeho podniku dodal príslušnému orgánu, predstavuje časť šarže krmiva rovnakej triedy alebo rovnakého opisu. V súlade s článkom 15 nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 178/2002 (5) v prípade, že sa zistilo, že táto časť šarže nespĺňa požiadavky EÚ, má sa za to, a to aj v prípade vzorky krmiva určeného na predaj na diaľku, že sa to týka všetkého krmiva tejto šarže, pokiaľ z podrobného posúdenia nevyplynie (v prípade potreby na základe kontroly na mieste), že neexistujú dôkazy o tom, že zvyšok šarže nie je v súlade s požiadavkami EÚ.

„PRÍLOHA II

VŠEOBECNÉ USTANOVENIA TÝKAJÚCE SA ANALYTICKÝCH METÓD PRE KRMIVÁ

A.   PRÍPRAVA VZORIEK NA ANALÝZU

1.   Účel

Postupy opísané v tejto prílohe sa týkajú prípravy na analýzu vzoriek zasielaných kontrolným laboratóriám po odobratí vzoriek v súlade s ustanoveniami stanovenými v prílohe I.

Laboratórne vzorky musia byť pripravené tak, aby navážené množstvá, ktoré sú uvedené v analytických metódach, boli homogénne a reprezentatívne pre konečné vzorky.

Okrem postupov opísaných v tejto prílohe treba dodržiavať usmernenia k príprave vzoriek stanovené v norme EN ISO 6498.

2.   Preventívne opatrenia, ktoré sa majú prijať

Postup prípravy vzorky, ktorý sa má dodržiavať, závisí od analytických metód, ktoré majú byť použité, a od zložiek alebo látok, ktoré sa majú kontrolovať. Preto je mimoriadne dôležité zabezpečiť, aby bol tento postup prípravy vzorky primeraný použitej analytickej metóde a zložkám alebo látkam, ktoré sa majú kontrolovať.

Všetky potrebné kroky pracovného postupu sa musia vykonať takým spôsobom, aby sa v čo najvyššej možnej miere zamedzilo kontaminácii vzorky a zmenám jej zloženia.

Mletie, premiešanie a preosievanie by sa malo vykonať bez zbytočného odkladu s minimálnym vystavením vzorky účinkom vzduchu a svetla. Nemali by sa používať mlynčeky a drviče, ktoré by mohli vzorky značne zahrievať.

Ručné mletie sa odporúča v prípade krmív obzvlášť citlivých na zohriatie. Malo by sa dbať aj na to, aby samotné prístrojové vybavenie nebolo zdrojom kontaminácie.

Ukazuje sa, že homogenizácia vzorky prostredníctvom prípravy suspenzie premiešaním s vodou vo vysokošmykovej miešačke v určitých prípadoch vytvára homogénnejšie podvzorky ako v prípade homogenizácie/mletia, a to najmä v prípade heterogénne rozložených chemických látok. Homogénne podvzorky sa však môžu pripraviť aj dostatočným mletím za sucha.

V určitých prípadoch, ako napríklad na určenie ražného námeľu, škodlivých botanických nečistôt atď., nie je možné homogenizáciu vzorky vykonať mletím, ale dostatočným premiešaním vzorky.

Ak prípravu nemožno vykonať bez výrazných zmien v obsahu vlhkosti vzorky, je potrebné obsah vlhkosti určiť pred prípravou a po nej podľa metódy stanovenej v časti A prílohy III.

3.   Postup

3.1.   Všeobecný postup

Testovaný podiel sa odoberie z konečnej homogenizovanej vzorky. Delenie metódou kužeľov a štvrtenia sa neodporúča, keďže v jeho dôsledku môžu vzniknúť testované podiely s vysokou pravdepodobnosťou chyby z delenia.

3.1.1.   Krmivá, ktoré sa môžu priamo drviť

—	Konečná vzorka sa premieša a vloží sa do vhodnej čistej, suchej nádoby so vzduchotesným uzáverom. Na zabezpečenie úplnej homogenizácie sa opätovne premieša bezprostredne pred navážením množstva na analýzu (testovaný podiel).

3.1.2.   Krmivá, ktoré sa môžu drviť po vysušení

—	Pokiaľ nie je v analytických metódach stanovené inak, konečná vzorka sa vysuší tak, aby sa jej vlhkosť znížila na 8 až 12 %, v súlade s postupom na predsušenie opísaným v bode 4.3 metódy na stanovenie vlhkosti uvedenej v časti A prílohy III. Ďalej sa postupuje podľa bodu 3.1.1.

3.1.3.   Tekuté alebo polotekuté krmivá

—	Konečná vzorka sa vloží do vhodnej čistej, suchej nádoby so vzduchotesným uzáverom. Na zabezpečenie úplnej homogenizácie sa opätovne premieša bezprostredne pred navážením množstva na analýzu (testovaný podiel).

3.1.4.   Iné krmivá

—	Konečné vzorky, ktoré sa nedajú pripraviť v súlade s jedným z uvedených postupov, by sa mali upraviť akýmkoľvek iným postupom, ktorým sa zabezpečí, že množstvá navážené na analýzu (testovaný podiel) budú homogénne a reprezentatívne pre konečné vzorky.

3.2.   Osobitný postup v prípade preskúmania prostredníctvom vizuálnej kontroly alebo mikroskopu, alebo v prípade, keď je celá súhrnná vzorka homogenizovaná

—	V prípade preskúmania prostredníctvom vizuálnej kontroly (bez použitia mikroskopu) sa na preskúmanie použije celá súhrnná alebo konečná vzorka.

—	V prípade preskúmania pod mikroskopom môže laboratórium zredukovať súhrnnú vzorku alebo zredukovanú vzorku ešte viac zmenšiť. Konečné vzorky na účely obhajoby, prípadne na referenčné účely, sa odoberajú na základe postupu, ktorý je rovnaký ako postup pri konečnej vzorke na účely vymáhania práva.

—	V prípade homogenizácie celej súhrnnej vzorky sa konečné vzorky odoberú z homogenizovanej súhrnnej vzorky.

—

Na stanovenie ražného námeľu a škodlivých botanických nečistôt sa konečná vzorka musí rozdeliť na dve podvzorky s rovnakou hmotnosťou približne 500 gramov. Preskúma sa jedna podvzorka. V prípade, že výsledok podvzoriek predstavuje najviac 50 % (analytická prahová hodnota) najvyššieho prípustného obsahu, vzorka spĺňa najvyšší prípustný obsah. Ak výsledok prekračuje 50 % najvyššieho obsahu, musí sa preskúmať ďalšia podvzorka a na kontrolu súladu s najvyšším prípustným obsahom sa použije priemer výsledkov obidvoch podvzoriek.

4.   Uskladnenie vzoriek

Vzorky sa musia skladovať pri teplote, ktorá nespôsobí zmeny v ich zložení. Vzorky určené na analýzu vitamínov alebo látok, ktoré sú mimoriadne citlivé na svetlo, sa uskladňujú pri takých podmienkach, aby vzorka nebola vystavená negatívnym účinkom svetla.

B.   USTANOVENIA TÝKAJÚCE SA CHEMIKÁLIÍ A PRÍSTROJOVÉHO VYBAVENIA POUŽÍVANÝCH PRI ANALYTICKÝCH METÓDACH

1.

Pokiaľ nie je v analytických metódach stanovené inak, všetky chemikálie musia byť analyticky čisté (a.p.). Pri analýze mikroprvkov sa čistota chemikálií musí kontrolovať slepým pokusom. Na základe dosiahnutých výsledkov sa môže vyžadovať ďalšie prečistenie chemikálií.

2.

Akýkoľvek krok pracovného postupu zahŕňajúci prípravu roztokov, riedenie, preplachovanie alebo premývanie, uvedený v analytických metódach bez uvedenia použitého rozpúšťadla alebo riediacej kvapaliny znamená, že sa musí použiť voda. Všeobecne platí, že voda musí byť demineralizovaná alebo destilovaná. V konkrétnych prípadoch, ktoré sú uvedené v analytických metódach, sa musí osobitne prečistiť.

3.

Vzhľadom na zariadenie bežných kontrolných laboratórií sa pri analytických metódach uvádzajú len špeciálne nástroje a prístrojové vybavenie alebo také, ktoré vyžadujú osobitné používanie. Musia byť čisté, najmä vtedy, keď ide o stanovenie veľmi malých množstiev látok.

C.   UPLATŇOVANIE ANALYTICKÝCH METÓD A VYJADROVANIE VÝSLEDKOV

1.   Extrakčný postup

Niektoré metódy si vyžadujú špecifické extrakčné postupy. Vo všeobecnosti platí, že iné extrakčné postupy ako ten, ktorý je uvedený v metóde, sa môžu uplatňovať len pod podmienkou, že sa dokáže, že tento použitý extrakčný postup má rovnakú extrakčnú účinnosť na analyzovanú matricu ako postup uvedený v metóde.

2.   Postup čistenia

Niektoré metódy si vyžadujú špecifické postupy čistenia. Vo všeobecnosti platí, že iné postupy čistenia ako ten, ktorý je uvedený v metóde, sa môžu uplatňovať len pod podmienkou, že sa dokáže, že tento použitý postup čistenia vykazuje rovnaké analytické výsledky pre analyzovanú matricu ako postup uvedený v metóde.

3.   Počet stanovení

Ak je pri analýze nežiaducich látok výsledok prvého stanovenia výrazne (> 50 %) nižší ako špecifikácia, ktorá sa má skontrolovať, nie sú potrebné žiadne ďalšie stanovenia pod podmienkou, že sa použijú vhodné postupy na určenie kvality. V ostatných prípadoch je na vylúčenie možnosti vnútornej krížovej kontaminácie alebo náhodného pomiešania vzoriek potrebná dvojnásobná analýza (druhé stanovenie). Na ďalšie posúdenie sa použije priemer týchto dvoch stanovení.

Ak je pri kontrole minimálnej hladiny alebo najvyššieho prípustného obsahu doplnkových látok v krmivách výsledok prvého stanovenia vyšší ako minimálna hladina alebo nižší ako najvyšší prípustný obsah, nie sú potrebné žiadne ďalšie stanovenia pod podmienkou, že sa použijú vhodné postupy na určenie kvality. V ostatných prípadoch je na vylúčenie možnosti vnútornej krížovej kontaminácie alebo náhodného pomiešania vzoriek potrebná dvojnásobná analýza (druhé stanovenie). Na ďalšie posúdenie sa použije priemer týchto dvoch stanovení.

Ak pri kontrole deklarovaného obsahu látky alebo zložky výsledok prvého stanovenia potvrdí deklarovaný obsah, t. j. ak analytický výsledok patrí do rozsahu prijateľnej odchýlky od deklarovaného obsahu, nie sú potrebné žiadne ďalšie stanovenia pod podmienkou, že sa použijú vhodné postupy na kontrolu kvality. V ostatných prípadoch je na vylúčenie možnosti vnútornej krížovej kontaminácie alebo náhodného pomiešania vzoriek potrebná dvojnásobná analýza (druhé stanovenie). Na ďalšie posúdenie sa použije priemer týchto dvoch stanovení (priemerný analytický výsledok patrí alebo nepatrí do rozsahu prijateľnej odchýlky od deklarovaného obsahu).

V niektorých prípadoch sa tento prijateľný rozsah odchýlky definuje v právnych predpisoch, ako napríklad v nariadení (ES) č. 767/2009 a v nariadení Európskeho parlamentu a Rady (EÚ) 2019/4 (1).

4.   Správa o použitej metóde analýzy

V správe o analýze sa musí uviesť použitá analytická metóda.

5.   Správa o analytickom výsledku

Analytický výsledok sa vyjadruje spôsobom, ktorý je uvedený v analytickej metóde, príslušným počtom platných číslic a podľa potreby sa koriguje vzhľadom na obsah vlhkosti v konečnej vzorke pred prípravou.

Väčšina regulačných úrovní (napr. najvyšší prípustný obsah, minimálna hladina) v právnych predpisoch EÚ v oblasti krmív pre zvieratá sa stanovuje vzhľadom na krmivo s obsahom vlhkosti 12 %. V týchto prípadoch sa teda na účely posúdenia analytického výsledku nameraného vo vzorke vzhľadom na regulačnú úroveň musí analytický výsledok najprv vydeliť obsahom sušiny vo vzorke (v %) vynásobeným koeficientom 88, ako sa uvádza v tejto rovnici:

kde:

Mc	:	obsah vlhkosti vzorky (v %). Výraz 100 – Mc teda predstavuje obsah sušiny vo vzorke (v %).
Rana	:	analytický výsledok nameraný vo vzorke.
R12 %	:	výsledok pre krmivo s obsahom vlhkosti 12 %; posúdi sa vzhľadom na regulačnú úroveň.

Okrem toho, ak sú splnené tieto podmienky:

—	výsledok analýzy je výrazne (> 50 %) nižší alebo vyšší ako informácie na označení/špecifikácia, ktorá sa má skontrolovať (v závislosti od toho, či informácia na označení/špecifikácia predstavuje najvyšší prípustný obsah alebo minimálnu hladinu),

—

obsah vlhkosti vzorkovaného krmiva je známy a je možné stanoviť, že posúdenie sa nezmení v dôsledku korekcie obsahu vlhkosti, potom pod podmienkou, že sa uplatňujú vhodné postupy na kontrolu kvality, a ak analýzy slúžia len na účely kontroly súladu s právnymi ustanoveniami, sa môže korekcia obsahu vlhkosti vynechať (napr. v prípadoch, keď neexistujú žiadne špecifikácie či regulačná úroveň), pokiaľ nie je potrebná na účely interpretácie.

Ak je analytický výsledok korigovaný vzhľadom na obsah vlhkosti, príslušná neistota merania sa takisto musí korigovať v tom istom postupe.

V prípade stanovenia ražného námeľu alebo škodlivých botanických nečistôt prostredníctvom vizuálneho preskúmania/preskúmania pod mikroskopom sa obsah vlhkosti nemusí korigovať.

6.   Analytická neistota merania a miera výťažnosti v prípade analýzy nežiaducich látok

Pokiaľ ide o nežiaduce látky v zmysle smernice 2002/32/ES, produkt určený na výživu zvierat sa považuje za nevyhovujúci z hľadiska najvyššieho prípustného obsahu, ak sa na základe analytického výsledku stanoveného ako priemer dvoch nezávislých stanovení, ktorý sa týka krmiva s obsahom vlhkosti 12 %, najvyšší prípustný obsah pokladá za prekročený, pričom sa zohľadňuje rozšírená analytická neistota merania s použitím koeficientu rozšírenia 2, v dôsledku čoho je úroveň spoľahlivosti približne 95 %, a korekcia vzhľadom na výťažnosť. To znamená, že na posúdenie súladu sa používa analyzovaná koncentrácia korigovaná vzhľadom na výťažnosť a po odpočítaní rozšírenej analytickej neistoty merania. Tento postup sa používa len v prípadoch, keď analytická metóda umožňuje odhad rozšírenej analytickej neistoty merania a korekcie vzhľadom na výťažnosť (nevyžaduje sa napr. v prípade vizuálneho preskúmania alebo preskúmania pod mikroskopom).

Ak analytický výsledok vzorky odobratej na účely obhajoby prekročí najvyšší prípustný obsah (bez toho, aby sa zohľadnila rozšírená analytická neistota merania), potvrdí sa tým nesúlad zistený v kontrolnej vzorke, a to aj bez osobitných pravidiel členského štátu v tejto oblasti.

Správa o analytickom výsledku sa podáva takto (pokiaľ používaná analytická metóda umožňuje odhadnúť rozšírenú analytickú neistotu merania):

a)

výsledok je korigovaný vzhľadom na výťažnosť, keď je to vhodné a relevantné, a v prípade korekcie sa táto skutočnosť uvedie. Uvedie sa miera výťažnosti, pokiaľ súčasťou postupu nie je vnútorná korekcia vychýlenia, pričom vychýlenie je rozdiel medzi nameranou hodnotou a referenčnou koncentráciou. Korekcia vzhľadom na výťažnosť nie je potrebná v prípade, že miera výťažnosti je v rozmedzí 90 – 110 %;

b)	ako „x +/– U“, kde x je analytický výsledok a U je rozšírená analytická neistota merania, pričom sa použije koeficient rozšírenia 2 (2), ktorý poskytuje úroveň spoľahlivosti približne 95 %.

Ak je však výsledok analýzy výrazne nižší (> 50 %) ako špecifikácia, ktorá sa má skontrolovať, a pod podmienkou, že sa uplatňujú vhodné postupy na kontrolu kvality, a ak analýzy slúžia len na účely kontroly súladu s právnymi ustanoveniami, miera výťažnosti a rozšírená analytická neistota merania sa môžu zo správy vynechať (napr. v prípadoch, keď neexistujú žiadne špecifikácie či regulačná úroveň), pokiaľ neistota merania nie je potrebná na účely interpretácie.

7.   Analytická neistota merania a miera výťažnosti v prípade analýzy obsahu doplnkových látok v krmivách

Na účely kontroly súladu s povoleným minimálnym a najvyšším prípustným obsahom doplnkových látok v krmivách sa prítomnosť doplnkových látok v krmivách považuje za nevyhovujúcu z hľadiska najnižšieho a najvyššieho prípustného obsahu, ak sa na základe analytického výsledku stanoveného ako priemer dvoch nezávislých stanovení, ktoré sa týkajú krmiva s obsahom vlhkosti 12 %, pokladá za:

—

prekračujúcu najvyšší prípustný obsah, pričom sa zohľadňuje rozšírená analytická neistota merania a korekcia vzhľadom na výťažnosť. To znamená, že na posúdenie súladu sa používa analyzovaná koncentrácia (t. j. priemer dvoch stanovení) korigovaná vzhľadom na výťažnosť a po odpočítaní rozšírenej analytickej neistoty merania,

—

nižšiu ako najnižší prípustný obsah, pričom sa zohľadňuje rozšírená analytická neistota merania a korekcia vzhľadom na výťažnosť. To znamená, že na posúdenie súladu sa používa analyzovaná koncentrácia (t. j. priemer dvoch stanovení) korigovaná vzhľadom na výťažnosť a po pripočítaní rozšírenej analytickej neistoty merania.

Ak analytický výsledok vzorky odobratej na účely obhajoby prekročí najvyšší prípustný obsah (bez toho, aby sa zohľadnila rozšírená analytická neistota merania), potvrdí sa tým nesúlad zistený v kontrolnej vzorke, a to aj bez osobitných pravidiel členského štátu v tejto oblasti.

Správa o analytickom výsledku sa podáva takto (pokiaľ používaná analytická metóda umožňuje odhadnúť rozšírenú analytickú neistotu merania):

a)

výsledok je korigovaný vzhľadom na výťažnosť, keď je to vhodné a relevantné, a v prípade korekcie sa táto skutočnosť uvedie. Uvedie sa miera výťažnosti, pokiaľ súčasťou postupu nie je vnútorná korekcia vychýlenia, pričom vychýlenie je rozdiel medzi nameranou hodnotou a referenčnou koncentráciou. Korekcia vzhľadom na výťažnosť nie je potrebná v prípade, že miera výťažnosti je v rozmedzí 90 – 110 %;

b)	ako ‚x +/– U‘, kde x je analytický výsledok (priemer dvoch stanovení) a U je rozšírená analytická neistota merania, pričom sa použije koeficient rozšírenia 2 (3), ktorý poskytuje úroveň spoľahlivosti približne 95 %.

„PRÍLOHA III

ANALYTICKÉ METÓDY NA KONTROLU ZLOŽENIA KŔMNYCH SUROVÍN A KŔMNYCH ZMESÍ

A.   STANOVENIE VLHKOSTI

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanovenie obsahu vlhkosti v krmivách. V prípade, že krmivo obsahuje prchavé látky, ako napr. organické kyseliny, treba si uvedomiť, že spolu s obsahom vlhkosti sa stanoví aj značné množstvo prchavých látok.

Táto metóda sa nevzťahuje na analýzu mliečnych výrobkov ako kŕmnych surovín a kŕmnych zmesí zložených predovšetkým z mliečnych výrobkov, na analýzu živočíšnych a rastlinných tukov a olejov, ani na analýzu olejnatých semien a olejnatých plodov.

Stanovenie obsahu vlhkosti v olejnatých semenách sa určí prostredníctvom metódy stanovenej normou EN ISO 665 „Stanovenie obsahu vlhkosti a prchavých látok“, pričom sója sa pred stanovením obsahu vlhkosti musí najprv pomlieť.

2.   Podstata metódy

Vzorka sa vysuší za špecifikovaných podmienok, ktoré sa líšia podľa druhu krmiva. Úbytok hmotnosti sa stanoví vážením. V prípade krmív tuhého skupenstva, ktoré majú vysoký obsah vlhkosti, je potrebné ich predsušenie.

3.   Prístrojové vybavenie

3.1.

Mlynček z materiálu, ktorý neabsorbuje vlhkosť, ľahko sa čistí, umožňuje rýchle mletie bez vytvárania znateľného tepla, v najvyššej možnej miere zamedzuje kontaktu s okolitým vzduchom a spĺňa požiadavky uvedené v bodoch 4.1.1 a 4.1.2 (napr. kladivkové alebo vodou chladené mikromlynčeky, rozoberateľné kužeľové mlynčeky, nízkootáčkové mlynčeky alebo mlynčeky s ozubenými kolesami).

3.2.

Analytické váhy s presnosťou na 1 mg.

3.3.

Suché vysúšačky z nehrdzavejúceho kovu alebo zo skla s vrchnákmi zaručujúcimi vzduchotesné uzatvorenie; s pracovným povrchom, na ktorom je možné rozprestrieť skúšobnú vzorku vo vrstve približne 0,3 g/cm2.

3.4.

Elektricky vyhrievaná izotermická sušiareň (± 2 °C), primerane vetraná, s možnosťou rýchlej regulácie teploty (1).

3.5.

Nastaviteľná elektricky vyhrievaná vákuová sušiareň vybavená olejovým čerpadlom a buď mechanizmom na vpúšťanie horúceho suchého vzduchu, alebo sušiacou látkou (napr. oxid vápenatý).

3.6.

Exsikátor s hrubou perforovanou kovovou alebo porcelánovou platňou obsahujúci účinnú sušiacu látku.

4.   Postup

Poznámka:

Postupy opísané v tomto oddiele sa musia vykonať hneď po otvorení balení so vzorkami. Analýza sa musí vykonať aspoň dvakrát.

4.1.   Príprava

4.1.1.   Krmivá iné ako krmivá patriace pod body 4.1.2 a 4.1.3

Odoberte aspoň 50 g vzorky. Ak je to potrebné, rozmeľte alebo rozdeľte ju takým spôsobom, aby sa zamedzilo akejkoľvek odchýlke v obsahu vlhkosti (pozri bod 6).

4.1.2.   Obilniny a obilné krúpy

Odoberte aspoň 50 g vzorky. Pomeľte na častice, z ktorých najmenej 50 % prejde sitom s veľkosťou ôk 0,5 mm, a zvyšok, ktorý zostane na site s okrúhlymi okami s veľkosťou 1 mm, bude predstavovať najviac 10 %.

4.1.3.   Krmivá v tekutej alebo pastovitej forme, krmivá prevažne zložené z olejov a tukov

Odoberte približne 25 g vzorky, odvážte s presnosťou na 10 mg, pridajte primerané množstvo bezvodého piesku odváženého s presnosťou na 10 mg a miešajte, až kým sa nezíska homogénny produkt.

4.2.   Sušenie

Sušte vysúšačku (bod 3.3) s vrchnákom v sušiarni nastavenej na teplotu 103 °C počas 30 min. +/- 1 min. Vyberte zo sušiarne a nechajte ju vychladnúť na teplotu okolia v exsikátore (bod 3.6).

4.2.1.   Krmivá iné ako krmivá patriace pod body 4.2.2 a 4.2.3

Odvážte vysúšačku s vrchnákom s presnosťou na 1 mg. Do odváženej vysúšačky navážte približne 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg a rovnomerne rozložte. Vložte vysúšačku bez vrchnáka do sušiarne predhriatej na teplotu 103 °C. Aby ste sa vyhli neželanému poklesu teploty sušiarne, vysúšačku do nej vložte čo najrýchlejšie. Vzorka sa suší štyri hodiny, ktoré sa počítajú od času, keď sa teplota v sušiarni vráti na 103 °C. Otvorte sušiareň, ihneď na vysúšačku znovu položte vrchnák, vyberte ju zo sušiarne, nechajte ju v exsikátore (bod 3.6) počas 30 až 45 minút vychladnúť a odvážte s presnosťou na 1 mg.

Krmivá zložené prevažne (> 50 %) z olejov a tukov živočíšneho a rastlinného pôvodu sušte v sušiarni ešte ďalších 30 minút pri teplote 103 °C. Rozdiel medzi dvomi váženiami nesmie presiahnuť 0,1 % vlhkosti.

4.2.2.   Obilniny, múka, krúpy a šrot

Odvážte vysúšačku s vrchnákom s presnosťou na 0,5 mg. Do odváženej vysúšačky navážte približne 5 g rozdrvenej vzorky s presnosťou na 1 mg a rovnomerne rozložte. Vložte vysúšačku bez vrchnáka do sušiarne predhriatej na teplotu 130 °C. Aby ste sa vyhli neželanému poklesu teploty sušiarne, vysúšačku do nej vložte čo najrýchlejšie. Vzorku nechajte sušiť dve hodiny, ktoré sa počítajú od času, keď sa teplota v sušiarni vráti na 130 °C. Otvorte sušiareň, ihneď na vysúšačku znovu položte vrchnák, vyberte ju zo sušiarne, nechajte ju v exsikátore (bod 3.6) počas 30 až 45 minút vychladnúť a odvážte s presnosťou na 1 mg.

4.2.3.   Kŕmna zmes obsahujúca viac ako 4 % sacharózy alebo laktózy: kŕmne suroviny, ako napr. svätojánsky chlieb, hydrolyzované obilninové produkty, slad, sušené repné rezky, šťavy z rýb a cukru.

Odvážte vysúšačku s vrchnákom s presnosťou na 0,5 mg. Do odváženej vysúšačky navážte približne 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg a rovnomerne rozložte. Vysúšačku bez vrchnáka vložte do vákuovej sušiarne (bod 3.5) predhriatej na teplotu medzi 80 °C a 85 °C. Aby ste sa vyhli neželanému poklesu teploty sušiarne, nádobu do nej vložte čo najrýchlejšie.

Nastavte tlak na 100 torrov a nechajte pri tomto tlaku sušiť štyri hodiny buď pod prúdom horúceho suchého vzduchu, alebo použite sušiaci prostriedok (približne 300 g na 20 vzoriek). V prípade použitia sušiacej látky odpojte vákuové čerpadlo po dosiahnutí predpísaného tlaku. Čas sušenia počítajte od momentu, keď sa teplota v sušiarni vráti na hodnotu od 80 °C do 85 °C. Opatrne upravte atmosférický tlak v sušiarni na pôvodnú hodnotu. Potom ju otvorte, ihneď na vysúšačku opäť položte vrchnák, vyberte ju zo sušiarne, nechajte v exsikátore (bod 3.6) 30 až 45 minút vychladnúť a odvážte s presnosťou na 1 mg. Sušte ďalších 30 minút vo vákuovej sušiarni pri teplote 80 °C až 85 °C a opäť odvážte. Rozdiel medzi dvomi váženiami nesmie presiahnuť 0,1 % vlhkosti.

4.3.   Predsušenie (čiastočné sušenie)

„Vlhké“ krmivá s hmotnostným zlomkom sušiny menej než 85 % (napr. krmoviny, celkové zmiešané kŕmne dávky, iné ako tekuté krmivo) sa musia čiastočne vysušiť pred jemným mletím na účely analýzy ich stálych látok; čiastočné sušenie nie je možné v prípade nestálych látok.

Čiastočné sušenie sa môže vykonávať buď s použitím sušičky s nútenou cirkuláciou vzduchu, alebo mikrovlnnej rúry, či prostredníctvom lyofilizácie. S výnimkou čiastočného sušenia lyofilizáciou je cieľom sušiť krmivo pri teplote vzorky udržiavanej pod 60 °C tak, aby sušenie malo čo najmenší vplyv na chemické zloženie vzorky. Sušenie pri teplotách vyšších než 60 °C spôsobuje chemické zmeny v krmive (napr. degradácia bielkovín). Vysušené krmivo sa odloží pri laboratórnej teplote približne na 15 minút, aby sa ustálilo, pred meraním čiastočne usušenej sušiny s cieľom minimalizovať potenciálnu zmenu vlhkosti, ku ktorej môže dôjsť počas mletia a skladovania. Pri sušení pri teplotách do 60 °C sa z krmiva neodstráni všetka voda; (prvotným) čiastočným sušením sa preto nezíska celková sušina krmiva. Po vysušení sa podvzorka pomelie a analyzuje sa na stanovenie (konečnej) sušiny čiastočne suchej vzorky (zvyšné 3 % až 15 % vlhkosti), keď sa stanovia ďalšie chemické zložky.

Odporúča sa preto dvojstupňový postup na stanovenie sušiny. Najprv sa stanoví obsah čiastočnej sušiny (ak vzorka obsahuje menej než 85 % sušiny), potom sa stanoví obsah zvyšnej sušiny v zomletej skúšobnej vzorke a čiastočná sušina sa vynásobí zvyšnou sušinou s cieľom stanoviť obsah celkovej sušiny.

5.   Výpočet výsledkov

Obsah vlhkosti (X), ako percento zo vzorky sa vypočíta podľa týchto rovníc:

5.1.   Sušenie bez predsušenia

kde:

m	=	počiatočná hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch,
m0	=	hmotnosť vysušenej skúšobnej vzorky v gramoch.

5.2.   Sušenie s predsušením (2)

kde:

m	=	počiatočná hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch,
m1	=	hmotnosť skúšobnej vzorky po predsušení v gramoch,
m2	=	hmotnosť skúšobnej vzorky po rozdrvení alebo pomletí v gramoch,
m0	=	hmotnosť vysušenej skúšobnej vzorky v gramoch.

5.3.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 0,2 % absolútnej hodnoty vlhkosti, s výnimkou mokrého krmiva pre spoločenské zvieratá a žuvačiek pre psy, v prípade ktorých rozdiel nesmie presiahnuť 0,5 % absolútnej hodnoty vlhkosti.

6.   Poznámka

Ak vzorku treba upraviť drvením a ak sa zdá, že sa touto úpravou zmení obsah vlhkosti produktu, výsledky analýzy zložiek krmív sa musia upraviť na základe obsahu vlhkosti vzorky v jej pôvodnom stave.

B.   STANOVENIE VLHKOSTI V ŽIVOČÍŠNYCH A RASTLINNÝCH TUKOCH A OLEJOCH

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah vody a prchavých látok v živočíšnych a rastlinných tukoch a olejoch.

2.   Podstata metódy

Vzorka je vysušená na konštantnú hmotnosť (úbytok hmotnosti medzi dvomi za sebou nasledujúcimi váženiami musí byť najviac 1 mg) pri teplote 103 °C. Úbytok hmotnosti sa stanoví vážením.

3.   Prístrojové vybavenie

3.1.

Miska s plochým dnom z nehrdzavejúceho materiálu s priemerom 8 až 9 cm a výškou približne 3 cm.

3.2.

Teplomer so spevnenou guľôčkou a s vyrovnávacou rúrkou na hornom konci, s delenou stupnicou od približne 80 °C najmenej do 110 °C a s dĺžkou približne 10 cm.

3.3.

Pieskový kúpeľ alebo elektrická vyhrievacia platňa.

3.4.

Exsikátor obsahujúci účinnú sušiacu látku.

3.5.

Analytické váhy.

4.   Postup

Navážte s presnosťou na 1 mg približne 20 g homogenizovanej vzorky do suchej odváženej misky (bod 3.1), v ktorej sa nachádza teplomer (bod 3.2). Zohrejte na pieskovom kúpeli alebo vyhrievacej platni (bod 3.3), za trvalého miešania teplomerom tak, aby teplota dosiahla hodnotu 90 °C za približne 7 minút.

Znížte intenzitu ohrevu pozorujúc frekvenciu, akou stúpajú bubliny z dna misky. Teplota nesmie presiahnuť hodnotu 105 °C. Pokračujte v miešaní, stierajúc dno misky, kým sa neprestanú tvoriť bubliny.

S cieľom zabezpečiť úplné odstránenie vlhkosti niekoľkokrát znovu zohrejte na teplotu 103 °C ± 2 °C, pričom medzi jednotlivými zohriatiami ochlaďte na 93 °C. Potom nechajte vychladnúť na laboratórnu teplotu v exsikátore (bod 3.4) a odvážte. Túto operáciu opakujte dovtedy, kým úbytok hmotnosti medzi dvomi za sebou nasledujúcimi váženiami nebude menší ako 2 mg.

Poznámka:

Nárast hmotnosti vzorky po opakovanom zohriatí znamená oxidáciu tuku, v takomto prípade vypočítajte výsledok z váženia vykonaného bezprostredne pred tým, ako začala hmotnosť stúpať.

5.   Výpočet výsledkov

Obsah vlhkosti (X), ako percento vzorky, je daný touto rovnicou:

kde:

m	=	hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch,
m1	=	hmotnosť misky s obsahom pred zohrievaním v gramoch,
m2	=	hmotnosť misky s obsahom po zohriatí v gramoch.

Výsledky menšie ako 0,05 % sa musia vyjadriť ako „menej ako 0,05 %“.

Opakovateľnosť

Rozdiel vo vlhkosti medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť 0,1 % v absolútnej hodnote.

C.   STANOVENIE OBSAHU DUSÍKA A VÝPOČET OBSAHU DUSÍKATÝCH LÁTOK

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah dusíkatých látok v krmive na základe obsahu dusíka stanoveného podľa Kjeldahlovej metódy (3).

2.   Podstata metódy

Vzorka sa mineralizuje kyselinou sírovou v prítomnosti katalyzátora. Kyslý roztok sa alkalizuje roztokom hydroxidu sodného. Amoniak sa oddestiluje a zachytí v odmeranom množstve kyseliny sírovej, ktorej prebytok sa titruje štandardným roztokom hydroxidu sodného.

Uvoľnený amoniak sa eventuálne oddestiluje do prebytku roztoku kyseliny boritej, po čom nasleduje titrácia roztokom kyseliny chlorovodíkovej alebo kyseliny sírovej.

3.   Činidlá

3.1.

Síran draselný.

3.2.

Katalyzátor: oxid meďnatý (II), CuO, alebo pentahydrát síranu meďnatého (II), CuSO4.5H2O.

3.3.

Granulovaný zinok.

3.4.

Kyselina sírová, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5.

Kyselina sírová, štandardný roztok, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6.

Kyselina sírová, štandardný roztok, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7.

Kyselina sírová, štandardný roztok, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8.

Indikátor metylčerveň: rozpustite 300 mg metylčervene v 100 ml etanolu, σ = 95 – 96 % (v/v).

3.9.

Roztok hydroxidu sodného (môže sa použiť technicky čistý), β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10.

Hydroxid sodný, štandardný roztok, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11.

Hydroxid sodný, štandardný roztok, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12.

Granulovaná pemza premytá kyselinou chlorovodíkovou a vyžíhaná.

3.13.

Acetanilid (b.t. = 114 °C, obsah N = 10,36 %).

3.14.

Sacharóza (bez dusíka).

3.15.

Kyselina boritá (H3BO3).

3.16.

Indikátorový roztok metylčervene: rozpustite 100 mg metylčervene v 100 ml etanolu alebo metanolu.

3.17.

Roztok bromkrezolovej zelene: rozpustite 100 mg bromkrezolovej zelene v 100 ml etanolu alebo metanolu.

3.18.

Roztok kyseliny boritej (10 g/l až 40 g/l v závislosti od použitého prístrojového vybavenia) Ak sa použije kolorimetrická detekcia bodu ekvivalencie, do roztokov kyseliny boritej sa musia pridať indikátory metylčerveň a bromkrezol. Ak sa pripravuje 1 liter kyseliny boritej, pred úpravou objemu sa pridá 7 ml indikátorového roztoku metylčervene (bod 3.16) a 10 ml roztoku bromkrezolovej zelene (bod 3.17). V závislosti od použitej vody sa môže pH jednotlivých roztokov kyseliny boritej líšiť. Rozsah pH roztoku kyseliny boritej musí byť od 4,3 do 4,7. Často je potrebná úprava pomocou malého objemu zásaditej látky tak, aby sa získalo vhodné pH. Poznámka: Pridanie cca 3 až 4 ml NaOH (bod 3.11) do 1 litra 10 g/l kyseliny boritej je zvyčajne dobrou metódou úpravy. Roztok skladujte pri laboratórnej teplote a počas skladovania ho chráňte pred svetlom a zdrojom amoniakových výparov.

3.19.

Štandardný roztok kyseliny chlorovodíkovej, c(HCL) = 0,10 mol/l. Poznámka: Možno použiť aj iné koncentrácie odmerných roztokov (body 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 a 3.19), ak sa to zohľadní pri výpočtoch. Koncentrácie by sa vždy mali vyjadriť s presnosťou na štyri desatinné miesta.

4.   Prístrojové vybavenie

Prístrojové vybavenie je vhodné na vykonanie mineralizácie, destilácie a titrácie podľa Kjeldahlovej metódy.

5.   Postup

5.1.   Mineralizácia

Navážte 1 g vzorky s presnosťou na 0,001 g a vzorku preneste do mineralizačnej banky. Pridajte 15 g síranu draselného (bod 3.1), vhodné množstvo katalyzátora (bod 3.2) [0,3 až 0,4 g oxidu meďnatého (II) alebo 0,9 až 1,2 g pentahydrátu síranu meďnatého (II)], 25 ml kyseliny sírovej (bod 3.4) a v prípade potreby niekoľko granúl pemzy (bod 3.12) a premiešajte.

Banku najskôr mierne zahrievajte, ak je potrebné, obsah občas premiešajte, až kým hmota zuhoľnatie a kým sa prestane tvoriť pena; potom zahrievajte intenzívnejšie, až kým kvapalina nedosiahne trvalý var. Zahrievanie je primerané vtedy, keď vriaca kyselina kondenzuje na stenách banky. Zabráňte prehriatiu stien banky a zachytávaniu organických častíc na nich.

Keď sa roztok vyčíri a získa svetlozelenú farbu, pokračujte vo vare ešte ďalšie dve hodiny, potom nechajte vychladnúť.

5.2.   Destilácia

Opatrne pridajte dostatočné množstvo vody, aby sa sírany úplne rozpustili. Nechajte vychladnúť a potom v prípade potreby pridajte niekoľko granúl zinku (bod 3.3). Postupujte podľa bodov 5.2.1 alebo 5.2.2.

5.2.1.   Destilácia do kyseliny sírovej

Do zachytávacej banky destilačného prístroja dajte presne odmerané množstvo 25 ml kyseliny sírovej (bod 3.5) alebo (bod 3.7) v závislosti od predpokladaného obsahu dusíka. Pridajte niekoľko kvapiek indikátora metylčervene (bod 3.8).

Pripojte mineralizačnú banku na chladič destilačného prístroja a ponorte koniec chladiča do kvapaliny nachádzajúcej sa v zachytávacej banke do hĺbky najmenej 1 cm (pozri poznámku bod 8.3). Pomaly nalejte 100 ml roztoku hydroxidu sodného (bod 3.9) do mineralizačnej banky bez straty amoniaku (pozri poznámku v bode 8.1). Banku zahrievajte až do úplného predestilovania amoniaku.

5.2.2.   Destilácia do kyseliny boritej

V prípade manuálnej titrácie amoniakového obsahu destilátu sa uplatňuje postup uvedený ďalej. V prípade, že destilačná jednotka je plne automatizovaná a zahŕňa titráciu amoniakového obsahu destilátu, dodržiavajte pokyny výrobcu pre prevádzku destilačnej jednotky.

Umiestnite zachytávaciu banku s obsahom 25 až 30 ml roztoku kyseliny boritej (bod 3.18) pod otvor chladiča tak, že vývod chladiča je ponorený pod hladinu roztoku kyseliny boritej, ktorá je v prebytku. Prispôsobte destilačnú jednotku na dávkovanie 50 ml roztoku hydroxidu sodného (bod 3.9). S destilačnou jednotkou pracujte podľa pokynov výrobcu a destilujte amoniak uvoľnený pridaním roztoku hydroxidu sodného. Zachytávajte destilát do zachytávacieho roztoku kyseliny boritej. Množstvo destilátu (čas parnej destilácie) závisí od množstva dusíka vo vzorke. Dodržujte pokyny výrobcu.

Poznámka:

V poloautomatickej destilačnej jednotke sa dopĺňanie zvyšného hydroxidu sodného a parná destilácia vykonávajú automaticky.

5.3.   Titrácia

Postupujte podľa bodu 5.3.1 alebo 5.3.2.

5.3.1.   Kyselina sírová

Titrujte prebytočnú kyselinu sírovú v zachytávacej banke s roztokom hydroxidu sodného (bod 3.10 alebo bod 3.11) v závislosti od koncentrácie použitej kyseliny sírovej až do dosiahnutia bodu ekvivalencie.

5.3.2.   Kyselina boritá

Titrujte obsah zachytávacej banky so štandardným roztokom kyseliny chlorovodíkovej (bod 3.19) alebo štandardným roztokom kyseliny sírovej (bod 3.6) použitím byrety a prečítajte množstvo použitého titračného roztoku.

Ak sa použije kolorimetrická detekcia bodu ekvivalencie, bod ekvivalencie sa dosiahne pri prvom sfarbení obsahu na ružovo. Odčítajte objem byrety s presnosťou na 0,05 ml. Bod ekvivalencie možno lepšie vidieť, ak sa použije osvietená magnetická platňa na miešanie alebo fotometrický detektor.

Tento postup možno vykonať automaticky použitím parného destilátora s automatickou titráciou.

Pri prevádzke špecifického destilátora alebo destilátora/titrátora dodržiavajte pokyny výrobcu.

Poznámka:

Pri použití automatického titračného systému sa titrácia začína hneď po začatí destilácie a použije sa 1 % roztok kyseliny boritej (bod 3.18).

Pri použití plne automatickej destilačnej jednotky sa automatická titrácia amoniaku môže vykonať aj pomocou detekcie bodu ekvivalencie použitím potenciometrického pH systému.

V tomto prípade sa použije automatický titrátor s pH-metrom. Tento pH-meter má byť správne kalibrovaný v rozsahu pH od 4 do 7 podľa bežných laboratórnych postupov týkajúcich sa kalibrácie pH.

Bod ekvivalencie titrácie pH sa dosiahne pri hodnote pH 4,6, pričom ide o bod obratu na titračnej krivke (inflexný bod).

5.4.   Slepý pokus

Vykonajte slepý pokus, ktorým sa potvrdí, že chemikálie neobsahujú dusík (mineralizáciou, destiláciou a titráciou), s použitím 1 g sacharózy (bod 3.14) namiesto vzorky.

6.   Výpočet výsledkov

Výpočty sa robia podľa bodu 6.1 alebo 6.2.

6.1.   Výpočet pri titrácii podľa bodu 5.3.1

Obsah dusíkatých látok vyjadrený ako percentuálny podiel hmotnosti sa vypočíta podľa tohto vzorca:

kde:

V0	=	objem (ml) hydroxidu sodného (bod 3.10 alebo bod 3.11) použitého pri slepom pokuse,
V1	=	objem (ml) hydroxidu sodného (bod 3.10 alebo bod 3.11) použitého pri titrácii vzorky,
c	=	koncentrácia (mol/l) hydroxidu sodného (bod 3.10 alebo bod 3.11),
m	=	hmotnosť g) vzorky.

6.2.   Výpočet pri titrácii podľa bodu 5.3.2

6.2.1.   Titrácia s kyselinou chlorovodíkovou

Obsah dusíkatých látok vyjadrený ako percentuálny podiel hmotnosti sa vypočíta podľa tohto vzorca:

kde:

m	=	hmotnosť g) skúšobnej dávky,
c	=	koncentrácia (mol/l) štandardného roztoku kyseliny chlorovodíkovej (bod 3.19),
V0	=	objem (ml) kyseliny chlorovodíkovej použitej pri slepom pokuse,
V1	=	objem (ml) kyseliny chlorovodíkovej použitej na skúšobnú dávku.

6.2.2.   Titrácia s kyselinou sírovou

Obsah dusíkatých látok vyjadrený ako percentuálny podiel hmotnosti sa vypočíta podľa tohto vzorca:

kde:

m	=	hmotnosť g) skúšobnej dávky,
c	=	koncentrácia (mol/l) štandardného roztoku kyseliny sírovej (bod 3.6),
V0	=	objem (ml) kyseliny sírovej (bod 3.6) použitej pri slepom pokuse,
V1	=	objem (ml) kyseliny sírovej (bod 3.6) použitej na skúšobnú dávku.

7.   Overenie metódy

7.1.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť:

—	0,4 % v absolútnej hodnote pre obsah dusíkatých látok menší ako 20 %,

—	2,0 % z vyššej hodnoty pre obsah dusíkatých látok od 20 % do 40 %,

—	0,8 % v absolútnej hodnote pre obsah dusíkatých látok vyšší ako 40 %.

7.2.   Reprodukovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch stanovení vykonaných v tej istej vzorke v rôznych laboratóriách nesmie presiahnuť:

—	1,8 % v absolútnej hodnote pre obsah dusíkatých látok menší ako 20 %,

—	9,0 % z vyššej hodnoty pre obsah dusíkatých látok od 20 % do 40 %,

—	3,6 % v absolútnej hodnote pre obsah dusíkatých látok vyšší ako 40 %.

7.3.   Presnosť

Vykonajte analýzu (mineralizáciu, destiláciu a titráciu) na primeranom množstve acetanilidu (bod 3.13) (napr. 0,2 až 0,3 g) v prítomnosti 1 g sacharózy (bod 3.14); na 1 g acetanilidu sa spotrebuje 14,80 ml kyseliny sírovej (bod 3.5). Výťažnosť musí byť aspoň 99 %.

8.   Poznámky

8.1.

Prístrojové vybavenie môže byť manuálne, poloautomatické alebo automatické. Ak si prístrojové vybavenie vyžaduje prenos medzi krokom mineralizácie a destilácie, musí sa vykonať bez toho, aby došlo k stratám. Ak zachytávacia banka destilačného prístroja nie je vybavená prikvapkávacím lievikom, pridajte bezprostredne pred jej pripojením na chladič hydroxid sodný pomalým prilievaním kvapaliny po stene banky.

8.2.

Ak zmineralizovaná látka stuhne, zopakujte stanovenie s použitím väčšieho množstva kyseliny sírovej (bod 3.4), ako je množstvo uvedené v bode 5.1.

8.3.

Pri produktoch s nižším obsahom dusíka možno v prípade potreby objem kyseliny sírovej (bod 3.7) pridávanej do zachytávacej banky znížiť na 10 alebo 15 ml a doplniť vodou na 25 ml.

8.4.

Pri rutinnej analýze sa na stanovenie dusíkatých látok môžu použiť alternatívne metódy, no referenčnou metódou je Kjeldahlova metóda opísaná v časti C. Ekvivalencia výsledkov získaných alternatívnou metódou (napr. DUMAS) v porovnaní s referenčnou metódou sa musí dokázať samostatne pri každej matrici. Keďže výsledky získané alternatívnou metódou sa môžu aj v prípade overenia ekvivalencie nepatrne odchyľovať od výsledkov získaných referenčnou metódou, je potrebné v správe o analýze uviesť metódu analýzy použitú pri stanovení dusíkatých látok.

D.   STANOVENIE MOČOVINY

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanovenie obsahu močoviny používanej ako doplnková látka v krmivách pre prežúvavce.

2.   Podstata metódy

Vzorka sa rozmieša vo vode s číriacim činidlom. Suspenzia sa prefiltruje. Obsah močoviny vo filtráte sa stanovuje po pridaní 4-dimetylaminobenzaldehydu (4-DMAB) zmeraním absorbancie pri vlnovej dĺžke 420 nm.

3.   Činidlá

3.1.

Roztok 4-dimetylaminobenzaldehydu: rozpustite 1,6 g 4-DMAB v 100 ml 96 % etanolu a pridajte 10 ml kyseliny chlorovodíkovej (ρ20 1,19 g/ml). Túto chemikáliu možno uchovávať maximálne dva týždne.

3.2.

Carrezovo činidlo I: rozpustite vo vode 21,9 g dihydrátu octanu zinočnatého Zn(CH3COO)2.2H2O a 3 g ľadovej kyseliny octovej. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.3.

Carrezovo činidlo II: rozpustite vo vode 10,6 g trihydrátu ferokyanidu draselného, K4Fe(KN)6.3H2O. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.4.

Aktívne uhlie, ktoré neabsorbuje močovinu (je potrebné skontrolovať).

3.5.

Močovina, 0,1 % roztok (w/v).

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.

Mixér (trepačka): približne 35 až 40 ot/min.

4.2.

Skúmavky: 160 × 16 mm so zábrusovými zátkami.

4.3.

Spektrofotometer.

5.   Postup

5.1.   Analýza vzorky

Navážte 2 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte spolu s 1 g aktívneho uhlia (bod 3.4) do 500 ml kalibrovanej odmernej banky. Pridajte 400 ml vody a 5 ml Carrezovho činidla I (bod 3.2), miešajte približne 30 sekúnd a pridajte 5 ml Carrezovho činidla II (bod 3.3). Miešajte tridsať minút v trepačke. Doplňte objem vodou, potrepte a prefiltrujte.

Odoberte 5 ml z číreho bezfarebného filtrátu do skúmaviek so zábrusovými zátkami, pridajte 5 ml roztoku 4-DMAB (bod 3.1) a premiešajte. Skúmavky umiestnite do vodného kúpeľa s teplotou 20 °C (+/– 4 °C). Po pätnástich minútach zmerajte absorbanciu roztoku vzorky spektrofotometrom pri 420 nm. Porovnajte s roztokom pri slepom pokuse z použitých chemikálií.

5.2.   Kalibračná krivka

Odoberte objemy 1, 2, 4, 5 a 10 ml z roztoku močoviny (bod 3.5), vložte každý do jednej 100 ml kalibrovanej odmernej banky a doplňte objem vodou. Odoberte z každého roztoku 5 ml, pridajte do každého 5 ml roztoku 4-DMAB (bod 3.1), homogenizujte a zmerajte absorbanciu podľa uvedeného postupu porovnaním s kontrolným roztokom obsahujúcim 5 ml 4-DMAB a 5 ml vody bez močoviny. Zakreslite kalibračnú krivku.

6.   Výpočet výsledkov

Množstvo močoviny vo vzorke sa stanoví pomocou kalibračnej krivky.

Výsledok vyjadrite v mg močoviny na kg vzorky.

7.   Hodnotenie metódy

7.1.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch stanovení vykonaných v tej istej vzorke v rovnakom laboratóriu a tou istou osobou vykonávajúcou analýzu nesmie presiahnuť:

—	pri 420 nm: — 50 % z vyššej hodnoty pre obsah močoviny v rozsahu od 3 000 mg/kg až do menej než 5 000 mg/kg, — 25 % z vyššej hodnoty pre obsah močoviny v rozsahu od 5 000 mg/kg až do menej než 7 000 mg/kg, — 20 % z vyššej hodnoty pre obsah močoviny 7 000 mg/kg a viac,

—	pri 435 nm: — 40 % z vyššej hodnoty pre obsah močoviny v rozsahu od 3 000 mg/kg až do menej než 5 000 mg/kg, — 25 % z vyššej hodnoty pre obsah močoviny v rozsahu od 5 000 mg/kg až do menej než 9 000 mg/kg, — 5 % z vyššej hodnoty pre obsah močoviny 9 000 mg/kg a viac,

7.2.   Reprodukovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch stanovení vykonaných v tej istej vzorke v rôznych laboratóriách a/alebo rôznymi osobami vykonávajúcimi analýzu nesmie presiahnuť:

—	pri 420 nm: — 3 000 mg/kg v absolútnej hodnote pre obsah močoviny v rozsahu od 3 000 mg/kg až do menej než 12 000 mg/kg, — 4 500 mg/kg v absolútnej hodnote pre obsah močoviny 12 000 mg/kg a viac,

—	pri 435 nm: — 50 % z vyššej hodnoty pre obsah močoviny v rozsahu od 3 000 mg/kg až do menej než 8 000 mg/kg, — 25 % z vyššej hodnoty pre obsah močoviny 8 000 mg/kg a viac,

8.   Výsledky medzilaboratórnej štúdie

Uskutočnilo sa medzilaboratórne porovnanie EÚ, na ktorom sa zúčastnilo 18 laboratórií. Analýze bolo podrobených päť pozitívnych vzoriek kŕmnej zmesi pre prežúvavce (v tabuľkách 1 a 2 uvedených ako MAT) v podobe slepých duplikátov, pričom raz sa uskutočnila analýza jednej slepej vzorky kŕmnej zmesi pre prežúvavcov.

Výpočty týkajúce sa limitov opakovateľnosti r) a reprodukovateľnosti (R), ako sú vymedzené v medzinárodných usmerneniach, sa vykonali po odstránení odľahlých hodnôt s použitím analýzy rozptylu platných hodnôt.

Vypočítané hodnoty analytického výkonu metódy (opakovateľnosť, reprodukovateľnosť) sa uvádzajú v týchto tabuľkách. Vo všetkých skúšaných vzorkách vrátane slepého materiálu sa nenašli žiadne falošne pozitívne ani falošne negatívne výsledky.

Tabuľka 1

Charakteristiky analytického výkonu metódy pre močovinu meranú pri λ = 420 nm vo všetkých materiáloch

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Ovce	Dobytok	Ovce	Ovce	Dobytok
Cieľový hmotnostný zlomok (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Priemerný hmotnostný zlomok (mg kg-1)	4 241	6 993	7 830	9 962	12 071
Smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti sR (mg kg-1)	1 141	1 303	985	994	1 711
Smerodajná odchýlka opakovateľnosti sr (mg kg-1)	723	601	549	712	737
Relatívna smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti RSDR (%)	27	19	13	10	14
Relatívna smerodajná odchýlka opakovateľnosti RSDr (%)	17	9	7	7	6
Limit reprodukovateľnosti, R [R = 2,8 × sR ]	3 195	3 649	2 759	2 784	4 790
Limit opakovateľnosti, r [r = 2,8 × sr ]	2 024	1 684	1 536	1 994	2 064

Tabuľka 2

Charakteristiky analytického výkonu metódy pre močovinu meranú pri λ = 435 nm vo všetkých materiáloch

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Ovce	Dobytok	Ovce	Ovce	Dobytok
Cieľový hmotnostný zlomok (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Priemerný hmotnostný zlomok (mg kg-1)	4 101	6 467	7 890	10 062	11 642
Smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti sR (mg kg-1)	706	1 194	675	745	1 378
Smerodajná odchýlka opakovateľnosti sr (mg kg-1)	570	628	613	196	167
Relatívna smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti RSDR (%)	17	18	9	7	12
Relatívna smerodajná odchýlka opakovateľnosti RSDr (%)	14	10	8	2	1
Limit reprodukovateľnosti, R [R = 2,8 × sR ]	1 977	3 344	1 889	2 087	3 859
Limit opakovateľnosti, r [r = 2,8 × sr ]	1 596	1 759	1 715	549	467

9.   Poznámky

9.1.

V prípade, že obsah močoviny presahuje 3 %, zredukujte vzorku na 1 g alebo rozrieďte pôvodný roztok tak, aby v 500 ml nebolo viac ako 50 mg močoviny.

9.2.

V prípade nízkeho obsahu močoviny vzorku zväčšujte až dovtedy, kým filtrát zostane číry a bezfarebný.

9.3.

Z uvedených výsledkov medzilaboratórnych skúšok nevyplýva významný rozdiel v presnosti medzi močovinou meranou pri 420 nm alebo pri 435 nm.

E.   STANOVENIE AMINOKYSELÍN (OKREM TRYPTOFÁNU)

Na stanovenie aminokyselín (okrem tryptofánu) sa použijú tieto analytické metódy:

—	EN ISO 13903 Krmivá pre zvieratá. Stanovenie obsahu aminokyselín,

—	EN ISO 17180 Krmivá pre zvieratá. Stanovenie lyzínu, metionínu a treonínu v obchodných výrobkoch a premixoch aminokyselín (4),

—	analytická metóda opísaná ďalej v bodoch 1 až 10.

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanovenie voľných (syntetických a prírodných) a celkových (viazaných peptidickou väzbou a voľných) aminokyselín v kŕmnych surovinách, kŕmnych zmesiach a premixoch obsahujúcich menej než 10 % (5) z každej aminokyseliny s použitím analyzátora aminokyselín. Je použiteľná pre tieto aminokyseliny: cysteín (cystín), metionín, lyzín, treonín, alanín, arginín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutámovú, glycín, histidín, izoleucín, leucín, fenylalanín, prolín, serín, tyrozín a valín.

Táto metóda nedokáže rozlíšiť rôzne soli aminokyselín a nedokáže diferencovať medzi D a L formami aminokyselín. Neplatí pre stanovenie tryptofánu alebo hydroxyanalógov aminokyselín.

2.   Podstata metódy

2.1.   Voľné aminokyseliny

Voľné aminokyseliny sa extrahujú zriedenou kyselinou chlorovodíkovou. Spolu extrahované dusíkové makromolekuly sa vyzrážajú kyselinou sulfosalicylovou a odstránia sa filtráciou. Hodnota pH prefiltrovaného roztoku sa upraví na 2,20. Aminokyseliny sa oddelia pomocou iónovo-výmennej chromatografie a stanovia sa reakciou s ninhydrínom pomocou fotometrickej detekcie pri 570 nm.

2.2.   Celkové aminokyseliny

Zvolený postup závisí od aminokyselín, ktoré sa majú skúmať. Cysteín (cystín) a metionín sa musia pred hydrolýzou zoxidovať na kyselinu cysteovú a metionín sulfón. Tyrozín sa musí stanoviť v hydrolyzátoch neoxidovaných vzoriek. Všetky ostatné aminokyseliny uvedené v bode 1 (Účel a oblasť) sa dajú stanoviť v oxidovanej alebo neoxidovanej vzorke.

Oxidácia sa vykoná pri 0 °C zmesou kyseliny permravčej a fenolu. Prebytočné oxidačné činidlo sa rozloží pomocou disiričitanu disodného. Oxidovaná alebo neoxidovaná vzorka sa hydrolyzuje 23 hodín kyselinou chlorovodíkovou (bod 3.20). Hodnota pH hydrolyzátu sa upraví na 2,20. Aminokyseliny sa oddelia pomocou iónovo-výmennej chromatografie a stanovia sa reakciou s ninhydrínom pomocou fotometrickej detekcie pri 570 nm (v prípade prolínu pri 440 nm).

3.   Činidlá

Musí sa použiť dvakrát destilovaná voda alebo voda rovnakej kvality (vodivosť < 10 μS).

3.1.

Peroxid vodíka, w (w/w) = 30 %.

3.2.

Kyselina mravčia, w (w/w) = 98 – 100 %.

3.3.

Fenol.

3.4.

Disiričitan disodný.

3.5.

Hydroxid sodný.

3.6.

Dihydrát kyseliny 5-sulfosalicylovej

3.7.

Kyselina chlorovodíková, hustota približne 1,18 g/ml.

3.8.

Dihydrát citranu trojsodného.

3.9.

2‚2’-tiodietanol (tiodiglykol).

3.10.

Chlorid sodný.

3.11.

Ninhydrín.

3.12.

Petroléter, rozpätie bodu varu 40 °C – 60 °C.

3.13.

Norleucín alebo iná zlúčenina vhodná na použitie ako vnútorný štandard.

3.14.

Plynný dusík (< 10 ppm kyslíka).

3.15.

1-oktanol.

3.16.

Aminokyseliny.

3.16.1.

Štandardné látky aminokyselín uvedené v bode 1 (Účel a oblasť). Čisté zlúčeniny bez obsahu vody z kryštalizácie. Pred použitím ich sušte vo vákuu jeden týždeň nad P2O5 alebo H2SO4.

3.16.2.

Kyselina cysteová.

3.16.3.

Metionín sulfón.

3.17.

Roztok hydroxidu sodného, c = 7,5 mol/l: Rozpustite 300 g NaOH (bod 3.5) vo vode a objem doplňte na 1 liter.

3.18.

Roztok hydroxidu sodného, c = 1 mol/l: Rozpustite 40 g NaOH (bod 3.5) vo vode a objem doplňte na 1 liter.

3.19.

Roztok kyseliny mravčej a fenolu: zmiešajte 889 g kyseliny mravčej (bod 3.2) so 111 g vody a pridajte 4,73 g fenolu (bod 3.3).

3.20.

Hydrolyzačná zmes, c = 6 mol HCl/l s obsahom 1 g fenolu/l: pridajte 1 g fenolu (bod 3.3) k 492 ml HCl (bod 3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.21.

Extrakčná zmes, c = 0,1 mol HCl/l s obsahom 2 % tiodiglykolu: vezmite 8,2 ml HCl (bod 3.7), rozrieďte približne s 900 ml vody, pridajte 20 ml tiodiglykolu (bod 3.9) a objem doplňte vodou na 1 liter (body 3.7 a 3.9 nezmiešajte priamo).

3.22.

Kyselina 5-sulfosalicylová, ß = 6 %: rozpustite 60 g kyseliny 5-sulfosalicylovej (bod 3.6) vo vode a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.23.

Oxidačná zmes (kyselina permravčia – fenol): zmiešajte 0,5 ml peroxidu vodíka (bod 3.1) so 4,5 ml roztoku kyseliny mravčej s fenolom (bod 3.19) v malej kadičke. Inkubujte jednu hodinu pri teplote 20 – 30 °C, aby sa vytvorila kyselina permravčia, potom nechajte vychladnúť v ľadovom vodnom kúpeli (15 minút) pred pridaním k vzorke. Upozornenie: Vyhnite sa kontaktu s kožou a použite ochranný odev.

3.24.

Citranový tlmivý roztok, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: rozpustite 19,61 g citranu sodného (bod 3.8), 5 ml tioglykolu (bod 3.9), 1 g fenolu (bod 3.3) a 16,50 ml HCl (bod 3.7) približne v 800 ml vody. Upravte pH na 2,20. Doplňte vodou na objem 1 liter.

3.25.

Elučné tlmivé roztoky pripravené podľa podmienok pre použitý analyzátor (bod 4.9).

3.26.

Nihydrínové činidlo pripravené podľa podmienok pre použitý analyzátor (bod 4.9).

3.27.

Štandardné roztoky aminokyselín. Tieto roztoky treba skladovať pri teplote pod 5 °C.

3.27.1.

Zásobný štandardný roztok aminokyselín (bod 3.16.1), c = 2,5 μmol/ml každá v kyseline chlorovodíkovej. Možno ich získať aj komerčne.

3.27.2.

Zásobný štandardný roztok kyseliny cysteovej a metionín sulfónu, c = 1,25 μmol/ml. Rozpustite 0,2115 g kyseliny cysteovej (bod 3.16.2) a 0,2265 g metionín sulfónu (bod 3.16.3) v citranovom tlmivom roztoku (bod 3.24) v 1 l odmernej banke a doplňte po značku citranovým tlmivým roztokom. Skladujte pri teplote pod 5 °C najviac 12 mesiacov. Tento roztok sa nepoužíva, ak zásobný štandardný roztok (bod 3.27.1) obsahuje kyselinu cysteovú a metionín sulfón.

3.27.3.

Zásobný štandardný roztok vnútorného štandardu, napr. norleucín, c = 20 μmol/ml. Rozpustite 0,6560 g norleucínu (bod 3.13) v citranovom tlmivom roztoku (bod 3.24) v odmernej banke a doplňte objem citranovým tlmivým roztokom na 250 ml. Skladujte pri teplote pod 5 °C najviac šesť mesiacov.

3.27.4.

Kalibračný roztok štandardných aminokyselín na použitie s hydrolyzátmi, c = 5 nmol/50 μl kyseliny cysteovej a metionín sulfónu a c = 10 nmol/50 μl ostatných aminokyselín. Rozpustite 2,2 g chloridu sodného (bod 3.10) v 100 ml kadičke s 30 ml citranového tlmivého roztoku (bod 3.24). Pridajte 4,00 ml zásobného štandardného roztoku aminokyselín (bod 3.27.1), 4,00 ml zásobného štandardného roztoku kyseliny cysteovej a metionín sulfónu (bod 3.27.2) a 0,50 ml zásobného štandardného roztoku vnútorného štandardu (bod 3.27.3), ak sa používa. Hydroxidom sodným (bod 3.18) upravte pH na 2,20. Preneste kvantitatívne do 50 ml odmernej banky, doplňte po značku citranovým tlmivým roztokom (bod 3.24) a premiešajte. Skladujte pri teplote pod 5 °C najviac 3 mesiace. Pozri aj poznámky bod 9.1.

3.27.5.

Kalibračný roztok štandardných aminokyselín na použitie s hydrolyzátmi pripravenými podľa bodu 5.3.3.1 a na použitie s extraktmi (bod 5.2). Kalibračný roztok sa pripravuje podľa bodu 3.27.4, no bez použitia chloridu sodného. Skladujte pri teplote pod 5 °C najviac 3 mesiace.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.

Banka s guľatým dnom s objemom 100 alebo 250 ml vybavená spätným chladičom.

4.2.

Fľaša z borokremičitého skla s objemom 100 ml so skrutkovým uzáverom s gumovou/teflonovou podložkou (napr. Duran, Schott) na použitie v sušiarni.

4.3.

Sušiareň s nútenou ventiláciou a regulátorom teploty s presnosťou vyššou ako ± 2 °C.

4.4.

pH meter (s presnosťou na tri desatinné miesta).

4.5.

Membránový filter (0,22 μm).

4.6.

Odstredivka.

4.7.

Rotačná vákuová odparka.

4.8.

Mechanická trepačka alebo magnetické miešadlo.

4.9.

Analyzátor aminokyselín alebo zariadenie HPLC s iónovo-výmennou kolónou, zariadenie pre ninhydrín, postkolónová derivatizačná jednotka a fotometrický detektor. Kolóna je naplnená sulfónovanými polystyrénovými živicami, ktoré sú schopné oddeliť aminokyseliny navzájom, ako aj od iných ninhydrín-pozitívnych materiálov. Prietok pre tlmivý roztok a ninhydrín zabezpečujú pumpy, ktoré majú stabilitu prietoku ± 0,5 % v období, počas ktorého sa vykoná aj kalibrácia pomocou štandardu aj analyzovanie vzorky. Pri niektorých analyzátoroch aminokyselín sa môžu použiť také postupy hydrolýzy, v ktorých hydrolyzát má koncentráciu sodíka c = 0,8 mol/l a obsahuje všetku zvyškovú kyselinu mravčiu z oxidácie. Iné analyzátory nedokážu uspokojivo oddeliť určité aminokyseliny, ak hydrolyzát obsahuje prebytok kyseliny mravčej a/alebo vysoké koncentrácie sodíkového iónu. V tomto prípade sa objem kyseliny zredukuje odparením približne na 5 ml po hydrolýze a pred úpravou pH. Odparenie musí prebehnúť vo vákuu pri teplote najviac 40 °C.

5.   Postup

5.1.   Príprava vzorky

Vzorka sa pomelie tak, aby prepadla sitom s veľkosťou ôk 0,5 mm. Vzorky s vysokým obsahom vlhkosti sa pred mletím musia vysušiť buď vzduchom pri teplote do 50 °C, alebo lyofilizáciou. Vzorky s vysokým obsahom tuku treba pred mletím extrahovať s petroléterom (bod 3.12).

5.2.   Stanovenie voľných aminokyselín

Navážte s presnosťou na 0,2 mg primerané množstvo (1 – 5 g) pripravenej vzorky (bod 5.1) do Erlenmeyerovej banky a pridajte 100,0 ml extrakčnej zmesi (bod 3.21). Zmes trepte 60 min. použitím mechanickej trepačky alebo magnetického miešadla (bod 4.8). Nechajte sediment usadiť a pipetou preneste 10,0 ml zo supernatantu do kadičky s objemom 100 ml.

Primiešajte 5,0 ml roztoku kyseliny 5-sulfosalicylovej (bod 3.22) a pokračujte v miešaní pomocou magnetického miešadla počas 5 minút. Supernatant odstreďte alebo prefiltrujte, aby sa odstránili všetky zrazeniny. Preneste 10,0 ml výsledného roztoku do 100 ml kadičky a upravte pH na 2,20 použitím roztoku hydroxidu sodného (bod 3.18), preneste do kalibrovanej odmernej banky primeraného objemu s použitím citranového tlmivého roztoku (bod 3.24) a doplňte týmto roztokom (bod 3.24) po značku.

Ak sa používa vnútorný štandard, pridajte 1,00 ml vnútorného štandardu (bod 3.27.3) na každých 100 ml konečného roztoku a doplňte citranovým tlmivým roztokom (bod 3.24) po značku.

Ďalším krokom je chromatografia podľa bodu 5.4.

Ak sa extrakty neanalyzujú v ten istý deň, musia sa uskladniť pri teplote pod 5 °C.

5.3.   Stanovenie celkových aminokyselín

5.3.1.   Oxidácia

S presnosťou na 0,2 mg navážte 0,1 – 1 g pripravenej vzorky (bod 5.1) do:

—	100 ml banky s guľatým dnom (bod 4.1) na otvorenú hydrolýzu (bod 5.3.2.3) alebo

—	250 ml banky s guľatým dnom (bod 4.1), ak sa vyžaduje nízka koncentrácia sodíka (bod 5.3.3.1), alebo

—	100 ml fľaše so skrutkovým uzáverom (bod 4.2) (na uzavretú hydrolýzu bod 5.3.2.4).

Navážené množstvo vzorky musí mať obsah dusíka približne 10 mg a obsah vlhkosti nesmie presahovať 100 mg.

Vložte banku/fľašu do ľadového vodného kúpeľa a ochlaďte na 0 °C, pridajte 5 ml oxidačnej zmesi (bod 3.23) a premiešajte sklenenou špachtľou s ohnutým hrotom. Utesnite banku/fľašu, v ktorej je špachtľa, vzduchotesnou fóliou, vložte ľadový vodný kúpeľ s utesnenou nádobou do chladničky pri teplote 0 °C a nechajte pôsobiť 16 hodín. Po 16 hodinách vyberte z chladničky a rozložte prebytok oxidačného činidla pridaním 0,84 g disiričitanu disodného (bod 3.4).

Postupujte podľa bodu 5.3.2.1.

5.3.2.   Hydrolýza

5.3.2.1.

Hydrolýza oxidovaných vzoriek K oxidovanej vzorke pripravenej podľa bodu 5.3.1 pridajte 25 ml hydrolyzačnej zmesi (bod 3.20), pričom pozorne zmyte všetky zvyšky vzorky, ktoré sa držia na stranách nádoby a špachtle. V závislosti od použitého postupu hydrolýzy postupujte podľa bodov 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4.

5.3.2.2.

Hydrolýza neoxidovaných vzoriek Do 100 ml alebo 250 ml banky s guľatým dnom (bod 4.1) alebo do 100 ml fľaše so skrutkovým uzáverom (bod 4.2) navážte 0,1 až 1 g pripravenej vzorky (bod 5.1) s presnosťou na 0,2 mg. Navážené množstvo vzorky musí obsahovať približne 10 mg dusíka. Opatrne pridajte 25 ml hydrolyzačnej zmesi (bod 3.20) a zmiešajte so vzorkou. Postupujte podľa bodov 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4.

5.3.2.3.

Otvorená hydrolýza Pridajte 3 sklenené guľôčky k zmesi v banke (pripravenej v súlade s bodmi 5.3.2.1 alebo 5.3.2.2) a varte pri stálom prebublávaní s refluxom 23 hodín. Po dokončení hydrolýzy chladič umyte 5 ml citranového tlmivého roztoku (bod 3.24). Odpojte banku a ochlaďte v ľadovom kúpeli. Postupujte podľa bodu 5.3.3.

5.3.2.4.

Uzavretá hydrolýza Vložte fľašu s obsahom zmesi pripravenej v súlade s bodmi 5.3.2.1 alebo 5.3.2.2 do sušiarne (bod 4.3) pri teplote 110 °C. Počas prvej hodiny len položte na vrch nádoby skrutkový uzáver, aby ste predišli vytvoreniu tlaku (v dôsledku vytvárania plynných látok) a zabránili výbuchu. Nezatvárajte nádobu uzáverom. Po hodine uzatvorte nádobu uzáverom a nechajte na 23 hodín v sušiarni (bod 4.3). Po ukončení hydrolýzy vyberte fľašu zo sušiarne, opatrne otvorte uzáver fľaše a vložte ju do ľadového vodného kúpeľa. Nechajte vychladnúť. V závislosti od postupu na úpravu pH (bod 5.3.3) preneste kvantitatívne obsah fľaše do 250 ml kadičky alebo 250 ml banky s guľatým dnom s použitím citranového tlmivého roztoku (bod 3.24). Postupujte podľa bodu 5.3.3.

5.3.3.   Úprava pH

V závislosti od tolerancie analyzátora aminokyselín (bod 4.9) voči sodíku postupujte pri úprave pH podľa bodov 5.3.3.1 alebo 5.3.3.2.

5.3.3.1.

Chromatografické systémy (bod 4.9) vyžadujúce nízku koncentráciu sodíka. Pri použití analyzátora aminokyselín, ktorý vyžaduje nízku koncentráciu sodíka (keď sa musí znížiť objem kyseliny), sa odporúča použiť zásobný roztok vnútorného štandardu (bod 3.27.3). V takomto prípade pridajte k hydrolyzátu pred odparovaním 2,00 ml zásobného roztoku vnútorného štandardu (bod 3.27.3). Pridajte 2 kvapky 1-oktanolu (bod 3.15) k hydrolyzátu získanému podľa bodov 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4. Použitím rotačnej odparky (bod 4.7) znížte objem na 5 – 10 ml vo vákuu pri teplote 40 °C. Ak sa objem náhodou zníži na menej ako 5 ml, hydrolyzát sa musí znehodnotiť a analýza opakovať. Upravte pH na 2,20 s roztokom hydroxidu sodného (bod 3.18) a postupujte ďalej podľa bodu 5.3.4.

5.3.3.2.

Pre všetky ostatné analyzátory aminokyselín (bod 4.9) Vezmite hydrolyzáty získané podľa bodov 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4 a čiastočne ich neutralizujte opatrným pridávaním za miešania 17 ml roztoku hydroxidu sodného (bod 3.17), pričom je potrebné zabezpečiť, aby sa teplota udržala pod 40 °C. Upravte pH na 2,20 pri laboratórnej teplote použitím roztoku hydroxidu sodného (bod 3.17) a nakoniec roztoku hydroxidu sodného (bod 3.18). Postupujte podľa bodu 5.3.4.

5.3.4.   Roztok vzorky na chromatografiu

Kvantitatívne preneste hydrolyzát s upraveným pH (body 5.3.3.1 alebo 5.3.3.2) s citranovým tlmivým roztokom (bod 3.24) do 200 ml kalibrovanej odmernej banky a doplňte po značku tlmivým roztokom (bod 3.24).

Ak ešte nebol použitý vnútorný štandard, pridajte 2,00 ml vnútorného štandardu (bod 3.27.3) a doplňte po značku citranovým tlmivým roztokom (bod 3.24). Dôkladne premiešajte.

Pristúpte ďalej ku chromatografii (bod 5.4).

Ak sa roztoky vzorky neanalyzujú v ten istý deň, musia sa uskladniť pri teplote pod 5 °C.

5.4.   Chromatografia

Pred chromatografiou upravte teplotu extraktu (bod 5.2) alebo hydrolyzátu (bod 5.3.4) na laboratórnu teplotu. Zmes potrepte a prefiltrujte vhodné množstvo cez 0,22 μm membránový filter (bod 4.5). Výsledný číry roztok sa podrobí iónovo-výmennej chromatografii s použitím analyzátora aminokyselín (bod 4.9).

Nastreknutie sa môže vykonať manuálne alebo automaticky. Dôležité je, aby sa na kolónu nadávkovalo rovnaké analyzované množstvo roztoku štandardov a vzoriek s odchýlkou ± 0,5 % s výnimkou prípadov používania vnútorného štandardu a aby boli pomery sodíka a aminokyselín v roztokoch štandardu a vzorky v najvyššej možnej miere podobné.

Vo všeobecnosti závisí frekvencia kalibrácií od stability ninhydrínového činidla a analytického systému. Štandard alebo vzorka sa rozriedi s citranovým tlmivým roztokom (bod 3.24) tak, aby plocha píku štandardu predstavovala 30 – 200 % plochy píku aminokyseliny vzorky.

Chromatografia aminokyselín sa mierne odlišuje podľa typu použitého analyzátora a použitej živice. Zvolený systém musí byť schopný oddeliť aminokyseliny navzájom, ako aj od iných ninhydrín-pozitívnych materiálov. V pracovnom rozsahu musí chromatografický systém poskytnúť lineárnu odozvu na zmeny v množstvách aminokyselín pridaných do kolóny.

Počas chromatografie, keď sa analyzuje ekvimolárny roztok (aminokyselín, ktoré sa stanovujú), sa uplatňujú pomery výšky údolia k výške píku, ako sa uvádza ďalej. Tento ekvimolárny roztok musí obsahovať najmenej 30 % maximálneho množstva každej aminokyseliny, ktorá sa dá presne odmerať pomocou systému analyzátora aminokyselín (bod 4.9).

Pri oddeľovaní treonínu od serínu nesmie pomer výšky údolia k výške píku nižšej z dvoch prekrývajúcich sa aminokyselín na chromatograme prekročiť pomer 2:10 (ak sa stanovuje len cystín (cysteín), metionín, treonín a lyzín, nedostatočné oddelenie od susediacich píkov nepriaznivo ovplyvní proces stanovenia). Pri všetkých ostatných aminokyselinách musí byť oddelenie v pomere lepšom ako 1:10.

Systém musí zabezpečiť, aby sa lyzín oddelil od „lyzínových artefaktov“ a od ornitínu.

6.   Výpočet výsledkov

Plochy píkov vzorky a štandardu sa merajú pre každú jednotlivú aminokyselinu a vypočíta sa množstvo (X) v g aminokyselín na kg vzorky.

Ak sa použije vnútorný štandard, vynásobte:

A	=	plocha píku, hydrolyzátu alebo extraktu,
B	=	plocha píku, kalibračný štandardný roztok,
C	=	plocha píku, vnútorný štandard v hydrolyzáte alebo extrakte,
D	=	plocha píku, vnútorný štandard, kalibračný štandardný roztok,
M	=	molekulová hmotnosť aminokyseliny, ktorá sa stanovuje,
c	=	koncentrácia štandardu v μmol/ml,
m	=	hmotnosť vzorky g) (upravená na pôvodnú hmotnosť, ak je sušená alebo odtučnená),
V	=	celkový hydrolyzát v ml (bod 5.3.4) alebo vypočítaný objem celkového zriedenia extraktu v ml (bod 6.1).

Cystín a cysteín sa obidva stanovujú ako kyselina cysteová v hydrolyzátoch oxidovanej vzorky, no vypočítajú sa ako cystín (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) pomocou M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionín sa stanovuje ako metionín sulfón v hydrolyzátoch oxidovanej vzorky, no vypočíta sa ako metionín pomocou M metionínu: 149,21 g/mol.

Pridaný voľný metionín sa stanovuje po extrakcii ako metionín a výpočet sa vykoná pomocou tej istej molekulovej hmotnosti M.

6.1.

Objem celkového zriedenia extraktov (F) na stanovenie voľných aminokyselín (bod 5.2) sa vypočíta takto: V = objem konečného extraktu

7.   Hodnotenie metódy

Metóda bola testovaná v rámci vzájomného porovnávania na medzinárodnej úrovni v roku 1990 pomocou štyroch rôznych krmív (kŕmna zmes pre ošípané, kŕmna zmes pre brojlery, bielkovinový koncentrát, premix).

Poznámka:

Metóda bola testovaná v rámci druhej medzinárodnej štúdie vzájomného porovnávania v roku 2003 pomocou slepého duplikátu párov vzoriek krmiva na záverečný výkrm brojlerov, krmiva na začiatok výkrmu brojlerov, kukurice, rybej múčky a hydinovej múčky. Podrobné informácie sa nachádzajú v norme EN ISO 13903.

Výsledky vzájomného porovnávania priemeru a smerodajnej odchýlky z roku 1990 po eliminácii odľahlých hodnôt sú uvedené v tabuľkách v tomto bode:

Priemery v g/kg

Referenčný materiál	Aminokyselina
	Treonín	Cyste)ín	Metionín	Lyzín
Kŕmna zmes pre ošípané	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Kŕmna zmes pre brojlery	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Bielkovinový koncentrát	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Premix	58,42 n = 16	–	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = počet zúčastnených laboratórií.

7.1.   Opakovateľnosť

Opakovateľnosť vyjadrená ako ‚ vnútrolaboratórna smerodajná odchýlka‘ vzájomného porovnávania z predchádzajúcej tabuľky je uvedená v nasledujúcich tabuľke:

Variačný koeficient (v %) opakovateľnosti (CVr)

Referenčný materiál	Aminokyselina
	Treonín	Cyste)ín	Metionín	Lyzín
Kŕmna zmes pre ošípané	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Kŕmna zmes pre brojlery	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Bielkovinový koncentrát	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Premix	2,2 n = 16	–	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = počet zúčastnených laboratórií.

7.2.   Reprodukovateľnosť

Výsledky smerodajnej odchýlky medzi laboratóriami na základe uvedeného vzájomného porovnania sú uvedené v tabuľkách ďalej:

Variačný koeficient (v %) reprodukovateľnosti (CVR)

Referenčný materiál	Aminokyselina
	Treonín	Cyste)ín	Metionín	Lyzín
Kŕmna zmes pre ošípané	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Kŕmna zmes pre brojlery	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Bielkovinový koncentrát	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Premix	4,3 n = 16	–	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = počet zúčastnených laboratórií.

8.   Využitie referenčných materiálov

Správne uplatňovanie tejto metódy sa overí vykonaním opakovaných meraní certifikovaných referenčných materiálov, ak sú takéto materiály k dispozícii. Odporúča sa kalibrácia certifikovaným kalibračným roztokom aminokyselín.

9.   Poznámky

9.1.

V dôsledku rozdielov medzi analyzátormi aminokyselín sa berú za základ konečné koncentrácie kalibračných roztokov štandardných aminokyselín (pozri body 3.27.4 a 3.27.5) a hydrolyzátu (pozri bod 5.3.4). Rozsah lineárnej odozvy prístrojového vybavenia sa musí preveriť pri všetkých aminokyselinách. Štandardný roztok sa zriedi s citranovým tlmivým roztokom tak, aby plochy píkov boli v strede rozsahu.

9.2.

V prípade použitia zariadenia na vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu na analýzu hydrolyzátov sa musia optimalizovať experimentálne podmienky v súlade s odporúčaniami výrobcu.

9.3.

Uplatňovaním tejto metódy na kŕmne zmesi alebo premixy s obsahom viac ako 1 % chloridu (koncentrát, minerálne krmivá, doplnkové krmivá) môže dôjsť k podhodnoteniu metionínu a musí sa vykonať osobitná úprava.

10.   Kritériá účinnosti

Zhrnutie výsledkov (okrem výsledkov týkajúcich sa tyrozínu) pochádzajúcich z dvoch medzilaboratórnych štúdií (zo štúdie z roku 1990 uvedenej v bode 7 a zo štúdie z roku 2005 uvedenej v norme EN/ISO 13903) poskytuje nasledujúce kritériá opakovateľnosti a reprodukovateľnosti. Hodnoty odvodené z týchto dvoch medzilaboratórnych skúšok sa nesmú vzťahovať na iné rozsahy a matrice koncentrácie než tie, ktoré sú dané.

10.1.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch stanovení vykonaných v tej istej vzorke v rovnakom laboratóriu a tou istou osobou vykonávajúcou analýzu nesmie presiahnuť:

—	6 % z vyššej hodnoty pre celkový obsah aminokyselín v prípade glycínu, alanínu, lyzínu, prolínu, kyseliny glutámovej, izoleucínu a histidínu,

—	8 % z vyššej hodnoty pre celkový obsah aminokyselín v prípade treonínu, fenylalanínu, metionínu, kyseliny asparágovej a leucínu,

—	10 % z vyššej hodnoty pre celkový obsah aminokyselín v prípade arginínu a valínu,

—	12 % z vyššej hodnoty pre celkový obsah aminokyseliny serín,

—	15 % z vyššej hodnoty pre celkový obsah aminokyseliny cysteín (cystín).

10.2.   Reprodukovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch stanovení vykonaných v tej istej vzorke v rôznych laboratóriách a/alebo rôznymi osobami vykonávajúcimi analýzu nesmie presiahnuť:

—	15 % z vyššej hodnoty pre celkový obsah aminokyselín v prípade glycínu, alanínu a treonínu,

—	20 % z vyššej hodnoty pre celkový obsah aminokyselín v prípade lyzínu, prolínu, fenylalanínu, metionínu a kyseliny asparágovej,

—	22 % z vyššej hodnoty pre celkový obsah aminokyselín v prípade kyseliny glutámovej a leucínu.

—	27 % z vyššej hodnoty pre celkový obsah aminokyseliny arginín,

—	32 % z vyššej hodnoty pre celkový obsah aminokyseliny izoleucín,

—	35 % z vyššej hodnoty pre celkový obsah aminokyselín v prípade valínu a serínu,

—	40 % z vyššej hodnoty pre celkový obsah aminokyseliny histidín,

—	50 % z vyššej hodnoty pre celkový obsah aminokyseliny cysteín (cystín).

F.   STANOVENIE TRYPTOFÁNU

Na stanovenie tryptofánu sa použijú tieto analytické metódy:

—	EN ISO 13904 Krmivá pre zvieratá. Stanovenie obsahu tryptofánu,

—	analytická metóda opísaná ďalej v bodoch 1 až 9.

1.   Účel a oblasť

Metóda umožňuje stanovenie celkového a voľného tryptofánu v krmivách. Nerozlišuje medzi D a L formami.

2.   Podstata metódy

Na stanovenie celkového tryptofánu sa vzorka hydrolyzuje v alkalickom prostredí s nasýteným roztokom hydroxidu bárnatého a zahreje sa na 110 °C na 20 hodín. Po hydrolýze sa pridá vnútorný štandard.

Na stanovenie voľného tryptofánu sa vzorka extrahuje v mierne kyslom prostredí v prítomnosti vnútorného štandardu.

Tryptofán a vnútorný štandard v hydrolyzáte alebo v extrakte sa stanovujú pomocou HPLC s fluorescenčnou detekciou.

3.   Činidlá

3.1.

Musí sa použiť dvakrát destilovaná voda alebo voda rovnakej kvality (vodivosť < 10 μS/cm).

3.2.

Štandardná látka: tryptofán (čistota/obsah ≥ 99 %) vysušený vo vákuu nad oxidom fosforečným.

3.3.

Vnútorný štandard: α-metyl-tryptofán (čistota/obsah ≥ 99 %) vysušený vo vákuu nad oxidom fosforečným.

3.4.

Oktahydrát hydroxidu bárnatého [Ba(OH)2.8H2O sa nesmie nechať dlho na vzduchu, aby sa nevytváral BaCO3, ktorý môže narušiť proces stanovenia] (pozri poznámku bod 9.3).

3.5.

Hydroxid sodný.

3.6.

Kyselina orto-fosforečná, w (w/w) = 85 %.

3.7.

Kyselina chlorovodíková, ρ20 1,19 g/ml.

3.8.

Metanol, čistoty HPLC.

3.9.

Petroléter, rozpätie bodu varu 40 °C – 60 °C.

3.10.

Roztok hydroxidu sodného, c = 1 mol/l. Rozpustite 40,0 g NaOH (bod 3.5) vo vode a objem doplňte vodou na 1 liter (bod 3.1).

3.11.

Kyselina chlorovodíková, c = 6 mol/l: vezmite 492 ml HCl (bod 3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.12.

Kyselina chlorovodíková, c = 1 mol/l: vezmite 82 ml HCl (bod 3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.13.

Kyselina chlorovodíková, c = 0,1 mol/l: vezmite 8,2 ml HCl (bod 3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.14.

Kyselina orto-fosforečná, c = 0,5 mol/l: vezmite 34 ml kyseliny orto-fosforečnej (bod 3.6) a objem doplňte vodou na 1 liter (bod 3.1).

3.15.

Koncentrovaný roztok tryptofánu (bod 3.2), c = 2,50 μmol/ml: v 500 ml kalibrovanej odmernej banke rozpustite 0,2553 g tryptofánu (bod 3.2) v kyseline chlorovodíkovej (bod 3.13) a doplňte kyselinou chlorovodíkovou (bod 3.13) po značku. Skladujte pri teplote –18 °C maximálne štyri týždne.

3.16.

Koncentrovaný roztok vnútorného štandardu, c = 2,50 μmol/ml: v 500 ml kalibrovanej odmernej banke rozpustite 0,2728 g α-metyl-tryptofánu (bod 3.3) v kyseline chlorovodíkovej (bod 3.13) a doplňte kyselinou chlorovodíkovou (bod 3.13) po značku. Skladujte pri teplote –18 °C maximálne štyri týždne.

3.17.

Kalibračný štandardný roztok tryptofánu a vnútorného štandardu: vezmite 2,00 ml koncentrovaného roztoku tryptofánu (bod 3.15) a 2,00 ml koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (α-metyl-tryptofán) (bod 3.16). Zrieďte vodou (bod 3.1.) a metanolom (bod 3.8.) na približne rovnaký objem a rovnakú koncentráciu metanolu (10 – 30 %), ako má konečný hydrolyzát. Tento roztok sa musí pripravovať čerstvo pred použitím. Počas prípravy ho chráňte pred priamym slnečným svetlom.

3.18.

Kyselina octová.

3.19.

1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanol.

3.20.

Etanolamín, w (w/w) > 98 %.

3.21.

Roztok 1 g 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (bod 3.19) v 100 ml metanolu (bod 3.8).

3.22.

Mobilná fáza pre HPLC: 3,00 g kyseliny octovej (bod 3.18) + 900 ml vody (bod 3.1) + 50,0 ml roztoku (bod 3.21) 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (bod 3.19) v metanole (bod 3.8) (1 g/100 ml). Upravte pH na 5,00 pomocou etanolamínu (bod 3.20). Objem doplňte vodou (bod 3.1) na 1 000 ml.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.

Zariadenie HPLC s fluorescenčným detektorom.

4.2.

Kolóna na kvapalinovú chromatografiu, 125 mm × 4 mm, s náplňou C18, 3 μm alebo ekvivalentná.

4.3.

pH meter.

4.4.

Polypropylénová banka, objem 125 ml so širokým hrdlom a závitovým uzáverom.

4.5.

Membránový filter, 0,45 μm.

4.6.

Autokláv, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) baru.

4.7.

Mechanická trepačka alebo magnetické miešadlo.

4.8.

Vírivý mixér.

5.   Postup

5.1.   Príprava vzoriek

Vzorka sa pomelie tak, aby prepadla sitom s veľkosťou ôk 0,5 mm. Vzorky s vysokým obsahom vlhkosti sa pred mletím musia vysušiť buď vzduchom pri teplote do 50 °C, alebo lyofilizáciou. Vzorky s vysokým obsahom tuku sa pred mletím extrahujú petroléterom (bod 3.9).

5.2.   Stanovenie voľného tryptofánu (extrakt)

Navážte s presnosťou na 1 mg primerané množstvo (1 – 5 g) pripravenej vzorky (bod 5.1) do Erlenmeyerovej banky. Pridajte 100,0 ml kyseliny chlorovodíkovej (bod 3.13) a 5,00 ml koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (bod 3.16). Zmes trepte alebo miešajte 60 min. na mechanickej trepačke alebo na magnetickej miešačke (bod 4.7). Nechajte sediment usadiť a pipetou preneste 10,0 ml zo supernatantu do kadičky. Pridajte 5 ml kyseliny orto-fosforečnej (bod 3.14). Upravte pH na 3 pomocou hydroxidu sodného (bod 3.10). Pridajte dostatočné množstvo metanolu (bod 3.8.) na dosiahnutie koncentrácie v rozmedzí 10 až 30 % metanolu v konečnom objeme. Preneste do kalibrovanej odmernej banky primeraného objemu a rozrieďte s vodou na objem potrebný na chromatografiu [približne rovnaký objem, ako je objem kalibračného štandardného roztoku (bod 3.17)].

Prefiltrujte niekoľko ml roztoku cez 0,45 μm membránový filter (bod 4.5) pred nástrekom na HPLC kolónu. Ďalším krokom je chromatografia podľa bodu 5.4.

Štandardný roztok a extrakty chráňte pred priamym slnečným svetlom. Ak nie je možné analyzovať extrakty v ten istý deň, môžu sa skladovať pri teplote 5 °C maximálne tri dni.

5.3.   Stanovenie celkového tryptofánu (hydrolyzát)

Navážte s presnosťou na 0,2 mg od 0,1 do 1 g pripravenej vzorky (bod 5.1) do polypropylénovej banky (bod 4.4). Navážené množstvo vzorky má obsahovať približne 10 mg dusíka. Pridajte 8,4 g oktahydrátu hydroxidu bárnatého (bod 3.4) a 10 ml vody. Zamiešajte na vírivom mixéri (bod 4.8.) alebo magnetickom miešadle (bod 4.7.). Ponechajte teflónový magnet v zmesi. Steny nádoby opláchnite 4 ml vody. Položte na ňu skrutkový uzáver a voľne banku uzatvorte. Preneste do autoklávu (bod 4.6) s vriacou vodou a nechajte v pare 30 – 60 minút. Uzatvorte autokláv a autoklávujte 20 hodín pri 110 (± 2) °C.

Pred otvorením autoklávu znížte teplotu na hodnotu tesne pod 100 °C. K teplej zmesi pridajte 30 ml vody laboratórnej teploty, aby ste sa vyhli kryštalizácii Ba(OH)2.8H2O. Jemne potrepte alebo premiešajte. Pridajte 2,00 ml koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (α-metyl-tryptofán) (bod 3.16). Nechajte nádobu 15 minút ochladzovať vo vodnom/ľadovom kúpeli.

Potom pridajte 5 ml kyseliny orto-fosforečnej (bod 3.14). Nádobu nechajte v chladiacom kúpeli a neutralizujte pomocou HCl (bod 3.11) za stáleho miešania a upravte pH na 3,0 pomocou HCl (bod 3.12). Pridajte dostatočné množstvo metanolu na dosiahnutie koncentrácie v rozmedzí 10 až 30 % metanolu v konečnom objeme. Preneste do kalibrovanej odmernej banky primeraného objemu a zrieďte s vodou, aby sa dosiahol stanovený objem potrebný na chromatografiu (napríklad 100 ml). Pridanie metanolu nesmie spôsobiť vyzrážanie.

Prefiltrujte niekoľko ml roztoku cez 0,45 μm membránový filter (bod 4.5) pred nástrekom na HPLC kolónu. Ďalším krokom je chromatografia podľa bodu 5.4.

Štandardný roztok a hydrolyzáty chráňte pred priamym slnečným svetlom. Ak nie je možné analyzovať hydrolyzáty v ten istý deň, môžu sa skladovať pri teplote 5 °C maximálne tri dni.

5.4.   Stanovenie pomocou HPLC

Na usmernenie sú k dispozícii tieto podmienky pre izokratickú elúciu; môžu sa uplatniť iné podmienky, ak poskytujú rovnaké výsledky (pozri aj poznámky k bodom 9.1 a 9.2):

Kolóna na kvapalinovú	125 mm × 4 mm, s náplňou C18, 3 μm alebo chromatografiu (bod 4.2): ekvivalentná
Teplota kolóny:	Izbová teplota
Mobilná fáza (bod 3.22):	3,00 g kyseliny octovej (bod 3.18) + 900 ml vody (bod 3.1) + 50,0 ml roztoku (bod 3.21) 1,1,1-trichloro-2- metyl-2-propanolu (bod 3.19) v metanole (bod 3.8) (1 g/100 ml). Upravte pH na 5,00 pomocou etanolamínu (bod 3.20). Doplňte vodou (bod 3.1) na objem 1 000 ml.
Prietoková rýchlosť:	1 ml/min.
Celkový čas analýzy:	približne 34 min.
Detekčná vlnová dĺžka:	excitácia: 280 nm, emisia: 356 nm
Vstrekový objem	20 μl

6.   Výpočet výsledkov

Množstvo tryptofánu (X) v g na 100 g vzorky sa vypočíta podľa vzorca:

A	=	plocha píku vnútorného štandardu, kalibračného štandardného roztoku (bod 3.17),
B	=	plocha píku tryptofánu, extraktu (bod 5.2) alebo hydrolyzátu (bod 5.3),
V1	=	objem v ml (2 ml) koncentrovaného roztoku tryptofánu (bod 3.15) pridaného do kalibračného roztoku (bod 3.17),
c	=	koncentrácia v μmol/ml (= 2,50) koncentrovaného roztoku tryptofánu (bod 3.15) pridaného do kalibračného roztoku (bod 3.17),
V2	=	objem v ml koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (bod 3.16) pridaného pri extrakcii (bod 5.2) (= 5,00 ml) alebo k hydrolyzátu (bod 5.3) (= 2,00 ml),
C	=	plocha píku vnútorného štandardu, extraktu (bod 5.2) alebo hydrolyzátu (bod 5.3),
D	=	plocha píku tryptofánu, kalibračného štandardného roztoku (bod 3.17),
V3	=	objem v ml (bod = 2,00 ml) koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (bod 3.16) pridaného do kalibračného štandardného roztoku (bod 3.17),
m	=	hmotnosť vzorky v g (upravená na pôvodnú hmotnosť, ak je sušená a/alebo odtučnená),
M	=	molekulová hmotnosť tryptofánu (= 204,23 g/mol).

7.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 10 % z najvyššieho výsledku.

8.   Výsledky medzilaboratórnej štúdie

Zorganizovala sa medzilaboratórna štúdia EÚ (4. vzájomné porovnávanie), v ktorej sa analyzovali tri vzorky až v 12 laboratóriách na overenie metódy pre hydrolýzu. Každá vzorka sa analyzovala päťkrát. Výsledky sú uvedené v tejto tabuľke:

	Vzorka 1 Krmivo pre ošípané	Vzorka 2 Krmivo pre ošípané doplnené L-tryptofánom	Vzorka 3 Koncentrát krmiva pre ošípané
L	12	12	12
n Priemer [g/kg]	50 2,42	55 3,40	50 4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [%]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVR [%]	6,3	6,0	2,2
L = počet laboratórií, ktoré poskytli výsledky, n = počet jednotlivých výsledkov, ktoré zostali po eliminácii odľahlých hodnôt (určené Cochranovým, Dixonovým testom na odľahlé hodnoty), sr = smerodajná odchýlka opakovateľnosti, SR = smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti, r = opakovateľnosť, R = reprodukovateľnosť, CVr = variačný koeficient opakovateľnosti, %, CVR = variačný koeficient reprodukovateľnosti, %.

Zorganizovala sa ďalšia medzilaboratórna štúdia EÚ (3. vzájomné porovnávanie), v ktorej sa analyzovali dve vzorky až v 13 laboratóriách na overenie metódy pre extrakciu voľného tryptofánu. Každá vzorka sa analyzovala päťkrát. Výsledky sú uvedené v tejto tabuľke:

	Vzorka 4 Zmes pšenice a sóje	Vzorka 5 Zmes pšenice a sóje (= vzorka 4) s pridaným tryptofánom (0,457g/kg)
L n	12 55	12 60
Priemer [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [%]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [%]	4,71	5,11
L = počet laboratórií, ktoré poskytli výsledky, n = počet jednotlivých výsledkov, ktoré zostali po eliminácii odľahlých hodnôt (určené Cochranovým, Dixonovým testom na odľahlé hodnoty), sr = smerodajná odchýlka opakovateľnosti, SR = smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti, r = opakovateľnosť, R = reprodukovateľnosť, CVr = variačný koeficient opakovateľnosti, %, CVR = variačný koeficient reprodukovateľnosti, %.

Zorganizovala sa ďalšia štúdia EÚ vzájomného porovnania, v ktorej sa analyzovali štyri vzorky až v siedmich laboratóriách s cieľom certifikovať tryptofán na hydrolýzu. Výsledky sa uvádzajú ďalej. Každá vzorka sa analyzovala päťkrát.

	Vzorka 1 Kŕmna zmes pre ošípané (CRM 117)	Vzorka 2 Rybia múčka s nízkym obsahom tuku (CRM 118)	Vzorka 3 Sójová múčka (CRM 119)	Vzorka 4 Sušené odstredené mlieko (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Priemer [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [%]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [%]	1,48	4,69	4,11	4,22
L = počet laboratórií, ktoré poskytli výsledky, n = počet jednotlivých výsledkov, ktoré zostali po eliminácii odľahlých hodnôt (určené Cochranovým, Dixonovým testom na odľahlé hodnoty), sr = smerodajná odchýlka opakovateľnosti, SR = smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti, r = opakovateľnosť, R = reprodukovateľnosť, CVr = variačný koeficient opakovateľnosti, %, CVR = variačný koeficient reprodukovateľnosti, %.

9.   Poznámky

9.1.

Nasledovné špeciálne chromatografické podmienky môžu poskytnúť lepšiu separáciu tryptofánu a α-metyl-tryptofánu. Izokratická elúcia, po ktorej nasleduje gradientové čistenie kolóny: Kolóna na kvapalinovú chromatografiu (4.2): 125 mm × 4 mm, s náplňou C18, 5 μm alebo ekvivalentná Teplota kolóny: 32 °C Mobilná fáza: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95 + 5 (V + V). B: Metanol. Gradientový program: 0 min. 100 % A 0 % B 15 min. 100 % A 17 min. 60 % A 40 % B 19 min. 60 % A 40 % B 21 min. 100 % A 0 % B 33 min. 100 % A 0 % B Prietoková rýchlosť: 1,2 ml/min. Celkový čas analýzy: približne 33 min.

9.2.

Chromatografia sa mení v závislosti od typu HPLC a od použitej náplne kolóny. Zvolený systém musí umožňovať rozlíšenie na základnú čiaru medzi tryptofánom a vnútorným štandardom. Okrem toho je dôležité, aby sa produkty degradácie dobre oddelili od tryptofánu a vnútorného štandardu. Hydrolyzáty bez vnútorného štandardu sa musia analyzovať na kontrolu základnej čiary pod vnútorným štandardom na prítomnosť nečistôt. Je dôležité, aby bol čas analýzy dostatočne dlhý na elúciu všetkých produktov degradácie, inak môžu oneskorene eluujúce píky interferovať s nasledujúcou chromatografickou analýzou. V pracovnom rozsahu musí chromatografický systém dávať lineárnu odozvu. Lineárna odozva sa meria konštantnou (bežnou) koncentráciou vnútorného štandardu a meniacimi sa koncentráciami tryptofánu. Je dôležité, aby rozmery píkov tryptofánu aj vnútorného štandardu patrili do lineárneho rozsahu HPLC/fluorescenčného systému. Ak je jeden z píkov – tryptofánu a/alebo vnútorného štandardu – príliš malý alebo príliš veľký, analýzu treba zopakovať s inou veľkosťou vzorky a/alebo so zmeneným konečným objemom.

9.3.   Hydroxid bárnatý

Čím je hydroxid bárnatý starší, tým ťažšie sa rozpúšťa. Výsledkom je nečíry roztok na stanovenie pomocou HPLC, ktorý môže viesť k nízkym výsledným hodnotám tryptofánu.

G.   STANOVENIE SUROVÝCH OLEJOV A TUKOV

1.   Účel a oblasť

Táto metóda je určená na stanovenie surových olejov a tukov v krmivách.

Použitie týchto dvoch postupov uvedených ďalej závisí od charakteru a zloženia krmív a od dôvodu, prečo sa analýza vykonáva.

Na stanovenie obsahu surových olejov a tukov v olejnatých semenách a olejnatých plodoch, ako aj v krmive, ktorých obsah surových olejov/tukov je vyšší ako 15 %, by sa mala vykonať extrakcia podľa postupu A a reextrakcia podľa postupu B (bod 5.3).

1.1.   Postup A – priamo extrahovateľné surové oleje a tuky

Táto metóda sa uplatňuje na kŕmne suroviny rastlinného pôvodu okrem tých, na ktoré sa vzťahuje postup B.

1.2.   Postup B – celkové surové oleje a tuky

Táto metóda sa uplatňuje na kŕmne suroviny živočíšneho pôvodu a na všetky kŕmne zmesi. Používa sa aj pri všetkých materiáloch, z ktorých sa oleje a tuky nedajú úplne extrahovať bez predchádzajúcej hydrolýzy (napr. glutény, kvasnice, zemiakové bielkoviny a produkty, ktoré boli spracované postupom ako extrúzia, vločkovanie a zahrievanie).

1.3.   Interpretácia výsledkov

Vo všetkých prípadoch, keď sa postupom B dosiahne vyšší výsledok ako postupom A, sa za správnu hodnotu považuje výsledok získaný postupom B.

2.   Podstata metódy

2.1.   Postup A

Vzorka sa extrahuje petroléterom. Rozpúšťadlo sa oddestiluje a zvyšok sa vysuší a odváži.

2.2.   Postup B

Vzorka sa upravuje kyselinou chlorovodíkovou za varu. Zmes sa ochladí a prefiltruje. Zvyšok sa premýva a vysuší a postúpi na stanovenie podľa postupu A.

3.   Činidlá

3.1.

Petroléter, rozpätie bodu varu: 40 °C – 60 °C. Hodnota brómového čísla musí byť nižšia ako 1 a zvyšok po odparení menej ako 2 mg/100 ml.

3.2.

Síran sodný, bezvodý.

3.3.

Kyselina chlorovodíková, c = 3 mol/l.

3.4.

Filtračná pomôcka, napr. Kieselguhr, Hyflo-supercel.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.

Extrakčná aparatúra. Ak je vybavený sifónom (Soxhletov prístroj), prietoková rýchlosť musí byť taká, aby vykazovala 10 cyklov za hodinu; ak ide o zariadenie bez sifónu, prietoková rýchlosť musí byť 10 ml za minútu.

4.2.

Extrakčné patróny, ktoré neobsahujú látky rozpustné v petroléteri a ktoré majú priepustnosť v súlade s požiadavkami bodu 4.1.

4.3.

Sušiareň, buď vákuová nastavená na 75 ± 3 °C, alebo vzduchová nastavená na 100 ± 3 °C.

5.   Postup

5.1.   Postup A (pozri bod 8.1)

Navážte 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg, preneste ju do extrakčnej patróny (bod 4.2) a prikryte kúskom beztukovej vaty.

Vložte patrónu do extraktora (bod 4.1) a extrahujte šesť hodín petroléterom (bod 3.1). Zachyťte extrakt petroléteru v suchej odváženej banke s obsahom zrniečok pemzy (6).

Oddestilujte rozpúšťadlo. Sušte zvyšok, ktorý zostal v banke, jeden a pol hodiny v sušiarni (bod 4.3). Nechajte vychladnúť v exsikátore a odvážte. Opäť sušte 30 minút, aby ste zabezpečili konštantnú hmotnosť olejov a tukov (strata hmotnosti medzi dvomi po sebe nasledujúcimi váženiami nesmie prekročiť 1 mg).

5.2.   Postup B

Navážte 2,5 g vzorky s presnosťou na 1 mg (pozri bod 8.2), vložte do 400 ml kadičky alebo do 300 ml Erlenmeyerovej banky a pridajte 100 ml kyseliny chlorovodíkovej (bod 3.3) a zrniečka pemzy. Kadičku prikryte hodinovým sklíčkom alebo na Erlenmeyerovu banku nasaďte spätný chladič. Uveďte zmes do mierneho varu na slabom ohni alebo vyhrievacej platni a varte jednu hodinu. Zabráňte prilepeniu vzorky na steny nádobky.

Ochlaďte a pridajte také množstvo filtračnej pomôcky (bod 3.4), ktoré bude dostatočné na zabránenie akýmkoľvek stratám oleja a tuku počas filtrácie. Prefiltrujte cez navlhčený, beztukový, dvojitý filtračný papier. Zvyšok premývajte studenou vodou, kým nezískate neutrálny filtrát. Skontrolujte, či filtrát neobsahuje oleje alebo tuky. Ich prítomnosť znamená, že sa vzorka pred hydrolýzou musí extrahovať petroléterom podľa postupu A.

Položte dvojitý filtračný papier obsahujúci zvyšok na hodinové sklíčko a sušte jeden a pol hodiny vo vzduchovej sušiarni (bod 4.3) pri teplote 100 °C ± 3 °C.

Vložte dvojitý filtračný papier obsahujúci suché zvyšky do extrakčnej patróny (bod 4.2) a prikryte kúskom beztukovej vaty. Patrónu vložte do extraktora (bod 4.1) a postupujte tak, ako sa uvádza v druhom a treťom odseku bodu 5.1.

5.3.   Postup A a reextrakcia podľa postupu B

Na stanovenie obsahu surových olejov a tukov v olejnatých semenách a olejnatých plodoch, ako aj v krmive, ktorých obsah surových olejov/tukov je vyšší ako 15 %, by sa mala vykonať extrakcia podľa postupu A a reextrakcia podľa postupu B.

To znamená, že po extrakcii petroléterom (postup A) sa zvyšok alebo časť zvyšku reextrahuje kyselinou chlorovodíkovou (postup B). Obsah surových olejov a tukov je suma výsledkov postupov A a B.

6.   Vyjadrenie výsledkov

Vyjadrite hmotnosť zvyšku ako percento zo vzorky.

7.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke tým istým analytikom nesmie presiahnuť:

—	0,2 % v absolútnej hodnote v prípade obsahu surových olejov a tukov nižšieho ako 5 %,

—	4,0 % z najvyššieho výsledku pre obsahy 5 – 10 %,

—	0,4 % v absolútnej hodnote pre obsah vyšší ako 10 %.

8.   Poznámky

8.1.

Pri produktoch s vysokým obsahom olejov a tukov, ktoré sa ťažko drvia alebo sú nevhodné na získanie homogénnej redukovanej skúšobnej vzorky, postupujte podľa tohto postupu: Navážte 20 g vzorky s presnosťou na 1 mg a zmiešajte s 10 alebo viac gramami bezvodého síranu sodného (bod 3.2). Extrahujte petroléterom (bod 3.1) podľa bodu 5.1. Získaný extrakt doplňte na 500 ml petroléterom (bod 3.1) a premiešajte. Odoberte 50 ml roztoku a vložte do malej, suchej, odváženej banky obsahujúcej zrniečka pemzy. Rozpúšťadlo oddestilujte, vysušte a postupujte spôsobom uvedeným v poslednom odseku bodu 5.1. Odstráňte rozpúšťadlo z extrakčného zvyšku, ktorý zostal v patróne, zvyšok rozdrvte na jemnosť 1 mm, vráťte do extrakčnej patróny (nepridávajte síran sodný) a postupujte spôsobom uvedeným v druhom a treťom odseku bodu 5.1. Vypočítajte obsah olejov a tukov ako percento vzorky s pomocou tohto vzorca: kde: m1 = hmotnosť zvyšku v gramoch po prvej extrakcii (alikvotná časť extraktu), m2 = hmotnosť zvyšku v gramoch po druhej extrakcii.

8.2.

V prípade niektorých produktov (napr. s nízkym obsahom olejov a tukov) sa môže množstvo skúšobnej vzorky zvýšiť.

8.3.

V prípade krmív pre spoločenské zvieratá s vysokým obsahom vody sa môže stať, že ich bude treba zmiešať s bezvodým síranom sodným ešte pred hydrolýzou a extrakciou podľa postupu B.

8.4.

V bode 5.2 môže byť na premytie zvyšku po filtrácii efektívnejšie použiť horúcu vodu namiesto studenej.

8.5.

V prípade niektorých krmív môže byť potrebné 1,5-hodinovú dobu sušenia predĺžiť. Vyhnite sa nadmernému sušeniu, keďže to môže viesť k nízkym výsledným hodnotám. Je možné použiť aj mikrovlnnú rúru.

H.   STANOVENIE VLÁKNINY

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť beztukové organické látky v krmivách, ktoré sú nerozpustné v kyslom a zásaditom prostredí a bežne sa označujú ako vláknina.

Metóda sa neuplatňuje v prípade lignocelulózy a aktívneho uhlia (príliš jemné častice).

2.   Podstata metódy

Vzorka, v prípade potreby odtučnená, sa postupne rozkladá vriacimi roztokmi kyseliny sírovej a hydroxidu draselného v predpísaných koncentráciách. Zvyšok sa oddelí filtráciou na sklenenej filtračnej frite, premyje, vysuší, odváži a spopolní pri teplote 475 až 500 °C. Úbytok hmotnosti v dôsledku spopolnenia zodpovedá vláknine prítomnej v skúšobnej vzorke.

3.   Činidlá

3.1.

Kyselina sírová, c = 0,13 mol/l.

3.2.

Protipeniace činidlo (napr. n-oktanol).

3.3.

Filtračná pomôcka (Celit 545 alebo ekvivalentná) žíhaná štyri hodiny pri teplote 500 °C (bod 8.6).

3.4.

Acetón.

3.5.

Petroléter, rozpätie bodu varu 40 °C – 60 °C.

3.6.

Kyselina chlorovodíková, c = 0,5 mol/l.

3.7.

Roztok hydroxidu draselného, c = 0,23 mol/l.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.

Vyhrievacia jednotka určená na rozklad kyselinou sírovou a roztokom hydroxidu draselného vybavená držiakom na filtračný téglik (4.2) a výstupnou rúrkou s kohútom na vypustenie kvapaliny a vákua, podľa možnosti so stlačeným vzduchom. Pred použitím jednotku každý deň predhrievajte vriacou vodou počas piatich minút.

4.2.

Sklenený filtračný téglik so sklenenou filtračnou fritou s veľkosťou pórov 40 – 90 μm. Pred prvým použitím žíhajte niekoľko minút pri teplote 500 °C a nechajte vychladnúť (bod 8.6).

4.3.

Valec s objemom najmenej 270 ml so spätným chladičom, vhodný na varenie.

4.4.

Sušiareň s termostatom.

4.5.

Mufľová pec s termostatom.

4.6.

Extrakčná jednotka s podpornou platňou na filtračný téglik (bod 4.2) a vypúšťacím potrubím s kohútom na uvoľňovanie vákua a vypúšťanie kvapaliny.

4.7.

Spojovacie krúžky na spájanie vyhrievacej jednotky (bod 4.1), téglika (bod 4.2) a valca (bod 4.3) a na pripojenie jednotky na extrakciu za studena (bod 4.6) a téglika.

5.   Postup

Navážte 1 g pripravenej vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte do téglika (bod 4.2) (pozri poznámky body 9.1, 9.2 a 9.3) a pridajte 1 g filtračnej pomôcky (bod 3.3).

Spojte vyhrievaciu jednotku (bod 4.1) a filtračný téglik (bod 4.2), potom pripojte k tégliku valec (bod 4.3). Nalejte 150 ml vriacej kyseliny sírovej (bod 3.1) do valca spojeného s téglikom a v prípade potreby pridajte niekoľko kvapiek protipeniaceho činidla (bod 3.2).

Uveďte tekutinu do varu v priebehu 5 minút ± 2 minúty a prudko varte presne 30 minút.

Otvorte kohút na vypúšťacom potrubí (bod 4.1) a vo vákuu filtrujte kyselinu sírovú cez filtračný téglik a zvyšok premyte tromi po sebe nasledujúcimi 30 ml dávkami vriacej vody. Presvedčte sa, že zvyšok je prefiltrovaný po každom premytí dosucha.

Zatvorte výpustný kohút a nalejte 150 ml vriaceho roztoku hydroxidu draselného (bod 3.7) do valca spojeného s téglikom a pridajte niekoľko kvapiek protipeniaceho činidla (bod 3.2). Uveďte tekutinu do varu v priebehu 5 minút ± 2 minúty a prudko varte presne 30 minút. Prefiltrujte a zopakujte postup premývania použitý pri kroku s kyselinou sírovou.

Po poslednom premytí a vysušení odpojte téglik a jeho obsah a znovu pripojte k jednotke na extrakciu za studena (bod 4.6). Vytvorte vákuum a premyte zvyšok v tégliku tromi po sebe nasledujúcimi 25 ml dávkami acetónu (bod 3.4) a presvedčte sa, či bol zvyšok po každom premytí prefiltrovaný dosucha.

Vysušte téglik na konštantnú hmotnosť v sušiarni pri teplote 130 °C. Po každom vysušení nechajte vychladnúť v exsikátore a rýchlo odvážte. Umiestnite téglik do mufľovej pece a spopolňujte na konštantnú hmotnosť (strata hmotnosti medzi dvomi po sebe nasledujúcimi váženiami musí byť najviac 2 mg) pri teplote 475 °C až 500 °C po dobu najmenej 30 minút.

Po každom zahriatí najskôr nechajte vychladnúť v peci a potom v exsikátore pred vážením.

Vykonajte slepý pokus bez vzorky. Strata hmotnosti v dôsledku spopolňovania nesmie presiahnuť 4 mg.

6.   Výpočet výsledkov

Obsah vlákniny ako percento vzorky je daný touto rovnicou:

kde:

m	=	hmotnosť vzorky v g,
m0	=	strata hmotnosti po spopolnení počas stanovovania, v g,
m1	=	strata hmotnosti po spopolnení počas slepého pokusu, v g.

7.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi dvomi paralelnými stanoveniami vykonanými v tej istej vzorke nesmie presiahnuť:

—	0,6 % v absolútnej hodnote pre obsah vlákniny nižší ako 10 %,

—	6 % z vyššieho výsledku pre obsah vlákniny najmenej 10 %.

8.   Reprodukovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch stanovení vykonaných v tej istej vzorke v rôznych laboratóriách nesmie presiahnuť:

—	1,0 % v absolútnej hodnote pre obsah vlákniny nižší ako 10 %,

—	10 % z vyššieho výsledku pre obsah vlákniny najmenej 10 %.

9.   Poznámky

9.1.

Krmivá obsahujúce viac ako 10 % surového tuku sa musia pred analýzou odtučniť petroléterom (bod 3.5). Pripojte filtračný téglik (bod 4.2) s obsahom k jednotke na extrakciu za studena (bod 4.6) a vytvorte vákuum, premyte zvyšok tromi po sebe nasledujúcimi 30 ml dávkami petroléteru, pričom sa presvedčte, či je zvyšok suchý. Pripojte téglik s obsahom k vyhrievacej jednotke (bod 4.1) a postupujte ďalej podľa bodu 5.

9.2.

Krmivá obsahujúce tuky, ktoré sa nedajú priamo extrahovať petroléterom (bod 3.5), sa musia odtučniť postupom uvedeným v bode 8.1 a opätovne odtučniť po varení s kyselinou. Po varení s kyselinou a následnom premytí pripojte téglik s obsahom k jednotke na extrakciu za studena (bod 4.6) a premyte tri razy 30 ml dávkami acetónu a následne tri razy 30 ml dávkami petroléteru. Filtrujte vo vákuu do sucha a pokračujte v analýze postupom opísaným v bode 5, počnúc varom s hydroxidom draselným.

9.3.

Ak krmivá obsahujú viac ako 5 % uhličitanov, vyjadrených ako uhličitan vápenatý, tak pripojte téglik (bod 4.2) s naváženou vzorkou k vyhrievacej jednotke (bod 4.1). Premyte vzorku tri razy 30 ml kyseliny chlorovodíkovej (bod 3.6). Po každom prídavku nechajte vzorku asi jednu minútu stáť, než ju prefiltrujete. Premyte jedenkrát 30 ml vody a ďalej postupujte podľa bodu 5.

9.4.

Ak sa použije prístroj vo forme stojana (niekoľko téglikov pripojených k tej istej vyhrievacej jednotke) v rámci tej istej súpravy sa nesmú vykonať dve samostatné stanovenia s použitím tej istej analyzovanej vzorky.

9.5.

Ak je po prevarení ťažké prefiltrovať kyslé a zásadité roztoky, použite stlačený vzduch cez vypúšťacie potrubie vyhrievacej jednotky a potom pokračujte vo filtrovaní.

9.6.

Teplota pri spopolňovaní nesmie byť vyššia ako 500 °C, aby sa predĺžila životnosť sklenených filtračných téglikov. Je potrebné vyhnúť sa nadmernému tepelnému šoku počas cyklov zahrievania a chladenia.

I.   STANOVENIE CUKROV

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanovenie množstva redukujúcich cukrov a celkových cukrov po inverzii, vyjadrených ako glukóza, alebo v prípade, že je to vhodné, ako sacharóza, po vynásobení koeficientom 0,95. Uplatňuje sa v prípade kŕmnych zmesí. Pre iné krmivá platia osobitné metódy. V prípade potreby sa laktóza stanoví oddelene a zohľadní sa pri výpočte výsledkov.

Táto metóda sa použije na stanovenie obsahu cukru na účely výpočtu energetickej hodnoty krmiva.

V prípade stanovovania obsahu cukru na iné účely sa môžu použiť iné analytické metódy.

2.   Podstata metódy

Cukry sa extrahujú v rozriedenom etanole; roztok sa vyčíri Carrezovými činidlami I a II. Po eliminácii etanolu sa množstvá stanovujú pred inverziou a po nej Luff-Schoorlovou metódou.

3.   Činidlá

3.1.

Roztok etanolu, 40 % (v/v), s hustotou: 0,948 g/ml pri 20 °C, neutralizovaný na indikátor fenolftaleín.

3.2.

Carrezovo činidlo I: rozpustite vo vode 21,9 g dihydrátu octanu zinočnatého Zn(CH3COO)2.2H2O a 3 g ľadovej kyseliny octovej. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.3.

Carrezovo činidlo II: rozpustite vo vode 10,6 g trihydrátu ferokyanidu draselného, K4Fe(KN)6.3H2O. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.4.

Metyloranž, roztok 0,1 % (w/v).

3.5.

Kyselina chlorovodíková, 4 mol/liter.

3.6.

Kyselina chlorovodíková, 0,1 mol/liter.

3.7.

Roztok hydroxidu sodného, 0,1 mol/liter.

3.8.

Luff-Schoorlovo činidlo: za opatrného miešania nalejte roztok kyseliny citrónovej (bod 3.8.2) do roztoku uhličitanu sodného (bod 3.8.3). Pridajte roztok síranu meďnatého (bod 3.8.1) a objem doplňte vodou na 1 liter. Nechajte cez noc odstáť a prefiltrujte. Skontrolujte koncentráciu takto získaného činidla (Cu 0,05 mol/liter; Na2 CO3 1 mol/liter), pozri bod 5.4 posledný odsek. Hodnota pH roztoku má byť približne 9,4.

3.8.1.

Roztok síranu meďnatého: rozpustite 25 g pentahydrátu síranu meďnatého, CuSO4.5H2O, bez obsahu železa v 100 ml vody.

3.8.2.

Roztok kyseliny citrónovej: rozpustite 50 g monohydrátu kyseliny citrónovej, C6H8O7.H2O v 50 ml vody.

3.8.3.

Roztok uhličitanu sodného: rozpustite 143,8 g bezvodého uhličitanu sodného približne v 300 ml teplej vody. Nechajte vychladnúť.

3.9.

Roztok tiosíranu sodného 0,1 mol/liter.

3.10.

Roztok škrobu: pridajte zmes 5 g škrobu rozpusteného v 30 ml vody do 1 litra vriacej vody. Varte tri minúty, nechajte vychladnúť a v prípade potreby pridajte 10 mg jodidu ortutnatého na konzervovanie.

3.11.

Kyselina sírová, 3 mol/liter.

3.12.

Jodid draselný, roztok 30 % (w/v).

3.13.

Granulovaná pemza vyvarená v kyseline chlorovodíkovej, premytá vodou a vysušená.

3.14.

3-metylbutan-1-ol

4.   Prístrojové vybavenie

Mixér (trepačka): približne 35 až 40 ot/min.

5.   Postup

5.1.   Extrakcia vzorky

Navážte 2,5 g vzorky s presnosťou na 1 mg do 250 ml kalibrovanej odmernej banky. Pridajte 200 ml etanolu (bod 3.1) a hodinu miešajte v trepačke. Pridajte 5 ml Carrezovho činidla I (bod 3.2) a miešajte približne 30 sekúnd. Pridajte 5 ml Carrezovho činidla II (bod 3.3) a miešajte približne jednu minútu. Doplňte etanolom po značku (bod 3.1), homogenizujte a prefiltrujte. Pipetou naberte 200 ml filtrátu a odparte na približne polovičný objem, aby sa odstránilo čo najväčšie množstvo etanolu. Zvyšok po odparení kvantitatívne preneste do 200 ml kalibrovanej odmernej banky pomocou horúcej vody, nechajte vychladnúť, doplňte po značku vodou, homogenizujte a v prípade potreby prefiltrujte. Roztok sa použije na stanovenie množstva redukujúcich cukrov a po inverzii na stanovenie celkového obsahu cukrov.

5.2.   Stanovenie redukujúcich cukrov

Pomocou pipety odoberte najviac 25 ml roztoku obsahujúceho menej ako 60 mg redukujúcich cukrov vyjadrených ako glukóza. V prípade potreby objem doplňte destilovanou vodou na 25 ml a stanovte obsah redukujúcich cukrov Luff-Schoorlovou metódou. Výsledok sa vyjadrí ako percentuálny obsah glukózy vo vzorke.

5.3.   Stanovenie celkového obsahu cukrov po inverzii

Do 100 ml kalibrovanej odmernej banky pipetou preneste 50 ml roztoku. Pridajte niekoľko kvapiek roztoku metyloranže (bod 3.4), potom za stáleho miešania opatrne pridávajte kyselinu chlorovodíkovú (bod 3.5) až do vzniku červeného zafarbenia. Pridajte 15 ml kyseliny chlorovodíkovej (bod 3.6), banku ponorte do kúpeľa s vriacou vodou a nechajte v ňom tridsať minút. Rýchlo ochlaďte približne na 20 °C a pridajte 15 ml roztoku hydroxidu sodného (bod 3.7). Doplňte objem vodou na 100 ml a homogenizujte. Odoberte najviac 25 ml s obsahom menej ako 60 mg redukujúcich cukrov vyjadrených ako glukóza. V prípade potreby objem doplňte destilovanou vodou na 25 ml a stanovte obsah redukujúcich cukrov Luff-Schoorlovou metódou. Výsledok sa vyjadrí ako percento glukózy alebo, v prípade potreby, sacharózy vynásobením koeficientom 0,95.

5.4.   Titrácia Luff-Schoorlovou metódou

Do 300 ml Erlenmeyerovej banky pipetou preneste 25 ml Luff-Schoorlovho činidla (bod 3.8); pridajte presne 25 ml vyčíreného roztoku cukru. Pridajte 2 granule pemzy (bod 3.13) a zahrievajte za ručného miešania nad stredne vysokým voľným plameňom tak, aby ste kvapalinu priviedli do varu približne za dve minúty. Erlenmeyerovu banku položte okamžite na azbestom potiahnutú drôtenú sieťku s otvorom s priemerom približne 6 cm, pod ktorou je zapálený plameň. Plameň sa musí regulovať tak, aby zohrieval len dno Erlenmeyerovej banky. Na Erlenmeyerovu banku nasaďte spätný chladič. Nechajte variť presne desať minút. Okamžite ochlaďte v studenej vode a približne po piatich minútach titrujte takto:

Pridajte 10 ml roztoku jodidu draselného (bod 3.12) a hneď pridajte 25 ml kyseliny sírovej (bod 3.11) (opatrne z dôvodu rizika silného penenia). Titrujte roztokom tiosíranu sodného (bod 3.9) až do vzniku matnej žltej farby, pridajte škrobový indikátor (bod 3.10) a dokončite titráciu.

Rovnakú titráciu vykonajte v presne odmeranej zmesi 25 ml Luff-Schoorlovho činidla (bod 3.8) a 25 ml vody po pridaní 10 ml roztoku jodidu draselného (bod 3.12) a 25 ml kyseliny sírovej (bod 3.11) bez varu.

6.   Výpočet výsledkov

Pomocou priloženej tabuľky stanovte množstvo laktózy v mg, ktoré zodpovedá rozdielu medzi výsledkami dvoch titrácií, vyjadrené v ml tiosíranu sodného 0,1 mol/liter. Výsledok sa vyjadrí ako percento zo vzorky.

7.   Špeciálne postupy

7.1.

Ak ide o krmivá bohaté na melasu a krmivá, ktoré nie sú celkom homogénne, do 1 l kalibrovanej odmernej banky navážte 20 g vzorky a pridajte 500 ml vody. Miešajte jednu hodinu na trepačke. Vyčírte pomocou Carrezových činidiel I (bod 3.2) a II (bod 3.3) podľa bodu 5.1, tento raz však použite štvornásobné množstvá z každého činidla. Doplňte po značku 80 % etanolom (v/v). Homogenizujte a prefiltrujte. Odstráňte etanol podľa bodu 5.1. Ak nie je prítomný žiadny dextrínovaný škrob, doplňte objem destilovanou vodou.

7.2.

Ak ide o melasu a kŕmne suroviny bohaté na cukry a neobsahujúce takmer žiadny škrob (svätojánsky chlieb, sušené repné rezky atď.), navážte 5 g vzorky, vložte do 250 ml kalibrovanej odmernej banky, pridajte 200 ml destilovanej vody a pretrepávajte na trepačke jednu hodinu alebo v prípade potreby dlhšie. Vyčírte pomocou Carrezových činidiel I (bod 3.2) a II (bod 3.3) podľa bodu 5.1. Doplňte objem studenou vodou, homogenizujte a prefiltrujte. Na stanovenie množstva celkového obsahu cukrov pokračujte podľa postupu v bode 5.3.

8.   Poznámky

8.1.

Aby sa zabránilo peneniu, odporúča sa pred varením s Luff-Schoorlovým činidlom pridať (bez ohľadu na objem) približne 1 ml 3-metylbutan-1-olu (bod 3.14).

8.2.

Výsledkom vynásobenia rozdielu medzi obsahom celkových cukrov po inverzii, vyjadrených ako glukóza, a obsahom redukujúcich cukrov, vyjadrených ako glukóza, koeficientom 0,95 je percentuálny obsah sacharózy.

8.3.

Na stanovenie obsahu redukujúcich cukrov okrem laktózy sa môžu použiť dve metódy:

8.3.1.

Na približný výpočet vynásobte obsah laktózy stanovený inou analytickou metódou číslom 0,675 a odpočítajte získaný výsledok z obsahu redukujúcich cukrov.

8.3.2.

Na presný výpočet redukujúcich cukrov okrem laktózy sa pre dve konečné stanovenia použije tá istá vzorka. Jedna analýza sa vykonáva na časti roztoku získaného podľa bodu 5.1, druhá na časti roztoku získaného počas procesu stanovenia laktózy metódou stanovenou na tento účel (po fermentácii ostatných typov cukru a vyčírení). V oboch prípadoch sa množstvo prítomného cukru stanovuje Luff-Schoorlovou metódou a vypočítava sa v mg glukózy. Jedna hodnota sa odráta od druhej a rozdiel sa vyjadrí ako percento vzorky. Príklad Obidva odobraté objemy zodpovedajú, pre každé stanovenie, vzorke s hmotnosťou 250 mg. V prvom prípade spotreba 17 ml roztoku tiosíranu sodného 0,1 mol/liter zodpovedá 44,2 mg glukózy; v druhom prípade spotreba 11 ml zodpovedá 27,6 mg glukózy. Rozdiel je 16,6 mg glukózy. Obsah redukujúcich cukrov (okrem laktózy) vypočítaných ako glukóza, je preto: Tabuľka hodnôt pre 25 ml Luff-Schoorlovho činidla ml Na2S2O3 0,1 mol/liter, pri dvojminútovom zahrievaní a 10 min. varu Na2 S2 O3 0,1 mol/liter Glukóza, fruktóza, invertné cukry C6 H12 O6 Laktóza C12 H22 O11 Na2 S2 O3 0,1 mol/liter ml mg rozdiel mg rozdiel ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

J.   STANOVENIE LAKTÓZY

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah laktózy v krmivách obsahujúcich viac ako 0,5 % laktózy.

2.   Podstata metódy

Cukry sa rozpustia vo vode. Roztok sa podrobí fermentácii kvasinkami Saccharomyces cerevisiae, ktoré ponechávajú laktózu nedotknutú. Po vyčírení a prefiltrovaní sa obsah laktózy vo filtráte stanoví Luff-Schoorlovou metódou.

3.   Činidlá

3.1.

Suspenzia kvasiniek Saccharomyces cerevisiae: rozmiešajte 25 g čerstvých kvasníc v 100 ml vody. Táto suspenzia vydrží v chladničke najviac jeden týždeň.

3.2.

Carrezovo činidlo I: rozpustite vo vode 21,9 g dihydrátu octanu zinočnatého Zn(CH3COO)2.2H2O a 3 g ľadovej kyseliny octovej. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.3.

Carrezovo činidlo II: rozpustite vo vode 10,6 g trihydrátu ferokyanidu draselného, K4Fe(KN)6.3H2O. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.4.

Luff-Schoorlovo činidlo: za opatrného miešania nalejte roztok kyseliny citrónovej (bod 3.4.2) do roztoku uhličitanu sodného (bod 3.4.3). Pridajte roztok síranu meďnatého (bod 3.4.1) a doplňte vodou na objem 1 liter. Nechajte cez noc odstáť a prefiltrujte. Skontrolujte koncentráciu takto získaného činidla (Cu 0,05 mol/liter; Na2CO3 1 mol/liter). Hodnota pH roztoku má byť približne 9,4.

3.4.1.

Roztok síranu meďnatého: rozpustite 25 g pentahydrátu síranu meďnatého, CuSO4.5H2O, bez obsahu železa v 100 ml vody.

3.4.2.

Roztok kyseliny citrónovej: rozpustite 50 g monohydrátu kyseliny citrónovej, C6H8O7.H2O v 50 ml vody.

3.4.3.

Roztok uhličitanu sodného: rozpustite 143,8 g bezvodého uhličitanu sodného približne v 300 ml teplej vody. Nechajte vychladnúť.

3.5.

Granulovaná pemza vyvarená v kyseline chlorovodíkovej, premytá vodou a vysušená.

3.6.

Jodid draselný, roztok 30 % (w/v).

3.7.

Kyselina sírová, 3 mol/liter.

3.8.

Roztok tiosíranu sodného, 0,1 mol/liter.

3.9.

Roztok škrobu: pridajte zmes 5 g škrobu rozpusteného v 30 ml vody do 1 litra vriacej vody. Varte tri minúty, nechajte vychladnúť a v prípade potreby pridajte 10 mg jodidu ortuťnatého na konzervovanie.

4.   Prístrojové vybavenie

Vodný kúpeľ s termostatom nastaveným na 38 – 40 °C.

5.   Postup

Do 100 ml kalibrovanej odmernej banky navážte 1 g vzorky s presnosťou na 1 mg. Pridajte 25 až 30 ml vody. Vložte banku do vriaceho vodného kúpeľa na tridsať minút a potom ochlaďte na teplotu približne 35 °C. Pridajte 5 ml suspenzie kvasiniek (bod 3.1) a homogenizujte. Nechajte banku dve hodiny odstáť vo vodnom kúpeli pri teplote 38 – 40 °C. Ochlaďte na teplotu približne 20 °C.

Pridajte 2,5 ml Carrezovho činidla I (bod 3.2) a miešajte tridsať sekúnd, potom pridajte 2,5 ml Carrezovho činidla II (bod 3.3) a opäť miešajte tridsať sekúnd. Doplňte objem vodou na 100 ml, potrepte a prefiltrujte. Pomocou pipety odoberte množstvo filtrátu nie väčšie ako 25 ml, ktoré obsahuje 40 až 80 mg laktózy, a preneste ho do 300 ml Erlenmeyerovej banky. V prípade potreby doplňte na objem 25 ml vodou.

Rovnakým postupom vykonajte slepý pokus s 5 ml suspenzie kvasiniek (bod 3.1). Stanovte obsah laktózy podľa Luff-Schoorla takto: pridajte presne 25 ml Luff-Schoorlovho činidla (bod 3.4) a dve granule pemzy (bod 3.5). Miešajte ručne počas zahrievania nad stredne vysokým voľným plameňom a kvapalinu priveďte do varu približne za dve minúty. Erlenmeyerovu banku položte okamžite na azbestom potiahnutú drôtenú sieťku s otvorom s priemerom približne 6 cm, pod ktorou je zapálený plameň. Plameň sa musí regulovať tak, aby zohrieval len dno Erlenmeyerovej banky. Na Erlenmeyerovu banku nasaďte spätný chladič. Nechajte variť presne desať minút. Okamžite ochlaďte v studenej vode a približne po piatich minútach titrujte takto:

Pridajte 10 ml roztoku jodidu draselného (bod 3.6) a ihneď potom pridajte 25 ml kyseliny sírovej (bod 3.7) (opatrne z dôvodu rizika silného penenia). Titrujte roztokom tiosíranu sodného (bod 3.8) až do vzniku matnej žltej farby, pridajte škrobový indikátor (bod 3.9) a dokončite titráciu.

Rovnakú titráciu vykonajte v presne odmeranej zmesi 25 ml Luff-Schoorlovho činidla (bod 3.4) a 25 ml vody po pridaní 10 ml roztoku jodidu draselného (bod 3.6) a 25 ml kyseliny sírovej (bod 3.7) bez varu.

6.   Výpočet výsledkov

Pomocou priloženej tabuľky stanovte množstvo laktózy v mg, ktoré zodpovedá rozdielu medzi výsledkami dvoch titrácií, vyjadrené v ml tiosíranu sodného 0,1 mol/liter.

Vyjadrite výsledok ako podiel bezvodej laktózy v percentách vzorky.

7.   Poznámka

1.

Pre produkty s obsahom viac ako 40 % fermentovateľného cukru použite viac ako 5 ml suspenzie kvasiniek (bod 3.1).

2.

V krmive so „zníženým obsahom laktózy“ (napr. v mlieku pre mačky) sa laktóza premenila na fruktózu, ktorá za dve hodiny nestihla úplne sfermentovať, čo má za následok vyššie alebo falošne pozitívne výsledky (pretože v extrakte zostávajú zvyšky fruktózy). Tabuľka hodnôt pre 25 ml Luff-Schoorlovho činidla ml Na2S2O3 0,1 mol/liter, pri dvojminútovom zahrievaní a 10 min. varu Na2 S2 O3 0,1 mol/liter Glukóza, fruktóza, invertné cukry C6 H12 O6 Laktóza C12 H22 O11 Na2 S2 O3 0,1 mol/liter ml mg rozdiel mg rozdiel ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   STANOVENIE ŠKROBU

POLARIMETRICKÁ METÓDA

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanovenie obsahu škrobu a produktov degradácie škrobu s vysokou molekulovou hmotnosťou v krmivách na účely kontroly súladu s deklarovanou energetickou hodnotou (v ustanoveniach prílohy VII) a s nariadením (ES) č. 767/2009.

Táto metóda sa použije na stanovenie obsahu škrobu na účely výpočtu energetickej hodnoty krmiva.

V prípade stanovovania obsahu škrobu na iné účely sa môžu použiť iné analytické metódy.

2.   Podstata metódy

Táto metóda pozostáva z dvoch stanovení. Pri prvom stanovení sa vzorka upraví zriedenou kyselinou chlorovodíkovou. Po vyčírení a filtrácii sa polarimetrickým meraním stanoví optická otáčavosť roztoku.

Pri druhom stanovení sa vzorka extrahuje 40 % etanolom. Po okyslení filtrátu kyselinou chlorovodíkovou, vyčírení a prefiltrovaní sa zmeria optická otáčavosť rovnakým spôsobom ako pri prvom stanovení.

Rozdiel medzi týmito dvomi meraniami, vynásobený známym koeficientom udáva obsah škrobu vo vzorke.

3.   Činidlá

3.1.

Kyselina chlorovodíková, roztok 25 % (w/w) s hustotou: 1,126 g/ml.

3.2.

Kyselina chlorovodíková, roztok 1,13 % (w/v). Koncentrácia sa musí skontrolovať titráciou s použitím roztoku hydroxidu sodného 0,1 mol/liter v prítomnosti 0,1 % (w/v) metylčervene v 94 % (v/v) etanole. Na neutralizáciu 10 ml je potrebných 30,94 ml NaOH 0,1 mol/liter.

3.3.

Carrezovo činidlo I: rozpustite vo vode 21,9 g dihydrátu octanu zinočnatého Zn(CH3COO)2.2H2O a 3 g ľadovej kyseliny octovej. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.4.

Carrezovo činidlo II: rozpustite vo vode 10,6 g trihydrátu ferokyanidu draselného, K4Fe(KN)6.3H2O. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.5.

Roztok etanolu, 40 % (v/v), s hustotou: 0,948 g/ml pri 20 °C.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.

250 ml Erlenmeyerova banka so štandardným zábrusovým skleneným spojom a so spätným chladičom.

4.2.

Polarimeter alebo sacharimeter.

5.   Postup

5.1.   Príprava vzorky

Vzorku meľte dovtedy, kým nebude dostatočne jemná, aby celá prešla cez sito s okrúhlymi okami s veľkosťou 0,5 mm.

5.2.   Stanovenie celkovej optickej otáčavosti (P alebo S) (pozri poznámku 7.1)

Navážte 2,5 g pomletej vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte do 100 ml odmernej banky. Pridajte 25 ml kyseliny chlorovodíkovej (bod 3.2), premiešajte tak, aby ste docielili rovnomerné rozptýlenie skúšobnej vzorky, a pridajte ďalších 25 ml kyseliny chlorovodíkovej (bod 3.2). Banku ponorte do vriaceho vodného kúpeľa, pričom ňou prvé tri minúty intenzívne a sústavne pretrepávajte, aby sa zabránilo tvorbe hrudiek. Množstvo vody vo vodnom kúpeli musí byť dostatočné na to, aby kúpeľ zostal na bode varu aj po ponorení banky do kúpeľa. Banka sa počas pretrepávania nesmie vybrať z kúpeľa. Presne po 15 minútach ju vyberte z kúpeľa, pridajte 30 ml studenej vody a ihneď ochlaďte na teplotu 20 °C.

Pridajte 5 ml Carrezovho činidla I (bod 3.3) a pretrepávajte približne 30 sekúnd. Potom pridajte 5 ml Carrezovho činidla II (bod 3.4) a znovu pretrepávajte približne 30 sekúnd. Doplňte na požadovaný objem vodou, premiešajte a prefiltrujte. Ak filtrát nebude dokonale číry, (čo je zriedkavé), stanovenie zopakujte s použitím väčšieho množstva Carrezových činidiel I a II, napr. 10 ml.

Zmerajte optickú otáčavosť roztoku v 200 mm trubici pomocou polarimetra alebo sacharimetra.

5.3.   Stanovenie optickej otáčavosti (P’ alebo S’) látok rozpustných v 40 % etanole

Navážte 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg, vložte do 100 ml odmernej banky a pridajte približne 80 ml etanolu (bod 3.5) (pozri poznámku bod 7.2). Nechajte banku 1 hodinu odstáť pri laboratórnej teplote; počas tejto doby ju šesťkrát intenzívne pretrepte tak, aby sa skúšobná vzorka dôkladne premiešala s etanolom. Doplňte na požadovaný objem etanolom (bod 3.5), premiešajte a prefiltrujte.

Do 250 ml Erlenmeyerovej banky pipetou preneste 50 ml filtrátu (čo zodpovedá 2,5 g vzorky), pridajte 2,1 ml kyseliny chlorovodíkovej (bod 3.1) a intenzívne pretrepte. Na Erlenmeyerovu banku nasaďte spätný chladič a banku ponorte do vriaceho vodného kúpeľa. Presne po 15 minútach Erlenmeyerovu banku z kúpeľa vyberte, obsah preneste do 100 ml odmernej banky, prepláchnite malým množstvom studenej vody a ochlaďte na teplotu 20 °C.

Vyčírte použitím Carrezových činidiel I (bod 3.3) a II (bod 3.4), doplňte na požadovaný objem vodou, premiešajte, prefiltrujte a zmerajte optickú otáčavosť spôsobom uvedeným v druhom a treťom odseku bodu 5.2.

6.   Výpočet výsledkov

Obsah škrobu (%) sa vypočíta takto:

6.1.   Meranie polarimetrom

P	=	celková optická otáčavosť v uhlových stupňoch,
P’	=	optická otáčavosť v uhlových stupňoch látok rozpustných v 40 % (V/V) etanole,
	=	špecifická optická otáčavosť čistého škrobu. Číselné hodnoty bežne akceptované pre tento koeficient sú:

+ 185,9°	:	ryžový škrob,
+ 185,7°	:	zemiakový škrob,
+ 184,6°	:	kukuričný škrob,
+ 182,7°	:	pšeničný škrob,
+ 181,5°	:	jačmenný škrob,
+ 181,3°	:	ovsený škrob,
+ 184,0°	:	ostatné druhy škrobov a zmesi škrobov v kŕmnych zmesiach.

6.2.   Meranie sacharimetrom

S	=	celková optická otáčavosť v sacharimetrických stupňoch,
S’	=	optická otáčavosť v sacharimetrických stupňoch látok rozpustných v 40 % (v/v) etanole,
N	=	hmotnosť g) sacharózy v 100 ml vody poskytujúca optickú otáčavosť 100 sacharimetrických stupňov pri meraní pomocou 200 mm trubice, 16,29 g pre francúzske sacharimetre, 26,00 g pre nemecké sacharimetre, 20,00 g pre zmiešané sacharimetre,
	=	špecifická optická otáčavosť čistého škrobu (pozri bod 6.1).

6.3.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v rovnakej vzorke nesmie presiahnuť 0,4 v absolútnej hodnote pre obsah škrobu nižší ako 40 % a 1 % relatívnych pre obsah škrobu najmenej 40 %.

7.   Poznámky

7.1.

Ak vzorka obsahuje viac ako 6 % uhličitanov, vypočítaných ako uhličitan vápenatý, tieto uhličitany sa musia rozložiť pred stanovením celkovej optickej otáčavosti presne známym množstvom zriedenej kyseliny sírovej.

7.2.

Ak ide o produkty s vysokým obsahom laktózy, ako je sušené mliečne sérum alebo sušené odstredené mlieko, postupujte po pridaní 80 ml etanolu (bod 3.5) takto: na banku nasaďte spätný chladič a ponorte ju na 30 minút do vodného kúpeľa s teplotou 50 °C. Nechajte vychladnúť a pokračujte v analýze podľa bodu 5.3.

7.3.

Ak sú tieto kŕmne suroviny prítomné vo významnom množstve v krmivách, je známe, že spôsobujú interferencie pri stanovovaní obsahu škrobu polarimetrickou metódou, čo môže viesť k nesprávnym výsledkom: — produkty z (cukrovej) repy, ako dužina z (cukrovej) repy, melasa z (cukrovej) repy, dužina z (cukrovej) repy – melasová, vinas z (cukrovej) repy, (repný) cukor, — citrusová dužina, — ľanové semeno, ľanové výlisky, ľanové semeno extrahované, — repkové semeno, repkové výlisky, repkové semeno extrahované, repkové šupky, — slnečnicové semeno, slnečnicový extrahovaný šrot, slnečnicový extrahovaný šrot z čiastočne lúpaných semien, — kokosové výlisky, kokosový extrahovaný šrot, — zemiaková dužina, — sušené kvasnice, — produkty bohaté na inulín (napríklad rezky a múčka z topinamburu), — oškvarky, — produkty zo sóje. V týchto prípadoch sa môže použiť analytická metóda stanovená v nariadení Komisie (ES) č. 121/2008 (7). Táto metóda sa môže použiť aj v prípade krmiva, ktoré obsahuje menej ako 1 % škrobu.

L.   STANOVENIE POPOLA

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah popola v krmivách.

2.   Podstata metódy

Vzorka sa spopolní pri teplote 550 °C, zvyšok sa odváži.

3.   Činidlá

Dusičnan amónny, roztok 20 % (w/v).

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.

Vyhrievacia platňa.

4.2.

Elektrická mufľová pec s termostatom.

4.3.

Spaľovacie tégliky vyrobené z kremeňa, porcelánu alebo platiny buď obdĺžnikové (približne 60 × 40 × 25 mm), alebo valcovité (s priemerom: 60 až 75 mm, s výškou: 20 až 40 mm).

5.   Postup

Navážte s presnosťou na 1 mg približne 5 g vzorky (2,5 g v prípade, že ide o produkty, ktoré majú tendenciu napučiavať) a vložte do spaľovacieho téglika, ktorý ste vopred vyžíhali na 550 °C, nechali ochladiť a odvážili. Položte téglik na vyhrievaciu platňu a postupne zohrievajte až do zuhoľnatenia látky. Spopolňujte podľa bodu 5.1 alebo 5.2.

5.1.

Téglik vložte do kalibrovanej mufľovej pece nastavenej na teplotu 550 °C. Túto teplotu udržiavajte až do získania bieleho, bledosivého alebo červenkastého popola, bez obsahu zuhoľnatených častíc. Vložte téglik do exsikátora, nechajte vychladnúť a okamžite odvážte.

5.2.

Téglik vložte do kalibrovanej mufľovej pece vyhriatej na 550 °C. Spopolňujte tri hodiny. Vložte téglik do exsikátora, nechajte vychladnúť a okamžite odvážte. Opäť spopolňujte 30 minút, čím sa zabezpečí, že hmotnosť popola zostane konštantná (strata hmotnosti medzi dvomi po sebe nasledujúcimi váženiami musí byť najviac 1 mg).

6.   Výpočet výsledkov

Hmotnosť zvyšku vypočítajte odpočítaním hmotnosti téglika.

Výsledok sa vyjadrí ako percento zo vzorky.

7.   Poznámky

7.1.

Látky, ktoré sa ťažko spopolňujú, sa najskôr musia spopolňovať najmenej tri hodiny, ochladiť a potom sa k popolu pridá niekoľko kvapiek 20 % roztoku dusičnanu amónneho alebo vody (opatrne, aby sa zabránilo rozptýleniu popola alebo tvorbe hrudiek). Po vysušení v sušiarni pokračujte v žíhaní. Postup podľa potreby opakujte dovtedy, kým nebude spopolnenie ukončené.

7.2.

Ak ide o látky odolné voči úprave opísanej v bode 7.1, postupujte takto: po trojhodinovom spopolňovaní vložte popol do teplej vody a prefiltrujte cez malý bezpopolový filter. Filter a jeho obsah spopolnite v pôvodnom tégliku. Filtrát vložte do vychladnutého téglika, odparte do sucha, spopolnite a odvážte.

7.3.

V prípade olejov a tukov presne navážte 25 g vzorky do téglika vhodnej veľkosti. Zuhoľňujte pod lampou nastavenou na látku a pomocou pásika bezpopolového filtračného papiera. Po spálení zvlhčite čo možno najmenším množstvom vody. Vysušte a spopolnite postupom uvedeným v bode 5.

M.   STANOVENIE OBSAHU POPOLA, KTORÝ JE NEROZPUSTNÝ V KYSELINE CHLOROVODÍKOVEJ

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť v krmivách obsah minerálnych látok, ktoré sú nerozpustné v kyseline chlorovodíkovej. V závislosti od druhu vzorky sa môžu použiť dve metódy.

1.1.

Metóda A: uplatniteľná na kŕmne suroviny organického pôvodu a na väčšinu kŕmnych zmesí.

1.2.

Metóda B: uplatniteľná na minerálne zlúčeniny a zmesi a na kŕmne zmesi, v ktorých je obsah látok nerozpustných v kyseline chlorovodíkovej, stanovený metódou A, väčší ako 1 %.

2.   Podstata metódy

2.1.

Metóda A: vzorka sa spopolní, popol sa uvarí v kyseline chlorovodíkovej a nerozpustný zvyšok sa prefiltruje a odváži.

2.2.

Metóda B: na vzorku sa pôsobí kyselinou chlorovodíkovou. Roztok sa prefiltruje, zvyšok sa spopolní a takto získaný popol sa spracuje podľa metódy A.

3.   Činidlá

3.1.

Kyselina chlorovodíková, 3 mol/liter.

3.2.

Kyselina trichlóroctová, 20 % roztok (w/v).

3.3.

Kyselina trichlóroctová, 1 % roztok (w/v).

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.

Vyhrievacia platňa.

4.2.

Elektrická mufľová pec s termostatom.

4.3.

Spaľovacie tégliky vyrobené z kremeňa, porcelánu alebo platiny buď obdĺžnikové (približne 60 × 40 × 25 mm), alebo valcovité (s priemerom: 60 až 75 mm, s výškou: 20 až 40 mm).

4.4.

Bezpopolové filtre.

5.   Postup

5.1.   Metóda A

Vzorku spopolnite postupom opísaným pri stanovení popola. Môže sa použiť aj popol získaný pri uvedenej analýze.

Popol vložte do 250 až 400 ml kadičky pomocou 75 ml kyseliny chlorovodíkovej (bod 3.1). Pomaly priveďte do varu a nechajte jemne vrieť pätnásť minút. Teplý roztok prefiltrujte cez bezpopolový filtračný papier a zvyšok premývajte teplou vodou až do odstránenia kyslej reakcie. Filter so zvyškom vysušte a spopolnite v odváženom tégliku pri teplote najmenej 550 °C a najviac 700 °C. Nechajte vychladnúť v exsikátore a odvážte.

5.2.   Metóda B

Navážte 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte do 250 až 400 ml kadičky. Pridajte 25 ml vody a následne 25 ml kyseliny chlorovodíkovej (bod 3.1), premiešajte a počkajte, kým neprestane šumieť. Pridajte ďalších 50 ml kyseliny chlorovodíkovej (bod 3.1). Počkajte, kým sa prestane uvoľňovať akýkoľvek plyn, potom kadičku vložte do vriaceho vodného kúpeľa na tridsať minút, prípadne na dlhšie, aby sa dôkladne hydrolyzoval všetok prítomný škrob. Prefiltrujte ešte za tepla cez bezpopolový filter a filter premyte 50 ml teplej vody (pozri poznámku 7). Filter so zvyškom vložte do spaľovacieho téglika, vysušte a spopolnite pri teplote najmenej 550 °C a najviac 700 °C. Popol vložte do 250 až 400 ml kadičky pomocou 75 ml kyseliny chlorovodíkovej (bod 3.1); pokračujte postupom opísaným v druhom pododseku bodu 5.1.

6.   Výpočet výsledkov

Hmotnosť zvyšku vypočítajte odpočítaním hmotnosti téglika. Výsledok sa vyjadrí ako percento zo vzorky.

7.   Poznámka

Ak je filtrácia obtiažna, začnite analýzu znova, pričom 50 ml kyseliny chlorovodíkovej (bod 3.1) nahraďte 50 ml kyseliny trichlóroctovej, 20 % roztok (w/v) (bod 3.2) a filter premyte teplým roztokom 1 % kyseliny trichlóroctovej (bod 3.3).

N.   STANOVENIE OBSAHU CELKOVÉHO FOSFORU

Celkový obsah fosforu sa stanoví:

—	analytickou metódou stanovenou v norme EN 15510 – Krmivá pre zvieratá. Metódy odberu vzoriek a analýz. Stanovenie vápnika, sodíka, fosforu, horčíka, draslíka, železa, zinku, medi, mangánu, kobaltu, molybdénu a olova metódou ICP-AES, alebo

—	analytickou metódou stanovenou v norme EN 15621 – Krmivá pre zvieratá. Metódy odberu vzoriek a analýz. Stanovenie vápnika, sodíka, fosforu, horčíka, draslíka, síry, železa, zinku, medi, mangánu a kobaltu po mineralizácii tlakom metódou ICP-AES, alebo

—	fotometrickou metódou podľa opisu uvedeného ďalej.

FOTOMETRICKÁ METÓDA

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah celkového fosforu v krmivách. Je vhodná najmä na analýzu produktov s nízkym obsahom fosforu. V určitých prípadoch (ak ide o produkt bohatý na fosfor) je možné použiť gravimetrickú metódu.

2.   Podstata metódy

Vzorka sa mineralizuje buď suchým spaľovaním (v prípade organických krmív), alebo rozkladom kyselinou (v prípade minerálnych zlúčenín a tekutých krmív) a umiestni sa do roztoku kyseliny. Roztok sa upraví molybdátovanádovým činidlom. Optická hustota takto vzniknutého žltého roztoku sa meria spektrofotometrom pri 430 nm.

3.   Činidlá

3.1.

Uhličitan vápenatý.

3.2.

Kyselina chlorovodíková, ρ20 = 1,10 g/ml (približne 6 mol/liter).

3.3.

Kyselina dusičná, ρ20 = 1,045 g/ml.

3.4.

Kyselina dusičná, ρ20 = 1,38 až 1,42 g/ml.

3.5.

Kyselina sírová, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.6.

Molybdátovanádové činidlo: zmiešajte 200 ml roztoku heptamolybdénanu amónneho (bod 3.6.1), 200 ml roztoku vanadičnanu amónneho (bod 3.6.2) a 134 ml kyseliny dusičnej (bod 3.4) v 1 l odmernej banke. Doplňte destilovanou vodou na celkový objem.

3.6.1.

Roztok heptamolybdénanu amónneho: rozpustite v horúcej vode 100 g heptamolybdénanu amónneho (NH4)/6Mo7O24.4H2O. Pridajte 10 ml amoniaku (hustota 0,91 g/ml) a doplňte vodou na objem 1 liter.

3.6.2.

Roztok vanadičnanu amónneho: rozpustite 2,35 g vanadičnanu amónneho NH4VO3 v 400 ml horúcej vody. Za stáleho miešania pomaly pridajte 20 ml zriedenej kyseliny dusičnej [7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O] a doplňte vodou na objem 1 liter.

3.7.

Štandardný roztok 1 mg fosforu na 1 ml: vo vode rozpustite 4,387 g dihydrogenfosforečnanu draselného KH2PO4. Doplňte vodou na objem 1 liter.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.

Kremenné, porcelánové alebo platinové spaľovacie tégliky.

4.2.

Elektrická mufľová pec s termostatom nastavená na 550 °C.

4.3.

250 ml Kjeldahlova banka.

4.4.

Odmerné banky a presné pipety.

4.5.

Spektrofotometer.

4.6.

Skúmavky s priemerom asi 16 mm, so zátkami s priemerom do 14,5 mm; objem: 25 až 30 ml.

5.   Postup

5.1.   Príprava roztoku

Pripravte roztok podľa druhu vzorky, ako je uvedené v bode 5.1.1 alebo 5.1.2.

5.1.1.   Obvyklý postup

Navážte 1 g alebo väčšie množstvo vzorky s presnosťou na 1 mg. Skúšobnú vzorku vložte do Kjeldahlovej banky, pridajte 20 ml kyseliny sírovej (bod 3.5), pretrepte, aby sa látka úplne nasýtila kyselinou a aby sa zamedzilo jej prilepeniu na steny banky, zahrejte a 10 minút udržujte na bode varu. Nechajte pomaly vychladnúť, pridajte 2 ml kyseliny dusičnej (bod 3.4), jemne zahrejte, nechajte pomaly vychladnúť, pridajte trochu viac kyseliny dusičnej (bod 3.4) a priveďte znovu do bodu varu. Tento postup opakujte, až kým nezískate bezfarebný roztok. Ochlaďte, pridajte trochu vody, zlejte kvapalinu do 500 ml odmernej banky, Kjeldahlovu banku vypláchnite horúcou vodou. Nechajte vychladnúť, doplňte vodou do celkového objemu, homogenizujte a prefiltrujte.

5.1.2.   Vzorky obsahujúce organické látky a vzorky bez dihydrogenfosforečnanu vápenatého a dihydrogenfosforečnanu horečnatého

Navážte 2,5 g vzorky s presnosťou na 1 mg do spaľovacieho téglika. Miešajte skúšobnú vzorku, až kým sa úplne nespojí s 1 g uhličitanu vápenatého (bod 3.1). Spopolňujte v peci pri teplote 550 °C, až kým nezískate biely alebo sivý popol (malé množstvo dreveného uhlia neprekáža). Preneste popol do 250 ml kadičky. Pridajte 20 ml vody a kyselinu chlorovodíkovú (bod 3.2), až kým neprestane šumieť. Pridajte ďalších 10 ml kyseliny chlorovodíkovej (bod 3.2). Uložte kadičku do pieskového kúpeľa a odparujte do sucha, čím sa kremeň prevedie na nerozpustnú formu. Rozpustite zvyšok v 10 ml kyseliny dusičnej (bod 3.3) a varte v pieskovom kúpeli alebo na vyhrievacej platni 5 minút bez odparovania do sucha. Zlejte kvapalinu do 500 ml odmernej banky, kadičku niekoľkokrát vypláchnite horúcou vodou. Nechajte vychladnúť, doplňte vodou do celkového objemu, homogenizujte a prefiltrujte.

5.2.   Vyfarbenie a meranie optickej hustoty

Zrieďte alikvotnú časť filtrátu získaného podľa bodu 5.1.1 alebo 5.1.2, aby ste získali koncentráciu fosforu nie väčšiu ako 40 μg/ml. Do skúmavky (bod 4.6) vlejte 10 ml tohto roztoku a pridajte 10 ml molybdátovanádového činidla (bod 3.6). Homogenizujte a nechajte odstáť najmenej 10 minút pri teplote 20 °C. Zmerajte optickú hustotu v spekrofotometri pri 430 nm oproti roztoku získanému pridaním 10 ml molybdátovanádového činidla (bod 3.6) do 10 ml vody.

5.3.   Kalibračná krivka

Zo štandardného roztoku (bod 3.7) pripravte roztoky obsahujúce 5, 10, 20, 30 a 40 μg fosforu na ml. Zoberte 10 ml z každého roztoku a pridajte do nich 10 ml molybdátovanádového činidla (bod 3.6). Homogenizujte a nechajte odstáť najmenej 10 minút pri teplote 20 °C. Zmerajte optickú hustotu, ako je uvedené v bode 5.2. Zostrojte kalibračnú krivku vynesením optických hustôt oproti zodpovedajúcim množstvám fosforu. Pri koncentráciách medzi 0 a 40 μg bude krivka lineárna.

6.   Výpočet výsledkov

Použitím kalibračnej krivky stanovte množstvo fosforu v skúšobnej vzorke.

Výsledok sa vyjadrí ako percento zo vzorky.

Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť:

—	3 % z vyššieho výsledku pre obsah fosforu nižší ako 5 %,

—	0,15 % v absolútnej hodnote pre obsah fosforu 5 % alebo viac.

O.   STANOVENIE CHLÓRU Z CHLORIDOV

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť množstvo chlóru v chloridoch rozpustných vo vode, bežne vyjadrené ako chlorid sodný. Uplatňuje sa v prípade všetkých krmív.

2.   Podstata metódy

Chloridy sa rozpustia vo vode. Ak produkt obsahuje organické látky, vyčíri sa. Roztok sa mierne okyslí kyselinou dusičnou a chloridy sa vyzrážajú vo forme chloridu strieborného roztokom dusičnanu strieborného. Prebytok dusičnanu strieborného sa stitruje roztokom tiokyanatanu amónneho Volhardovou metódou.

3.   Činidlá

3.1.

Roztok tiokyanatanu amónneho, 0,1 mol/liter.

3.2.

Roztok dusičnanu strieborného, 0,1 mol/liter.

3.3.

Nasýtený roztok síranu amónno-železitého (NH4)Fe(SO4)2.

3.4.

Kyselina dusičná, hustota: 1,38 g/ml.

3.5.

Dietyléter.

3.6.

Acetón.

3.7.

Carrezovo činidlo I: rozpustite vo vode 21,9 g dihydrátu octanu zinočnatého Zn(CH3COO)2.2H2O a 3 g ľadovej kyseliny octovej. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.8.

Carrezovo činidlo II: rozpustite vo vode 10,6 g trihydrátu ferokyanidu draselného, K4Fe(KN)6 3H2O. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.9.

Aktívne uhlie, ktoré neobsahuje chloridy a ani ich neabsorbuje.

4.   Prístrojové vybavenie

Mixér (trepačka): približne 35 až 40 ot/min.

5.   Postup

5.1.   Príprava roztoku

Pripravte roztok podľa druhu vzorky, ako je uvedené v bodoch 5.1.1, 5.1.2 alebo 5.1.3.

Zároveň vykonajte slepý pokus bez použitia vzorky, ktorá sa má analyzovať.

5.1.1.   Vzorky bez organických látok

Navážte s presnosťou na 1 mg vzorku v množstve najviac 10 g, aby obsahovala najviac 3 g chlóru vo forme chloridov. Vložte spolu so 400 ml vody do 500 ml kalibrovanej odmernej banky pri teplote približne 20 °C. Miešajte tridsať minút v trepačke, doplňte na požadovaný objem, homogenizujte a prefiltrujte.

5.1.2.   Vzorky s obsahom organických látok, okrem produktov uvedených v bode 5.1.3

Navážte približne 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte spolu s 1 g aktívneho uhlia do 500 ml kalibrovanej odmernej banky. Pridajte 400 ml vody pri teplote približne 20 °C a 5 ml Carrezovho činidla I (bod 3.7), miešajte 30 sekúnd a pridajte 5 ml Carrezovho činidla II (bod 3.8). Miešajte tridsať minút v trepačke, doplňte na požadovaný objem, homogenizujte a prefiltrujte.

5.1.3.   Tepelne upravené krmivá, ľanové výlisky a múčka, produkty bohaté na ľanovú múčku a ostatné produkty bohaté na slizovité alebo na koloidné látky (napr. dextrínovaný škrob)

Pripravte roztok postupom opísaným v bode 5.1.2, ale bez filtrácie. Nechajte usadiť (podľa potreby odstreďte), odoberte 100 ml supernatantu a preneste do 200 ml odmernej banky. Zmiešajte s acetónom (bod 3.6) a doplňte na požadovaný objem týmto rozpúšťadlom, homogenizujte a prefiltrujte.

5.2.   Titrácia

Pomocou pipety preneste do Erlenmeyerovej banky 25 ml až 100 ml filtrátu (podľa predpokladaného obsahu chlóru) získaného podľa bodov 5.1.1, 5.1.2 alebo 5.1.3. Alikvotná časť nesmie obsahovať viac ako 150 mg chlóru (Cl). Podľa potreby zrieďte vodou na objem najmenej 50 ml, pridajte 5 ml kyseliny dusičnej (bod 3.4), 2 ml nasýteného roztoku síranu amónno-železitého (bod 3.3) a z naplnenej byrety 2 kvapky roztoku tiokyanatanu amónneho (bod 3.1). Byretou pridajte roztok dusičnanu strieborného (bod 3.2), tak aby bol v prebytku 5 ml. Pridajte 5 ml dietyléteru (bod 3.5) a intenzívne pretrepte, aby sa vytvorila zrazenina. Prebytok dusičnanu strieborného stitrujte roztokom tiokyanatanu amónneho (bod 3.1) až do vzniku jednu minútu trvajúceho červenkasto-hnedého sfarbenia.

6.   Výpočet výsledkov

Množstvo chlóru (X) vyjadrené ako % chloridu sodného sa vypočíta pomocou tejto rovnice:

kde:

V1	=	ml pridaného roztoku dusičnanu strieborného 0,1 mol/l,
V2	=	ml roztoku tiokyanatanu amónneho 0,1 mol/l použitého na titráciu,
m	=	g hmotnosti vzorky v alikvotnej časti.

Ak slepý pokus naznačil, že roztok dusičnanu strieborného 0,1 mol/l sa spotreboval, odpočítajte túto hodnotu od objemu (V1 – V2).

7.   Poznámky

7.1.

Titráciu možno vykonať aj potenciometricky alebo ampérometricky.

7.2.

Produkty veľmi bohaté na oleje a tuky najskôr odtučnite dietyléterom alebo petroléterom.

7.3.

V prípade rybej múčky možno titráciu vykonať Mohrovou metódou.