«ANEXO I

MÉTODOS DE AMOSTRAGEM

1.   OBJETO E ÂMBITO DE APLICAÇÃO

As amostras destinadas aos controlos oficiais de alimentos para animais são colhidas de acordo com os métodos seguidamente indicados. As amostras assim obtidas serão consideradas representativas das porções amostradas.

O objetivo das amostras representativas é obter uma pequena fração de um lote, correspondendo a determinação de quaisquer características particulares dessa fração ao valor médio das características do lote. O lote é amostrado colhendo repetidamente amostras elementares em várias posições únicas do lote. Essas amostras elementares são combinadas misturando-as de forma a obter uma amostra global a partir da qual são preparadas amostras finais representativas por divisão representativa.

Se uma inspeção visual ou outra informação pertinente revelar uma diferença de qualidade entre as porções amostradas do alimento para animais e o resto do alimento para animais do mesmo lote, essas porções devem ser separadas do resto do alimento para animais e ser tratadas como um sublote separado. Se não for possível dividir o alimento para animais em sublotes separados, o produto em causa é amostrado como lote único. Nesses casos, esse facto será mencionado no relatório de amostragem.

Sempre que um alimento para animais amostrado em conformidade com as disposições do presente regulamento não satisfaça os requisitos da UE e faça parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

A amostragem pode igualmente incluir alimentos para animais apresentados para venda pelos operadores das empresas do setor dos alimentos para animais através de técnicas de comunicação à distância nos termos do artigo 11.o, n.o 3, do Regulamento (CE) n.o 767/2009 do Parlamento Europeu e do Conselho (1). A amostragem de alimentos para animais apresentados para venda através de técnicas de comunicação à distância deve, em princípio, estar sujeita ao disposto nos pontos estabelecidos no presente anexo. Os aspetos específicos da amostragem de alimentos para animais apresentados para venda à distância encontram-se descritos no ponto 11.

2.   DEFINIÇÕES

—

Lote: quantidade identificada de alimentos para animais que se presume ter características uniformes, nomeadamente a origem, a variedade, o tipo de acondicionamento, o embalador, o expedidor ou a rotulagem; no caso de um processo de produção, uma quantidade do produto fabricada por uma unidade de produção de uma única unidade fabril que utilize parâmetros de produção uniformes ou por várias dessas unidades, quando produzida em ordem sequencial e armazenada em conjunto.

—	Porção amostrada: lote ou uma parte identificada do lote ou sublote.

—	Amostra selada: amostra selada de modo a impedir qualquer acesso à amostra sem quebrar ou remover o selo.

—	Amostra elementar: quantidade colhida num ponto da porção amostrada.

—	Amostra global: conjunto de amostras elementares colhidas da mesma porção amostrada.

—	Amostra reduzida: parte da amostra global, obtida a partir desta através de um processo de redução representativa.

—	Amostra final: parte da amostra global (misturada), da amostra reduzida ou da amostra global homogeneizada, em função do tipo de controlo (ver ponto 9.4).

—	Amostra laboratorial: amostra destinada ao laboratório (como recebida pelo laboratório), que pode ser uma amostra final, reduzida ou global.

—	Amostra de um alimento para venda à distância: amostra de um lote de alimentos para animais apresentados para venda através de técnicas de comunicação à distância.

3.   DISPOSIÇÕES GERAIS

—	As amostras são colhidas por pessoas autorizadas para o efeito pela autoridade competente.

—	Para uma amostra de um alimento para venda à distância, a autoridade competente deve solicitar uma quantidade do alimento para animais ao operador da empresa do setor de alimentos para animais, através de técnicas de comunicação à distância.

—	A amostra tem de ser selada de modo a impedir qualquer acesso à amostra sem quebrar ou remover o selo.

A marca do selo tem de ser claramente identificável e visível.

—	Identificação da amostra: a amostra tem de estar marcada de modo indelével e identificada de forma a garantir uma relação inequívoca com o relatório de amostragem.

—

De cada amostra global ou reduzida são obtidas as seguintes amostras finais: uma amostra para efeitos de controlo (da aplicação da legislação) e uma destinada ao operador da empresa do setor dos alimentos para animais (para efeitos de recurso). Pode ser obtida uma amostra final adicional, para efeitos de arbitragem. Caso a amostra global completa esteja homogeneizada, as amostras finais são obtidas a partir da amostra global homogeneizada, desde que esse procedimento não colida com as regras dos Estados-Membros em matéria de direitos do operador.

—

Nos termos do artigo 15.o, n.os 1 e 2, do Regulamento (UE) 2017/625, quando necessário para a realização da amostragem oficial e sempre que solicitado pelas autoridades competentes, os operadores das empresas do setor dos alimentos para animais devem: — facultar ao pessoal das autoridades competentes o acesso ao equipamento sob o seu controlo, incluindo, se for caso disso, a disponibilização do equipamento para a colheita de amostras e do equipamento de proteção individual necessários, — prestar apoio e cooperar com o pessoal das autoridades competentes a fim de permitir a amostragem, nomeadamente disponibilizando os alimentos para animais ao pessoal das autoridades competentes.

4.   EQUIPAMENTO

4.1.   O equipamento destinado à colheita de amostras deve ser fabricado com materiais que não contaminem os produtos amostrados. O equipamento destinado a ser utilizado várias vezes tem de ser fácil de limpar para evitar contaminações cruzadas.

4.2.   Equipamento recomendado para a amostragem dos alimentos sólidos

4.2.1.   Amostragem manual

4.2.1.1.

Pá de amostragem com fundo plano e bordos verticais.

4.2.1.2.

Sonda de fenda longa ou compartimentada. As dimensões da sonda têm de ser adequadas às características da porção amostrada (profundidade do recipiente, dimensões do saco, etc.) e ao tamanho das partículas que compõem o alimento. Se a sonda tiver várias aberturas, para garantir que a amostra é colhida em diferentes sítios, as aberturas devem ser separadas por compartimentos ou por aberturas sequenciais.

4.2.2.   Amostragem mecânica

Podem ser utilizados aparelhos mecânicos apropriados para a amostragem de alimentos em movimento. O aparelho mecânico será considerado adequado se, pelo menos, toda a secção do caudal for amostrada.

A amostragem de alimentos em movimento (em caudais elevados) pode ser efetuada por sistemas automáticos de recolha de amostras.

4.2.3.   Divisor

Quando possível e adequado, devem ser utilizados aparelhos destinados a dividir a amostra em partes aproximadamente iguais, para a preparação de amostras reduzidas de uma forma representativa.

5.   REQUISITOS QUANTITATIVOS QUANTO AO NÚMERO DE AMOSTRAS ELEMENTARES

—

Os requisitos quantitativos estabelecidos nos pontos 5.1 e 5.2 no que se refere ao número de amostras elementares são aplicáveis a porções com uma dimensão máxima de 500 toneladas e que podem ser amostradas de forma representativa. O procedimento de amostragem descrito é igualmente válido para quantidades superiores à porção máxima prescrita, desde que o número máximo de amostras elementares indicado nos quadros seguintes, constantes dos pontos 5.1.1, 5.1.3 e 5.1.5, seja ignorado, passando a ser determinado pela fórmula de raiz quadrada apresentada na parte respetiva do procedimento (ver ponto 5.3), e na condição de a dimensão mínima da amostra global ser aumentada proporcionalmente. Tal não impede que um lote grande possa ser dividido em sublotes de menor dimensão e que cada sublote seja amostrado em conformidade com o procedimento descrito nos pontos 5.1 e 5.2.

—	A dimensão da porção amostrada tem de ser suficiente para permitir a amostragem de todas as partes que a compõem.

—	Para lotes ou sublotes muito grandes (> 500 toneladas) e para lotes cujo transporte ou armazenagem não permita uma amostragem segundo o procedimento estabelecido nos pontos 5.1 e 5.2 do presente ponto, deve aplicar-se o procedimento de amostragem indicado no ponto 5.3.

—

Para amostras de alimentos para venda à distância, o tamanho do lote a partir do qual a quantidade do alimento é solicitada, geralmente não é conhecido pela autoridade competente. Por conseguinte, o procedimento estabelecido nos pontos 5.1 e 5.2 não pode ser utilizado. Neste caso, aplicar-se-á o processo descrito no ponto 11.

—

Se for legalmente exigida ao operador da empresa do setor de alimentos para animais a aplicação do presente regulamento no âmbito de um sistema obrigatório de controlo, o operador pode divergir dos requisitos quantitativos estabelecidos no presente ponto, para ter em conta determinadas características operacionais, desde que demonstre cabalmente à autoridade competente a equivalência do procedimento de amostragem em termos de representatividade e após autorização dessa autoridade.

—

Em casos excecionais, quando não seja possível aplicar o método de amostragem previsto no que diz respeito aos requisitos quantitativos, devido a danos comerciais inaceitáveis do lote (relacionados com o tipo de acondicionamento, meios de transporte, armazenagem, etc.), pode ser aplicado um método de amostragem alternativo, desde que seja tão representativo quanto possível e esteja plenamente descrito e documentado.

5.1.   Requisitos quantitativos das amostras elementares respeitantes ao controlo de substâncias ou produtos repartidos uniformemente nos alimentos para animais

5.1.1.   Alimentos sólidos a granel

Dimensão da porção amostrada	Número mínimo de amostras elementares
≤ 2,5 toneladas	7
> 2,5 toneladas	√ (20 vezes o número de toneladas que constituem a porção amostrada) (*1) , até 40 amostras elementares

5.1.2.   Alimentos líquidos a granel

Dimensão da porção amostrada	Número mínimo de amostras elementares
≤ 2,5 toneladas ou ≤ 2 500 litros	4  (*2)
> 2,5 toneladas ou > 2 500 litros	7  (*2)

5.1.3.   Alimentos embalados

Os alimentos para animais (sólidos e líquidos) podem ser embalados em sacos, latas, barricas, etc., que são referidos no quadro seguinte enquanto unidades. As unidades de grande dimensão (≥ 500 kg ou litros) têm de ser amostradas em conformidade com as disposições estabelecidas para os alimentos a granel (ver 5.1.1 e 5.1.2).

Dimensão da porção amostrada	Número mínimo de unidades a partir do qual deve ser obtida (pelo menos) uma amostra elementar (*3)
1 a 20 unidades	1 unidade (*4)
21 a 150 unidades	3 unidades (*4)
151 a 400 unidades	5 unidades (*4)
> 400 unidades	¼ de √ (número de unidades que compõem a porção amostrada) (*5) , até 40 unidades

5.1.4.   Alimentos em blocos e pedras minerais para lamber

Será considerado, no mínimo, um bloco ou pedra para lamber por cada porção amostrada de 25 unidades e, no máximo, quatro destes produtos.

Para blocos ou pedras para lamber cujo peso unitário não exceda 1 kg, a amostra elementar é composta pelo conteúdo de um bloco ou pedra para lamber.

5.1.5.   Alimentos grosseiros/forragem

Dimensão da porção amostrada	Número mínimo de amostras elementares (*6)
≤ 5 toneladas	5
> 5 toneladas	√ (5 vezes o número de toneladas que constituem a porção amostrada) (*7) , até 40 amostras elementares

5.2.   Requisitos quantitativos das amostras elementares respeitantes ao controlo de constituintes ou substâncias suscetíveis de não estarem repartidos uniformemente nos alimentos para animais

Estes requisitos quantitativos das amostras elementares devem ser aplicados nas seguintes situações:

—	controlo de aflatoxinas, cravagem do centeio, outras micotoxinas e impurezas botânicas prejudiciais nas matérias-primas para a alimentação animal,

—	controlo da contaminação cruzada por um constituinte, incluindo material geneticamente modificado, ou uma substância suscetível de repartição não uniforme nos alimentos para animais.

Sempre que a autoridade de controlo suspeitar fortemente de que essa repartição não uniforme também se verifica em caso de contaminação cruzada por um constituinte ou substância em alimentos compostos, podem ser aplicados os requisitos quantitativos previstos no quadro seguinte.

Dimensão da porção amostrada	Número mínimo de amostras elementares
< 80 toneladas	Ver requisitos quantitativos no ponto 5.1. O número de amostras elementares a colher tem de ser multiplicado por 2,5.
≥ 80 toneladas	100

5.3.   Requisitos quantitativos das amostras elementares no caso de lotes muito grandes

No caso de porções amostradas muito grandes (porções amostradas > 500 toneladas), o número de amostras elementares a colher = 40 amostras elementares + √toneladas em relação ao controlo das substâncias ou produtos repartidos uniformemente nos alimentos para animais, ou 100 amostras elementares + √toneladas em relação ao controlo de constituintes ou substâncias suscetíveis de não estarem repartidos uniformemente nos alimentos para animais.

6.   REQUISITOS QUANTITATIVOS DA AMOSTRA GLOBAL

É necessária uma única amostra global por porção amostrada.

	Natureza dos alimentos para animais	Dimensão mínima da amostra global (*8)  (*9)
6.1.	Alimentos a granel	4 kg
6.2.	Alimentos embalados	4 kg (*10)
6.3.	Alimentos líquidos ou semilíquidos	4 litros
6.4.	Alimentos em blocos ou pedras minerais para lamber:
6.4.1.	peso unitário superior a 1 kg	4 kg
6.4.2.	peso unitário não superior a 1 kg	peso de quatro blocos ou pedras de origem
6.5.	Alimentos grosseiros/forragem	4 kg (*11)

7.   REQUISITOS QUANTITATIVOS DAS AMOSTRAS FINAIS

Amostras finais

É exigida a análise de pelos menos uma amostra final. A dimensão da amostra final destinada a análise não pode ser inferior às quantidades seguintes:

Alimentos sólidos	500 g (*12)  (*13)  (*14)  (*15)
Alimentos líquidos ou semilíquidos	500 ml (*12)

8.   MÉTODO DE AMOSTRAGEM PARA LOTES MUITO GRANDES OU LOTES ARMAZENADOS OU TRANSPORTADOS DE MODO A NÃO PERMITIR UMA AMOSTRAGEM DE TODO O LOTE

8.1.   Princípios gerais

Sempre que o tipo de transporte ou armazenagem de um lote não permita colher amostras elementares em todo o lote, a amostragem deve ser, de preferência, efetuada enquanto o lote estiver em movimento.

No caso de grandes armazéns destinados a alimentos para animais, os operadores devem ser incentivados a instalar equipamentos nos armazéns que permitam uma amostragem (automática) em todo o lote armazenado.

Em caso de aplicação dos procedimentos de amostragem previstos no presente ponto, o operador da empresa do setor de alimentos para animais ou o seu representante são informados acerca desses procedimentos. Se os referidos procedimentos de amostragem forem questionados pelo operador ou pelo seu representante, o operador ou o seu representante deve permitir que a autoridade competente proceda à amostragem em todo o lote a expensas do operador.

8.2.   Lotes grandes transportados por navio

8.2.1.   Amostragem dinâmica de lotes grandes transportados por navio

A amostragem de lotes grandes nos navios deve ser preferencialmente realizada enquanto o produto está em movimento (amostragem dinâmica).

A amostragem é feita por porão, podendo os porões estar fisicamente separados. Todavia, os porões são esvaziados parcialmente um após outro, deixando essa separação física inicial de existir após a transferência para as instalações de armazenamento. A amostragem pode, portanto, ser efetuada em função da separação física inicial ou da separação existente após transferência para as referidas instalações.

A descarga de um navio pode durar vários dias. Normalmente, as amostras têm de ser colhidas a intervalos regulares durante todo o período de descarga. Contudo, nem sempre é possível ou adequado para um inspetor oficial estar presente para amostragem durante toda a operação de descarga. Por conseguinte, é permitida a amostragem de uma parte (porção amostrada) da totalidade do lote. O número de amostras elementares é determinado em função da dimensão da porção amostrada.

Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição e seja considerado que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

Mesmo quando a amostragem oficial é efetuada de forma automática, é necessária a presença de um inspetor. Contudo, se a amostragem automática utilizar parâmetros preestabelecidos que não possam ser alterados durante a amostragem e se as amostras elementares forem recolhidas num recipiente selado, impedindo qualquer possível fraude, a presença de um inspetor só é exigida no início da amostragem, de cada vez que tenha de ser mudado o recipiente das amostras, e no final da amostragem.

8.2.2.   Amostragem estática de lotes transportados por navio

No caso de a amostragem ser realizada de forma estática, têm de ser aplicados os procedimentos previstos para as instalações de armazenagem (silos) acessíveis pelo topo (ver ponto 8.4.1).

A amostragem tem de ser efetuada através da parte acessível (do topo) do lote/porão. O número de amostras elementares é determinado em função da dimensão da porção amostrada. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição e seja considerado que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

8.3.   Amostragem de lotes grandes armazenados em armazéns

A amostragem tem de ser efetuada através da parte acessível do lote. O número de amostras elementares é determinado em função da dimensão da porção amostrada. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição e seja considerado que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

8.4.   Amostragem de instalações de armazenagem (silos)

8.4.1.   Amostragem de silos (facilmente) acessíveis pelo topo

A amostragem tem de ser efetuada através da parte acessível do lote. O número de amostras elementares é determinado em função da dimensão da porção amostrada. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição e seja considerado que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

8.4.2.   Amostragem de silos não acessíveis pelo topo (silos fechados)

8.4.2.1.   Silos não acessíveis pelo topo (silos fechados) com dimensão > 100 toneladas

Os alimentos para animais armazenados neste tipo de silos não podem ser amostrados de forma estática. Por conseguinte, sempre que os alimentos para animais no silo tenham de ser amostrados e não exista possibilidade de movê-los, é estabelecido um acordo com o operador no sentido de informar o inspetor sobre o momento em que o silo será descarregado, para que possa ser realizada uma amostragem dinâmica dos alimentos.

8.4.2.2.   Silos não acessíveis pelo topo (silos fechados) com dimensão < 100 toneladas

O procedimento de amostragem envolve a introdução num recipiente de uma quantidade de 50 kg a 100 kg e a recolha de uma amostra a partir dessa quantidade. A dimensão da amostra global corresponde a todo o lote e o número de amostras elementares é determinado em função da quantidade libertada do silo para o recipiente de amostragem. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição e seja considerado que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

8.5.   Amostragem de alimentos a granel em contentores grandes fechados

Muitas vezes, estes lotes só podem ser amostrados quando descarregados. Em determinados casos, não é possível proceder à descarga no ponto de importação ou de controlo, devendo a amostragem ter lugar quando os contentores são descarregados.

9.   INSTRUÇÕES RELATIVAS À COLHEITA, À PREPARAÇÃO E AO ACONDICIONAMENTO DAS AMOSTRAS

9.1.   Generalidades

As amostras devem ser colhidas e preparadas tão rapidamente quanto possível, tendo em conta as precauções necessárias para evitar que o produto seja alterado ou contaminado. Os instrumentos, as superfícies e os recipientes destinados a receber as amostras têm de estar limpos e secos.

9.2.   Amostras elementares

As amostras elementares têm de ser colhidas, aleatoriamente e de forma uniforme em termos de repartição, em toda a porção de amostragem e apresentar dimensões aproximadamente equivalentes.

As amostras elementares têm uma dimensão mínima de 100 g ou 25 g em caso de alimentos grosseiros/forragem com baixa densidade relativa.

Sempre que, em conformidade com as regras dos procedimentos de amostragem estabelecidas no ponto 8, tenham de ser colhidas menos de 40 amostras elementares, a dimensão dessas amostras é determinada em função da dimensão exigida para a amostra global (ver ponto 6).

No caso de amostragem de pequenos lotes de alimentos embalados relativamente aos quais, de acordo com os requisitos quantitativos, tenha de ser colhido um número limitado de amostras elementares, cada amostra elementar será composta pelo conteúdo de uma unidade de origem cujo conteúdo não exceda 1 kg ou 1 litro.

Em caso de amostragem de alimentos embalados constituídos por pequenas unidades (p. ex., < 250 g), a dimensão das amostras elementares depende da dimensão de cada unidade.

No caso de amostras de alimentos para venda à distância, a dimensão das amostras elementares depende da dimensão de cada unidade e pode, em casos específicos, ser inferior a 100 g ou a 100 ml.

9.2.1.   Alimentos a granel

Sempre que adequado, a colheita das amostras pode ser efetuada quando da movimentação do lote (carga ou descarga).

9.2.2.   Alimentos embalados

Após seleção do número requerido de unidades amostradas, como indicado no ponto 5, procede-se à colheita de uma parte do conteúdo de cada unidade com o auxílio de uma sonda ou pá. Sempre que necessário, as amostras são colhidas depois de se esvaziar separadamente as unidades.

9.2.3.   Alimentos líquidos ou semilíquidos homogéneos ou homogeneizáveis

Após seleção do número requerido de unidades amostradas, como indicado no ponto 5, procede-se à colheita de uma quantidade em cada unidade após se ter homogeneizado o conteúdo, se necessário.

As amostras elementares podem ser colhidas quando da descarga do produto.

9.2.4.   Alimentos líquidos ou semilíquidos não homogeneizáveis

Após seleção do número requerido de unidades amostradas, como indicado no ponto 5, procede-se à colheita das amostras a diferentes níveis.

As amostras podem igualmente ser colhidas quando da descarga do produto, mas rejeitando as primeiras frações.

Nos dois casos, o volume total colhido não pode ser inferior a 10 litros.

9.2.5.   Alimentos em blocos e pedras minerais para lamber

Após seleção do número requerido de blocos ou pedras para lamber amostradas, como indicado no ponto 5, pode ser colhida uma parte de cada bloco ou pedra. Em caso de suspeita de bloco ou pedra não homogéneo, todo o bloco ou pedra pode ser colhido como amostra.

Para blocos ou pedras para lamber cujo peso unitário não exceda 1 kg, a amostra elementar é composta pelo conteúdo de um bloco ou pedra para lamber.

9.3.   Preparação das amostras globais

As amostras elementares devem ser misturadas para formar uma só amostra global.

9.4.   Preparação das amostras finais

O material da amostra global deve ser misturado cuidadosamente (2).

Introduzir cada amostra num recipiente apropriado. Tomar todas as precauções necessárias para evitar qualquer modificação da composição da amostra ou qualquer contaminação ou adulteração que possam ocorrer no decurso do transporte ou armazenagem.

9.4.1.   Substâncias repartidas uniformemente

No caso de controlo de constituintes ou substâncias repartidos uniformemente nos alimentos para animais, a amostra global pode ser reduzida de forma representativa para, pelo menos, 2,0 kg ou 2,0 litros (amostra reduzida) (3) de preferência utilizando um divisor mecânico ou automático. Para controlar a presença de resíduos de pesticidas em leguminosas, grãos de cereais, e frutos de casca rija, a dimensão mínima da amostra reduzida será de 3 kg. Se a natureza dos alimentos para animais não permitir a utilização de um divisor ou não estiver disponível um divisor, a amostra pode ser reduzida pelo método dos quartos.

A partir das amostras globais ou das amostras reduzidas, podem ser colhidas as amostras finais (para efeitos de controlo, recurso e eventualmente arbitragem), tendo aproximadamente a mesma quantidade e respeitando os requisitos quantitativos indicados no ponto 7.

9.4.2.   Substâncias repartidas não uniformemente

No caso de controlo de constituintes, incluindo material geneticamente modificado, ou substâncias suscetíveis de não estarem repartidos uniformemente nos alimentos para animais, a amostra global deve ser:

i)	completamente homogeneizada. A partir das amostras globais homogeneizadas, podem depois ser colhidas as amostras finais (para efeitos de controlo, recurso e eventualmente arbitragem), tendo aproximadamente a mesma quantidade e respeitando os requisitos quantitativos indicados no ponto 7, ou

ii)

reduzida para, pelo menos, 2 kg ou 2 litros (4), utilizando um divisor mecânico ou automático. Apenas quando a natureza dos alimentos para animais não permita a utilização de um divisor, pode a amostra, se necessário, ser reduzida pelo método dos quartos. Para controlar a presença de material geneticamente modificado no âmbito do Regulamento (UE) n.o 619/2011, a amostra reduzida tem de conter, pelo menos, 35 000 sementes/grãos para obter amostras finais destinadas ao controlo, recurso e eventualmente arbitragem contendo, no mínimo, 10 000 sementes de cereais [ver nota de rodapé (**) no ponto 6 e nota de rodapé (*) no ponto 7].

A partir das amostras reduzidas, podem ser colhidas as amostras finais, tendo aproximadamente a mesma quantidade e respeitando os requisitos quantitativos indicados no ponto 7.

9.5.   Acondicionamento das amostras

Os recipientes são selados e rotulados de forma a impedir a sua abertura sem danificação do selo. O rótulo deve estar totalmente incorporado no selo. Em alternativa, a amostra pode ser colocada num recipiente que terá de ser fechado de forma a não permitir a sua abertura sem danificação irreversível e a impedir a sua reutilização.

9.6.   Envio das amostras para o laboratório

As amostras são enviadas sem atrasos desnecessários para o laboratório de análises designado, juntamente com a informação necessária para proceder à análise.

10.   REGISTO DA AMOSTRAGEM

Tem de ser efetuado um registo de cada amostra, identificando claramente cada porção amostrada e a respetiva dimensão.

O registo deve igualmente mencionar qualquer desvio do procedimento de amostragem previsto no presente regulamento.

Além de disponibilizado ao laboratório de controlo oficial, o registo deve ser facultado ao operador da empresa do setor de alimentos para animais e/ou ao laboratório designado pelo operador.

11.   AMOSTRAS DE ALIMENTOS PARA VENDA À DISTÂNCIA

—

Para uma amostra de alimentos para venda à distância, o alimento para animais deve ser solicitado ao operador da empresa do setor de alimentos para animais através de técnicas de comunicação à distância. Neste caso, quando a autoridade competente solicita os alimentos para animais não é obrigada a identificar-se com uma identidade oficial ao operador da empresa do setor dos alimentos para animais, podendo utilizar uma identidade falsa.

—

A amostra global e as amostras finais da amostra do alimento para venda à distância têm de ser colhidas imediatamente após a receção da remessa por pessoas autorizadas para o efeito. Para preparar a amostra global, tem de ser colhido, aleatoriamente e de forma uniforme em termos de repartição, um número adequado de amostras elementares a partir da quantidade total obtida, que é depois misturado cuidadosamente ou homogeneizado, em conformidade, tanto quanto possível, com os princípios estabelecidos nos pontos 5, 9.2 e 9.3. Se os alimentos para animais forem embalados em unidades individuais, devem ser obtidas no mínimo quatro unidades, a partir das quais é colhida pelo menos uma amostra elementar. Em casos individuais, quando haja conhecimento de que as unidades são provenientes de lotes diferentes, o número de unidades a amostrar tem de ser reduzido e limitado às unidades do mesmo lote. No caso da análise a amostras de alimentos para venda à distância para deteção de constituintes ou substâncias repartidos não uniformemente no alimento para animais, o número de amostras elementares tem de ser, pelo menos, 2,5 vezes superior ao das amostras analisadas para deteção de substâncias repartidas uniformemente no alimento. A partir das amostras globais são então colhidas as amostras finais correspondentes (para efeitos de controlo, recurso e eventualmente arbitragem), em conformidade, tanto quanto possível, com os princípios estabelecidos no ponto 9.4 e é declarado no relatório de amostragem que se trata de uma amostra de alimento para venda à distância. De seguida, a autoridade competente informa imediatamente o operador da empresa do setor de alimentos para animais acerca da amostragem. O operador é igualmente notificado de que, sempre que possível, uma amostra (de recurso) detida pela autoridade competente se encontra à sua disposição numa localização específica, para efeitos de recurso, ou foi enviada para o operador da empresa do setor de alimentos para animais, ou foi enviada para o laboratório designado pelo operador, em conformidade com as normas nacionais em vigor. Se a amostra for enviada diretamente para o laboratório oficial, a amostra final tem de ser preparada e selada no laboratório por pessoas autorizadas para o efeito ou na presença de pessoas autorizadas para o efeito. O relatório de amostragem da amostra do alimento para venda à distância tem de ser enviado imediatamente após a preparação das amostras finais para a autoridade competente, que informa o operador da empresa do setor de alimentos para animais acerca da amostragem. Considera-se que a quantidade fornecida pelo operador da empresa do setor de alimentos para animais à autoridade competente representa uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição. Nos termos do artigo 15.o do Regulamento (CE) n.o 178/2002 do Parlamento Europeu e do Conselho (5), se se concluir que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, incluindo no caso de amostras de alimentos para venda à distância, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

«ANEXO II

DISPOSIÇÕES GERAIS RELATIVAS AOS MÉTODOS DE ANÁLISE DOS ALIMENTOS PARA ANIMAIS

A.   PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE

1.   Objeto

Os procedimentos descritos no presente anexo referem-se à preparação para análise das amostras enviadas aos laboratórios de controlo, após uma amostragem efetuada segundo o disposto no anexo I.

As amostras laboratoriais têm de ser preparadas de forma que as quantidades colhidas, como previsto nos métodos de análise, sejam homogéneas e representativas das amostras finais.

Além dos procedimentos descritos no presente anexo, devem ser seguidas as orientações para a preparação de amostras previstas nas normas EN ISO 6498.

2.   Precauções a tomar

O procedimento de preparação da amostra adotado depende dos métodos de análise a utilizar e dos constituintes ou substâncias a controlar. Importa, pois, que o procedimento aplicado se adeque ao método de análise utilizado e aos constituintes ou substâncias a controlar.

Todas as operações têm de ser efetuadas de forma a evitar tanto quanto possível a contaminação da amostra ou a alteração da sua composição.

Todas as moagens, misturas e peneiramentos devem ser efetuados rapidamente, evitando ao máximo expor a amostra ao ar e à luz. Não se devem usar moinhos ou trituradores suscetíveis de aquecer demasiado a amostra.

Recomenda-se a moagem manual para os alimentos particularmente sensíveis ao calor. Deve ainda garantir-se que o equipamento não seja uma fonte de contaminação.

A homogeneização da amostra através da preparação de uma suspensão por mistura de alto cisalhamento com água permite, por vezes, obter subamostras mais homogéneas, relativamente às obtidas por homogeneização a seco ou moagem, especialmente no caso de substâncias químicas repartidas de forma heterogénea. No entanto, subamostras homogéneas podem igualmente ser obtidas através de suficiente moagem a seco.

Em certos casos, tal como para a determinação da cravagem do centeio, impurezas botânicas prejudiciais, etc., a homogeneização da amostra é obtida através da mistura da amostra e não por moagem.

Caso a amostra não possa ser preparada sem uma variação significativa do seu teor em humidade, esse teor deve ser determinado antes e depois da preparação pelo método estabelecido na parte A do anexo III.

3.   Procedimento

3.1.   Procedimento geral

A alíquota de teste é colhida da amostra final homogeneizada. Não se recomenda o uso do método dos quartos, dado que pode dar origem a alíquotas de teste com uma elevada margem de erro de divisão.

3.1.1.   Alimentos que podem ser moídos tal como se encontram

—	Misturar a amostra final e recolhê-la para um recipiente adequado, limpo, seco e com fecho hermético. Misturar de novo a fim de garantir uma homogeneização completa, imediatamente antes de colher a quantidade para análise (alíquota de teste).

3.1.2.   Alimentos que podem ser moídos após secagem

—

Salvo indicação específica em contrário nos métodos de análise, secar a amostra final de maneira a baixar o seu teor de humidade para 8 % a 12 %, utilizando o processo de pré-dessecação indicado no ponto 4.3 do método de determinação do teor de humidade referido na parte A do anexo III. Proceder, em seguida, como indicado no ponto 3.1.1.

3.1.3.   Alimentos líquidos ou semilíquidos

—	Recolher a amostra final para um recipiente adequado, limpo, seco e com fecho hermético. Misturar cuidadosamente a fim de garantir uma homogeneização completa, imediatamente antes de colher a quantidade para análise (alíquota de teste).

3.1.4.   Outros alimentos

—	Caso a amostra final não possa ser preparada por qualquer dos processos acima indicados, utilizar outro processo de preparação apropriado que garanta que as quantidades colhidas para análise (alíquotas de teste) são homogéneas e representativas das amostras finais.

3.2.   Procedimento específico em caso de análise por inspeção visual ou por microscopia ou quando toda a amostra global esteja homogeneizada

—	Em caso de exame por inspeção visual (sem utilizar um microscópio), toda a amostra global ou final é utilizada para exame.

—

Em caso de exame microscópico, o laboratório pode reduzir a amostra global ou reduzir mais ainda a amostra reduzida. As amostras finais para efeitos de recurso e eventualmente arbitragem, são colhidas segundo um procedimento equivalente ao procedimento adotado para obter a amostra final para efeitos de controlo.

—	Caso toda a amostra global esteja homogeneizada, as amostras finais são colhidas da amostra global homogeneizada.

—

Para a determinação da cravagem do centeio e de impurezas botânicas prejudiciais, a amostra final tem de ser dividida em duas subamostras de igual massa, de aproximadamente 500 gramas. Uma subamostra é analisada. Se o resultado das subamostras for igual ou inferior a 50 % (limiar analítico) do teor máximo, a amostra cumpre o teor máximo. Se o resultado for superior a 50 % do teor máximo, é necessário analisar outra subamostra e utiliza-se a média do resultado das duas subamostras para verificar o cumprimento do teor máximo.

4.   Armazenamento das amostras

As amostras têm de ser armazenadas a uma temperatura que não altere a sua composição. As amostras destinadas a análise de vitaminas ou substâncias particularmente sensíveis à luz devem ser armazenadas em condições que impeçam que a amostra seja adversamente afetada pela luz.

B.   DISPOSIÇÕES RELATIVAS AOS REAGENTES E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS NOS MÉTODOS DE ANÁLISE

1.

Salvo indicação específica em contrário nos métodos de análise, todos os reagentes analíticos têm de ser analiticamente puros (a. p.). Para a análise de vestígios, a pureza dos reagentes tem de ser controlada mediante um ensaio em branco. Consoante o resultado obtido, poderá ou não vir a ser necessária a sua purificação suplementar.

2.

Todas as operações de preparação de soluções, diluição e lavagem mencionadas nos métodos de análise sem indicações quanto à natureza do solvente ou diluente a utilizar significam que deverá ser utilizada água. Regra geral, a água deve ser desmineralizada ou destilada. Em certos casos, indicados nos métodos de análise, essa água tem de ser submetida a processos de purificação específicos.

3.

Atendendo ao equipamento corrente normalmente presente nos laboratórios de controlo, o método de análise indica apenas o material especial ou os instrumentos e aparelhos que devam responder a determinadas condições. Esse material tem de estar bem limpo, em especial quando têm de ser determinadas quantidades ínfimas de substâncias.

C.   APLICAÇÃO DOS MÉTODOS DE ANÁLISE E EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

1.   Procedimento de extração

Vários métodos determinam um procedimento de extração específico. Regra geral, podem ser usados procedimentos de extração diferentes do indicado no método de análise, desde que o procedimento usado tenha dado provas de que proporciona, para a matriz em causa, a mesma eficiência de extração que o procedimento mencionado no método de análise.

2.   Procedimento de purificação

Vários métodos indicam um procedimento de purificação específico. Regra geral, podem ser usados procedimentos de purificação diferentes do indicado no método de análise, desde que o procedimento usado tenha dado provas de que proporciona, para a matriz em causa, resultados analíticos equivalentes aos do procedimento mencionado no método de análise.

3.   Número de determinações

No caso de análise de substâncias indesejáveis, se o resultado da primeira determinação for significativamente (> 50 %) inferior à especificação a controlar, não são necessárias determinações adicionais, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados. Nos outros casos, é necessário um ensaio em duplicado (segunda determinação) para se excluir a possibilidade de contaminação cruzada interna ou de uma troca acidental de amostras. A média das duas determinações é utilizada para a avaliação adicional.

Em caso de controlo dos teores mínimo e máximo de aditivos para a alimentação animal, se os resultados da primeira determinação forem superiores ao teor mínimo ou inferiores ao teor máximo, não são necessárias determinações adicionais, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados. Nos outros casos, é necessário um ensaio em duplicado (segunda determinação) para se excluir a possibilidade de contaminação cruzada interna ou de uma troca acidental de amostras. A média das duas determinações é utilizada para a avaliação adicional.

Nos casos em que o controlo incide sobre o teor declarado de uma substância ou ingrediente, se o resultado da primeira determinação confirmar o teor declarado, ou seja, se o resultado analítico se situar dentro da gama de variação aceitável desse teor, não são necessárias mais determinações, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados. Nos outros casos, é necessário um ensaio em duplicado (segunda determinação) para se excluir a possibilidade de contaminação cruzada interna ou de uma troca acidental de amostras. A média das duas determinações é utilizada para a avaliação adicional (a média do resultado analítico situa-se ou não dentro da gama de variação aceitável do teor declarado).

Em certos casos, a gama de variação aceitável encontra-se estabelecida na legislação, nomeadamente no Regulamento (CE) n.o 767/2009 e no Regulamento (UE) 2019/4 do Parlamento Europeu e do Conselho (1).

4.   Notificação do método de análise utilizado

O relatório de análise deve mencionar o método de análise utilizado.

5.   Notificação do resultado analítico

O resultado analítico, que deve ser expresso em conformidade com as indicações dadas no método de análise e conter o devido número de algarismos significativos, pode, caso necessário, ser corrigido em função do teor de humidade apresentado pela amostra final antes da sua preparação para análise.

A maioria dos teores regulamentares (nomeadamente os teores máximo e mínimo) na legislação da UE no domínio da alimentação animal são estabelecidos em relação a alimentos para animais com um teor de humidade de 12 %. Por conseguinte, nestes casos, a fim de avaliar o resultado analítico medido na amostra em relação ao teor regulamentar, é necessário que o resultado analítico seja primeiro dividido pelo teor de matéria seca da amostra (em %) multiplicado por 88, tal como indicado na fórmula seguinte:

em que:

Mc	:	teor de humidade da amostra (em %). Por conseguinte, 100 – Mc representa o teor de matéria seca da amostra (em %).
Rana	:	resultado analítico medido na amostra.
R12 %	:	resultado para um alimento para animais com um teor de humidade de 12 %; a avaliar em relação ao teor regulamentar.

Além disso, se as seguintes condições forem preenchidas:

—	o resultado da análise é significativamente (> 50 %) inferior ou superior à informação constante do rótulo ou à especificação a controlar (dependendo se a informação constante do rótulo ou a especificação corresponde a um teor máximo ou mínimo),

—

o teor de humidade do alimento para animais amostrado é conhecido e pode ser determinado que a correção em função do teor de humidade não influenciará a avaliação, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados e se a análise se destinar exclusivamente a verificar a observância das disposições legislativas, a correção em função do teor de humidade pode ser omitida (p. ex., em casos em que não existe uma especificação ou um teor regulamentar), a menos que seja necessária para a interpretação do resultado.

Se o resultado analítico for corrigido em função do teor de humidade, a incerteza de medição correspondente tem de ser igualmente corrigida no mesmo procedimento.

No caso da determinação da cravagem do centeio e de impurezas botânicas prejudiciais por inspeção visual ou por microscopia, não é necessária a correção em função do teor de humidade.

6.   Incerteza de medição analítica e taxa de recuperação no caso da análise de substâncias indesejáveis

No que diz respeito às substâncias indesejáveis na aceção da Diretiva 2002/32/CE, um produto destinado à alimentação animal é considerado não conforme com o limite máximo fixado se se considerar que o resultado analítico expresso como a média de duas determinações independentes, em relação a um alimento com um teor de humidade de 12 %, ultrapassa o limite máximo tendo em conta a incerteza de medição analítica expandida utilizando um fator de expansão de 2, que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %, e a correção em função da recuperação. Isto significa que, para avaliar a conformidade, usa-se a concentração analisada, corrigida em função da recuperação, e subtrai-se a incerteza de medição analítica expandida. Este procedimento só é aplicável nos casos em que o método de análise permita estimar a incerteza de medição analítica expandida e a correção em função da recuperação (p. ex., não é necessário no caso de inspeção visual ou por microscopia).

Se o resultado analítico da amostra colhida para efeitos de recurso ultrapassar o teor máximo (sem ter em conta a incerteza de medição analítica expandida), tal confirma a não conformidade em relação à amostra de controlo, na ausência de normas nacionais específicas a este respeito.

O resultado analítico será apresentado do seguinte modo (na medida em que o método de análise utilizado permita estimar a incerteza de medição analítica expandida):

a)

Corrigido em função da recuperação, quando adequado e pertinente, facto que terá de ser declarado. A taxa de recuperação deve ser citada, a menos que a correção intrínseca de enviesamento faça parte do procedimento, em que o enviesamento corresponde à diferença entre o valor medido e a concentração de referência. Se a taxa de recuperação se situar entre 90 % e 110 % não é necessário efetuar a correção;

b)	Como «x +/- U», em que x é o resultado analítico e U é a incerteza de medição analítica expandida, utilizando um fator de expansão de 2 (2), que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %.

Todavia, se o resultado da análise for significativamente (> 50 %) inferior à especificação a controlar e se a análise se destinar exclusivamente a verificar a observância das disposições legislativas, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados, os valores da taxa de recuperação e da incerteza de medição analítica expandida podem ser omitidos (p. ex., em casos em que não existe uma especificação ou teor regulamentar), a menos que sejam necessários para a interpretação do resultado.

7.   Incerteza de medição analítica e taxa de recuperação no caso da análise do teor de aditivos para a alimentação animal

Para verificar a observância dos aditivos para a alimentação animal no que diz respeito aos teores mínimo e máximo autorizados, a presença de um aditivo para a alimentação animal é considerada não conforme com os teores mínimo e máximo fixados se o resultado analítico, expresso como a média de duas determinações independentes, em relação a um alimento para animais com um teor de humidade de 12 %:

—

ultrapassar o teor máximo, tendo em conta a incerteza de medição analítica expandida e a correção em função da recuperação. Isto significa que, para avaliar a conformidade, usa-se a concentração analisada (ou seja, a média das duas determinações), corrigida em função da recuperação, e subtrai-se a incerteza de medição analítica expandida,

—

for inferior ao teor mínimo, tendo em conta a incerteza de medição analítica expandida e a correção em função da recuperação. Isto significa que, para avaliar a conformidade, usa-se a concentração analisada (ou seja, a média das duas determinações), corrigida em função da recuperação, e soma-se a incerteza de medição analítica expandida.

Se o resultado analítico da amostra colhida para efeitos de recurso ultrapassar o teor máximo (sem ter em conta a incerteza de medição analítica expandida), tal confirma a não conformidade em relação à amostra de controlo, na ausência de normas nacionais específicas a este respeito.

O resultado analítico será apresentado do seguinte modo (na medida em que o método de análise utilizado permita estimar a incerteza de medição analítica expandida):

a)

Corrigido em função da recuperação, quando adequado e pertinente, facto que terá de ser declarado. A taxa de recuperação deve ser citada, a menos que a correção intrínseca de enviesamento faça parte do procedimento, em que o enviesamento corresponde à diferença entre o valor medido e a concentração de referência. Se a taxa de recuperação se situar entre 90 % e 110 % não é necessário efetuar a correção;

b)	Como «x +/- U», em que x é o resultado analítico (a média de duas determinações) e U é a incerteza de medição analítica expandida, utilizando um fator de expansão de 2 (3), que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %.

«ANEXO III

MÉTODOS DE ANÁLISE PARA O CONTROLO DA COMPOSIÇÃO DAS MATÉRIAS-PRIMAS PARA A ALIMENTAÇÃO ANIMAL E DOS ALIMENTOS COMPOSTOS PARA ANIMAIS

A.   DETERMINAÇÃO DA HUMIDADE

1.   Objeto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de humidade dos alimentos para animais. Se os alimentos contiverem substâncias voláteis, como por exemplo ácidos orgânicos, deve ter-se em conta que, a par do teor de humidade, também se mede um número significativo de substâncias voláteis.

O método não abrange a análise dos produtos lácteos enquanto matérias-primas para a alimentação animal e dos alimentos compostos para animais constituídos essencialmente de produtos lácteos, a análise das matérias gordas animais e vegetais nem a análise das sementes e frutos oleaginosos.

A determinação do teor de humidade nas sementes oleaginosas é efetuada utilizando o método previsto na norma EN ISO 665 – Sementes de oleaginosas - Determinação do teor de água e matérias voláteis, no pressuposto de que, antes da determinação do teor de humidade, as sementes de soja têm de ser moídas.

2.   Princípio

A amostra é dessecada em condições definidas que variam em função da natureza do alimento. A perda de massa é determinada por pesagem. É necessário proceder a uma pré-dessecação sempre que se trate de alimentos sólidos com um elevado teor de humidade.

3.   Equipamento

3.1.

Triturador construído num material que não absorva a humidade, fácil de limpar e que permita uma trituração rápida e uniforme sem provocar aquecimento sensível, que evite o mais possível o contacto com o ar exterior, e que satisfaça as exigências indicadas nos pontos 4.1.1 e 4.1.2 (p. ex., microtrituradores de martelos ou com arrefecimento por água, moinhos de cones desmontáveis, trituradores de movimento lento ou de discos dentados).

3.2.

Balança analítica com uma sensibilidade de 1 miligrama.

3.3.

Recipientes secos de metal inoxidável ou de vidro, munidos de uma tampa hermética; superfície útil que permita obter uma repartição da amostra de ensaio da ordem dos 0,3 g/cm2.

3.4.

Estufa isotérmica (± 2 °C) de aquecimento elétrico, com uma regulação rápida da temperatura e convenientemente ventilada (1).

3.5.

Estufa de vácuo, com aquecimento elétrico regulável, munida de uma bomba de óleo e quer de um dispositivo de introdução de ar quente seco, quer de um agente desidratante (p. ex., óxido de cálcio).

3.6.

Exsicador com placa de metal ou de porcelana espessa, perfurada, contendo um agente desidratante eficaz.

4.   Procedimento

N.B.:

As operações descritas nesta secção devem ser efetuadas imediatamente após a abertura das embalagens que contêm as amostras. As análises devem ser efetuadas pelo menos em duplicado.

4.1.   Preparação

4.1.1.   Alimentos com exceção dos mencionados nos pontos 4.1.2 e 4.1.3

Tomar pelo menos 50 g da amostra. Se for necessário, triturar ou dividir de maneira apropriada para evitar qualquer variação do teor de humidade (ver ponto 6).

4.1.2.   Cereais e sêmolas grossas

Tomar pelo menos 50 g da amostra. Moer em partículas, das quais pelo menos 50 % passem por uma peneira de malhas de 0,5 mm e não deixem mais de 10 % de resíduos sobre outro crivo de malhas redondas de 1 mm.

4.1.3.   Alimentos líquidos ou pastosos, alimentos constituídos essencialmente de matérias gordas

Tomar e pesar, com uma aproximação de 10 mg, cerca de 25 g da amostra, adicionar-lhe uma quantidade adequada de areia anidra, com uma aproximação de 10 mg, misturar até à obtenção de um produto homogéneo.

4.2.   Dessecação

Na estufa, secar um recipiente (ponto 3.3) com a tampa, a 103 °C, durante 30 minutos ± 1 minuto. Retirar da estufa e arrefecer até à temperatura ambiente, no exsicador (ponto 3.6).

4.2.1.   Alimentos com exceção dos mencionados nos pontos 4.2.2 e 4.2.3

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, o recipiente com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g da amostra repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa previamente aquecida a 103 °C. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possível, para evitar que a temperatura da estufa desça demasiado. Deixar secar durante quatro horas, a partir do momento em que a estufa tiver atingido de novo a temperatura de 103 °C. Abrir a estufa, colocar imediatamente a tampa no recipiente, retirá-lo da estufa, deixar arrefecer 30 a 45 minutos no exsicador (ponto 3.6) e pesar com uma aproximação de 1 mg.

No caso de alimentos constituídos essencialmente de matérias gordas (> 50 %), efetuar uma dessecação suplementar de 30 minutos na estufa a 103 °C. A diferença entre as duas pesagens não deve exceder o valor correspondente a 0,1 % de humidade.

4.2.2.   Cereais, farinhas, sêmolas grossas e finas

Pesar, com uma aproximação de 0,5 mg, o recipiente com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g da amostra triturada, repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa previamente aquecida a 130 °C. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possível, para evitar que a temperatura da estufa desça demasiado. Deixar secar durante duas horas, a partir do momento em que a estufa tiver atingido de novo a temperatura de 130 °C. Abrir a estufa, colocar imediatamente a tampa no recipiente, retirá-lo da estufa, deixar arrefecer 30 a 45 minutos no exsicador (ponto 3.6) e pesar com uma aproximação de 1 mg.

4.2.3.   Alimentos compostos contendo mais de 4 % de sacarose ou de lactose: matérias-primas para a alimentação animal tais como alfarroba, produtos cereais hidrolisados, germes de malte, rodelas de beterraba, solúveis de peixe e açúcares;

Pesar, com uma aproximação de 0,5 mg, o recipiente com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g da amostra, repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa de vácuo (ponto 3.5) previamente aquecida a uma temperatura entre 80 °C e 85 °C. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possível, para evitar que a temperatura da estufa desça demasiado.

Elevar a pressão a 100 Torr e deixar secar a esta pressão durante quatro horas, quer sob uma corrente de ar seco e quente, quer por meio de um agente desidratante (cerca de 300 g para 20 amostras). Neste último caso, desligar a bomba de vácuo quando a pressão indicada tiver sido atingida. Contar o tempo de secagem a partir do momento em que a estufa tiver atingido de novo a temperatura de 80 °C a 85 °C. Reduzir cuidadosamente a pressão no interior da estufa até à pressão atmosférica. Abrir a estufa, tapar imediatamente o recipiente, retirá-lo da estufa, deixar arrefecer durante 30 a 45 minutos no exsicador (ponto 3.6) e pesar com uma aproximação de 1 mg. Proceder a uma dessecação complementar de 30 minutos na estufa de vácuo a uma temperatura entre 80 °C e 85 °C e pesar novamente. A diferença entre as duas pesagens não deve exceder o valor correspondente a 0,1 % de humidade.

4.3.   Pré-dessecação (parcial)

Os alimentos «húmidos», com uma fração mássica inferior a 85 % de matéria seca (p. ex., forragens, rações completas, alimentos para animais não líquidos), têm de ser parcialmente dessecados antes de serem moídos finamente, a fim de analisar as suas substâncias estáveis; a dessecação parcial não é possível para a determinação de substâncias instáveis.

A dessecação parcial pode ser efetuada utilizando uma estufa com ventilação forçada ou um forno de micro-ondas ou por liofilização. Exceto no caso de dessecação parcial por liofilização, o objetivo é secar o alimento para animais a uma temperatura estável inferior a 60 °C, a fim de que a composição química sofra apenas alterações mínimas. A dessecação a temperaturas superiores a 60 °C conduz a alterações na composição química do alimento (nomeadamente degradação proteica). O alimento dessecado é estabilizado durante cerca de 15 minutos à temperatura ambiente, antes de se proceder à medição da matéria seca parcial, de modo a minimizar a potencial alteração no teor de humidade durante o processo de moagem e armazenamento. A dessecação a temperaturas inferiores a 60 °C não retira toda a água do alimento para animais; por conseguinte, a matéria seca total do alimento não é obtida após uma pré-dessecação parcial. Após a dessecação, a subamostra é moída e analisada para determinação da matéria seca (final) da amostra parcialmente seca (o teor de humidade restante de 3 % a 15 %) quando os outros constituintes químicos são determinados.

Por conseguinte, recomenda-se um procedimento em duas etapas para a determinação da matéria seca. Primeiro, determinar o teor parcial de matéria seca (se inferior a 85 % de matéria seca), em seguida, determinar o restante teor de matéria seca numa amostra de ensaio moída e calcular o teor total de matéria seca multiplicando o valor de matéria seca parcial pelo valor de matéria seca restante.

5.   Cálculo dos resultados

O teor de humidade (X), em percentagem da amostra, é dado pelas seguintes fórmulas:

5.1.   Dessecação sem pré-dessecação

em que:

m	=	massa inicial, em gramas, da amostra de ensaio,
m0	=	massa, em gramas, da amostra de ensaio seca.

5.2.   Dessecação com pré-dessecação (2)

em que:

m	=	massa inicial, em gramas, da amostra de ensaio,
m1	=	massa, em gramas, da amostra de ensaio, depois da pré-dessecação,
m2	=	massa, em gramas, da amostra de ensaio depois da trituração ou moagem,
m0	=	massa, em gramas, da amostra de ensaio seca.

5.3.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efetuadas com a mesma amostra não deve exceder 0,2 % do valor absoluto da humidade, exceto no caso de alimentos húmidos para animais de companhia e produtos de roer para cães, em que a diferença não deve exceder 0,5 % do valor absoluto da humidade.

6.   Observação

Se for necessária uma trituração e dela resultar uma variação do teor de humidade do produto, os resultados da análise que dizem respeito aos componentes do alimento devem ser corrigidos de acordo com o teor de humidade da amostra inicial.

B.   DETERMINAÇÃO DA HUMIDADE NAS MATÉRIAS GORDAS ANIMAIS E VEGETAIS

1.   Objeto e âmbito de aplicação

O método permite determinar o teor em humidade (água e outras matérias voláteis) das matérias gordas animais e vegetais.

2.   Princípio

A amostra é seca a 103 °C até massa constante (a perda de massa entre duas pesagens sucessivas deve ser igual ou inferior a 1 mg). A perda de massa é determinada por pesagem.

3.   Equipamento

3.1.

Cápsula de fundo plano, em material resistente à corrosão, diâmetro: 8 a 9 cm, altura: cerca de 3 cm.

3.2.

Termómetro com globo reforçado e câmara de dilatação na extremidade superior, graduado de cerca de 80 °C a pelo menos 110 °C, comprimento: cerca de 10 cm.

3.3.

Banho de areia ou placa de aquecimento elétrica.

3.4.

Exsicador, contendo um agente desidratante eficaz.

3.5.

Balança analítica.

4.   Procedimento

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 20 g da amostra homogeneizada na cápsula (ponto 3.1) seca e com tara calculada, contendo o termómetro (ponto 3.2). Aquecer em banho de areia ou placa de aquecimento (ponto 3.3), agitando constantemente com a ajuda do termómetro, de modo a que a temperatura atinja 90 °C em cerca de 7 minutos.

Reduzir a intensidade do aquecimento, atendendo à frequência com que as bolhas sobem do fundo do recipiente. A temperatura não pode ultrapassar 105 °C. Continuar a agitar, raspando o fundo da cápsula até que cesse a formação de bolhas.

A fim de assegurar a eliminação total da humidade, repetir várias vezes o aquecimento a 103 °C ± 2 °C, arrefecendo até 93 °C entre os aquecimentos sucessivos. Em seguida deixar arrefecer no exsicador (ponto 3.4) até que atinja a temperatura ambiente e pesar. Repetir esta operação até que a perda de massa entre duas pesagens sucessivas deixe de exceder 2 mg.

N.B.:

Um aumento de massa da amostra após aquecimento repetido indica uma oxidação da gordura. Neste caso, calcular o resultado a partir da pesagem efetuada imediatamente antes do começo do aumento de massa.

5.   Cálculo dos resultados

O teor de humidade (X) em percentagem da amostra é dado pela fórmula:

em que:

m	=	massa, em gramas, da amostra de ensaio,
m1	=	massa, em gramas, da cápsula com o respetivo conteúdo, antes do aquecimento,
m2	=	massa, em gramas, da cápsula com o respetivo conteúdo, após aquecimento.

Os resultados inferiores a 0,05 % devem ser registados com a referência “inferior a 0,05 %”.

Repetibilidade

A diferença entre os resultados obtidos em duas determinações paralelas efetuadas com a mesma amostra não pode exceder 0,1 % em valor absoluto.

C.   DETERMINAÇÃO DO TEOR DE AZOTO E CÁLCULO DO TEOR DE PROTEÍNA BRUTA

1.   Objeto e âmbito de aplicação

O presente método permite determinar o teor de proteína bruta dos alimentos para animais com base no teor de azoto, determinado pelo método de Kjeldahl (3).

2.   Princípio

A amostra é mineralizada com ácido sulfúrico, na presença de um catalisador. A solução ácida é alcalinizada por adição de uma solução de hidróxido de sódio. O amoníaco é destilado e recolhido numa quantidade determinada de ácido sulfúrico, cujo excesso é titulado com uma solução-padrão de hidróxido de sódio.

Alternativamente, o amoníaco libertado é destilado numa solução de ácido bórico em excesso, seguido de titulação com uma solução de ácido clorídrico ou sulfúrico.

3.   Reagentes

3.1.

Sulfato de potássio.

3.2.

Catalisador: óxido de cobre (II), CuO, ou sulfato de cobre (II) penta-hidratado, CuSO4·5H2O.

3.3.

Zinco granulado.

3.4.

Ácido sulfúrico, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5.

Ácido sulfúrico, solução volumétrica padrão, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6.

Ácido sulfúrico, solução volumétrica padrão, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7.

Ácido sulfúrico, solução volumétrica padrão, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8.

Indicador vermelho de metilo: dissolver 300 mg de vermelho de metilo em 100 ml de etanol, σ = 95-96 % (v/v).

3.9.

Solução de hidróxido de sódio (pode utilizar-se uma solução de pureza técnica), β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10.

Hidróxido de sódio, solução volumétrica padrão, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11.

Hidróxido de sódio, solução volumétrica padrão, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12.

Pedra-pomes granulada, lavada em ácido clorídrico e inflamada.

3.13.

Acetanilida (p.f. = 114 °C, teor de N = 10,36 %).

3.14.

Sacarose (isenta de azoto).

3.15.

Ácido bórico (H3BO3).

3.16.

Solução de indicador vermelho de metilo: dissolver 100 mg de vermelho de metilo em 100 ml de etanol ou metanol.

3.17.

Solução de verde de bromocresol: dissolver 100 mg de verde de bromocresol em 100 ml de etanol ou metanol.

3.18.

Solução de ácido bórico (10 g/l a 40 g/l, em função do equipamento utilizado). Se se aplicar a deteção colorimétrica do ponto final, deve adicionar-se os indicadores vermelho de metilo e bromocresol às soluções de ácido bórico. Se se preparar 1 l de solução de ácido bórico, adicionam-se, antes de ajustar o volume, 7 ml de solução de indicador vermelho de metilo (ponto 3.16) e 10 ml de solução de verde de bromocresol (ponto 3.17). O pH das soluções de ácido bórico preparadas pode diferir em função da água usada. O pH da solução de ácido bórico tem de estar compreendido entre 4,3 e 4,7. Por vezes, é necessário efetuar um ajuste com um pequeno volume de uma solução alcalina a fim de obter um resultado positivo no ensaio em branco. Nota: Com a adição de cerca de 3 a 4 ml de NaOH (ponto 3.11) a 1 l de ácido bórico 10 g/l consegue-se normalmente um bom ajuste. A solução deve ser armazenada à temperatura ambiente e ao abrigo da luz e de fontes de vapores de amoníaco.

3.19.

Ácido clorídrico, solução volumétrica padrão, c(HCl) = 0,10 mol/l. Nota: Podem usar-se outras concentrações das soluções volumétricas (pontos 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11, e 3.19) desde que se efetue a respetiva correção no cálculo dos resultados. As concentrações devem sempre ser expressas com quatro casas decimais.

4.   Equipamento

Equipamento adequado para efetuar a mineralização, a destilação e a titulação pelo método de Kjeldahl.

5.   Procedimento

5.1.   Mineralização

Pesar, com uma aproximação de 0,001 g, 1 g de amostra e transferi-la para o recipiente do aparelho de mineralização. Adicionar 15 g de sulfato de potássio (ponto 3.1), uma quantidade adequada de catalisador (ponto 3.2) [0,3 a 0,4 g de óxido de cobre (II) ou 0,9 a 1,2 g de sulfato de cobre (II) penta-hidratado], 25 ml de ácido sulfúrico (ponto 3.4) e, se necessário, alguns grânulos de pedra-pomes (ponto 3.12), misturando.

Começar por aquecer moderadamente a mistura, agitando ocasionalmente se necessário, até à carbonização completa da massa e o desaparecimento da espuma. Aquecer seguidamente de um modo mais vigoroso até à ebulição; o aquecimento é adequado quando se observar a condensação do ácido nas paredes do recipiente. Evitar o sobreaquecimento lateral e a adesão de partículas orgânicas às paredes.

Quando a solução ficar límpida e assumir um tom verde-claro, continuar a ebulição durante mais duas horas, arrefecendo de seguida.

5.2.   Destilação

Adicionar cuidadosamente uma quantidade de água adequada para a dissolução completa dos sulfatos. Deixar arrefecer e adicionar, se necessário, alguns grânulos de zinco (ponto 3.3). Proceder de acordo com o disposto nos pontos 5.2.1 ou 5.2.2.

5.2.1.   Destilação com recolha em ácido sulfúrico

Colocar no balão de recolha do dispositivo de destilação 25 ml, rigorosamente medidos, de ácido sulfúrico (ponto 3.5) ou (ponto 3.7), em função do teor presumido de azoto. Adicionar algumas gotas de vermelho de metilo (ponto 3.8).

Adaptar o recipiente de mineralização ao refrigerante do dispositivo de destilação, imergindo a extremidade do refrigerante no líquido contido no balão de recolha, até uma profundidade mínima de 1 cm (ver observação no ponto 8.3). Juntar cuidadosamente 100 ml de solução de hidróxido de sódio (ponto 3.9) ao recipiente de mineralização, evitando perdas de amoníaco (ver observação no ponto 8.1). Aquecer o recipiente até à destilação completa do amoníaco.

5.2.2.   Destilação com recolha em ácido bórico

Sempre que a titulação do teor de amoníaco no destilado for realizada manualmente, aplica-se o procedimento mencionado a seguir. Se a unidade de destilação for totalmente automatizada e incluir a titulação do teor de amoníaco no destilado, seguir as instruções do fabricante.

Colocar um balão de recolha com 25 a 30 ml da solução de ácido bórico (ponto 3.18) sob a saída do refrigerante de forma que o tubo de saída se situe sob a superfície da solução de ácido bórico em excesso. Regular a unidade de destilação de forma a adicionar 50 ml da solução de hidróxido de sódio (ponto 3.9). Colocar a unidade de destilação em funcionamento de acordo com as instruções do fabricante e destilar o amoníaco libertado com a adição da solução de hidróxido de sódio. Recolher o destilado na solução de ácido bórico. A quantidade de destilado (duração da destilação por arrastamento de vapor) depende da quantidade de azoto na amostra. Seguir as instruções do fabricante.

Nota:

Numa unidade de destilação semiautomática, a adição de hidróxido de sódio em excesso e a destilação por arrastamento de vapor são realizadas automaticamente.

5.3.   Titulação

Proceder de acordo com o disposto nos pontos 5.3.1 ou 5.3.2.

5.3.1.   Ácido sulfúrico

Titular o excesso de ácido sulfúrico existente no balão de recolha com a solução de hidróxido de sódio (pontos 3.10 ou 3.11), em função da concentração de ácido sulfúrico utilizada, até atingir o ponto final.

5.3.2.   Ácido bórico

Com o auxílio de uma bureta, titular o conteúdo do balão de recolha com a solução volumétrica padrão de ácido clorídrico (ponto 3.19) ou com a solução volumétrica padrão de ácido sulfúrico (ponto 3.6) e registar o volume de solução titulante usada.

Se se aplicar a deteção colorimétrica do ponto final, este é atingido assim que a solução começa a adquirir uma cor rosa. A leitura da bureta é feita com uma aproximação de 0,05 ml. A visualização do ponto final pode ser facilitada pelo uso de uma placa de agitação magnética dotada de iluminação ou de um detetor fotométrico.

Esta operação pode ser feita automaticamente se se usar um dispositivo de destilação por arrastamento de vapor com titulação automática.

Para o funcionamento do destilador ou destilador/titulador, seguir as instruções do fabricante.

Nota:

Quando se usa um sistema de titulação automática, a titulação começa assim que se dá início à destilação e usa-se a solução de ácido bórico a 1 % (ponto 3.18).

Se se recorrer a uma unidade de destilação totalmente automatizada, a titulação do amoníaco também se pode fazer com a deteção do ponto final através de um sistema potenciométrico de medição do pH.

Neste caso, usa-se um titulador automático com um medidor de pH. O medidor de pH deve estar devidamente calibrado no intervalo de pH 4 a 7, segundo procedimentos laboratoriais normais.

O ponto final da titulação é atingido a um pH de 4,6, correspondente ao ponto de inflexão da curva de titulação (ponto de maior declive).

5.4.   Ensaio em branco

Com vista a confirmar a ausência de azoto nos reagentes, efetuar um ensaio em branco (mineralização, destilação e titulação) utilizando 1 g de sacarose (ponto 3.14) em vez da amostra.

6.   Cálculo dos resultados

Os cálculos efetuam-se em conformidade com os pontos 6.1 ou 6.2.

6.1.   Cálculo para a titulação em conformidade com o ponto 5.3.1

O teor de proteína bruta, expresso em percentagem ponderal, é dado pela fórmula seguinte:

em que:

V0	=	volume, em ml, de NaOH (pontos 3.10 ou 3.11) utilizado no ensaio em branco,
V1	=	volume, em ml, de NaOH (pontos 3.10 ou 3.11) utilizado na titulação da amostra,
c	=	concentração, em mol/l, da solução de hidróxido de sódio (pontos 3.10 ou 3.11),
m	=	massa (g) da amostra.

6.2.   Cálculo para a titulação em conformidade com o ponto 5.3.2

6.2.1.   Titulação com ácido clorídrico

O teor de proteína bruta, expresso em percentagem ponderal, é dado pela fórmula seguinte:

em que:

m	=	massa (g) da toma de ensaio,
c	=	concentração, em mol/l, da solução volumétrica padrão de ácido clorídrico (3.19),
V0	=	volume, em ml, de ácido clorídrico utilizado no ensaio em branco,
V1	=	volume, em ml, de ácido clorídrico utilizado na toma de ensaio.

6.2.2.   Titulação com ácido sulfúrico

O teor de proteína bruta, expresso em percentagem ponderal, é dado pela fórmula seguinte:

em que:

m	=	massa (g) da toma de ensaio,
c	=	concentração, em mol/l, da solução volumétrica padrão de ácido sulfúrico (3.6),
V0	=	volume, em ml, de ácido sulfúrico (3.6) utilizado no ensaio em branco,
V1	=	volume, em ml, de ácido sulfúrico (3.6) utilizado na toma de ensaio.

7.   Verificação do método

7.1.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efetuadas com a mesma amostra não deve exceder:

—	0,4 %, em valor absoluto, para teores de proteína bruta inferiores a 20 %,

—	2,0 % do maior dos valores, para teores de proteína bruta compreendidos entre 20 % e 40 %,

—	0,8 %, em valor absoluto, para teores superiores a 40 %.

7.2.   Reprodutibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações efetuadas com a mesma amostra em laboratórios diferentes não deve exceder:

—	1,8 %, em valor absoluto, para teores de proteína bruta inferiores a 20 %,

—	9,0 % do maior dos valores, para teores de proteína bruta compreendidos entre 20 % e 40 %,

—	3,6 %, em valor absoluto, para teores superiores a 40 %.

7.3.   Exatidão

Efetuar a análise (mineralização, destilação e titulação) numa quantidade adequada de acetanilida (ponto 3.13) (p. ex., 0,2 g a 0,3 g) na presença de 1 g de sacarose (ponto 3.14); 1 g de acetanilida deverá consumir 14,80 ml de ácido sulfúrico (ponto 3.5). A taxa de recuperação deve ser de, pelo menos, 99 %.

8.   Observações

8.1.

O equipamento utilizado pode ser de tipo manual, semiautomático ou automático. Se for necessário efetuar uma operação de transferência entre os processos de mineralização e destilação, não deverão observar-se perdas. Se o recipiente do dispositivo de destilação não se encontrar munido de uma ampola de carga, adicionar o hidróxido de sódio imediatamente antes de adaptar o recipiente ao refrigerante, vertendo o líquido cuidadosamente ao longo das paredes.

8.2.

Se o resíduo da mineralização solidificar, recomeçar o processo, utilizando um volume de ácido sulfúrico (ponto 3.4) superior ao especificado no ponto 5.1.

8.3.

No caso de produtos com baixo teor de azoto, o volume de ácido sulfúrico (ponto 3.7) a adicionar ao balão de recolha pode ser reduzido, se necessário, para 10 ou 15 ml e diluído para 25 ml com água.

8.4.

Em análises de rotina, pode recorrer-se a métodos alternativos para a determinação da proteína bruta, mas o método Kjeldahl descrito na presente parte C é o método de referência. Deve demonstrar-se, para cada matriz individualmente, a equivalência dos resultados obtidos com o método alternativo (p. ex., DUMAS) em comparação com o método de referência. Dado que os resultados obtidos com métodos alternativos, mesmo depois de verificada a sua equivalência, podem apresentar um pequeno desvio em relação aos resultados derivados do método de referência, é necessário mencionar no relatório analítico o método de análise usado na determinação da proteína bruta.

D.   DETERMINAÇÃO DA UREIA

1.   Objeto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de ureia utilizada como aditivo em alimentos para ruminantes.

2.   Princípio

Suspende-se a amostra em água juntamente com um agente clarificante e filtra-se. Determina-se o teor de ureia do filtrado, após a adição de 4-dimetilaminobenzaldeído (4-DMAB), medindo a densidade ótica a um comprimento de onda de 420 nm.

3.   Reagentes

3.1.

Solução de 4-dimetilaminobenzaldeído: dissolver 1,6 g de 4-DMAB em 100 ml de etanol a 96 % e juntar 10 ml de ácido clorídrico (ρ20: 1,19 g/ml). O tempo de conservação máximo deste reagente é de duas semanas.

3.2.

Solução de Carrez I: dissolver, em água, 21,9 g de acetato de zinco, Zn(CH3COO)2·2H2O, e 3 g de ácido acético glacial. Perfazer o volume de 100 ml com água.

3.3.

Solução de Carrez II: dissolver em água 10,6 g de ferrocianeto de potássio, K4Fe(CN)6·3H2O. Perfazer o volume de 100 ml com água.

3.4.

Carvão ativado, não absorvente da ureia (a verificar).

3.5.

Solução de ureia a 0,1 % (m/v).

4.   Equipamento

4.1.

Misturador basculante: cerca de 35 a 40 rotações por minuto.

4.2.

Tubos de ensaio: 160 × 16 mm, com tampa esmerilada.

4.3.

Espetrofotómetro.

5.   Procedimento

5.1.   Análise da amostra

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 2 g de amostra, introduzi-la com 1 g de carvão ativado (ponto 3.4) num balão volumétrico de 500 ml. Juntar 400 ml de água e 5 ml de solução de Carrez I (ponto 3.2), misturar durante cerca de 30 segundos e juntar em seguida 5 ml de solução de Carrez II (ponto 3.3). Misturar durante 30 minutos no misturador. Completar o volume com água, agitar e filtrar.

Recolher 5 ml de filtrado límpido e incolor e transferi-los para os tubos de ensaio com tampa esmerilada, juntar 5 ml de solução de 4-DMAB (ponto 3.1) e misturar. Colocar os tubos em banho-maria a 20 °C (± 4 °C). Decorridos 15 minutos, medir a densidade ótica da solução de amostra, com o espetrofotómetro, a 420 nm. Comparar com a solução de reagentes feita no ensaio em branco.

5.2.   Curva de calibração

Recolher volumes de 1, 2, 4, 5 e 10 ml de solução de ureia (ponto 3.5), introduzi-los em balões volumétricos de 100 ml, completando os volumes com água. De cada um dos balões, retirar 5 ml de solução e juntar 5 ml de solução de 4-DMAB (ponto 3.1), homogeneizar e medir a densidade ótica, como referido, por comparação com uma solução de referência com 5 ml de 4-DMAB e 5 ml de água, isenta de ureia. Traçar a curva de calibração.

6.   Cálculo dos resultados

A partir da curva de calibração, determinar a quantidade de ureia na amostra.

Exprimir o resultado em mg de ureia por kg de amostra.

7.   Avaliação do método

7.1.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações efetuadas na mesma amostra, no mesmo laboratório e pelo mesmo analista, não deve exceder:

—	a 420 nm: — 50 % do maior dos valores, para teores de ureia compreendidos entre 3 000 mg/kg e 5 000 mg/kg, — 25 % do maior dos valores, para teores de ureia compreendidos entre 5 000 mg/kg e 7 000 mg/kg, — 20 % do maior dos valores, para teores de ureia iguais ou superiores a 7 000 mg/kg,

—	a 435 nm: — 40 % do maior dos valores, para teores de ureia compreendidos entre 3 000 mg/kg e 5 000 mg/kg, — 25 % do maior dos valores, para teores de ureia compreendidos entre 5 000 mg/kg e 9 000 mg/kg, — 5 % do maior dos valores, para teores de ureia iguais ou superiores a 9 000 mg/kg.

7.2.   Reprodutibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações efetuadas com a mesma amostra em laboratórios diferentes e/ou por analistas diferentes não deve exceder:

—	a 420 nm: — 3 000 mg/kg, em valor absoluto, para teores de ureia compreendidos entre 3 000 mg/kg e 12 000 mg/kg, — 4 500 mg/kg, em valor absoluto, para teores de ureia iguais ou superiores a 12 000 mg/kg.

—	a 435 nm: — 50 % do maior dos valores, para teores de ureia compreendidos entre 3 000 mg/kg e 8 000 mg/kg, — 25 % do maior dos valores, para teores de ureia iguais ou superiores a 8 000 mg/kg.

8.   Resultados de um estudo colaborativo

Foi organizado um exercício de comparação interlaboratorial na UE, no qual participaram 18 laboratórios. Foram analisadas cinco amostras positivas de alimentos compostos para ruminantes, designadas MAT nos quadros 1 e 2 (1 análise), em duplicados em ensaio cego, e foi analisada uma vez uma amostra em branco de um alimento composto para ruminantes.

Após a exclusão de valores anómalos, foram efetuados os cálculos para os limites de repetibilidade (r) e de reprodutibilidade (R), tal como definidos por orientações internacionais, utilizando a análise de variância dos valores válidos.

Os valores de desempenho analítico calculados (repetibilidade e reprodutibilidade) são apresentados nos quadros seguintes. De todas as amostras analisadas, incluindo o material em branco, não foram encontrados quaisquer falsos positivos ou falsos negativos.

Quadro 1

Características de desempenho analítico para a ureia medida a λ = 420 nm, em todas as matérias-primas

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Ovinos	Bovinos	Ovinos	Ovinos	Bovinos
Valor conhecido da fração mássica (mg/kg)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Valor médio da fração mássica (mg/kg)	4 241	6 993	7 830	9 962	12 071
Desvio-padrão da reprodutibilidade, sR (mg/kg)	1 141	1 303	985	994	1 711
Desvio-padrão da repetibilidade, sr (mg/kg)	723	601	549	712	737
Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade, RSDR (%)	27	19	13	10	14
Desvio-padrão relativo da repetibilidade, RSDr (%)	17	9	7	7	6
Limite de reprodutibilidade, R [R = 2,8 × sR ]	3 195	3 649	2 759	2 784	4 790
Limite de repetibilidade, r [r = 2,8 × sr ]	2 024	1 684	1 536	1 994	2 064

Quadro 2

Características de desempenho analítico para a ureia medida a λ = 435 nm, em todas as matérias-primas

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Ovinos	Bovinos	Ovinos	Ovinos	Bovinos
Valor conhecido da fração mássica (mg/kg)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Valor médio da fração mássica (mg/kg)	4 101	6 467	7 890	10 062	11 642
Desvio-padrão da reprodutibilidade, sR (mg/kg)	706	1 194	675	745	1 378
Desvio-padrão da repetibilidade, sr (mg/kg)	570	628	613	196	167
Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade, RSDR (%)	17	18	9	7	12
Desvio-padrão relativo da repetibilidade, RSDr (%)	14	10	8	2	1
Limite de reprodutibilidade, R [R = 2,8 × sR ]	1 977	3 344	1 889	2 087	3 859
Limite de repetibilidade, r [r = 2,8 × sr ]	1 596	1 759	1 715	549	467

9.   Observações

9.1.

Para teores de ureia superiores a 3 %, reduzir a amostra de ensaio para 1 g, ou diluir a solução inicial, para que o teor de ureia por cada 500 ml não seja superior a 50 mg.

9.2.

Para teores de ureia pouco elevados, aumentar o peso da amostra, sem deixar, no entanto, que a quantidade de amostra impeça o filtrado de ficar límpido e incolor.

9.3.

Os resultados acima referidos, obtidos em ensaios colaborativos, indicam que não existe uma diferença significativa na precisão no que diz respeito ao teor de ureia medido a 420 nm e a 435 nm.

E.   DETERMINAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS (COM EXCEÇÃO DO TRIPTOFANO)

Os métodos de análise a utilizar na determinação dos aminoácidos (com exceção do triptofano) são:

—	EN ISO 13903 – Animal feeding stuffs – Determination of amino acids content (Alimentos para animais – Determinação do teor de aminoácidos),

—	EN ISO 17180 –Animal feeding stuffs – Determination of lysine, methionine, and threonine in commercial amino acid products and premixtures  (4) (Alimentos para animais – Determinação de lisina, metionina e treonina em produtos comerciais à base de aminoácidos e em pré-misturas),

—	o método de análise a seguir descrito, nos pontos 1 a 10.

1.   Objeto e âmbito de aplicação

O presente método destina-se à determinação do teor de aminoácidos livres (naturais e de síntese) e aminoácidos totais (ligados e livres) em matérias-primas para a alimentação animal, alimentos compostos para animais e pré-misturas contendo menos de 10 % (5) de cada aminoácido, utilizando um analisador de aminoácidos. O método é aplicável à determinação dos seguintes aminoácidos: cistina/cisteína, metionina, lisina, treonina, alanina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, serina, tirosina e valina.

O método não permite distinguir as formas D e L nem os vários sais de aminoácidos. Não é aplicável para a determinação do triptofano nem de derivados hidroxilados de aminoácidos.

2.   Princípio

2.1.   Aminoácidos livres

Os aminoácidos livres são extraídos com ácido clorídrico diluído. As macromoléculas azotadas co-extraídas são precipitadas com ácido sulfossalicílico e removidas por filtração. O pH do filtrado é ajustado a 2,20. Os aminoácidos são separados por cromatografia de troca iónica e determinados fotometricamente a 570 nm, após reação com ninidrina.

2.2.   Aminoácidos totais

O procedimento a adotar depende dos aminoácidos a dosear. A cistina/cisteína e a metionina necessitam de oxidação a ácido cisteico e a metionina sulfona, respetivamente, antes da hidrólise. A tirosina é determinada nos hidrolisados de amostras não oxidadas. Todos os restantes aminoácidos referidos no ponto 1 (Objeto e âmbito de aplicação) podem ser determinados a partir de amostras oxidadas ou não oxidadas.

A oxidação é realizada a 0 °C, com uma mistura ácido perfórmico/fenol. O excesso de reagente de oxidação é decomposto com bissulfito de sódio. A amostra, oxidada ou não, é hidrolisada com ácido clorídrico (ponto 3.20) durante 23 horas. O pH do hidrolisado é ajustado a 2,20. Os aminoácidos são separados por cromatografia de troca iónica e determinados fotometricamente a 570 nm (440 nm no caso da prolina), após reação com ninidrina.

3.   Reagentes

Deve utilizar-se água bidestilada ou água de qualidade equivalente (condutividade inferior a 10 μS).

3.1.

Peróxido de hidrogénio, w (m/m) = 30 %.

3.2.

Ácido fórmico, w (m/m) = 98-100 %.

3.3.

Fenol.

3.4.

Bissulfito de sódio.

3.5.

Hidróxido de sódio.

3.6.

Ácido 5-sulfossalicílico di-hidratado.

3.7.

Ácido clorídrico (densidade aproximada 1,18 g/ml).

3.8.

Citrato trissódico di-hidratado.

3.9.

2,2’-Tiodietanol (tiodiglicol).

3.10.

Cloreto de sódio.

3.11.

Ninidrina.

3.12.

Éter de petróleo, intervalo de ebulição: 40 a 60 °C.

3.13.

Norleucina ou outro composto adequado, para ser usado como padrão interno.

3.14.

Azoto (teor de oxigénio inferior a 10 ppm).

3.15.

1-Octanol.

3.16.

Aminoácidos.

3.16.1.

Substâncias-padrão dos aminoácidos referidos no ponto 1 (Objeto e âmbito de aplicação). Os produtos devem ser puros e não conter água de cristalização. Secar sob vácuo, com P2O5 ou H2SO4, durante uma semana, antes de usar.

3.16.2.

Ácido cisteico.

3.16.3.

Metionina sulfona.

3.17.

Solução de hidróxido de sódio, c = 7,5 mol/l: Dissolver 300 g de NaOH (ponto 3.5) em água, e perfazer o volume de 1 litro.

3.18.

Solução de hidróxido de sódio, c = 1 mol/l: Dissolver 40 g de NaOH (ponto 3.5) em água, e perfazer o volume de 1 litro.

3.19.

Solução de ácido fórmico/fenol: Misturar 889 g de ácido fórmico (ponto 3.2) com 111 g de água e adicionar 4,73 g de fenol (ponto 3.3).

3.20.

Mistura de hidrólise, c = 6 mol/l de HCl contendo 1 g de fenol/l: Adicionar 1 g de fenol (ponto 3.3) a 492 ml de HCl (ponto 3.7) e perfazer o volume de 1 litro com água.

3.21.

Mistura de extração, c = 0,1 mol/l de HCl contendo 2 % de tiodiglicol: Diluir 8,2 ml de HCl (ponto 3.7) em cerca de 900 ml de água, adicionar 20 ml de tiodiglicol (ponto 3.9) e perfazer o volume de 1 litro com água (não misturar diretamente os reagentes dos pontos 3.7 e 3.9).

3.22.

Ácido 5-sulfossalicílico, ß = 6 %: Dissolver 60 g de ácido 5-sulfossalicílico (ponto 3.6) em água e perfazer o volume de 1 litro.

3.23.

Mistura oxidante (ácido perfórmico/fenol): Misturar, num pequeno copo, 0,5 ml de peróxido de hidrogénio (ponto 3.1) com 4,5 ml de solução de ácido fórmico/fenol (ponto 3.19). Incubar a 20-30 °C durante uma hora, de modo a obter ácido perfórmico. Arrefecer num banho de gelo (15 minutos) e adicionar à amostra. Cuidado: evitar o contacto com a pele e utilizar vestuário de proteção.

3.24.

Tampão citrato, c = 0,2 mol Na+/l, pH = 2,20: Dissolver 19,61 g de citrato de sódio (ponto 3.8), 5 ml de tiodiglicol (ponto 3.9), 1 g de fenol (ponto 3.3) e 16,50 ml de HCl (ponto 3.7) em cerca de 800 ml de água. Ajustar o pH a 2,20. Perfazer o volume de 1 litro com água.

3.25.

Tampões de eluição, preparados em função do analisador utilizado (ponto 4.9).

3.26.

Reagente de ninidrina, preparado em função do analisador utilizado (ponto 4.9).

3.27.

Soluções-padrão de aminoácidos. Estas soluções devem ser armazenadas a uma temperatura inferior a 5 °C.

3.27.1.

Solução-mãe padrão de aminoácidos (ponto 3.16.1). c = 2,5 μmol/ml de cada aminoácido em ácido clorídrico. Disponíveis no comércio.

3.27.2.

Solução-mãe padrão de ácido cisteico e metionina sulfona, c = 1,25 μmol/ml. Dissolver, num balão volumétrico de 1 litro, 0,2115 g de ácido cisteico (ponto 3.16.2) e 0,2265 g de metionina sulfona (ponto 3.16.3) em tampão citrato (ponto 3.24), completando o volume com o mesmo tampão. Armazenar a uma temperatura inferior a 5 °C, por um período não superior a 12 meses. Esta solução não é necessária no caso de a solução-mãe padrão (ponto 3.27.1) conter ácido cisteico e metionina sulfona.

3.27.3.

Solução-mãe de padrão interno, p. ex., norleucina, c = 20 μmol/ml. Dissolver, num balão volumétrico de 250 ml, 0,6560 g de norleucina (ponto 3.13) em tampão citrato (ponto 3.24), completando o volume com o mesmo tampão. Armazenar a uma temperatura inferior a 5 °C, por um período não superior a 6 meses.

3.27.4.

Solução de calibração de aminoácidos-padrão para uso com os hidrolisados, c = 5 nmol/50 μl de ácido cisteico e metionina sulfona e c = 10 nmol/50 μl dos restantes aminoácidos. Dissolver, num copo de 100 ml, 2,2 g de cloreto de sódio (ponto 3.10) em 30 ml de tampão citrato (ponto 3.24). Adicionar 4,00 ml de solução-mãe padrão de aminoácidos (ponto 3.27.1), 4,00 ml de solução-mãe padrão de ácido cisteico e metionina sulfona (ponto 3.27.2) e 0,50 ml de solução-mãe de padrão interno (ponto 3.27.3), se for caso disso. Ajustar o pH a 2,20 com a solução de hidróxido de sódio (ponto 3.18). Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 50 ml, completar o volume com tampão citrato (ponto 3.24) e homogeneizar. Armazenar a uma temperatura inferior a 5 °C, por um período não superior a 3 meses. Ver igualmente observações no ponto 9.1.

3.27.5.

Solução de calibração de aminoácidos-padrão para uso com os hidrolisados obtidos de acordo com o ponto 5.3.3.1, bem como com extratos (ponto 5.2). A solução de calibração é preparada em conformidade com o ponto 3.27.4, suprimindo o cloreto de sódio. Armazenar a uma temperatura inferior a 5 °C, por um período não superior a 3 meses.

4.   Equipamento

4.1.

Balão de fundo redondo de 100 ml ou 250 ml equipado com um condensador de refluxo.

4.2.

Frasco de vidro borossilicato de 100 ml munido de tampa de rosca com revestimento de borracha ou teflon (p. ex., Duran, Schott) para uso em estufa.

4.3.

Estufa munida de um sistema de ventilação e de um sistema de regulação de temperatura com exatidão superior a ± 2 °C.

4.4.

Medidor de pH (com leitura às milésimas).

4.5.

Filtro de membrana (porosidade 0,22 μm).

4.6.

Centrífuga.

4.7.

Evaporador rotativo de vácuo.

4.8.

Agitador mecânico ou magnético.

4.9.

Analisador de aminoácidos ou aparelho de HPLC munido de uma coluna de troca iónica, derivatização pós-coluna com ninidrina e detetor fotométrico. O enchimento da coluna é de resinas de poliestireno sulfonado que permitem separar os aminoácidos entre si, bem como de outros produtos com reação positiva à ninidrina. A estabilidade do fluxo das bombas que controlam o caudal do tampão de eluição e do reagente de ninidrina deve ser de cerca de ± 0,5 %, quer durante o ensaio de calibração, quer durante a execução da análise. Em alguns analisadores de aminoácidos, é possível utilizar procedimentos de hidrólise cujos hidrolisados contenham uma concentração de sódio superior a 0,8 mol/l, bem como a totalidade do ácido fórmico residual do processo de oxidação. Noutros analisadores, a separação de determinados aminoácidos não é satisfatória caso os produtos de hidrólise contenham um excesso de ácido fórmico e/ou uma concentração elevada de ião sódio. Nestes casos, o volume de ácido é reduzido, por evaporação, a cerca de 5 ml, após a hidrólise e antes do ajuste do pH. A evaporação deve ser realizada sob vácuo, a uma temperatura não superior a 40 °C.

5.   Procedimento

5.1.   Preparação da amostra

A amostra é moída a uma granulometria inferior a 0,5 mm. As amostras com elevado teor de humidade devem ser secas ao ar, a uma temperatura não superior a 50 °C, ou liofilizadas, antes da moagem. Se o seu teor de matérias gordas for elevado, as amostras terão de ser submetidas a uma extração com éter de petróleo (ponto 3.12) antes da moagem.

5.2.   Determinação dos aminoácidos livres

Pesar num balão de Erlenmeyer, com uma aproximação de 0,2 mg, uma quantidade adequada (1-5 g) de amostra preparada de acordo com o ponto 5.1 e adicionar 100,0 ml de mistura de extração (ponto 3.21). Agitar durante 60 minutos em agitador mecânico ou magnético (ponto 4.8). Deixar sedimentar e pipetar 10,0 ml de solução sobrenadante para um copo de 100 ml.

Adicionar, sob agitação, 5,0 ml de solução de ácido sulfossalicílico (ponto 3.22), mantendo a agitação durante 5 minutos. Filtrar ou centrifugar o sobrenadante, de modo a remover qualquer precipitado. Colocar 10,0 ml da solução resultante num copo de 100 ml e ajustar o pH a 2,20 com solução de hidróxido de sódio (ponto 3.18), transferir para um balão volumétrico de volume adequado utilizando tampão citrato (ponto 3.24) e completar até à marca com a solução-tampão (ponto 3.24).

Caso se utilize um padrão interno, adicionar 1,00 ml (ponto 3.27.3) por cada 100 ml de solução final, antes de completar até à marca com tampão (ponto 3.24).

Efetuar a análise cromatográfica de acordo com o ponto 5.4.

Se os extratos não forem sujeitos a cromatografia no mesmo dia, devem ser armazenados a uma temperatura inferior a 5 °C.

5.3.   Determinação dos aminoácidos totais

5.3.1.   Oxidação

Pesar, com uma aproximação de 0,2 mg, entre 0,1 e 1 g de amostra preparada (ponto 5.1):

—	num balão de fundo redondo de 100 ml (ponto 4.1), no caso de hidrólise em sistema aberto (ponto 5.3.2.3), ou

—	num balão de fundo redondo de 250 ml (ponto 4.1), caso seja necessário um teor de sódio reduzido (ponto 5.3.3.1), ou

—	num frasco de 100 ml munido de tampa de rosca (ponto 4.2), no caso de hidrólise em sistema fechado (ponto 5.3.2.4).

A toma de amostra para ensaio deve ter um teor aproximado de azoto de 10 mg e um teor de humidade não superior a 100 mg.

Colocar o balão ou o frasco num banho de gelo, arrefecer até 0 °C, adicionar 5 ml de mistura oxidante (ponto 3.23) e misturar com uma vareta de vidro de ponta recurva. Selar o balão ou o frasco contendo a vareta com película impermeável ao ar, e colocar o conjunto constituído pelo recipiente selado e o banho de gelo no frigorífico, a 0 °C, durante 16 horas. Após este período, retirar do frigorífico e decompor o excesso de oxidante por adição de 0,84 g de bissulfito de sódio (ponto 3.4).

Continuar de acordo com o descrito no ponto 5.3.2.1.

5.3.2.   Hidrólise

5.3.2.1.

Hidrólise de amostras oxidadas À amostra oxidada como descrito no ponto 5.3.1, adicionar 25 ml de mistura de hidrólise (ponto 3.20) tendo o cuidado de arrastar quaisquer resíduos de amostra das paredes do recipiente e da vareta. Proceder em conformidade com o ponto 5.3.2.3 ou 5.3.2.4, em função do tipo de hidrólise.

5.3.2.2.

Hidrólise de amostras não oxidadas Pesar num balão de fundo redondo de 100 ml ou 250 ml (ponto 4.1) ou num frasco de 100 ml munido de tampa de rosca (ponto 4.2), com uma aproximação de 0,2 mg, 0,1 a 1 g de amostra preparada (ponto 5.1). A porção de ensaio pesada deve ter um teor aproximado de azoto de 10 mg. Adicionar cuidadosamente 25 ml da mistura de hidrólise (ponto 3.20) e misturar. Proceder de acordo com o descrito no ponto 5.3.2.3 ou 5.3.2.4.

5.3.2.3.

Hidrólise em sistema aberto Juntar 3 pérolas de vidro como reguladores de ebulição à mistura preparada de acordo com o ponto 5.3.2.1 ou 5.3.2.2 e manter em ebulição contínua, sob refluxo, durante 23 horas. Após a hidrólise, lavar o condensador pelo topo, com 5 ml de tampão citrato (ponto 3.24). Desmontar o conjunto e arrefecer o balão num banho de gelo. Proceder de acordo com o ponto 5.3.3.

5.3.2.4.

Hidrólise em sistema fechado Colocar o frasco que contém a mistura preparada de acordo com o ponto 5.3.2.1 ou 5.3.2.2 numa estufa (ponto 4.3) a 110 °C. Durante a primeira hora, de modo a evitar um aumento da pressão (devido aos gases libertados) e para evitar uma explosão, colocar a tampa de rosca no topo do frasco sem, contudo, o vedar. Decorrida uma hora, vedar o frasco com a tampa e manter em estufa (ponto 4.3) durante 23 horas. Após a hidrólise, remover o frasco da estufa, abri-lo cuidadosamente e colocá-lo num banho de gelo, até arrefecer. Com o auxílio de tampão citrato (ponto 3.24), transferir quantitativamente o conteúdo do frasco para um copo ou um balão de fundo redondo de 250 ml, em função do procedimento de ajuste do pH a utilizar (ponto 5.3.3). Proceder de acordo com o ponto 5.3.3.

5.3.3.   Ajuste do pH

Para o ajuste do pH, proceder de acordo com o ponto 5.3.3.1 ou 5.3.3.2, em função da tolerância do analisador de aminoácidos (ponto 4.9) ao sódio.

5.3.3.1.

Sistemas cromatográficos (ponto 4.9) que necessitem de um teor reduzido de sódio É aconselhável utilizar uma solução-mãe de padrão interno (ponto 3.27.3), no caso de analisadores de aminoácidos que necessitem de um teor reduzido de sódio (uma vez que o volume de ácido deve ser reduzido). Neste caso, adicionar 2,00 ml de solução-mãe de padrão interno (ponto 3.27.3) ao hidrolisado, antes da evaporação. Adicionar 2 gotas de 1-octanol (ponto 3.15) ao hidrolisado obtido de acordo com os pontos 5.3.2.3 ou 5.3.2.4. Em evaporador rotativo (ponto 4.7), reduzir o volume a 5-10 ml, sob vácuo, a 40 °C. Se, acidentalmente, o volume for reduzido a menos de 5 ml, o produto deve ser rejeitado e a análise recomeçada. Ajustar o pH a 2,20 com solução de hidróxido de sódio (ponto 3.18), e proceder de acordo com o referido no ponto 5.3.4.

5.3.3.2.

Restantes analisadores de aminoácidos (ponto 4.9) Neutralizar parcialmente o hidrolisado obtido de acordo com o ponto 5.3.2.3 ou 5.3.2.4 mediante a adição cuidadosa, sob agitação, de 17 ml de solução de hidróxido de sódio (ponto 3.17), mantendo a temperatura inferior a 40 °C. Ajustar o pH a 2,20, à temperatura ambiente, com as soluções de hidróxido de sódio (ponto 3.17) e (ponto 3.18). Proceder de acordo com o ponto 5.3.4.

5.3.4.   Solução de amostra para cromatografia

Com o auxílio de tampão citrato (ponto 3.24), transferir quantitativamente o produto de hidrólise com o pH ajustado (ponto 5.3.3.1 ou 5.3.3.2) para um balão volumétrico de 200 ml, completando até à marca com o mesmo tampão (ponto 3.24).

No caso de não se ter adicionado ainda um padrão interno, juntar 2,00 ml da solução-mãe de padrão interno (3.27.3) e completar até à marca com tampão citrato (ponto 3.24). Homogeneizar.

Efetuar a análise cromatográfica de acordo com o ponto 5.4.

Se as soluções de amostra não forem analisadas no mesmo dia, devem ser conservadas a uma temperatura inferior a 5 °C.

5.4.   Cromatografia

Antes de iniciar a análise cromatográfica, deixar estabilizar o extrato (ponto 5.2) ou o produto de hidrólise (ponto 5.3.4) à temperatura ambiente. Agitar a mistura e filtrar uma quantidade adequada com um filtro de membrana de 0,22 μm (ponto 4.5). A solução límpida resultante é sujeita a cromatografia de troca iónica no analisador de aminoácidos (ponto 4.9).

A injeção pode ser manual ou automática. A quantidade de solução utilizada na análise dos padrões e das amostras deve ser constante, com uma aproximação de ± 0,5 %, exceto no caso de se utilizar um padrão interno, e a razão entre as concentrações de sódio e de aminoácidos na solução-padrão e na amostra deve ser tão próxima quanto possível.

Em geral, a frequência dos ensaios de calibração depende da estabilidade do reagente de ninidrina e do sistema analítico. O padrão ou a amostra são diluídos com tampão citrato (ponto 3.24), de modo que a área dos picos dos aminoácidos produzidos pelo padrão seja 30-200 % da área dos picos correspondentes dos aminoácidos da amostra.

A cromatografia dos aminoácidos varia ligeiramente em função do tipo de analisador e da resina utilizados. O sistema escolhido deve permitir a separação dos aminoácidos entre si, bem como dos restantes produtos com reação positiva à ninidrina. Além disso, o sistema deverá dar uma resposta linear à alteração das quantidades de aminoácidos injetadas, na gama das concentrações utilizadas.

Durante a cromatografia, as razões entre a altura do vale e a altura do pico referidas infra aplicam-se na análise de uma solução equimolar (dos aminoácidos a determinar). A solução equimolar de aminoácidos deve conter, pelo menos, 30 % da quantidade máxima de cada aminoácido que pode ser determinada com exatidão no analisador de aminoácidos (ponto 4.9).

Para a separação treonina-serina, se os respetivos picos estiverem parcialmente sobrepostos, a razão entre a altura do vale e a altura do menor dos dois picos sobrepostos no cromatograma não deve exceder 2:10 (caso se pretenda determinar apenas a cistina/cisteína, a metionina, a treonina e a lisina, a má resolução de dois picos adjacentes afeta a determinação). No que respeita aos restantes aminoácidos, a separação deve ser superior a 1:10.

O sistema deve assegurar a separação da lisina das substâncias afins e da ornitina.

6.   Cálculo dos resultados

Procede-se à determinação da área do pico correspondente a cada aminoácido presente na amostra e no padrão, sendo o respetivo teor (X), expresso em g por kg de amostra, calculado pela fórmula:

Caso tenha sido utilizado um padrão interno, multiplicar pelo fator:

A	=	área do pico do hidrolisado ou do extrato,
B	=	área do pico da solução-padrão de calibração,
C	=	área do pico do padrão interno, no hidrolisado ou no extrato,
D	=	área do pico do padrão interno, na solução-padrão de calibração,
M	=	massa molecular do aminoácido a determinar,
c	=	concentração da solução-padrão, em μmol/ml,
m	=	massa (g) da amostra (corrigida em caso de secagem ou desengorduramento),
V	=	volume do hidrolisado (ponto 5.3.4) ou volume de diluição total do extrato (ponto 6.1), em ml.

A cistina e a cisteína são determinadas na forma de ácido cisteico, no hidrolisado da amostra oxidada, sendo expressas em cistina (C6H12N2O4S2, M = 240,30 g/mol), considerando M = 120,15 g/mol (0,5 × 240,30 g/mol).

A metionina é determinada na forma de metionina sulfona, no hidrolisado da amostra oxidada, sendo expressa em metionina, considerando M = 149,21 g/mol.

A metionina livre adicionada é determinada na forma de metionina, após extração, utilizando o mesmo valor de massa molecular.

6.1.

O volume total de diluição dos extratos (F), para a determinação dos aminoácidos livres (5.2), é calculado do seguinte modo: V = volume do extrato final.

7.   Avaliação do método

O método foi testado num estudo internacional de comparação interlaboratorial realizado em 1990 com base em quatro tipos de alimentos para animais (alimento misto para suínos, alimento composto para frangos, concentrado proteico e pré-mistura).

Nota:

O método foi testado num segundo estudo internacional de comparação interlaboratorial em 2003, que utilizou pares de duplicados cegos de amostras de alimentos de acabamento para frangos, alimentos de arranque para frangos, milho, farinha de peixe e farinha de aves de capoeira. Para mais pormenores, consultar a norma EN ISO 13903.

Os resultados da comparação interlaboratorial de 1990, após eliminação dos valores anómalos, para a média e o desvio-padrão são apresentados nos quadros seguintes:

Médias, expressas em g/kg

Material de referência	Aminoácidos
	Treonina	Cistina/Cisteína	Metionina	Lisina
Alimento misto para suínos	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Alimento composto para frangos	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Concentrado proteico	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Pré-mistura	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = número de laboratórios participantes.

7.1.   Repetibilidade

Os valores relativos à repetibilidade, expressos em termos de “desvio-padrão intralaboratorial”, obtidos na comparação interlaboratorial do quadro anterior são apresentados nos quadros seguintes:

Coeficiente de variação, expresso em percentagem, da repetibilidade (CVr)

Material de referência	Aminoácidos
	Treonina	Cistina/Cisteína	Metionina	Lisina
Alimento misto para suínos	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Alimento composto para frangos	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Concentrado proteico	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Pré-mistura	2,2 n = 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = número de laboratórios participantes.

7.2.   Reprodutibilidade

Os valores do desvio-padrão interlaboratorial obtidos na comparação interlaboratorial acima mencionada são apresentados no quadro seguinte:

Coeficiente de variação, expresso em percentagem, da reprodutibilidade (CVR)

Material de referência	Aminoácidos
	Treonina	Cistina/Cisteína	Metionina	Lisina
Alimento misto para suínos	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Alimento composto para frangos	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Concentrado proteico	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Pré-mistura	4,3 n = 16	—	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = número de laboratórios participantes.

8.   Utilização de materiais de referência

Deve verificar-se a aplicação correta do método mediante a realização de ensaios em duplicado com materiais de referência certificados, quando disponíveis. Recomenda-se a calibração com soluções de calibração de aminoácidos certificadas.

9.   Observações

9.1.

Em virtude das diferenças entre os analisadores de aminoácidos, deve tomar-se como orientação a concentração final das soluções de calibração de aminoácidos-padrão (ver pontos 3.27.4 e 3.27.5) e do hidrolisado (ver ponto 5.3.4). A zona de resposta linear do aparelho deve ser verificada para todos os aminoácidos. A solução-padrão é diluída com tampão citrato de modo que os picos surjam no meio dessa zona.

9.2.

Quando se utilizar um aparelho de cromatografia líquida de alta resolução para análise dos hidrolisados, as condições experimentais devem ser otimizadas de acordo com as recomendações do fabricante.

9.3.

A aplicação do método a alimentos compostos para animais ou pré-misturas com mais de 1 % de cloretos (concentrados, minerais, alimentos complementares para animais) pode originar uma subestimação da metionina, sendo por isso necessário um tratamento especial.

10.   Critérios de desempenho

A compilação dos resultados (exceto para a tirosina) dos dois estudos colaborativos (de 1990, apresentado acima no ponto 7, e de 2005, apresentado na norma EN ISO 13903) define os critérios seguintes para a repetibilidade e a reprodutibilidade. Os valores decorrentes desses dois ensaios interlaboratoriais podem não ser aplicáveis a gamas de concentração e matrizes diferentes das indicadas.

10.1.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações efetuadas na mesma amostra, no mesmo laboratório e pelo mesmo analista, não deve exceder:

—	6 % do maior dos valores, para aminoácidos totais no caso da glicina, da alanina, da lisina, da prolina, do ácido glutâmico, da isoleucina e da histidina,

—	8 % do maior dos valores, para aminoácidos totais no caso da treonina, da fenilalanina, da metionina, do ácido aspártico e da leucina,

—	10 % do maior dos valores, para aminoácidos totais no caso da arginina e da valina,

—	12 % do maior dos valores, para o aminoácido total serina,

—	15 % do maior dos valores, para o aminoácido total cistina/cisteína.

10.2.   Reprodutibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações efetuadas com a mesma amostra em laboratórios diferentes e/ou por analistas diferentes não deve exceder:

—	15 % do maior dos valores, para aminoácidos totais no caso da glicina, da alanina e da treonina,

—	20 % do maior dos valores, para aminoácidos totais no caso da lisina, da prolina, da fenilalanina, da metionina e do ácido aspártico,

—	22 % do maior dos valores, para aminoácidos totais no caso do ácido glutâmico e da leucina,

—	27 % do maior dos valores, para o aminoácido total arginina,

—	32 % do maior dos valores, para o aminoácido total isoleucina,

—	35 % do maior dos valores, para aminoácidos totais no caso da valina e da serina,

—	40 % do maior dos valores, para o aminoácido total histidina,

—	50 % do maior dos valores, para o aminoácido total cistina/cisteína.

F.   DETERMINAÇÃO DO TRIPTOFANO

Os métodos de análise a utilizar na determinação do triptofano são:

—	EN ISO 13904 – Animal feeding stuffs – Determination of tryptophan content (Alimentos para animais – Determinação do teor de triptofano)

—	o método de análise a seguir descrito, nos pontos 1 a 9

1.   Objeto e âmbito de aplicação

O método permite determinar o triptofano livre e total em alimentos para animais. As formas D e L não são distinguidas.

2.   Princípio

Para a determinação do triptofano total, procede-se à hidrólise da amostra em condições alcalinas com uma solução saturada de hidróxido de bário que se aquece em seguida a 110 °C durante 20 horas. Depois de concluída a hidrólise, adiciona-se um padrão interno.

Para a determinação do triptofano livre, efetua-se uma extração da amostra em condições moderadamente ácidas na presença de um padrão interno.

O triptofano e o padrão interno no hidrolisado ou no extrato são determinados por HPLC com deteção por fluorescência.

3.   Reagentes

3.1.

Água bidestilada ou água de qualidade equivalente (condutividade inferior a 10 μS/cm).

3.2.

Substância-padrão: triptofano (grau de pureza/teor ≥ 99 %) seco sob vácuo na presença de pentóxido de fósforo.

3.3.

Padrão interno: α-metiltriptofano (grau de pureza/teor ≥ 99 %) seco sob vácuo na presença de pentóxido de fósforo.

3.4.

Hidróxido de bário octa-hidratado (tomar as devidas precauções para não expor excessivamente o Ba(OH)2·8H2O ao ar, para evitar a formação de BaCO3, que poderia perturbar a determinação) (ver observação no ponto 9.3).

3.5.

Hidróxido de sódio.

3.6.

Ácido ortofosfórico, w (m/m) = 85 %.

3.7.

Ácido clorídrico, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8.

Metanol de qualidade equivalente para HPLC.

3.9.

Éter de petróleo, intervalo de ebulição: 40 a 60 °C.

3.10.

Solução de hidróxido de sódio, c = 1 mol/l: Dissolver 40,0 g de NaOH (ponto 3.5) em água e completar o volume com água (ponto 3.1) até perfazer 1 litro.

3.11.

Ácido clorídrico, c = 6 mol/l: Misturar 492 ml de HCl (ponto 3.7) com água até perfazer 1 litro.

3.12.

Ácido clorídrico, c = 1 mol/l: Misturar 82 ml de HCl (ponto 3.7) com água até perfazer 1 litro.

3.13.

Ácido clorídrico, c = 0,1 mol/l: Misturar 8,2 ml de HCl (ponto 3.7) com água até perfazer 1 litro.

3.14.

Ácido ortofosfórico, c = 0,5 mol/l: Misturar 34 ml de ácido ortofosfórico (ponto 3.6) com água (ponto 3.1) até perfazer 1 litro.

3.15.

Solução concentrada de triptofano (ponto 3.2), c = 2,50 μmol/ml: Em balão volumétrico de 500 ml, dissolver 0,2553 g de triptofano (ponto 3.2) em ácido clorídrico (ponto 3.13) e completar o volume com o mesmo ácido (ponto 3.13) até ao traço. Conservar a -18 °C no máximo durante quatro semanas.

3.16.

Solução concentrada de padrão interno, c = 2,50 μmol/ml: Em balão volumétrico de 500 ml, dissolver 0,2728 g de α-metiltriptofano (ponto 3.3) em ácido clorídrico (ponto 3.13) e completar o volume com o mesmo ácido (ponto 3.13) até ao traço. Conservar a -18 °C no máximo durante quatro semanas.

3.17.

Solução-padrão de calibração de triptofano e de padrão interno: Tomar 2,00 ml da solução concentrada de triptofano (ponto 3.15) e 2,00 ml da solução concentrada de padrão interno (α-metiltriptofano) (ponto 3.16). Diluir com água (ponto 3.1) e metanol (ponto 3.8) até obter aproximadamente o mesmo volume e aproximadamente a mesma concentração de metanol (10-30 %) que o hidrolisado pronto. A solução é preparada imediatamente antes da utilização. Proteger da luz solar direta durante a preparação.

3.18.

Ácido acético.

3.19.

1,1,1-Tricloro-2-metil-2-propanol.

3.20.

Etanolamina, w (m/m) > 98 %.

3.21.

Solução de 1 g de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (ponto 3.19) em 100 ml de metanol (ponto 3.8).

3.22.

Fase móvel para HPLC: 3,00 g de ácido acético (ponto 3.18) + 900 ml de água (ponto 3.1) + 50,0 ml da solução 1 g/100 ml (ponto 3.21) de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (ponto 3.19) em metanol (ponto 3.8). Ajustar o pH a 5,00 com etanolamina (ponto 3.20). Completar o volume com água (ponto 3.1) até perfazer 1 000 ml.

4.   Equipamento

4.1.

Aparelho para HPLC com espetrofluorímetro.

4.2.

Coluna para cromatografia líquida com 125 mm × 4 mm e enchimento C18 de 3 μm, ou equivalente.

4.3.

Medidor de pH.

4.4.

Frasco de polipropileno de 125 ml, com colo largo e tampa de rosca.

4.5.

Filtro de membrana, porosidade 0,45 μm.

4.6.

Autoclave, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar.

4.7.

Agitador mecânico ou magnético.

4.8.

Agitador vortex.

5.   Procedimento

5.1.   Preparação da amostra

A amostra é moída a uma granulometria inferior a 0,5 mm. As amostras com elevado teor de humidade devem ser secas ao ar, a uma temperatura não superior a 50 °C, ou liofilizadas, antes da moagem. Se o seu teor de matérias gordas for elevado, as amostras terão de ser submetidas a uma extração com éter de petróleo (ponto 3.9) antes da moagem.

5.2.   Determinação do triptofano livre (extração)

Pesar num balão de Erlenmeyer, com uma aproximação de 1 mg, uma quantidade adequada (1-5 g) de amostra preparada de acordo com o ponto 5.1. Adicionar 100,0 ml de ácido clorídrico (ponto 3.13) e 5,00 ml da solução concentrada de padrão interno (ponto 3.16). Agitar durante 60 minutos em agitador mecânico ou magnético (ponto 4.7). Deixar sedimentar e pipetar 10,0 ml da solução sobrenadante para um copo. Adicionar 5 ml de ácido ortofosfórico (ponto 3.14). Ajustar o pH a 3 com a solução de hidróxido de sódio (ponto 3.10). Adicionar metanol (ponto 3.8) em quantidade suficiente para obter uma concentração de metanol no volume final compreendida entre 10 % e 30 %. Transferir para um balão volumétrico de capacidade adequada e diluir com água até ao volume necessário para a cromatografia [aproximadamente o mesmo volume que a solução-padrão de calibração (ponto 3.17)].

Filtrar alguns mililitros da solução por um filtro de membrana de 0,45 μm (ponto 4.5) antes de proceder à injeção na coluna de HPLC. Efetuar a análise cromatográfica de acordo com o ponto 5.4.

Proteger a solução-padrão e os extratos da luz solar direta. Se os extratos não puderem ser analisados no mesmo dia, podem ser conservados a 5 °C durante um máximo de três dias.

5.3.   Determinação do triptofano total (hidrolisado)

Pesar em frasco de polipropileno (ponto 4.4), com uma aproximação de 0,2 mg, 0,1 g a 1 g da amostra preparada de acordo com o ponto 5.1. A toma de amostra para ensaio deve ter um teor aproximado de azoto de 10 mg. Adicionar 8,4 g de hidróxido de bário octa-hidratado (ponto 3.4) e 10 ml de água. Agitar em agitador vortex (ponto 4.8) ou magnético (ponto 4.7) (deixar o magnete revestido a teflon no frasco). Lavar as paredes do frasco com 4 ml de água. Colocar a tampa de rosca e fechar o frasco sem enroscar muito a tampa. Colocar na autoclave (ponto 4.6) com água em ebulição e manter sob a ação do vapor durante 30-60 minutos. Fechar a autoclave e manter a 110 (± 2) °C durante 20 horas.

Antes de abrir a autoclave, reduzir a temperatura a um pouco menos de 100 °C. Para evitar a cristalização do Ba(OH)2·8H2O, adicionar à mistura quente 30 ml de água à temperatura ambiente. Agitar com cuidado. Adicionar 2,00 ml da solução concentrada de padrão interno (α-metiltriptofano) (ponto 3.16). Arrefecer o recipiente num banho de água/gelo durante 15 minutos.

Adicionar, em seguida, 5 ml de ácido ortofosfórico (ponto 3.14). Manter o recipiente no banho de arrefecimento e neutralizar com HCl (ponto 3.11), sob agitação; ajustar o pH a 3,0 com HCl (ponto 3.12). Adicionar metanol em quantidade suficiente para obter uma concentração de metanol no volume final compreendida entre 10 % e 30 %. Transferir para um balão volumétrico de capacidade adequada e diluir com água até ao volume necessário para a cromatografia (por exemplo, 100 ml). A adição de metanol não deve produzir precipitação.

Filtrar alguns mililitros da solução por um filtro de membrana de 0,45 μm (ponto 4.5) antes de proceder à injeção na coluna de HPLC. Efetuar a análise cromatográfica de acordo com o ponto 5.4.

Proteger a solução-padrão e o hidrolisado da luz solar direta. Se o hidrolisado não puder ser analisado no mesmo dia, pode ser conservado a 5 °C durante um máximo de três dias.

5.4.   Análise por HPLC

As condições a seguir especificadas para a eluição isocrática são-no a título indicativo. Poderão escolher-se outras condições, desde que produzam resultados equivalentes (ver igualmente observações nos pontos 9.1 e 9.2):

Coluna para cromatografia líquida (ponto 4.2):	125 mm × 4 mm e enchimento C18 de 3 μm, ou equivalente
Temperatura da coluna:	Temperatura ambiente
Fase móvel (ponto 3.22):	3,00 g de ácido acético (ponto 3.18) + 900 ml de água (3.1) + 50,0 ml da solução (ponto 3.21) de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (ponto 3.19) em metanol (ponto 3.8) (1 g/100 ml). Ajustar o pH a 5,00 com etanolamina (ponto 3.20). Perfazer o volume de 1 000 ml com água (ponto 3.1).
Caudal:	1 ml/min
Tempo total de eluição:	cerca de 34 minutos
Comprimento de onda de deteção:	excitação: 280 nm; emissão: 356 nm
Volume injetado:	20 μl

6.   Cálculo dos resultados

A quantidade de triptofano (X), expressa em gramas, por 100 gramas de amostra, é calculada através da fórmula seguinte:

A	=	área do pico do padrão interno na solução-padrão de calibração (ponto 3.17)
B	=	área do pico do triptofano no extrato (ponto 5.2) ou no hidrolisado (ponto 5.3)
V1	=	volume em ml (2 ml) de solução concentrada de triptofano (ponto 3.15) adicionado à solução de calibração (ponto 3.17)
c	=	concentração, em μmol/ml (= 2,50), da solução concentrada de triptofano (ponto 3.15) adicionada à solução de calibração (ponto 3.17)
V2	=	volume, em ml, da solução concentrada de padrão interno (ponto 3.16) adicionado na extração (ponto 5.2) (= 5,00 ml) ou na hidrólise (ponto 5.3) (= 2,00 ml)
C	=	área do pico do padrão interno no extrato (ponto 5.2) ou no hidrolisado (ponto 5.3)
D	=	área do pico do triptofano na solução-padrão de calibração (ponto 3.17)
V3	=	volume em ml (= 2,00 ml) de solução concentrada de padrão interno (ponto 3.16) adicionado à solução-padrão de calibração (ponto 3.17)
m	=	massa, em g, da amostra (corrigida para a massa original se tiver sido submetida a secagem e/ou desengorduramento)
M	=	massa molecular do triptofano (= 204,23 g/mol)

7.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efetuadas com a mesma amostra não deve exceder 10 % do maior dos valores.

8.   Resultados de um estudo colaborativo

Tendo em vista a certificação do método de hidrólise, foi organizado um estudo colaborativo da UE (quarta comparação interlaboratorial), no âmbito do qual foram analisadas três amostras em 12 laboratórios. Cada amostra foi analisada em quintuplicado. Os resultados obtidos figuram no quadro seguinte:

	Amostra 1 Alimento para suínos	Amostra 2 Alimento para suínos com suplemento de L-triptofano	Amostra 3 Alimento concentrado para suínos
L	12	12	12
n Média [g/kg]	50 2,42	55 3,40	50 4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [%]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVR [%]	6,3	6,0	2,2
L = número de laboratórios que apresentaram resultados n = número de resultados individuais considerado (com exceção dos valores anómalos, identificados pelo teste de Cochran, Dixon) sr = desvio-padrão da repetibilidade SR = desvio-padrão da reprodutibilidade r = repetibilidade R = reprodutibilidade CVr = coeficiente de variação da repetibilidade (%) CVR = coeficiente de variação da reprodutibilidade (%)

Tendo em vista a certificação do método de extração do triptofano livre, foi organizado um outro estudo colaborativo da UE (terceira comparação interlaboratorial), no âmbito do qual foram analisadas duas amostras em 13 laboratórios. Cada amostra foi analisada em quintuplicado. Os resultados obtidos figuram no quadro seguinte:

	Amostra 4 Mistura de trigo e soja	Amostra 5 Mistura de trigo e soja (= amostra 4) com triptofano adicionado (0,457 g/kg)
L n	12 55	12 60
Média [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [%]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [%]	4,71	5,11
L = número de laboratórios que apresentaram resultados n = número de resultados individuais considerado (com exceção dos valores anómalos, identificados pelo teste de Cochran, Dixon) sr = desvio-padrão da repetibilidade SR = desvio-padrão da reprodutibilidade r = repetibilidade R = reprodutibilidade CVr = coeficiente de variação da repetibilidade (%) CVR = coeficiente de variação da reprodutibilidade (%)

Tendo em vista a certificação do triptofano para a hidrólise, foi organizado um outro estudo de comparação interlaboratorial da UE, no âmbito do qual foram analisadas quatro amostras em sete laboratórios. Os resultados obtidos figuram no quadro seguinte. Cada amostra foi analisada em quintuplicado.

	Amostra 1 Alimento misto para suínos (CRM 117)	Amostra 2 Farinha de peixe com baixo teor de matérias gordas (CRM 118)	Amostra 3 Farinha de soja (CRM 119)	Amostra 4 Leite em pó desnatado (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Média [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [%]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [%]	1,48	4,69	4,11	4,22
L = número de laboratórios que apresentaram resultados n = número de resultados individuais considerado (com exceção dos valores anómalos, identificados pelo teste de Cochran, Dixon) sr = desvio-padrão da repetibilidade SR = desvio-padrão da reprodutibilidade r = repetibilidade R = reprodutibilidade CVr = coeficiente de variação da repetibilidade (%) CVR = coeficiente de variação da reprodutibilidade (%)

9.   Observações

9.1.

A aplicação das condições cromatográficas a seguir especificadas pode permitir uma melhor separação entre o triptofano e o α-metiltriptofano. Eluição isocrática seguida de lavagem da coluna com aplicação de um gradiente: Coluna para cromatografia líquida: 125 mm × 4 mm, enchimento C18 de 5 μm, ou equivalente Temperatura da coluna: 32 °C Fase móvel: A: KH2PO4 (0,01 mol/l)/metanol 95 + 5 (V + V) B: metanol Gradiente a aplicar: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 17 min 60 % A 19 min 60 % A 21 min 100 % A 33 min 100 % A Caudal: 1,2 ml/min Tempo total de eluição: cerca de 33 minutos

9.2.

A cromatografia varia em função do tipo de aparelho de HPLC e do material de enchimento da coluna. O sistema selecionado deve permitir separar o triptofano do padrão interno com retorno à linha de base. É também importante que os produtos de degradação sejam bem separados do triptofano e do padrão interno. Devem efetuar-se algumas passagens cromatográficas de hidrolisados sem padrão interno para avaliar da presença de impurezas na zona da linha de base correspondente ao padrão interno. É importante que o tempo total de eluição seja suficientemente longo para eluir todos os produtos de degradação; caso contrário, pode haver interferência de picos eluídos tardiamente em passagens cromatográficas posteriores. O sistema cromatográfico deve produzir uma resposta linear nas condições de trabalho. A linearidade da resposta deve ser determinada com uma concentração constante (normal) do padrão interno e concentrações variáveis de triptofano. É importante que o tamanho dos picos do triptofano e do padrão interno esteja dentro da zona de linearidade do sistema de HPLC/fluorescência. Se o(s) pico(s) do triptofano e/ou do padrão interno for(em) muito grande(s) ou muito pequeno(s), haverá que repetir a análise com outra dimensão de amostra e/ou um volume final devidamente ajustado.

9.3.   Hidróxido de bário

Com o tempo, a dissolução do hidróxido de bário torna-se mais difícil. Daí resulta uma solução turva para a análise por HPLC, a qual pode produzir resultados por defeito para o triptofano.

G.   DETERMINAÇÃO DAS MATÉRIAS GORDAS BRUTAS

1.   Objeto e âmbito de aplicação

Este método tem por objetivo a determinação das matérias gordas brutas nos alimentos para animais.

A utilização dos dois processos a seguir descritos depende da natureza e da composição do alimento e da razão pela qual a análise é realizada.

Para a determinação de matérias gordas brutas nas sementes e frutos oleaginosos, bem como nos alimentos para animais que contenham mais de 15 % de matérias gordas brutas, a extração e reextração devem ser efetuadas utilizando, respetivamente, o processo A e o processo B (ponto 5.3).

1.1.   Processo A — Matérias gordas brutas extraíveis diretamente

Este método é aplicável a matérias-primas para a alimentação animal de origem vegetal, com exceção daquelas a que é aplicável o processo B.

1.2.   Processo B — Matérias gordas brutas totais

Este método é aplicável a matérias-primas para a alimentação animal de origem animal e a todos os alimentos compostos para animais. Deve ser utilizado para todas as matérias-primas das quais não se possam extrair completamente as matérias gordas sem hidrólise prévia (p. ex., glúten, leveduras, proteínas de batata e produtos submetidos a processos como a extrusão, transformação em flocos e aquecimento).

1.3.   Interpretação dos resultados

Sempre que, pelo processo B, for obtido um resultado de valor mais elevado do que o obtido pelo processo A, o resultado obtido com o processo B será considerado como o verdadeiro valor.

2.   Princípio

2.1.   Processo A

A amostra é extraída com éter de petróleo. O solvente é destilado e o resíduo é seco e pesado.

2.2.   Processo B

A amostra é tratada a quente com ácido clorídrico. A mistura é arrefecida e filtrada. Depois de ter sido lavado e seco, o resíduo é submetido a análise segundo o processo A.

3.   Reagentes

3.1.

Éter de petróleo, intervalo de ebulição: 40 a 60 °C. O índice de bromo deve ser inferior a 1 e o resíduo após evaporação inferior a 2 mg/100 ml.

3.2.

Sulfato de sódio, anidro.

3.3.

Ácido clorídrico, c = 3 mol/l.

3.4.

Adjuvante de filtração, por exemplo, terra de diatomáceas, Hyflo-supercel.

4.   Equipamento

4.1.

Extrator. Se o dispositivo for munido de um sifão (aparelho Soxhlet), a taxa de refluxo deve ser regulada de maneira a obter cerca de 10 ciclos por hora; se se tratar de um aparelho sem sifão, a taxa de refluxo deve ser de cerca de 10 ml por minuto.

4.2.

Cartuchos de extração, isentos de matérias solúveis em éter de petróleo, com uma porosidade compatível com as exigências do ponto 4.1.

4.3.

Estufa, quer de vácuo, a 75 °C ± 3 °C, quer de ar, a 100 °C ± 3 °C.

5.   Procedimento

5.1.   Processo A (ver ponto 8.1)

Pesar 5 g de amostra, com uma aproximação de 1 mg, introduzi-los num cartucho de extração (ponto 4.2) e cobri-los com um tampão de algodão isento de matéria gorda.

Colocar o cartucho num extrator (ponto 4.1) e proceder à extração durante 6 horas com éter de petróleo (ponto 3.1). Recolher o extrato de éter de petróleo num balão seco com tara calculada, contendo fragmentos de pedra-pomes (6).

Eliminar o solvente por destilação. Secar o resíduo, colocando o balão durante uma hora e meia numa estufa (ponto 4.3). Deixar arrefecer num exsicador e pesar. Secar de novo durante 30 minutos para ter a certeza de que a massa da matéria gorda permanece constante (a perda de massa entre duas pesagens sucessivas deve ser igual ou inferior a 1 mg).

5.2.   Processo B

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 2,5 g de amostra (ver ponto 8.2), introduzi-los num copo de 400 ml ou num balão de Erlenmeyer de 300 ml e juntar 100 ml de ácido clorídrico (ponto 3.3) e alguns fragmentos de pedra-pomes. Cobrir o copo com um vidro de relógio ou munir o balão de Erlenmeyer de um condensador de refluxo. Deixar ferver suavemente durante uma hora, à chama fraca ou sobre uma placa de aquecimento. Evitar que o produto adira às paredes do recipiente.

Arrefecer e adicionar uma quantidade de adjuvante de filtração (ponto 3.4) suficiente para evitar qualquer perda de matéria gorda na filtração. Filtrar num papel de filtro duplo, humidificado e isento de matérias gordas. Lavar o resíduo com água fria até à neutralização do filtrado. Verificar que o filtrado não contém matérias gordas. A presença destas indica que, antes da hidrólise, deve ser efetuada uma extração da amostra com éter de petróleo, segundo o processo A.

Colocar o papel de filtro duplo contendo o resíduo num vidro de relógio e secar durante uma hora e meia na estufa (ponto 4.3) a 100 °C ± 3 °C.

Introduzir o papel de filtro duplo contendo o resíduo seco num cartucho de extração (ponto 4.2) e cobrir com um tampão de algodão isento de matéria gorda. Colocar o cartucho num extrator (ponto 4.1) e prosseguir como indicado nos segundo e terceiro parágrafos do ponto 5.1.

5.3.   Processo A e reextração pelo processo B

Para a determinação das matérias gordas brutas nas sementes e frutos oleaginosos, bem como nos alimentos para animais que contenham mais de 15 % de matérias gordas brutas, a extração e a reextração devem ser efetuadas utilizando, respetivamente, o processo A e o processo B.

Tal significa que após a extração com éter de petróleo (processo A), o resíduo ou uma porção do resíduo é reextraído com ácido clorídrico (processo B). O teor em matérias gordas brutas corresponde à soma dos valores obtidos pelos processos A e B.

6.   Expressão dos resultados

Exprimir a massa do resíduo em percentagem da amostra.

7.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efetuadas com a mesma amostra pelo mesmo analista não deve exceder:

—	0,2 %, em valor absoluto, para teores de matérias gordas brutas inferiores a 5 %,

—	4,0 % do maior dos valores para teores entre 5 e 10 %,

—	0,4 %, em valor absoluto, para teores superiores a 10 %.

8.   Observações

8.1.

Para produtos de elevado teor de matérias gordas, difíceis de triturar ou inadequados para a colheita de uma amostra de ensaio reduzida e homogénea, proceder como se segue: Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 20 g de amostra e misturá-los com 10 g ou mais de sulfato de sódio anidro (ponto 3.2). Extrair com éter de petróleo (ponto 3.1) como indicado no ponto 5.1. Completar o extrato obtido com éter de petróleo (ponto 3.1) até perfazer 500 ml e misturar. Introduzir 50 ml de solução num pequeno balão seco com tara calculada, contendo fragmentos de pedra-pomes. Eliminar o solvente por destilação, secar e prosseguir como indicado no último parágrafo do ponto 5.1. Eliminar o solvente do resíduo de extração que se encontra no cartucho de extração, triturar o resíduo até atingir uma granulometria de 1 mm, colocá-lo novamente no cartucho de extração (não adicionar sulfato de sódio) e prosseguir como indicado nos segundo e terceiro parágrafos do ponto 5.1. O teor de matérias gordas brutas em percentagem da amostra é dado pela fórmula: em que: m1 = massa, em gramas, do resíduo da primeira extração (alíquota do extrato), m2 = massa, em gramas, do resíduo da segunda extração.

8.2.

No caso de determinados produtos (p. ex., produtos pobres em matérias gordas), a amostra de ensaio pode ser aumentada.

8.3.

Os alimentos para animais de companhia com um elevado teor de água podem ter de ser misturados com sulfato de sódio anidro antes da hidrólise e da extração, como para o processo B.

8.4.

No ponto 5.2, pode ser mais eficaz utilizar água quente em vez de fria para lavar o resíduo após filtração.

8.5.

Para alguns alimentos para animais, o tempo de secagem de uma hora e meia pode ter de ser aumentado. A secagem excessiva deve ser evitada, pois pode levar a resultados por defeito. Pode também ser utilizado um forno de micro-ondas.

H.   DETERMINAÇÃO DA FIBRA BRUTA

1.   Objeto e âmbito de aplicação

O presente método permite efetuar a determinação, em alimentos para animais, de substâncias orgânicas isentas de gordura e insolúveis em meio ácido e em meio alcalino, convencionalmente designadas por fibra bruta.

O método não é aplicável na determinação de lignocelulose e carvão vegetal (partículas demasiado finas).

2.   Princípio

A amostra, eventualmente desengordurada, é tratada sucessivamente com soluções de ácido sulfúrico e hidróxido de potássio em ebulição, de concentrações determinadas. O resíduo é separado por filtração num filtro de vidro calcinato, lavado, seco, pesado e incinerado a uma temperatura compreendida entre 475 e 500 °C. A perda de massa resultante da incineração corresponde à fibra bruta presente na amostra de ensaio.

3.   Reagentes

3.1.

Ácido sulfúrico, c = 0,13 mol/l.

3.2.

Agente antiespuma (p. ex., n-octanol).

3.3.

Adjuvante de filtração (Celite 545 ou equivalente), aquecido a 500 °C durante quatro horas (ponto 8.6).

3.4.

Acetona.

3.5.

Éter de petróleo, intervalo de ebulição: 40 a 60 °C.

3.6.

Ácido clorídrico, c = 0,5 mol/l.

3.7.

Solução de hidróxido de potássio, c = 0,23 mol/l.

4.   Equipamento

4.1.

Unidade de aquecimento para a mineralização com ácido sulfúrico e hidróxido de potássio, equipada com um suporte para o cadinho de filtração (ponto 4.2) e com um tubo, munido de uma torneira, para a saída do líquido e para efetuar o vácuo, por recurso eventual a ar comprimido. Diariamente, antes do uso, proceder ao pré-aquecimento da unidade com água em ebulição, durante cinco minutos.

4.2.

Cadinho de filtração de vidro, com uma placa filtrante de vidro calcinato fundido, de porosidade 40-90 μm. Antes da primeira utilização, aquecer a 500 °C durante alguns minutos, arrefecendo em seguida (ponto 8.6).

4.3.

Balão, próprio para ebulição, com uma capacidade mínima de 270 ml, equipado com um condensador de refluxo.

4.4.

Estufa com termóstato.

4.5.

Mufla com termóstato.

4.6.

Unidade de extração a frio, constituída por um suporte para o cadinho de filtração (ponto 4.2) e por um tubo de descarga equipado com torneira, para efetuar o vácuo e para a saída do líquido.

4.7.

Juntas para a montagem da unidade de aquecimento (ponto 4.1), do cadinho de filtração (ponto 4.2) e do balão (ponto 4.3) assim como para a ligação da unidade de extração a frio (ponto 4.6) com o cadinho.

5.   Procedimento

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 1 g de amostra, previamente preparada, transferindo-a para o cadinho de filtração (ponto 4.2) (ver observações nos pontos 9.1, 9.2 e 9.3) e adicionar 1 g de adjuvante de filtração (ponto 3.3).

Montar a unidade de aquecimento (ponto 4.1) e o cadinho de filtração (ponto 4.2), adaptando em seguida o balão (ponto 4.3) ao cadinho. Adicionar ao balão 150 ml de ácido sulfúrico (ponto 3.1), em ebulição, juntando algumas gotas de agente antiespuma (ponto 3.2), se necessário.

Levar o líquido à ebulição em 5 ± 2 minutos, deixando ferver vigorosamente durante exatamente 30 minutos.

Abrir a torneira do tubo de descarga (ponto 4.1) e filtrar, sob vácuo, o ácido sulfúrico através do cadinho de filtração. Ainda sob vácuo, lavar o resíduo no filtro com três porções sucessivas, de 30 ml cada, de água em ebulição. Assegurar que o resíduo fica seco por aspiração, após cada lavagem.

Fechar a torneira e adicionar mais 150 ml de hidróxido de potássio (ponto 3.7) em ebulição. Juntar algumas gotas de agente antiespuma (ponto 3.2). Levar o líquido à ebulição em 5 ± 2 minutos, deixando ferver vigorosamente durante exatamente 30 minutos. Filtrar o resíduo, lavando-o de modo idêntico ao descrito no tratamento com ácido sulfúrico.

Após a última lavagem e secagem, retirar o cadinho com o seu conteúdo e adaptá-lo à unidade de extração a frio (ponto 4.6). Ligar o vácuo e lavar o resíduo com três porções sucessivas, de 25 ml cada, de acetona (ponto 3.4), secando o resíduo por aspiração, após cada lavagem.

Secar o cadinho de filtração até massa constante, na estufa, a 130 °C. Após cada secagem, arrefecer no exsicador e pesar de imediato. Colocar o cadinho na mufla, incinerando entre 475 e 500 °C, durante pelo menos 30 minutos, até massa constante (a perda de massa entre duas pesagens sucessivas deve ser igual ou inferior a 2 mg).

Após cada calcinação, proceder ao arrefecimento na mufla e, em seguida no exsicador, antes de pesar.

Efetuar um ensaio em branco. A perda de massa resultante da incineração não deverá, neste caso, exceder 4 mg.

6.   Cálculo dos resultados

O teor de fibra bruta, expresso em percentagem da amostra, é dado pela expressão:

em que:

m	=	massa da amostra, em g,
m0	=	perda de massa após incineração, durante a determinação, em g,
m1	=	perda de massa após incineração, durante o ensaio em branco, em g.

7.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efetuadas com a mesma amostra não deve exceder:

—	0,6 % em valor absoluto, para os teores de fibra bruta inferiores a 10 %,

—	6 % do maior dos valores, para os teores de fibra bruta iguais ou superiores a 10 %.

8.   Reprodutibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações efetuadas com a mesma amostra em laboratórios diferentes não deve exceder:

—	1,0 % em valor absoluto, para os teores de fibra bruta inferiores a 10 %,

—	10 % do maior dos valores, para os teores de fibra bruta iguais ou superiores a 10 %.

9.   Observações

9.1.

Os alimentos para animais cujo teor de gordura bruta seja superior a 10 % deverão ser previamente desengordurados, por recurso a éter de petróleo (ponto 3.5). Adaptar o cadinho de filtração (ponto 4.2) com o seu conteúdo à unidade de extração a frio (ponto 4.6) e lavar, sob vácuo, com três porções sucessivas, de 30 ml cada, de éter de petróleo, assegurando que o resíduo está seco. Adaptar o cadinho com o seu conteúdo à unidade de aquecimento (ponto 4.1), continuando de acordo com a descrição efetuada no ponto 5.

9.2.

Os alimentos para animais que contenham gorduras que não possam ser extraídas diretamente com éter de petróleo (ponto 3.5) deverão ser desengordurados de acordo com o método descrito no ponto 8.1 e sujeitos a um novo processo de desengorduramento, precedido do tratamento com ácido em ebulição. Após tratamento com ácido e lavagem subsequente, adaptar o cadinho com o seu conteúdo à unidade de extração a frio (ponto 4.6), lavando com três porções sucessivas, de 30 ml cada, de acetona, seguidas de três porções sucessivas, também de 30 ml, de éter de petróleo. Secar por aspiração e continuar o processo de acordo com a descrição efetuada no ponto 5, começando pelo tratamento com hidróxido de potássio.

9.3.

Se o teor em carbonatos dos alimentos para animais exceder 5 %, expressos em carbonato de cálcio, adaptar o cadinho (ponto 4.2) com a amostra pesada à unidade de aquecimento (ponto 4.1). Lavar a amostra com três porções sucessivas, de 30 ml cada, de ácido clorídrico (ponto 3.6). Após cada adição, deixar a amostra repousar durante cerca de um minuto, antes de filtrar. Lavar uma vez com 30 ml de água e continuar de acordo com a descrição efetuada no ponto 5.

9.4.

No caso da utilização de uma bateria de aparelhos (vários cadinhos ligados à mesma unidade de aquecimento), não se deverá proceder, na mesma série, a duas determinações diferentes com a mesma amostra.

9.5.

Se, após a ebulição, a filtração das soluções ácidas e alcalinas se revelar difícil, proceder à introdução de ar comprimido pelo tubo de descarga da unidade de aquecimento, continuando em seguida a filtração.

9.6.

Com vista a prolongar a vida média dos cadinhos de filtração de vidro, é conveniente não utilizar temperaturas de incineração superiores a 500 °C. Dever-se-ão igualmente evitar quaisquer choques térmicos excessivos no decurso dos ciclos de aquecimento e arrefecimento.

I.   DETERMINAÇÃO DOS AÇÚCARES

1.   Objeto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar os açúcares redutores e os açúcares totais após inversão, expressos sob a forma de glucose ou eventualmente sob a forma de sacarose, utilizando 0,95 como fator de conversão. Este método é aplicável aos alimentos compostos. Existem métodos especiais para outros alimentos para animais. Se for necessário, poderá medir-se separadamente a lactose, não sem ter em conta o respetivo valor no cálculo dos resultados.

Este método é utilizado na determinação do teor de açúcar para o cálculo do valor energético dos alimentos para animais.

Na determinação do teor de açúcar para outros efeitos, podem utilizar-se outros métodos de análise.

2.   Princípio

Os açúcares são extraídos com etanol diluído e a solução é clarificada com soluções de Carrez I e II. Uma vez eliminado o etanol, efetuam-se as determinações, antes e depois da inversão, aplicando o método de Luff-Schoorl.

3.   Reagentes

3.1.

Etanol, solução a 40 % (v/v), densidade: 0,948 g/ml a 20 °C, ajustado para o ponto de viragem da fenolftaleína.

3.2.

Solução de Carrez I: dissolver em água 21,9 g de acetato de zinco, Zn(CH3COO)2·2H2, e 3 g de ácido acético glacial. Perfazer o volume de 100 ml com água.

3.3.

Solução de Carrez II: dissolver em água 10,6 g de ferrocianeto de potássio, K4Fe(CN)6·3H2O. Perfazer o volume de 100 ml com água.

3.4.

Alaranjado de metilo, solução a 0,1 % (m/v).

3.5.

Ácido clorídrico 4 mol/l.

3.6.

Ácido clorídrico 0,1 mol/l.

3.7.

Solução de hidróxido de sódio 0,1 mol/l.

3.8.

Reagente de Luff-Schoorl: Agitando lentamente, deitar a solução de ácido cítrico (ponto 3.8.2) na solução de carbonato de sódio (ponto 3.8.3). Juntar em seguida a solução de sulfato de cobre (ponto 3.8.1) e perfazer o volume de 1 litro com água. Deixar repousar durante a noite e filtrar. Verificar a concentração do reagente assim obtido (Cu 0,05 mol/l; Na2CO3 1 mol/l), ver o último parágrafo do ponto 5.4. O pH da solução deverá ser cerca de 9,4.

3.8.1.

Solução de sulfato de cobre: dissolver 25 g de sulfato de cobre, CuSO4·5H2O, isento de ferro, em 100 ml de água.

3.8.2.

Solução de ácido cítrico: dissolver 50 g de ácido cítrico, C6H8O7•H2O, em 50 ml de água.

3.8.3.

Solução de carbonato de sódio: dissolver 143,8 g de carbonato de sódio anidro em cerca de 300 ml de água quente. Deixar arrefecer.

3.9.

Solução de tiossulfato de sódio 0,1 mol/l.

3.10.

Solução de amido: juntar uma mistura de 5 g de amido solúvel e 30 ml de água a 1 litro de água a ferver. Manter em ebulição durante três minutos, deixar arrefecer e juntar, se necessário, 10 mg de iodeto de mercúrio como conservante.

3.11.

Ácido sulfúrico 3 mol/l.

3.12.

Solução de iodeto de potássio a 30 % (m/v).

3.13.

Pedra-pomes granulada fervida em ácido clorídrico, lavada com água e seca.

3.14.

3-Metilbutan-1-ol.

4.   Equipamento

Misturador basculante: cerca de 35 a 40 rotações por minuto.

5.   Procedimento

5.1.   Extração da amostra

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 2,5 g de amostra e introduzi-la num balão volumétrico de 250 ml. Juntar 200 ml de etanol (ponto 3.1) e misturar durante uma hora no misturador. Juntar 5 ml de solução de Carrez I (ponto 3.2) e agitar durante cerca de 30 segundos. Juntar em seguida 5 ml de solução de Carrez II (ponto 3.3) e tornar a agitar, durante um minuto. Completar o volume com etanol (ponto 3.1), homogeneizar e filtrar. Recolher 200 ml de filtrado e evaporá-lo até cerca de metade do volume a fim de eliminar a maior parte do etanol. Transferir quantitativamente o resíduo da evaporação com água quente para um balão volumétrico de 200 ml, deixar arrefecer, completar o volume com água, homogeneizar e, se necessário, filtrar. Esta será a solução utilizada para a determinação dos açúcares redutores e, após inversão, dos açúcares totais.

5.2.   Determinação dos açúcares redutores

Com uma pipeta, recolher uma quantidade de solução, não superior a 25 ml, que contenha menos de 60 mg de açúcares redutores, expressos em glucose. Se necessário, perfazer o volume de 25 ml com água destilada e determinar o teor de açúcares redutores pelo método de Luff-Schoorl. O resultado é expresso em percentagem de glucose na amostra.

5.3.   Determinação dos açúcares totais após a inversão

Com a pipeta, recolher 50 ml de solução e deitá-la num balão volumétrico de 100 ml. Juntar algumas gotas de solução de alaranjado de metilo (ponto 3.4) e em seguida ácido clorídrico (ponto 3.5) lentamente e mexendo sempre, até que haja uma viragem nítida para vermelho. Juntar 15 ml de ácido clorídrico (3.6) e mergulhar o balão, durante 30 minutos, em água fervendo abundantemente. Arrefecer rapidamente até cerca de 20 °C e juntar 15 ml de solução de hidróxido de sódio (ponto 3.7). Perfazer o volume de 100 ml com água e homogeneizar. Recolher uma quantidade não superior a 25 ml e que contenha menos de 60 mg de açúcares redutores expressos em glucose. Se necessário, perfazer o volume de 25 ml com água destilada e determinar o teor de açúcares redutores pelo método de Luff-Schoorl. O resultado deverá ser expresso em percentagem de glucose, ou eventualmente sacarose, multiplicando pelo fator 0,95.

5.4.   Titulação pelo método de Luff-Schoorl

Recolher, com uma pipeta, 25 ml de reagente de Luff-Schoorl (ponto 3.8) e deitá-lo para um balão de Erlenmeyer de 300 ml; juntar 25 ml exatos da solução de açúcares já clarificada. Juntar dois grânulos de pedra-pomes (ponto 3.13), aquecer, agitando manualmente sobre uma chama aberta de altura média, e levar o líquido à ebulição em cerca de dois minutos. Colocar imediatamente o balão de Erlenmeyer sobre uma placa com rede de amianto com uma abertura de cerca de 6 cm de diâmetro, sob a qual terá sido previamente acendida uma chama, regulada de forma a aquecer apenas o fundo do balão de Erlenmeyer. Ajustar ao balão de Erlenmeyer um condensador de refluxo. Deixar em ebulição durante exatamente dez minutos. Arrefecer imediatamente em água fria durante cerca de cinco minutos e titular como se segue:

Juntar 10 ml de solução de iodeto de potássio (ponto 3.12) e, imediatamente depois e com cuidado (dado o risco de formação de espuma abundante), adicionar 25 ml de ácido sulfúrico (ponto 3.11). Titular seguidamente com a solução de tiossulfato de sódio (ponto 3.9) até ao aparecimento de uma coloração amarelada, juntar o indicador de amido (ponto 3.10) e completar a titulação.

Efetuar a mesma titulação numa mistura, medida com exatidão, de 25 ml de reagente de Luff-Schoorl (ponto 3.8) e 25 ml de água, a que se juntam 10 ml de solução de iodeto de potássio (ponto 3.12) e 25 ml de ácido sulfúrico (ponto 3.11), sem levar à ebulição.

6.   Cálculo dos resultados

Calcular por meio da tabela a quantidade de glucose, expressa em mg, correspondente à diferença entre os valores das duas titulações, expressos em ml de tiossulfato de sódio 0,1 mol/l. Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

7.   Procedimentos especiais

7.1.

No caso de alimentos muito ricos em melaço ou pouco homogéneos, pesar uma amostra de 20 g e introduzi-la com 500 ml de água num balão volumétrico de 1 litro. Misturar durante uma hora no misturador. Clarificar com soluções de Carrez I (ponto 3.2) e II (ponto 3.3) tal como se descreve no ponto 5.1, mas utilizando uma quantidade quatro vezes superior de cada solução. Completar o volume até à marca com etanol a 80 % (v/v). Homogeneizar e filtrar. Eliminar o etanol como se descreve no ponto 5.1. Na ausência de amido dextrinizado, completar o volume até à marca com água destilada.

7.2.

No caso dos melaços e das matérias-primas para a alimentação animal ricas em açúcares e praticamente isentas de amido (alfarroba, cascas secas de beterraba, etc.), pesar 5 g de amostra e introduzi-los num balão volumétrico de 250 ml, juntar 200 ml de água destilada e misturar durante uma hora ou mais, se necessário, no misturador. Clarificar em seguida com soluções de Carrez I (ponto 3.2) e II (ponto 3.3) tal como se descreve no ponto 5.1. Completar o volume com água, homogeneizar e filtrar. Para determinar os açúcares totais, proceder como descrito no ponto 5.3.

8.   Observações

8.1.

Para evitar a formação de espuma, recomenda-se a adição (independentemente do volume) de cerca de 1 ml de 3-metilbutan-1-ol (ponto 3.14) antes da ebulição com o reagente de Luff-Schoorl.

8.2.

O teor de sacarose, em percentagem, será igual à diferença entre o teor de açúcares totais após a inversão, expressos em glucose, e o teor de açúcares redutores (igualmente expressos em glucose), multiplicada por 0,95.

8.3.

Para determinar o teor de açúcares redutores, com exclusão da lactose, podem utilizar-se dois processos:

8.3.1.

Para um cálculo aproximado, multiplica-se o teor de lactose, determinado num ensaio em separado, por 0,675 e subtrai-se o resultado obtido do teor de açúcares redutores.

8.3.2.

Para um cálculo mais rigoroso dos açúcares redutores, com exclusão da lactose, é necessário utilizar a mesma amostra nas duas determinações finais, efetuando-se uma análise com parte da solução obtida no ponto 5.1 e outra com parte da solução que se utiliza no método de determinação da lactose (após a fermentação dos outros tipos de açúcares seguida de clarificação). Em ambos os casos, a quantidade de açúcar presente determina-se pelo método de Luff-Schoorl e o respetivo cálculo faz-se em mg de glucose, subtraindo um valor do outro e exprimindo o resultado em termos percentuais relativamente à amostra. Exemplo Os volumes recolhidos correspondem ambos, em cada uma das determinações, a uma amostra de 250 mg. No primeiro caso, são gastos 17 ml de solução de tiossulfato de sódio 0,1 mol/l, o que corresponde a 44,2 mg de glucose, e no segundo são gastos 11 ml, o que corresponde a 27,6 mg de glucose. A diferença é de 16,6 mg de glucose. O teor de açúcares redutores (exceto a lactose), calculado como glucose, será portanto de: Tabela de valores para 25 ml de reagente de Luff-Schoorl ml de Na2S2O3 0,1 mol/l, dois minutos de aquecimento e dez minutos de ebulição Na2S2O3 0,1 mol/l Glucose, frutose açúcares invertidos C6H12O6 Lactose C12H22O11 Na2S2O3 0,1 mol/l ml mg diferença mg diferença ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

J.   DETERMINAÇÃO DA LACTOSE

1.   Objeto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de lactose em alimentos para animais que a contenham em mais de 0,5 % de lactose.

2.   Princípio

Dissolvem-se os açúcares em água. Submete-se a solução a uma fermentação pela levedura Saccharomyces cerevisiae, que não modifica a lactose. Após clarificação e filtração, determina-se o teor de lactose do filtrado pelo método Luff-Schoorl.

3.   Reagentes

3.1.

Suspensão de Saccharomyces cerevisiae: suspender 25 g de levedura fresca em 100 ml de água. O tempo máximo de conservação desta suspensão em frigorífico é de uma semana.

3.2.

Solução de Carrez I: dissolver em água 21,9 g de acetato de zinco, Zn(CH3COO)2·2H2O, e 3 g de ácido acético glacial. Perfazer o volume de 100 ml com água.

3.3.

Solução de Carrez II: dissolver em água 10,6 g de ferrocianeto de potássio, K4Fe(CN)6·3H2O. Perfazer o volume de 100 ml com água.

3.4.

Reagente de Luff-Schoorl: Agitando lentamente, deitar a solução de ácido cítrico (ponto 3.4.2) na solução de carbonato de sódio (ponto 3.4.3). Juntar em seguida a solução de sulfato de cobre (ponto 3.4.1) e perfazer o volume de 1 litro com água. Deixar repousar durante a noite e filtrar. Verificar a concentração do reagente assim obtido (Cu 0,05 mol/l; Na2CO3 1 mol/l). O pH da solução deverá ser cerca de 9,4.

3.4.1.

Solução de sulfato de cobre: dissolver 25 g de sulfato de cobre, CuSO4·5H2O, isento de ferro, em 100 ml de água.

3.4.2.

Solução de ácido cítrico: dissolver 50 g de ácido cítrico, C6H8O7•H2O, em 50 ml de água.

3.4.3.

Solução de carbonato de sódio: dissolver 143,8 g de carbonato de sódio anidro em cerca de 300 ml de água quente. Deixar arrefecer.

3.5.

Pedra-pomes granulada fervida em ácido clorídrico, lavada com água e seca.

3.6.

Solução de iodeto de potássio a 30 % (m/v).

3.7.

Ácido sulfúrico 3 mol/l.

3.8.

Solução de tiossulfato de sódio 0,1 mol/l.

3.9.

Solução de amido: juntar uma mistura de 5 g de amido solúvel e 30 ml de água a 1 litro de água a ferver. Manter em ebulição durante três minutos, deixar arrefecer e juntar, se necessário, 10 mg de iodeto de mercúrio como conservante.

4.   Equipamento

Tina de banho-maria, com termóstato regulado para 38-40 °C.

5.   Procedimento

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 1 g de amostra e introduzi-la num balão volumétrico de 100 ml. Juntar 25 a 30 ml de água, colocar o balão durante trinta minutos em banho-maria a ferver, deixando arrefecer em seguida até cerca de 35 °C. Juntar 5 ml da suspensão de levedura (ponto 3.1) e homogeneizar. Deixar o balão durante duas horas em banho-maria a uma temperatura de 38 a 40 °C e deixar arrefecer em seguida até cerca de 20 °C.

Juntar 2,5 ml de solução de Carrez I (ponto 3.2) e agitar durante 30 segundos; adicionar seguidamente 2,5 ml de solução de Carrez II (ponto 3.3), agitando novamente durante 30 segundos. Perfazer o volume de 100 ml com água, misturar e filtrar. Com uma pipeta, recolher uma quantidade de filtrado não superior a 25 ml, que contenha, de preferência, entre 40 e 80 mg de lactose, e introduzi-lo num balão de Erlenmeyer de 300 ml. Se necessário, perfazer o volume de 25 ml com água.

Efetuar segundo o mesmo processo um ensaio em branco com 5 ml de suspensão de levedura (ponto 3.1). Determinar o teor de lactose em conformidade com o método de Luff-Schoorl, como se indica a seguir: juntar a 25 ml exatos de reagente de Luff-Schoorl (ponto 3.4) dois grânulos de pedra-pomes (ponto 3.5). Aquecer, agitando manualmente sobre uma chama aberta de altura média e levar o líquido à ebulição em cerca de dois minutos. Colocar imediatamente o balão de Erlenmeyer sobre uma placa com rede de amianto com uma abertura de cerca de 6 cm de diâmetro, sob a qual terá sido previamente acendida uma chama, regulada de forma a aquecer apenas o fundo do balão de Erlenmeyer. Ajustar ao balão de Erlenmeyer um condensador de refluxo. Deixar em ebulição durante exatamente dez minutos. Arrefecer imediatamente em água fria durante cerca de cinco minutos e titular como se segue:

Juntar 10 ml de solução de iodeto de potássio (ponto 3.6) e, imediatamente depois e com cuidado (dado o risco de formação de espuma abundante), adicionar 25 ml de ácido sulfúrico (ponto 3.7). Titular seguidamente com a solução de tiossulfato de sódio (ponto 3.8) até ao aparecimento de uma coloração amarelada, juntar o indicador de amido (ponto 3.9) e completar a titulação.

Efetuar a mesma titulação numa mistura, medida com exatidão, de 25 ml de reagente de Luff-Schoorl (ponto 3.4) e 25 ml de água, a que se juntam 10 ml de solução de iodeto de potássio (ponto 3.6) e 25 ml de ácido sulfúrico (ponto 3.7), sem levar à ebulição.

6.   Cálculo dos resultados

Utilizando a tabela, determinar a quantidade de lactose, em mg, correspondente à diferença entre os resultados das duas titulações, expressos em ml de tiossulfato de sódio 0,1 mol/l.

Exprimir o resultado obtido para a lactose anidra em percentagem da amostra.

7.   Observação

1.

Para os produtos que contenham mais de 40 % de açúcares fermentáveis, utilizar mais de 5 ml de suspensão de levedura (ponto 3.1).

2.

Em alimentos para animais com um «teor de lactose reduzido», a lactose é convertida em frutose, a qual não é completamente fermentada em 2 horas, resultando em valores mais elevados ou falsos positivos (uma vez que continuam a ocorrer resíduos de frutose no extrato). Tabela de valores para 25 ml de reagente de Luff-Schoorl ml de Na2S2O3 0,1 mol/l, dois minutos de aquecimento e dez minutos de ebulição Na2S2O3 0,1 mol/l Glucose, frutose açúcares invertidos C6H12O6 Lactose C12H22O11 Na2S2O3 0,1 mol/l ml mg diferença mg diferença ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   DETERMINAÇÃO DO AMIDO

MÉTODO POLARIMÉTRICO

1.   Objeto e âmbito de aplicação

O presente método permite determinar o teor de amido e dos seus produtos de degradação de elevado peso molecular em alimentos para animais, tendo em vista verificar o cumprimento do valor energético declarado (disposições do anexo VII) e do Regulamento (CE) n.o 767/2009.

Este método é utilizado na determinação do teor de amido para o cálculo do valor energético dos alimentos para animais.

Na determinação do teor de amido para outros efeitos, podem utilizar-se outros métodos de análise.

2.   Princípio

O método inclui duas determinações. Na primeira, a amostra é tratada com ácido clorídrico diluído. Depois de clarificada e filtrada, mede-se a rotação ótica da solução por polarimetria.

Na segunda, a amostra é submetida a extração com etanol a 40 %. Depois de acidificado o filtrado com ácido clorídrico, clarificação e filtração, mede-se a rotação ótica tal como na primeira determinação.

A diferença entre as duas medições, multiplicada por um fator conhecido, dá o teor de amido da amostra.

3.   Reagentes

3.1.

Ácido clorídrico, solução a 25 % (m/m), densidade: 1,126 g/ml.

3.2.

Ácido clorídrico, solução a 1,13 % (m/v). A concentração é verificada por titulação com uma solução 0,1 mol/l de hidróxido de sódio, na presença de vermelho de metilo a 0,1 % (m/v) em etanol a 94 % (v/v). Para a neutralização de 10 ml, são necessários 30,94 ml de NaOH 0,1 mol/l.

3.3.

Solução de Carrez I: dissolver em água 21,9 g de acetato de zinco, Zn(CH3COO)2·2H2O, e 3 g de ácido acético glacial. Perfazer o volume de 100 ml com água.

3.4.

Solução de Carrez II: dissolver em água 10,6 g de ferrocianeto de potássio, K4Fe(CN)6·3H2O. Perfazer o volume de 100 ml com água.

3.5.

Etanol, solução a 40 % (v/v), densidade: 0,948 g/ml a 20 °C.

4.   Equipamento

4.1.

Balão de Erlenmeyer de 250 ml com esmerilado normalizado e condensador de refluxo.

4.2.

Polarímetro ou sacarímetro.

5.   Procedimento

5.1.   Preparação da amostra

Triturar a amostra de maneira a passar a totalidade da mesma por um crivo de malha redonda de 0,5 mm de diâmetro.

5.2.   Determinação da rotação ótica total (P ou S) (ver observação no ponto 7.1)

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 2,5 g da amostra triturada para um balão volumétrico de 100 ml. Adicionar 25 ml de ácido clorídrico (ponto 3.2), agitar, para homogeneizar a amostra de ensaio, e adicionar mais 25 ml de ácido clorídrico (ponto 3.2). Introduzir o balão num banho de água em ebulição e agitar enérgica e regularmente durante três minutos, para evitar a formação de aglomerados. A quantidade de água no banho deve ser suficiente para que este se mantenha em ebulição quando o balão for introduzido. O balão não pode ser retirado do banho durante a agitação. Decorridos 15 minutos exatos, retirar o balão do banho, adicionar 30 ml de água fria e arrefecer imediatamente até 20 °C.

Juntar 5 ml de solução de Carrez I (ponto 3.3) e agitar durante cerca de 30 segundos. Adicionar em seguida 5 ml da solução de Carrez II (ponto 3.4) e agitar de novo durante cerca de 30 segundos. Completar o volume com água, homogeneizar e filtrar. Se o filtrado não ficar perfeitamente límpido (o que é pouco frequente), recomeçar a análise utilizando uma quantidade maior das soluções de Carrez I e II, por exemplo, 10 ml.

Medir, em seguida, a rotação ótica da solução num tubo de 200 mm com o polarímetro ou o sacarímetro.

5.3.   Determinação da rotação ótica (P’ ou S’) de substâncias solúveis em etanol a 40 %

Introduzir, num balão volumétrico de 100 ml, 5 g de amostra, pesada com uma aproximação de 1 mg, e adicionar cerca de 80 ml de etanol (ponto 3.5) (ver observação no ponto 7.2). Deixar o balão em repouso à temperatura ambiente durante uma hora; durante esse lapso de tempo, agitar energicamente por seis vezes, para que a amostra de ensaio fique bem misturada com o etanol. Perfazer o volume com etanol (ponto 3.5), homogeneizar e filtrar.

Pipetar 50 ml de filtrado (correspondentes a 2,5 g de amostra) para um balão de Erlenmeyer de 250 ml, adicionar 2,1 ml de ácido clorídrico (ponto 3.1) e agitar energicamente. Adaptar um condensador de refluxo ao balão de Erlenmeyer e mergulhar este num banho de água em ebulição. Decorridos exatamente 15 minutos, retirar o balão de Erlenmeyer do banho, transferir o conteúdo para um balão volumétrico de 100 ml, lavar com um pouco de água fria e arrefecer até 20 °C.

Clarificar, em seguida, com as soluções de Carrez I (ponto 3.3) e II (ponto 3.4), completar o volume com água, homogeneizar, filtrar e medir a rotação ótica como indicado nos segundo e terceiro parágrafos do ponto 5.2.

6.   Cálculo dos resultados

O teor percentual de amido é calculado como segue:

6.1.   Medições polarimétricas

P	=	rotação ótica total, em graus de ângulo
P’	=	rotação ótica, em graus de ângulo, das substâncias solúveis em etanol a 40 % (v/v)
	=	rotação ótica específica do amido puro. Os valores convencionalmente admitidos para este fator são os seguintes:

+ 185,9 °	:	amido de arroz
+ 185,7 °	:	amido de batata
+ 184,6 °	:	amido de milho
+ 182,7 °	:	amido de trigo
+ 181,5 °	:	amido de cevada
+ 181,3 °	:	amido de aveia
+ 184,0 °	:	outros tipos de amido e misturas de amidos em alimentos compostos para animais.

6.2.   Medições sacarimétricas

S	=	rotação ótica total, em graus sacarimétricos
S’	=	rotação ótica, em graus sacarimétricos, das substâncias solúveis em etanol a 40 % (v/v)
N	=	massa (g), de sacarose dissolvida em 100 ml de água, correspondente a um poder rotatório de 100 graus sacarimétricos, quando medido com um tubo de 200 mm 16,29 g para os sacarímetros franceses 26,00 g para os sacarímetros alemães 20,00 g para os sacarímetros mistos
	=	rotação ótica específica do amido puro (ver ponto 6.1).

6.3.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efetuadas com a mesma amostra não deve exceder 0,4, em valor absoluto, para teores de amido inferiores a 40 %, ou 1 %, em valor relativo, para teores de amido iguais ou superiores a 40 %.

7.   Observações

7.1.

Se a amostra contiver mais de 6 % de carbonatos, expressos em carbonato de cálcio, estes devem ser destruídos por tratamento com a quantidade apropriada, exata, de ácido sulfúrico diluído antes da determinação da rotação ótica total.

7.2.

No caso dos produtos com teor de lactose elevado, como o soro de leite em pó ou o leite em pó desnatado, proceder como segue depois da adição de 80 ml de etanol (ponto 3.5): adaptar um condensador de refluxo ao balão e mergulhar este durante 30 minutos num banho de água a 50 °C. Em seguida, deixar arrefecer e prosseguir a análise como indicado no ponto 5.3.

7.3.

Caso estejam presentes em quantidades significativas, as seguintes matérias-primas para a alimentação animal produzem comprovadamente interferências na determinação do teor de amido por polarimetria, podendo originar resultados incorretos: — produtos derivados da beterraba (sacarina), nomeadamente polpa de beterraba (sacarina), melaço de beterraba (sacarina), polpa de beterraba (sacarina) melaçada, vinassa de beterraba (sacarina), açúcar (de beterraba), — polpa de citrinos, — sementes de linho, bagaço de linho, obtido por pressão, bagaço de linho, obtido por extração, — colza, bagaço de colza, obtido por pressão, bagaço de colza, obtido por extração, cascas de colza, — sementes de girassol, bagaço de girassol, obtido por extração, bagaço de girassol, parcialmente descascado, obtido por extração, — bagaço de copra (coco), obtido por pressão, bagaço de copra (coco), obtido por extração, — polpa de batata, — leveduras desidratadas, — produtos ricos em inulina (p. ex., lascas e farinha de tupinambos), — torresmos, — produtos à base de soja. Nestes casos, pode utilizar-se o método de análise indicado no Regulamento (CE) n.o 121/2008 da Comissão (7). Este método pode igualmente ser utilizado em alimentos para animais com um teor de amido inferior a 1 %.

L.   DETERMINAÇÃO DAS CINZAS BRUTAS

1.   Objeto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de cinzas brutas em alimentos para animais.

2.   Princípio

Incinera-se amostra a 550 °C e pesa-se o resíduo.

3.   Reagentes

Nitrato de amónio, solução a 20 % (m/v).

4.   Equipamento

4.1.

Placa de aquecimento.

4.2.

Mufla elétrica com termóstato.

4.3.

Cadinhos para incineração em sílica, porcelana ou platina, retangulares (aprox. 60 × 40 × 25 mm) ou circulares (diâmetro: 60 a 75 mm, altura: 20 a 40 mm).

5.   Procedimento

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g de amostra (2,5 g para os produtos com tendência para aumentar de volume) num cadinho para incineração previamente aquecido a 550 °C, arrefecido e tarado. Colocar o cadinho na placa de aquecimento e aquecer progressivamente até à carbonização da matéria. Proceder à incineração de acordo com o disposto no ponto 5.1 ou 5.2.

5.1.

Introduzir o cadinho na mufla calibrada e regulada para 550 °C. Manter esta temperatura até à obtenção de cinzas brancas, de cor cinzenta-clara ou avermelhada, e sem partículas de carvão visíveis. Colocar o cadinho num exsicador, deixar arrefecer e pesar imediatamente.

5.2.

Introduzir o cadinho na mufla calibrada e regulada para 550 °C. Incinerar durante 3 horas. Colocar o cadinho num exsicador, deixar arrefecer e pesar imediatamente. Incinerar de novo por 30 minutos por forma a garantir que a massa das cinzas permanece constante (a perda de massa entre duas pesagens sucessivas deve ser igual ou inferior a 1 mg).

6.   Cálculo dos resultados

Calcular a massa do resíduo subtraindo-lhe a tara.

Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

7.   Observações

7.1.

As cinzas de substâncias de difícil incineração devem ser submetidas a uma primeira incineração de pelo menos três horas e arrefecidas, adicionando-se-lhes em seguida algumas gotas de solução de nitrato de amónio a 20 % ou de água (com extremo cuidado, para evitar a dispersão das cinzas ou a formação de aglomerados). Prosseguir com a calcinação, após secagem em estufa. Repetir eventualmente a operação até à incineração total.

7.2.

Para as substâncias que resistam ao tratamento indicado no ponto 7.1, proceder do modo seguinte: depois de uma incineração de três horas, recolher as cinzas em água quente e filtrá-las num pequeno filtro, isento de cinzas. Incinerar o filtro e o seu conteúdo no primeiro cadinho. Colocar o filtrado no cadinho arrefecido, evaporar até à secura, incinerar e pesar.

7.3.

No caso das matérias gordas, pesar rigorosamente 25 g de amostra num cadinho de capacidade adequada. Carbonizar, inflamando a substância com uma torcida de papel de filtro isento de cinzas. Terminada a combustão, humedecer com o mínimo de água possível. Secar e incinerar como indicado no ponto 5.

M.   DETERMINAÇÃO DAS CINZAS INSOLÚVEIS EM ÁCIDO CLORÍDRICO

1.   Objeto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de substâncias minerais insolúveis em ácido clorídrico existentes nos alimentos para animais. Podem utilizar-se dois processos, em função do tipo de amostra:

1.1.

Processo A: aplicável às matérias-primas orgânicas e à maior parte dos alimentos compostos.

1.2.

Processo B: aplicável aos compostos e misturas minerais, assim como aos alimentos compostos cujo teor de substâncias minerais insolúveis em ácido clorídrico, determinado segundo o Processo A, seja superior a 1 %.

2.   Princípio

2.1.

Processo A: incinera-se a amostra, tratam-se as cinzas em ácido clorídrico em ebulição, filtra-se o resíduo insolúvel e pesa-se.

2.2.

Processo B: trata-se a amostra com ácido clorídrico. Filtra-se a solução, incinera-se o resíduo e tratam-se as cinzas assim obtidas como no Processo A.

3.   Reagentes

3.1.

Ácido clorídrico 3 mol/l.

3.2.

Ácido tricloroacético, solução a 20 % (m/v).

3.3.

Ácido tricloroacético, solução a 1 % (m/v).

4.   Equipamento

4.1.

Placa de aquecimento.

4.2.

Mufla elétrica com termóstato.

4.3.

Cadinhos para incineração em sílica, porcelana ou platina, retangulares (aprox. 60 × 40 × 25 mm) ou circulares (diâmetro: 60 a 75 mm, altura: 20 a 40 mm).

4.4.

Filtros isentos de cinzas.

5.   Procedimento

5.1.   Processo A:

Incinerar a amostra de acordo com o método indicado para a determinação do teor de cinzas brutas. Podem igualmente utilizar-se as cinzas obtidas nessa determinação.

Introduzir as cinzas num copo de 250 a 400 ml com 75 ml de ácido clorídrico (ponto 3.1). Levar cuidadosamente o líquido a uma ebulição suave mantendo-a durante 15 minutos. Filtrar a solução quente com papel de filtro isento de cinzas e lavar o resíduo com água quente até desaparecer a reação ácida. Secar o filtro que contém o resíduo e incinerá-lo, num cadinho tarado, a uma temperatura de 550 °C (mín.) a 700 °C (máx.). Arrefecer num exsicador e pesar.

5.2.   Processo B

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 5 g de amostra e introduzi-la num copo de 250 a 400 ml. Juntar sucessivamente 25 ml de água e 25 ml de ácido clorídrico (ponto 3.1), misturar e deixar que acabe a efervescência. Juntar mais 50 ml de ácido clorídrico (ponto 3.1). Caso se verifique libertação de gás, aguardar que esta cesse completamente, colocar em seguida o copo num banho-maria em ebulição durante 30 minutos ou mais, se necessário, para hidrolisar completamente o amido eventualmente presente. Filtrar a quente com um filtro isento de cinzas e lavar o filtro com 50 ml de água quente (ver observação no ponto 7). Colocar o filtro com o resíduo num cadinho para incineração, secar e incinerar a uma temperatura entre 550 °C (mín.) e 700 °C (máx.). Introduzir as cinzas num copo de 250 a 400 ml com 75 ml de ácido clorídrico (ponto 3.1); prosseguir como indicado no segundo parágrafo do ponto 5.1.

6.   Cálculo dos resultados

Calcular a massa do resíduo subtraindo-lhe a tara. Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

7.   Observação

Se a filtração for difícil, repetir a análise substituindo os 50 ml de ácido clorídrico (ponto 3.1) por 50 ml da solução de ácido tricloracético a 20 % (m/v) (ponto 3.2), lavando o filtro com uma solução quente de ácido tricloracético a 1 % (ponto 3.3).

N.   DETERMINAÇÃO DO FÓSFORO TOTAL

O fósforo total é determinado pelo

—

pelo método de análise previsto na norma EN 15510 – Animal feeding stuffs: Methods of sampling and analysis - Determination of calcium, sodium, phosphorus, magnesium, potassium, iron, zinc, copper, manganese, cobalt, molybdenum and lead by ICP-AES (Alimentos para animais: Métodos de amostragem e análise – Determinação do cálcio, sódio, fósforo, magnésio, potássio, ferro, zinco, cobre, manganês, cobalto, molibdénio e chumbo por ICP-AES), ou

—

pelo método de análise previsto na norma EN 15621 – Animal feeding stuffs: Methods of sampling and analysis - Determination of calcium, sodium, phosphorus, magnesium, potassium, sulphur, iron, zinc, copper, manganese and cobalt after pressure digestion by ICP-AES (Alimentos para animais: Métodos de amostragem e análise – Determinação do cálcio, sódio, fósforo, magnésio, potássio, enxofre, ferro, zinco, cobre, manganês e cobalto por ICP-AES após mineralização sob pressão), ou

—	pelo método fotométrico, a seguir descrito.

MÉTODO FOTOMÉTRICO

1.   Objeto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de fósforo total dos alimentos para animais. É particularmente indicado para a análise de produtos pobres em fósforo. Em alguns casos (produtos ricos em fósforo), pode ser aplicado um método gravimétrico.

2.   Princípio

A amostra é mineralizada, quer por via seca (para os alimentos orgânicos) quer por via húmida (para os compostos minerais e os alimentos líquidos) e colocada em solução ácida. A solução é tratada pelo reagente vanadomolíbdico. A densidade ótica da solução amarela assim obtida é medida em espetrofotómetro a 430 nm.

3.   Reagentes

3.1.

Carbonato de cálcio.

3.2.

Ácido clorídrico, ρ20 = 1,10 g/ml (aprox. 6 mol/l).

3.3.

Ácido nítrico, ρ20 = 1,045 g/ml.

3.4.

Ácido nítrico, ρ20 = 1,38 a 1,42 g/ml.

3.5.

Ácido sulfúrico, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.6.

Reagente vanadomolíbdico: misturar 200 ml de solução de heptamolibdato de amónio (ponto 3.6.1), 200 ml de solução de monovanadato de amónio (ponto 3.6.2) e 134 ml de ácido nítrico (ponto 3.4) num balão volumétrico de 1 litro. Perfazer o volume com água.

3.6.1.

Solução de heptamolibdato de amónio: dissolver em água quente 100 g de heptamolibdato de amónio, (NH4)6Mo7O24 ·4H2O. Juntar 10 ml de amónia (densidade 0,91 g/ml) e perfazer 1 litro com água.

3.6.2.

Solução de monovanadato de amónio: em 400 ml de água quente, dissolver 2,35 g de monovanadato de amónio, NH4VO3. Adicionar lentamente, e agitando sempre, 20 ml de ácido nítrico diluído [7 ml de HNO3 (ponto 3.4) + 13 ml de H2O] e perfazer o volume de 1 litro com água.

3.7.

Solução-padrão a 1 mg/ml de fósforo: dissolver em água 4,387 g de di-hidrogenofosfato de potássio, KH2PO4. Perfazer o volume de 1 litro com água.

4.   Equipamento

4.1.

Cadinhos para incineração em sílica, porcelana ou platina.

4.2.

Mufla elétrica com termóstato regulado para 550 °C.

4.3.

Balão Kjeldahl, 250 ml.

4.4.

Balões volumétricos e pipetas de precisão.

4.5.

Espetrofotómetro.

4.6.

Tubos de ensaio, diâmetro: cerca de 16 mm, de rosca normalizada de 14,5 mm; capacidade: 25 a 30 ml.

5.   Procedimento

5.1.   Preparação da solução

Consoante a natureza da amostra, preparar uma solução tal como indicado nos pontos 5.1.1 ou 5.1.2.

5.1.1.   Caso geral

Pesar 1 g ou mais de amostra, com uma aproximação de 1 mg. Introduzir a amostra de ensaio num balão Kjeldahl, adicionar 20 ml de ácido sulfúrico (ponto 3.5) agitar para impregnar completamente a substância com ácido e evitar que adira às paredes do balão, aquecer e manter em ebulição durante 10 minutos. Deixar arrefecer ligeiramente, adicionar 2 ml de ácido nítrico (ponto 3.4), aquecer lentamente, deixar arrefecer ligeiramente, juntar de novo um pouco de ácido nítrico (ponto 3.4) e levar à ebulição. Repetir estas operações até à obtenção de uma solução incolor. Arrefecer, juntar um pouco de água, transferir o líquido para um balão volumétrico de 500 ml, enxaguando o balão de Kjeldahl com água quente. Deixar arrefecer, completar o volume com água, homogeneizar e filtrar.

5.1.2.   Amostras contendo substâncias orgânicas e isentas de di-hidrogenofosfatos de cálcio e de magnésio

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 2,5 g de amostra num cadinho de incineração. Misturar intimamente a amostra de ensaio com 1 g de carbonato de cálcio (ponto 3.1). Incinerar na mufla a 550 °C até à obtenção de cinzas brancas ou cinzentas (uma pequena quantidade de carvão não prejudica). Transferir as cinzas para um copo de precipitação de 250 ml. Juntar 20 ml de água e ácido clorídrico (ponto 3.2) até que cesse a efervescência. Juntar mais 10 ml de ácido clorídrico (ponto 3.2). Colocar o copo num banho de areia e evaporar até à secura para insolubilizar a sílica. Redissolver o resíduo em 10 ml de ácido nítrico (ponto 3.3) e levar à ebulição, durante 5 minutos num banho de areia ou placa de aquecimento, sem evaporar até à secura. Transferir o líquido para um balão volumétrico de 500 ml, enxaguando o copo de precipitação várias vezes com água quente. Deixar arrefecer, completar o volume com água, homogeneizar e filtrar.

5.2.   Desenvolvimento da coloração e medição da densidade ótica

Diluir uma alíquota do filtrado obtido no ponto 5.1.1 ou 5.1.2 de modo a obter uma concentração em fósforo não superior a 40 μg/ml. Introduzir 10 ml desta solução num tubo de ensaio (ponto 4.6) e adicionar 10 ml do reagente vanadomolíbdico (ponto 3.6). Homogeneizar e deixar repousar 10 minutos, pelo menos, à temperatura de 20 °C. Medir a densidade ótica em espetrofotómetro a 430 nm por comparação com uma solução obtida por adição de 10 ml do reagente vanadomolíbdico (ponto 3.6) a 10 ml de água.

5.3.   Curva de calibração

A partir da solução-padrão (ponto 3.7) preparar soluções contendo respetivamente 5, 10, 20, 30 e 40 μg de fósforo por ml. Tomar 10 ml de cada uma destas soluções e adicionar 10 ml do reagente vanadomolíbdico (ponto 3.6). Homogeneizar e deixar repousar 10 minutos, pelo menos, à temperatura de 20 °C. Medir a densidade ótica como indicado no ponto 5.2. Traçar a curva de calibração representando em ordenadas os valores da densidade ótica e, em abcissas, as quantidades correspondentes de fósforo. A curva é linear para concentrações compreendidas entre 0 e 40 μg/ml.

6.   Cálculo dos resultados

Recorrendo à curva de calibração, determinar a quantidade de fósforo na amostra de ensaio.

Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efetuadas com a mesma amostra não deve exceder:

—	3 % do maior dos valores, para os teores de fósforo inferiores a 5 %,

—	0,15 % em valor absoluto para os teores de fósforo iguais ou superiores a 5 %.

O.   DETERMINAÇÃO DO CLORO SOB A FORMA DE CLORETOS

1.   Objeto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o cloro dos cloretos solúveis em água, convencionalmente expressos como cloreto de sódio. É aplicável aos alimentos compostos.

2.   Princípio

Dissolvem-se os cloretos em água. Se o produto contiver matérias orgânicas, procede-se à sua clarificação. Acidifica-se ligeiramente a solução com ácido nítrico e os cloretos precipitam sob a forma de cloreto de prata com uma solução de nitrato de prata. Titula-se o excesso de nitrato de prata com uma solução de tiocianato de amónio segundo o método de Volhard.

3.   Reagentes

3.1.

Solução de tiocianato de amónio 0,1 mol/l.

3.2.

Solução de nitrato de prata 0,1 mol/l.

3.3.

Solução saturada de sulfato férrico de amónio, (NH4)Fe(SO4)2.

3.4.

Ácido nítrico, densidade: 1,38 g/ml.

3.5.

Éter dietílico.

3.6.

Acetona.

3.7.

Solução de Carrez I: dissolver em água 21,9 g de acetato de zinco, Zn(CH3COO)2·2H2O, e 3 g de ácido acético glacial. Perfazer o volume de 100 ml com água.

3.8.

Solução de Carrez II: dissolver em água 10,6 g de ferrocianeto de potássio, K4Fe(CN)6·3H2O. Perfazer o volume de 100 ml com água.

3.9.

Carvão ativado, isento de cloretos e não absorvente.

4.   Equipamento

Misturador basculante: cerca de 35 a 40 rotações por minuto.

5.   Procedimento

5.1.   Preparação da solução

Conforme o tipo de amostra, preparar uma solução como se indica no ponto 5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3.

Efetuar ao mesmo tempo, sem a amostra, um ensaio em branco.

5.1.1.   Amostras sem matéria orgânica

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, uma amostra de ensaio não superior a 10 g, que não contenha mais de 3 g de cloro sob a forma de cloretos, e introduzi-la, com 400 ml de água, num balão volumétrico de 500 ml, a cerca de 20 °C. Misturar durante 30 minutos no misturador, completar o volume, homogeneizar e filtrar.

5.1.2.   Amostras com matéria orgânica, à exceção dos produtos mencionados no ponto 5.1.3

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g de amostra e introduzi-la com 1 g de carvão ativado num balão volumétrico de 500 ml. Adicionar 400 ml de água a cerca de 20 °C e 5 ml de solução de Carrez I (ponto 3.7), agitar durante 30 segundos e juntar em seguida 5 ml de solução de Carrez II (ponto 3.8). Misturar durante 30 minutos no misturador, completar o volume, homogeneizar e filtrar.

5.1.3.   Alimentos cozidos, bagaços e farinha de linhaça, produtos ricos em farinha de linhaça e outros produtos ricos em mucilagens ou substâncias coloidais (amido dextrinado, por exemplo)

Preparar a solução como se indica no ponto 5.1.2, mas sem filtrar. Decantar (se necessário, centrifugar), recolher 100 ml do líquido sobrenadante e introduzi-lo num balão volumétrico de 200 ml. Adicionar acetona (ponto 3.6), completando o volume, homogeneizar e filtrar.

5.2.   Titulação

Com uma pipeta, transferir para um balão de Erlenmeyer 25 a 100 ml do filtrado (dependendo do teor presumido de cloro) obtido no ponto 5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3. A alíquota não deverá conter mais de 150 mg de cloro (Cl). Se for necessário, diluir com água, para obter, pelo menos, 50 ml de filtrado, juntar 5 ml de ácido nítrico (ponto 3.4), 2 ml de solução saturada de sulfato férrico de amónio (ponto 3.3) e duas gotas de solução de tiocianato de amónio (ponto 3.1), que se deitam com uma bureta cheia até à marca zero. Em seguida, juntar-lhe a solução de nitrato de prata (ponto 3.2) com uma bureta até obter um excesso de 5 ml. Adicionar 5 ml de éter dietílico (ponto 3.5) e agitar fortemente para formar o precipitado. Titular o excesso de nitrato de prata com a solução de tiocianato de amónio (ponto 3.1) até a viragem para vermelho acastanhado se manter durante um minuto.

6.   Cálculo dos resultados

O teor de cloro (X), expresso em percentagem de cloreto de sódio, é dado pela seguinte fórmula:

em que:

V1	=	ml de solução de nitrato de prata 0,1 mol/l adicionada,
V2	=	ml da solução de tiocianato de amónio 0,1 mol/l gasta na titulação,
m	=	gramas da alíquota de amostra.

Se o ensaio em branco revelar que houve consumo de solução de nitrato de prata 0,1 mol/l, subtrair o valor da quantidade consumida ao volume (V1 - V2).

7.   Observações

7.1.

A titulação pode igualmente fazer-se por potenciometria ou amperometria.

7.2.

Para os produtos muito ricos em matérias gordas, proceder a um desengorduramento prévio com éter dietílico ou éter de petróleo.

7.3.

Para as farinhas de peixe, a titulação pode ser efetuada pelo método de Mohr.