„I PRIEDAS

ĖMINIŲ ĖMIMO METODAI

1.   TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Ėminiai, skirti oficialiai pašarų kontrolei, imami pagal toliau aprašytus metodus. Taip gauti ėminiai laikomi reprezentatyviosiomis atrinktosiomis dalimis.

Reprezentatyviojo ėminių ėmimo tikslas yra gauti mažą dalį iš partijos tokiu būdu, kad nustatytos šiai daliai būdingos savybės rodytų partijos savybės vidutinę vertę. Partijos ėminiai sudaromi pakartotinai imant atskiruosius ėminius skirtingose partijos vietose. Atskirieji ėminiai sudedami ir sumaišomi, kad sudarytų jungtinį ėminį, iš kurio dalijant į visumos savybes rodančias dalis paruošiami reprezentatyvieji galutiniai ėminiai.

Jei atliekant regimąjį patikrinimą arba remiantis kita svarbia informacija nustatoma, kad pašarų partijos dalių, iš kurių turi būti paimti ėminiai, kokybė skiriasi nuo kitų tos pačios partijos pašarų, tokios partijos atskiriamos nuo likusių pašarų ir traktuojamos kaip atskira partijos dalis. Jei pašarų neįmanoma padalyti į atskiras partijos dalis, pašarai laikomi viena partija. Tokiais atvejais šis faktas paminimas ėminių ėmimo ataskaitoje.

Jei nustatoma, kad pašarai, kurių ėminiai paimti laikantis šio reglamento nuostatų, neatitinka ES reikalavimų ir yra tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalis, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

Taip pat gali būti imami pašarų, kuriuos pašarų ūkio subjektai siūlo parduoti nuotolinio ryšio priemonėmis pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglamento (EB) Nr. 767/2009 11 straipsnio 3 dalį (1), ėminiai. Imant nuotolinio ryšio priemonėmis parduodamų pašarų ėminius iš esmės taikomi šiame priede nustatyti punktai. Konkretūs nuotoliniu būdu parduodamų pašarų ėminių ėmimo aspektai aprašyti 11 punkte.

2.   APIBRĖŽTYS

—

Partija – nustatytas pašarų kiekis, kuriam būdingos vienodos savybės, pavyzdžiui, kilmė, veislė, pakuotės tipas, pakuotojas, siuntėjas arba ženklinimas, o gamybos proceso atveju – vienos gamybos įmonės produkcijos vienetas, pagamintas naudojant vienodus gamybos parametrus, arba keletas tokių vienetų, pagamintų vienas po kito ir laikomų kartu.

—	Atrinktoji dalis – partija arba nustatyta partijos dalis.

—	Užplombuotas ėminys – ėminys, užplombuotas taip, kad prie jo nebūtų galima prieiti nepažeidus arba nenuėmus plombos.

—	Atskirasis ėminys – kiekis, paimtas iš vienos atrinktosios dalies vietos.

—	Jungtinis ėminys – atskirųjų ėminių, paimtų iš vienos atrinktosios dalies, visuma.

—	Sumažintasis ėminys – jungtinio ėminio dalis, atspindinti jo visumą, gauta reprezentatyviosios redukcijos metodu.

—	Galutinis ėminys – jungtinio ėminio (sumaišyto), sumažintojo arba homogenizuoto jungtinio ėminio dalis, priklausomai nuo kontrolės tipo (žr. 9.4 punktą).

—	Laboratorinis ėminys – laboratorijai skirtas ėminys (gautas laboratorijos), kuris gali būti galutinis, sumažintasis arba jungtinis ėminys.

—	Nuotoliniu būdu parduodamų pašarų ėminys – pašarų, siūlomų parduoti nuotolinio ryšio priemonėmis, partijos ėminys.

3.   BENDROSIOS NUOSTATOS

—	Ėminius ima pareigūnai, kuriuos tam įgalioja kompetentinga institucija.

—	Kai imamas nuotoliniu būdu parduodamų pašarų ėminys, kompetentinga institucija pašarų ūkio subjekto paprašo nuotolinio ryšio priemonėmis jai pateikti tam tikrą pašarų kiekį.

—	Ėminys turi būti užplombuotas taip, kad jo negalima būtų atidaryti nepažeidus arba nenuėmus plombos.

Plombos žymuo turi būti aiškus ir gerai matomas.

—	Ėminio identifikavimas. Ėminys turi būti pažymėtas nenutrinamomis priemonėmis ir privalo būti identifikuotas tokiu būdu, kad jį būtų galima vienareikšmiai susieti su ėminių ėmimo ataskaita.

—

Iš kiekvieno jungtinio arba sumažintojo ėminio imama bent po du galutinius ėminius: bent vieną ėminį kontrolei atlikti (vykdymo užtikrinimo tikslais) ir bent vieną ėminį – pašarų ūkio subjektui (teisių gynimo tikslais). Galiausiai, dar vienas galutinis ėminys gali būti laikomas kontroliniu ėminiu. Jei visas jungtinis ėminys yra homogenizuotas, galutiniai ėminiai imami iš homogenizuoto jungtinio ėminio, išskyrus atvejus, kai tokia procedūra prieštarauja valstybių narių taisyklėms dėl pašarų ūkio subjekto teisių.

—

Pagal Reglamento (ES) 2017/625 15 straipsnio 1 ir 2 dalis, kai tai būtina oficialiai imant ėminius, pašarų ūkio subjektai, kai to reikalauja kompetentingos institucijos: — suteikia kompetentingų institucijų darbuotojams prieigą prie jų kontroliuojamos įrangos, taip pat, jei reikia, prie tinkamos ėminių ėmimo įrangos ir asmeninių apsaugos priemonių; — padeda kompetentingų institucijų darbuotojams ir su jais bendradarbiauja, kad jie galėtų paimti ėminius, taip pat suteikia jiems prieigą prie pašarų.

4.   APARATAS

4.1.   Ėminių ėmimo aparatas turi būti pagamintas iš medžiagų, negalinčių užteršti produktų, iš kurių imami ėminiai. Daugkartinio naudojimo aparatas turi būti lengvai valomas, kad būtų išvengiama bet kokio užteršimo.

4.2.   Aparatas, rekomenduojamas kietųjų pašarų ėminiams imti

4.2.1.   Ėminių ėmimas rankiniu būdu

4.2.1.1.

Plokščiadugnis ėminių semtuvas vertikaliais kraštais.

4.2.1.2.

Ėminių ėmimo zondas su ilgu plyšiu arba pertvaromis. Zondo matmenys turi atitikti atrinktosios dalies ypatybes (konteinerio gylį, maišo matmenis ir pan.) ir pašarų dalelių dydį. Jei ėminių ėmimo zondas turi keletą angų, siekiant užtikrinti, kad ėminiai būtų imami iš skirtingų vietų išilgai zondo, tarpai tarp angų turėtų būti vienodi arba angos turėtų būti atskirtos pertvaromis.

4.2.2.   Ėminių ėmimas mechaniniu būdu

Judančių pašarų ėminiams imti gali būti naudojamas tinkamas mechaninis aparatas. Mechaninis aparatas laikomas tinkamu, jei ėminiai imami bent iš visos srauto sekcijos.

Judančių pašarų (greito srauto) ėminiams imti gali būti naudojami automatiniai ėmikliai.

4.2.3.   Dalytuvas

Jei įmanoma ir taikoma, sumažintiesiems ėminiams ruošti reprezentatyviuoju būdu turėtų būti naudojamas aparatas, skirtas padalyti ėminį į maždaug vienodo dydžio dalis.

5.   KIEKYBINIAI REIKALAVIMAI DĖL ATSKIRŲJŲ ĖMINIŲ SKAIČIAUS

—

Kiekybiniai 5.1 ir 5.2 punktų reikalavimai dėl atskirųjų ėminių skaičiaus taikomi atrinktosioms dalims, kurios yra ne didesnės kaip 500 tonų ir iš kurių galima paimti ėminius, atspindinčius jų visumą. Aprašyta ėmimo procedūra taip pat taikoma kiekiams, didesniems nei nurodytas didžiausias atrinktosios dalies dydis, jei neatsižvelgiama į toliau 5.1.1, 5.1.3 ir 5.1.5 punktuose pateiktose lentelėse nurodytą didžiausią atskirųjų ėminių skaičių; atskirųjų ėminių skaičius nustatomas pagal procedūros atitinkamoje dalyje (žr. 5.3 punktą) pateiktą kvadratinės šaknies formulę, o mažiausias jungtinio ėminio dydis proporcingai padidinamas. Tai nereiškia, kad didelės partijos dėl to negalima padalyti į mažesnes partijos dalis ir imti ėminių iš partijos kiekvienos dalies laikantis 5.1 ir 5.2 punktuose aprašytos procedūros.

—	Atrinktoji dalis turi būti tokia, kad iš jos būtų galima paimti kiekvienos jos sudedamosios dalies ėminį.

—	Jei partijos arba partijų dalys yra labai didelės (> 500 tonų) ir jei partijos gabenamos arba laikomos taip, kad ėminių negalima imti pagal šio skyriaus 5.1 ir 5.2 punktuose nurodytą ėmimo procedūrą, taikoma 5.3 punkte nurodyta ėmimo procedūra.

—	Kai imami nuotoliniu būdu parduodamų pašarų ėminiai, kompetentinga institucija paprastai nežino partijos, iš kurios prašomas tam tikras kiekis, dydžio. Todėl 5.1 ir 5.2 punktuose nurodyta procedūra negali būti taikoma. Tokiu atveju taikoma 11 punkte aprašyta procedūra.

—

Jei pašarų ūkio subjektui teisės aktais nustatytas reikalavimas šio reglamento laikytis pagal privalomos stebėsenos sistemą, pašarų ūkio subjektas, siekdamas atsižvelgti į darbines charakteristikas, nuo šiame punkte nustatytų kiekybinių reikalavimų gali nukrypti tik kompetentingai institucijai įtikinamai įrodęs, kad ėminių ėmimo procedūra lygiavertė reprezentatyvumo atžvilgiu, ir tik gavęs kompetentingos institucijos leidimą.

—

Išimtiniais atvejais, jeigu nustatyto ėminių ėmimo metodo neįmanoma taikyti kiekybinių reikalavimų atžvilgiu dėl nepriimtinos komercinės žalos partijai (dėl įpakavimo būdų, gabenimo priemonių, laikymo būdo ir t. t.), galima taikyti kitokį ėminių ėmimo metodą, jei jis yra kuo reprezentatyvesnis ir yra išsamiai aprašytas bei patvirtintas dokumentais.

5.1.   Kiekybiniai atskirųjų ėminių reikalavimai kontroliuojant pašaruose vienodai pasiskirsčiusias medžiagas arba produktus

5.1.1.   Piltiniai kietieji pašarai

Atrinktosios dalies dydis	Mažiausias atskirųjų ėminių skaičius
≤ 2,5 tonos	7
> 2,5 tonos	kvadratinė šaknis iš 20 kartų atrinktąją dalį sudarančių tonų skaičiaus (*1) , bet ne daugiau kaip 40 atskirųjų ėminių

5.1.2.   Piltiniai skystieji pašarai

Atrinktosios dalies dydis	Mažiausias atskirųjų ėminių skaičius
≤ 2,5 tonos arba ≤ 2 500 litrų	4  (*2)
> 2,5 tonos arba > 2 500 litrų	7  (*2)

5.1.3.   Supakuoti pašarai

Pašarai (kietieji ir skystieji) gali būti supilti į maišelius, maišus, skardines, statines ir kt., nurodytus toliau pateiktoje lentelėje kaip pakavimo vienetai. Iš didelių vienetų (≥ 500 kg arba litrų) ėminiai turi būti imami laikantis piltiniams pašarams nustatytų nuostatų (žr. 5.1.1 ir 5.1.2 punktus).

Atrinktosios dalies dydis	Mažiausias vienetų, iš kurių reikia paimti (bent) vieną atskirąjį ėminį, skaičius (*3)
1 –20 vienetų	1 vienetas (*4)
21 –150 vienetų	3 vienetai (*4)
151 –400 vienetų	5 vienetai (*4)
> 400 vienetų	¼ atrinktąją dalį sudarančių vienetų skaičiaus kvadratinės šaknies (*5) , bet ne daugiau kaip 40 vienetų

5.1.4.   Pašarų briketai ir mineralų laižalai

Bent vienas briketas arba laižalas, iš kurio imamas ėminys, 25 vienetų atrinktajai daliai, bet ne daugiau kaip keturi briketai arba laižalai.

Jei briketai arba laižalai sveria ne daugiau kaip po 1 kg, atskirasis ėminys yra vieno briketo arba vieno laižalo turinys.

5.1.5.   Stambieji pašarai / pašariniai augalai

Atrinktosios dalies dydis	Mažiausias atskirųjų ėminių skaičius (*6)
≤ 5 tonos	5
> 5 tonos	kvadratinė šaknis iš 5 kartų atrinktąją dalį sudarančių tonų skaičiaus (*7) , bet ne daugiau kaip 40 atskirųjų ėminių

5.2.   Kiekybiniai atskirųjų ėminių reikalavimai kontroliuojant pašaruose tikėtinai nevienodai pasiskirsčiusias sudedamąsias dalis ar medžiagas

Šie kiekybiniai atskirųjų ėminių reikalavimai taikytini tokiomis aplinkybėmis:

—	kontroliuojant aflatoksinus, rugių skalsę, kitus mikotoksinus ir kenksmingas botanines priemaišas pašarinėse žaliavose;

—	kontroliuojant kryžminę taršą sudedamąja dalimi, įskaitant genetiškai modifikuotą medžiagą arba medžiagą, kuri, manoma, nevienodai pasiskirsčiusi pašaruose.

Jei kompetentinga kontrolės institucija pagrįstai įtaria, kad toks nevienodas pasiskirstymas taip pat galimas kryžminės taršos sudedamąja dalimi arba kombinuotųjų pašarų medžiaga atveju, gali būti taikomi lentelėje toliau nurodyti kiekybiniai reikalavimai.

Atrinktosios dalies dydis	Mažiausias atskirųjų ėminių skaičius
< 80 tonų	Žr. kiekybinius reikalavimus pagal 5.1 punktą. Imtinų atskirųjų ėminių skaičių reikia padauginti iš 2,5.
≥ 80 tonų	100

5.3.   Labai didelėms partijoms taikomi kiekybiniai atskirųjų ėminių reikalavimai

Jei atrinktosios dalys yra didelės (> 500 tonų), imtinų atskirųjų ėminių skaičius = 40 atskirųjų ėminių + tonų skaičiaus kvadratinė šaknis, kai atliekama vienodai pašaruose pasiskirsčiusių medžiagų arba produktų kontrolė, arba 100 atskirųjų ėminių + tonų skaičiaus kvadratinė šaknis, kai atliekama greičiausiai nevienodai pašaruose pasiskirsčiusių sudedamųjų dalių ar medžiagų kontrolė.

6.   KIEKYBINIAI JUNGTINIO ĖMINIO REIKALAVIMAI

Reikia paruošti vieną jungtinį vienos atrinktosios dalies ėminį.

	Pašarų pobūdis	Mažiausias jungtinio ėminio dydis (*8)  (*9)
6.1.	Piltiniai pašarai	4  kg
6.2.	Supakuoti pašarai	4  kg (*10)
6.3.	Skystieji arba pusiau skysti pašarai	4 litrai
6.4.	Pašarų briketai arba mineralų laižalai:
6.4.1.	kiekvieno masė didesnė kaip 1 kg	4  kg
6.4.2.	kiekvieno masė ne didesnė kaip 1 kg	keturių pirminių briketų arba laižalų masė
6.5.	Stambieji pašarai/pašariniai augalai	4  kg (*11)

7.   KIEKYBINIAI GALUTINIŲ ĖMINIŲ REIKALAVIMAI

Galutiniai ėminiai

Reikia atlikti bent vieno galutinio ėminio analizę. Analizuojamo galutinio ėminio kiekis turi būti ne mažesnis kaip:

Kietieji pašarai	500  g (*12)  (*13)  (*14)  (*15)
Skystieji arba pusiau skysti pašarai	500  ml (*12)

8.   ĖMINIŲ ĖMIMO IŠ LABAI DIDELIŲ PARTIJŲ ARBA IŠ PARTIJŲ, KURIOS LAIKOMOS ARBA GABENAMOS TAIP, KAD ĖMINIŲ ĖMIMAS IŠ VISOS PARTIJOS NĖRA ĮMANOMAS, METODAS

8.1.   Bendrieji principai

Jei dėl partijos gabenimo arba laikymo būdo neįmanoma paimti atskirųjų ėminių iš visos partijos, tokių partijų ėminius reikėtų imti tuomet, kai partija juda srautu.

Didelių sandėlių, skirtų laikyti pašarus, atveju, juos eksploatuojančius subjektus reikėtų paskatinti sandėlyje sumontuoti įrangą, kad būtų galima (automatiškai) imti ėminius iš visos sandėlyje laikomos partijos.

Kai taikoma šiame punkte nurodyta ėminių ėmimo procedūra, apie tokią procedūrą pranešama pašarų ūkio subjektui arba jo atstovui. Jei pašarų ūkio subjektui arba jo atstovui kyla abejonių dėl šios ėminių ėmimo procedūros, pašarų ūkio subjektas arba jo atstovas leidžia kompetentingai institucijai imti ėminius iš visos partijos ir pašarų ūkio subjektas padengia su tuo susijusias išlaidas.

8.2.   Laivu gabenamos didelės partijos

8.2.1.   Dinaminis ėminių ėmimas iš didelių laivu gabenamų partijų

Ėminius iš didelių partijų laivuose geriausia imti tuo metu, kai produktas juda srautu (dinaminis ėmimas).

Ėminiai imami talpų vienetais, kuriuos galima fiziškai atskirti. Vis dėlto talpos viena po kitos iš dalies ištuštinamos, kad po perkėlimo į saugyklas nebeliktų pradinio fizinio atskyrimo. Todėl ėminiai gali būti imami juos fiziškai atskiriant pačioje pradžioje arba jau perkėlus pašarus į saugyklą.

Partijai iškrauti iš laivo gali prireikti kelių dienų. Paprastai ėminiai turi būti imami reguliariu intervalu visą partijos iškrovimo laiką. Vis dėlto tai ne visada įmanoma ar tinkama, nes valstybinis inspektorius negali būti toje vietoje visą partijos iškrovimo laiką. Todėl ėminius leidžiama imti iš visos partijos dalies (atrinktosios dalies). Atskirųjų ėminių skaičius nustatomas atsižvelgiant į atrinktosios dalies dydį.

Jei ėminiai imami iš tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalies ir jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

NET jei oficialus ėminys imamas automatiškai, inspektoriui dalyvauti būtina. Vis dėlto, jei automatinis ėmimas atliekamas vadovaujantis iš anksto nustatytais parametrais, kurių negalima keisti imant ėminius, o atskirieji ėminiai surenkami į talpyklą, kuri užplombuojama apsaugant nuo bet kokių pažeidimų, tuomet inspektoriui būtina dalyvauti tik ėminių ėmimo pradžioje, kiekvieną kartą, kai reikia pakeisti ėminių talpyklą, ir ėminių ėmimo pabaigoje.

8.2.2.   Statinis ėminių ėmimas iš laivu gabenamų partijų

Jei ėminiai imami statiniu būdu, turi būti taikoma tokia pati procedūra, kokia numatyta iš viršaus pasiekiamoms laikymo patalpoms (silosinėms) (žr. 8.4.1 punktą).

Ėminiai turi būti imami iš (iš viršaus) pasiekiamos partijos dalies. Atskirųjų ėminių skaičius nustatomas atsižvelgiant į atrinktosios dalies dydį. Jei ėminiai imami iš tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalies ir jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

8.3.   Ėminių ėmimas iš didelių sandėliuose laikomų partijų

Ėminių ėmimas atliekamas prieinamoje partijos dalyje. Atskirųjų ėminių skaičius nustatomas atsižvelgiant į atrinktosios dalies dydį. Jei ėminiai imami iš tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalies ir jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

8.4.   Ėminių ėmimas iš laikymo patalpų (silosinių)

8.4.1.   Ėminių ėmimas iš silosinių, (lengvai) pasiekiamų iš viršaus

Ėminių ėmimas atliekamas prieinamoje partijos dalyje. Atskirųjų ėminių skaičius nustatomas atsižvelgiant į atrinktosios dalies dydį. Jei ėminiai imami iš tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalies ir jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

8.4.2.   Ėminių ėmimas iš silosinių, nepasiekiamų iš viršaus (uždaros silosinės)

8.4.2.1.   Didesnės nei 100 tonų silosinės, kurios yra nepasiekiamos iš viršaus (uždaros silosinės)

Tokiose silosinėse laikomų pašarų ėminių negalima imti statiniu būdu. Jei reikia imti ėminį iš silosinėje laikomų pašarų ir nėra galimybės siuntos pajudinti, su silosinę eksploatuojančiu subjektu susitariama, kad jis inspektoriui praneš, kada silosinės turinys bus iškraunamas, kad būtų galima paimti ėminius pašarams judant srautu.

8.4.2.2.   Mažesnės nei 100 tonų silosinės, kurios yra nepasiekiamos iš viršaus (uždaros silosinės)

Per ėminių ėmimo procedūrą į talpyklą paimamas 50–100 kg pašarų kiekis, tada iš jo imami ėminiai. Jungtinio ėminio dydis priklauso nuo visos partijos dydžio, o atskirųjų ėminių skaičius yra susijęs su siloso, paimto į talpyklą ėminiams, kiekiu. Jei ėminiai imami iš tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalies ir jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

8.5.   Piltinių pašarų dideliuose uždaruose konteineriuose ėminių ėmimas

Ėminius iš tokių partijų dažnai galima imti tik tuomet, kai partijos yra iškrautos. Tam tikrais atvejais konteinerių turinio neįmanoma iškrauti importo ar kontrolės punkte, todėl ėminiai turėtų būti imami konteinerių turinį iškrovus.

9.   ĖMINIŲ ĖMIMO, RUOŠIMO IR PAKAVIMO INSTRUKCIJOS

9.1.   Bendrosios nuostatos

Ėminiai turi būti imami ir ruošiami nedelsiant, laikantis atsargumo priemonių, kurios yra būtinos siekiant užtikrinti, kad produktas nepakistų ir nebūtų užterštas. Įrankiai ėminiams imti, atitinkami paviršiai ir konteineriai, kuriuose jie laikomi, turi būti švarūs ir sausi.

9.2.   Atskirieji ėminiai

Atskirieji ėminiai turi būti imami atsitiktinai ir tolygiai iš visos atrinktosios dalies ir jie turi būti maždaug vienodo dydžio.

Atskirojo ėminio dydis yra ne mažesnis nei 100 g arba, jei tai yra stambieji pašarai arba pašariniai augalai, kurių savitasis tankis yra mažas, 25 g.

Jei laikantis 8 punkte nurodytų ėmimo procedūros taisyklių būtina imti mažiau nei 40 atskirųjų ėminių, atskirųjų ėminių dydis nustatomas atsižvelgiant į nustatytą jungtinio ėminio dydį (žr. 6 punktą).

Jeigu ėminiai imami iš supakuotų pašarų mažų partijų, kai, laikantis kiekybinių reikalavimų, reikia imti nedidelį atskirųjų ėminių skaičių, atskirasis ėminys yra vieno pradinio vieneto, kurio turinys yra ne didesnis kaip 1 kg ar 1 litras, turinys.

Jei imami į mažus vienetus (pvz., < 250 g) supakuotų pašarų ėminiai, atskirojo ėminio dydis priklauso nuo vieneto dydžio.

Kai imami nuotoliniu būdu parduodamų pašarų ėminiai, atskirojo ėminio dydis priklauso nuo vieneto dydžio ir atskirais atvejais jame taip pat gali būti mažiau kaip 100 g arba 100 ml.

9.2.1.   Piltiniai pašarai

Jei tinka, ėminius galima imti keičiant atrinktosios dalies vietą (kraunant arba iškraunant).

9.2.2.   Supakuoti pašarai

Atrinkus ėminiams imti reikiamą vienetų skaičių, kaip nurodyta 5 punkte, kiekvieno vieneto turinio dalis paimama semtuvu arba zondu. Prireikus ėminiai imami atskirai ištuštinus vienetus.

9.2.3.   Homogeniniai arba homogenizuojami skystieji arba pusiau skysti pašarai

Atrinkus ėminiams imti reikiamą vienetų skaičių, kaip nurodyta 5 punkte, jų turinys prireikus homogenizuojamas ir iš kiekvieno vieneto paimamas tam tikras kiekis.

Atskiruosius ėminius galima imti išpilant talpyklos turinį.

9.2.4.   Nehomogenizuojami skystieji arba pusiau skysti pašarai

Atrinkus ėminiams imti reikiamą vienetų skaičių, kaip nurodyta 5 punkte, ėminiai imami iš skirtingų lygių.

Be to, ėminius galima imti išpilant turinį, tačiau pirmosios dalys turėtų būti pašalinamos kaip netinkamos.

Abiem atvejais suminis paimto ėminio tūris neturi būti mažesnis kaip 10 litrų.

9.2.5.   Pašarų briketai ir mineralų laižalai

Atrinkus ėminiams imti reikiamą pašarų briketų arba laižalų skaičių, kaip nurodyta 5 punkte, galima imti kiekvieno briketo arba laižalo dalį. Jei įtariama, kad briketas arba laižalas yra nehomogeninis, kaip ėminį galima imti visą briketą arba laižalą.

Jei briketai arba laižalai sveria ne daugiau kaip po 1 kg, atskirasis ėminys yra vieno briketo arba vieno laižalo turinys.

9.3.   Jungtinių ėminių ruošimas

Atskirieji ėminiai sumaišomi, kad būtų gautas vienas jungtinis ėminys.

9.4.   Galutinių ėminių ruošimas

Jungtinio ėminio medžiaga kruopščiai sumaišoma (2).

Kiekvienas ėminys sudedamas į atitinkamą konteinerį/talpyklą. Imamasi visų reikalingų atsargumo priemonių, kad gabenant arba saugant negalėtų pasikeisti ėminio sudėtis, jis nebūtų užterštas arba sufalsifikuotas.

9.4.1.   Vienodai pasiskirsčiusios medžiagos

Jei tikrinamos sudedamosios dalys arba vienodai pašaruose pasiskirsčiusios medžiagos, jungtinis ėminys gali būti reprezentatyviai sumažinamas bent iki 2,0 kg arba 2,0 litro (sumažintasis ėminys) (3), geriausia naudojant mechaninį arba automatinį dalytuvą. Jei atliekama pesticidų liekanų ankštiniuose augaluose, javų grūduose ir medžių riešutuose kontrolė, mažiausias sumažintojo ėminio kiekis yra 3 kg. Jei dėl pašarų pobūdžio neįmanoma naudoti dalytuvo arba dalytuvo nėra, ėminį galima sumažinti taikant ketvirčiavimo metodą.

Iš jungtinio ėminio arba sumažintųjų ėminių paruošiamas maždaug toks pats kiekis galutinių ėminių (kontrolės, teisių gynimo tikslais ir tam tikrais atvejais kontroliniam ėminiui) laikantis 7 punkte nurodytų kiekybinių reikalavimų.

9.4.2.   Nevienodai pasiskirsčiusios medžiagos

Atliekant sudedamųjų dalių, įskaitant genetiškai modifikuotas medžiagas, arba medžiagų, kurios, tikėtina, yra nevienodai pasiskirsčiusios pašaruose, kontrolę, jungtinis ėminys yra:

i)	visiškai homogenizuojamas. Paskui iš homogenizuoto jungtinio ėminio paimamas maždaug toks pats kiekis galutinių ėminių (kontrolės, teisių gynimo tikslais ir tam tikrais atvejais kontroliniam ėminiui) laikantis 7 punkte nurodytų kiekybinių reikalavimų; arba

ii)

sumažinamas iki bent 2 kg arba 2 litrų (4) naudojant mechaninį arba automatinį dalytuvą. Tik tuo atveju, jei dėl pašarų pobūdžio negalima naudoti dalytuvo, ėminį, jei reikia, galima sumažinti taikant ketvirčiavimo metodą. Siekiant nustatyti, ar pašaruose nėra genetiškai modifikuotų medžiagų, pagal Reglamentą (ES) Nr. 619/2011 sumažintasis ėminys turi būti sudarytas iš ne mažiau kaip 35 000 sėklų ir (arba) grūdų masės, kad būtų galima gauti galutinius ėminius vykdymo užtikrinimo, teisių gynimo tikslais ir tam tikrais atvejais kontroliniam ėmimui, kurie būtų sudaryti iš ne mažiau kaip 10 000 sėklų ir (arba) grūdų (žr. (**) išnašą 6 punkte ir (*) išnašą 7 punkte).

Iš sumažintųjų ėminių paimamas maždaug toks pats kiekis galutinių ėminių laikantis 7 punkte nurodytų kiekybinių reikalavimų.

9.5.   Ėminių pakavimas

Konteineriai arba pakuotės plombuojami ir ženklinami taip, kad jų nebūtų galima atidaryti, nepažeidus plombos. Visa etiketė turi būti po plomba. Ėminys taip pat gali būti dedamas į talpyklą ar konteinerį, kuris uždaromas taip, kad jo negalima atidaryti nepataisomai nepažeidus talpyklos arba konteinerio, taip išvengiant talpyklos ar konteinerio panaudojimo antrą kartą.

9.6.   Ėminių siuntimas į laboratoriją

Ėminys nedelsiant siunčiamas į paskirtąją kontrolės laboratoriją kartu su analizę atliekančiam asmeniui būtina informacija.

10.   ĖMINIŲ ĖMIMO ĮRAŠAI

Turi būti daromi įrašai apie visus ėminius, kad vienareikšmiškai būtų galima nustatyti kiekvieną atrinktąją dalį ir jos dydį.

Įrašuose taip pat nurodomas bet koks nukrypimas nuo šiame reglamente nustatytos ėmimo procedūros.

Su įrašais gali susipažinti oficiali kontrolės laboratorija, be to, jie pateikiami pašarų ūkio subjektui ir (arba) pašarų ūkio subjekto paskirtai laboratorijai.

11.   NUOTOLINIU BŪDU PARDUODAMŲ PAŠARŲ ĖMINYS

—

Kai imamas nuotoliniu būdu parduodamų pašarų ėminys, pašarų ūkio subjekto prašoma nuotolinio ryšio priemonėmis pateikti tam tikrą pašarų kiekį. Šiuo atveju kompetentinga institucija, prašydama pateikti pašarų, neprivalo pašarų ūkio subjektui nurodyti savo oficialios tapatybės, ji gali tai daryti neatskleisdama tapatybės.

—

Nuotoliniu būdu parduodamų pašarų jungtinį ėminį ir galutinius ėminius iš karto gavus siuntą turi paimti šiuo tikslu įgalioti asmenys. Norint sudaryti jungtinį ėminį, atsitiktinai ir tolygiai iš suminės gautos dalies turi būti paimamas atitinkamas skaičius atskirųjų ėminių ir jie, kiek įmanoma, kruopščiai sumaišomi ir (arba) homogenizuojami, laikantis 5 punkte ir 9.2 bei 9.3 punktuose nustatytų principų. Jei pašarai supakuoti į atskirus vienetus, turėtų būti gauti ne mažiau kaip 4 vienetai, iš kurių turi būti imamas bent vienas atskirasis ėminys. Jei kiekvienu konkrečiu atveju įrodoma, kad gauti vienetai yra iš skirtingų partijų, vienetų, iš kurių imami ėminiai, skaičius turi būti sumažintas, o ėminiai imami tik iš tos pačios partijos vienetų. Kai atliekama nuotoliniu būdu parduodamų pašarų ėminio sudedamųjų dalių ar medžiagų, kurios yra nevienodai pasiskirsčiusios pašaruose, analizė, atskirųjų ėminių skaičius turi būti bent 2,5 karto didesnis už ėminių skaičių, kai atliekama vienodai pašaruose pasiskirsčiusių medžiagų analizė. Tada iš jungtinio ėminio, jei įmanoma, vadovaujantis 9.4 punkte nustatytais principais, imami atitinkami galutiniai ėminiai (kontrolei, teisių gynimo tikslais ir tam tikrais atvejais kontroliniam ėminiui), o ėminių ėmimo įrašuose nurodoma, kad tai yra nuotoliniu būdų parduodamų pašarų ėminys. Tada kompetentinga institucija nedelsdama informuoja pašarų ūkio subjektą apie ėminių ėmimą. Pašarų ūkio subjektui taip pat pranešama, kad kompetentinga institucija, jei įmanoma, vieną ėminį saugo konkrečioje vietoje teisių gynimo tikslais arba kad jis siunčiamas pašarų ūkio subjektui arba pašarų ūkio subjekto pagal galiojančias nacionalines taisykles nurodytai laboratorijai. Jei ėminys siunčiamas tiesiai oficialiai laboratorijai, galutinį ėminį laboratorijoje turi paruošti ir užplombuoti šiuo tikslu įgalioti asmenys arba tam tikslui įgaliotų asmenų akivaizdoje. Suformavus galutinius ėminius, nuotoliniu būdu parduodamų pašarų ėminio ėmimo įrašai turi būti nedelsiant siunčiami kompetentingai institucijai, o ji apie ėminių ėmimą informuoja pašarų ūkio subjektą. Laikoma, kad pašarų ūkio subjekto kompetentingai institucijai pateiktas kiekis yra tos pačios klasės ar to paties aprašymo pašarų partijos dalis. Pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglamento (EB) Nr. 178/2002 (5) 15 straipsnį, jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida (taip pat ir tada, kai tai yra nuotoliniu būdų parduodamų pašarų ėminys), kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus (jei reikia, atlikus patikrinimą vietoje) nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

„II PRIEDAS

BENDROSIOS NUOSTATOS DĖL PAŠARŲ ANALIZĖS METODŲ

A.   ĖMINIŲ RUOŠIMAS ANALIZEI

1.   Tikslas

Šiame priede aprašytos procedūros taikomos analizei ruošiant į kontrolės laboratorijas atsiųstus ėminius, paimtus pagal I priede pateiktas nuostatas.

Šie laboratoriniai ėminiai turi būti ruošiami taip, kad pagal analizės metodą sverti numatyto kiekio ėminiai būtų homogeniniai ir atitiktų galutinius ėminius.

Laikomasi ne tik šiame priede aprašytų procedūrų, bet ir standarte EN ISO 6498 nustatytų ėminių ruošimo gairių.

2.   Taikytinos atsargumo priemonės

Ėminių ruošimo procedūra, kurios reikia laikytis, priklauso nuo taikomo analizės metodo ir nuo tikrintinų sudedamųjų dalių ir medžiagų. Todėl labai svarbu, kad ėminių ruošimo procedūra atitiktų taikomą analizės metodą ir tikrintinas sudedamąsias dalis ar medžiagas.

Visi būtini veiksmai turi būti atlikti taip, kad kuo labiau būtų išvengta ėminio užteršimo ir jo sudėties pokyčių.

Smulkinama, maišoma ir sijojama nedelsiant, kad ėminį kuo mažiau veiktų oras ir šviesa. Nenaudojami malūnėliai ir smulkintuvai, kurie gali gerokai įkaitinti ėminį.

Šilumai ypač jautrių pašarų ėminius rekomenduojama smulkinti rankiniu būdu. Be to, užtikrinama, kad pati aparatūra nebūtų užteršimo šaltiniu.

Įrodyta, kad tam tikrais atvejais, kai ėminys homogenizuojamas paruošiant suspensiją vien tik gerai sumaišant su vandeniu, susidaro homogeniškesni poėminiai nei tie, kuriuos galima gauti smulkinant ir homogenizuojant sausuoju būdu, ypač kai cheminės medžiagos pasiskirsčiusios vienodai. Tačiau kai homogenizuojama pakankamai ilgai smulkinant sausuoju būdu taip pat galima gauti homogeninius poėminius.

Tam tikrais atvejais, pvz., nustatant rugių skalsę, kenksmingas botanines priemaišas ir kt., ėminys homogenizuojamas ne jį susmulkinant, o pakankamai gerai sumaišant.

Jei ruošiant ėminį neįmanoma užtikrinti, kad gerokai nepakistų jo drėgmės kiekis, drėgmės kiekis nustatomas prieš ėminio ruošimą ir jį paruošus pagal III priedo A dalyje nurodytą metodą.

3.   Procedūra

3.1.   Bendroji procedūra

Tiriamoji alikvotinė dalis paimama iš galutinio homogenizuoto ėminio. Kūgio supylimo ir ketvirčiavimo metodas nerekomenduojamas, nes gali būti gautos alikvotinės dalys su didele dalijimo paklaida.

3.1.1.   Pašarai, kuriuos galima smulkinti be paruošimo

—	Galutinis ėminys sumaišomas ir sudedamas į tinkamą švarų ir sausą, sandariai užkemšamą konteinerį. Prieš sveriant analizei reikiamas ėminio kiekis (tiriamoji alikvotinė dalis) dar kartą sumaišomas, siekiant užtikrinti visišką vientisumą.

3.1.2.   Pašarai, kurie prieš juos smulkinant džiovinami

—	Jei analizės metoduose nenurodyta kitaip, galutinis ėminys džiovinamas drėgmės kiekiui sumažinti iki 8–12 % taikant pradinio džiovinimo procedūrą, aprašytą III priedo A dalyje pateikto drėgmės nustatymo metodo 4.3 punkte. Tada tęsiama, kaip nurodyta 3.1.1. punkte.

3.1.3.   Skystieji arba pusiau skysti pašarai

—	Galutinis ėminys supilamas į tinkamą švarų ir sausą, sandariai užkemšamą konteinerį. Prieš sveriant analizei reikiamas ėminio kiekis (tiriamoji alikvotinė dalis) dar kartą kruopščiai sumaišomas, siekiant užtikrinti visišką vientisumą.

3.1.4.   Kiti pašarai

—	Galutiniai ėminiai, kurių neįmanoma paruošti pagal kurią nors pirmiau pateiktą procedūrą, apdorojami taikant bet kurią kitą procedūrą, kuria būtų užtikrinta, kad analizei pasverti ėminiai (tiriamoji alikvotinė dalis) būtų homogeniniai ir reprezentuotų galutinius ėminius.

3.2.   Speciali procedūra atliekant regimąjį patikrinimą, tiriant mikroskopu arba tais atvejais, kai visas jungtinis ėminys yra homogenizuotas

—	Atliekant regimąjį patikrinimą (nenaudojant mikroskopo), patikrinimui naudojamas visas jungtinis arba galutinis ėminys.

—

Jei tiriama naudojant mikroskopą, laboratorija gali sumažinti jungtinį ėminį arba dar labiau sumažinti sumažintąjį ėminį. Galutiniai ėminiai teisių gynimo tikslais ir tam tikrais atvejais kontroliniam ėminiui imami laikantis tokios pačios procedūros kaip galutinio ėminio reikalavimų vykdymo procedūra.

—	Jei homogenizuotas visas jungtinis ėminys, galutiniai ėminiai imami iš homogenizuoto jungtinio ėminio.

—

Siekiant nustatyti rugių skalsę ir kenksmingas botanines priemaišas, galutinį ėminį reikia padalyti į du maždaug 500 gramų masės poėminius. Tiriamas vienas poėminis. Jei poėminių rezultatas yra ne didesnis kaip 50 % didžiausios leidžiamosios koncentracijos (analizės riba), ėminys atitinka didžiausią leidžiamąją koncentraciją. Jei rezultatas viršija 50 % didžiausios leidžiamosios koncentracijos, reikia ištirti kitą poėminį ir siekiant patikrinti, ar laikomasi didžiausios leidžiamosios koncentracijos, naudojamas dviejų poėminių rezultatų vidurkis.

4.   Ėminių laikymas

Ėminiai turi būti laikomi temperatūroje, kurioje nekistų jų sudėtis. Vitaminų analizei skirti ėminiai arba šviesai ypač jautrūs ėminiai laikomi tokiomis sąlygomis, kad ėminio neigiamai nepaveiktų šviesa.

B.   NUOSTATOS DĖL ANALIZĖS METODAMS NAUDOJAMŲ REAGENTŲ IR APARATŪROS

1.

Jei analizės metoduose nenurodyta kitaip, visi analiziniai reagentai turi būti analitiškai gryni (a. g.). Atliekant pėdsakų analizę, reagentų grynumas turi būti patikrintas atliekant tuščiąjį bandymą. Atsižvelgiant į gautą rezultatą, gali tekti papildomai gryninti reagentus.

2.

Visoms tirpalų ruošimo, skiedimo, skalavimo arba plovimo operacijoms, minimoms analizės metoduose, nenurodant naudojamo tirpiklio arba skiediklio tipo, turi būti naudojamas vanduo. Paprastai vanduo demineralizuojamas arba distiliuojamas. Konkrečiais atvejais, nurodytais analizės metode, jam turi būti taikomos specialios gryninimo procedūros.

3.

Atsižvelgiant į paprastai kontrolės laboratorijų turimą įrangą, analizės metoduose nurodomi tik specialios paskirties arba tam tikru būdu naudojami prietaisai ir aparatūra. Jie turi būti švarūs, ypač kai reikia nustatyti labai mažus cheminių medžiagų kiekius.

C.   ANALIZĖS METODŲ TAIKYMAS IR REZULTATŲ IŠRAIŠKA

1.   Ekstrahavimo procedūra

Keliems metodams yra nustatyta tam tikra ekstrahavimo procedūra. Paprastai galima taikyti kitas nei metodui nustatyta ekstrahavimo procedūras, jei įrodoma, kad analizuojamai matricai taikant tą kitą procedūrą gautas ekstrahavimo veiksmingumas atitinka metodu nustatytos procedūros veiksmingumą.

2.   Gryninimo procedūra

Keliems metodams yra nustatyta tam tikra gryninimo procedūra. Paprastai galima taikyti kitas nei metodui nustatyta gryninimo procedūras, jei įrodoma, kad analizuojamai matricai taikant tą kitą procedūrą gauti analizės rezultatai atitinka rezultatus, gautus taikant metodu nustatytą procedūrą.

3.   Nustatymų skaičius

Jei analizuojant nepageidaujamas medžiagas, pirmojo nustatymo rezultatas yra gerokai (> 50 %) mažesnis nei kontroliuojama specifikacijos vertė, papildomas nustatymas nebūtinas, jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros. Kitais atvejais kartotinė analizė (antrasis nustatymas) yra būtina tam, kad būtų pašalinta ėminių vidinio tarpusavio užteršimo arba atsitiktinio sumaišymo galimybė. Tolesniam vertinimui naudojama dviejų nustatymų vidutinė vertė.

Jei atliekant mažiausios arba didžiausios leidžiamosios pašarų priedų koncentracijos kontrolę pirmojo nustatymo rezultatas yra didesnis nei mažiausia koncentracija arba mažesnis nei didžiausia koncentracija, papildomas nustatymas nebūtinas, jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros. Kitais atvejais kartotinė analizė (antrasis nustatymas) yra būtina tam, kad būtų pašalinta ėminių vidinio tarpusavio užteršimo arba atsitiktinio sumaišymo galimybė. Tolesniam vertinimui naudojama dviejų nustatymų vidutinė vertė.

Jei atliekant nurodyto medžiagos arba sudedamosios dalies kiekio kontrolę, pirmojo nustatymo rezultatas patvirtina nurodytą kiekį, t. y. analizės rezultatas atitinka priimtiną nurodyto kiekio kitimo intervalą, papildomas nustatymas nebūtinas, jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros. Kitais atvejais kartotinė analizė (antrasis nustatymas) yra būtina tam, kad būtų pašalinta ėminių vidinio tarpusavio užteršimo arba atsitiktinio sumaišymo galimybė. Tolesniam vertinimui naudojama dviejų nustatymų vidutinė vertė (analizės rezultatų vidurkis atitinka priimtiną nurodyto kiekio kitimo intervalą arba jo neatitinka).

Kai kuriais atvejais priimtinas kitimo intervalas yra nustatytas teisės aktuose, kaip antai Europos Parlamento ir Tarybos reglamente (EB) Nr. 767/2009 ir Reglamente (ES) 2019/4 (1).

4.   Taikyto analizės metodo pateikimas ataskaitoje

Analizės ataskaitoje nurodomas taikytas analizės metodas.

5.   Analizės rezultato pateikimas ataskaitoje

Analizės rezultatas turi būti išreikštas analizės metode nustatytu būdu; nurodant atitinkamą reikšminių skaitmenų skaičių ir prireikus darant pataisą dėl drėgmės kiekio galutiniame ėminyje prieš ruošimą.

Dauguma norminių lygių (pvz., didžiausia arba mažiausia koncentracija) ES gyvūnų pašarų teisės aktuose nustatyti dėl pašarų, kurių drėgnis yra 12 %. Todėl tais atvejais, siekiant įvertinti ėminio analizės rezultatą pagal norminį lygį, analizės rezultatą pirmiausia reikia padalyti iš ėminio sausosios medžiagos kiekio (%), padauginto iš 88, kaip nurodyta šioje formulėje:

kurioje:

Mc –	:	ėminio drėgnis (%). 100 – Mc reiškia sausosios medžiagos kiekį ėminyje (%);
Rana –	:	išmatuotas ėminio analizės rezultatas;
R12 % –	:	pašarų, kurių drėgnis 12 %, rezultatas; turi būti vertinama pagal norminį lygį.

Be to, jei tenkinamos šios sąlygos:

—	analizės rezultatas yra gerokai (> 50 %) mažesnis arba didesnis už kontroliuotiną informaciją ir (arba) specifikaciją etiketėje (priklausomai nuo to, ar etiketėje pateiktoje informacijoje ir (arba) specifikacijoje nurodytas didžiausias, ar mažiausias kiekis);

—

pašarų, kurių ėminiai imami, drėgnis yra žinomas ir galima nustatyti, kad pakoregavus drėgnį vertinimas nepasikeis, tada, su sąlyga, kad taikomos tinkamos kokybės procedūros, o analizės tikslas – tik patikrinti, ar laikomasi teisės aktų nuostatų, drėgnio galima nekoreguoti (pvz., tais atvejais, kai nėra specifikacijos ar norminio lygio), išskyrus atvejus, kai tai būtina aiškinimui.

Jei analizės rezultatas koreguojamas pagal drėgnį, ta pačia tvarka taip pat turi būti pakoreguota atitinkama matavimo neapibrėžtis.

Nustatant rugių skalsę arba kenksmingas botanines priemaišas atliekant regimąjį patikrinimą arba mikroskopu drėgnio koreguoti nebūtina.

6.   Analitinio matavimo neapibrėžtis ir išgavos dydis atliekant nepageidaujamų medžiagų analizę

Dėl nepageidaujamų medžiagų, kaip apibrėžta Direktyvoje 2002/32/EB, laikoma, kad gyvūnų pašarams skirtas produktas neatitinka nustatyto didžiausio kiekio, jei manoma, kad su pašaru, kurio drėgmės kiekis yra 12 %, susijęs analizės rezultatas (dviejų nesusijusių nustatymų vidutinė vertė) viršija didžiausią kiekį, įskaitant išplėstinę analitinio matavimo neapibrėžtį, taikant aprėpties faktorių 2, kuriuo užtikrinamas maždaug 95 % pasikliovimo lygmuo, ir išgavos dydžio pataisą. Tai reiškia, kad atitikčiai įvertinti naudojama analizuojant gauta koncentracija, atlikus išgavos dydžio pataisą ir atėmus išplėstinę analitinio matavimo neapibrėžtį. Ši procedūra taikoma tais atvejais, kai galima įvertinti analizės metodo išplėstinę analitinio matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydžio pataisą (to daryti nereikia, pvz., kai atliekamas regimasis patikrinimas arba tiriama mikroskopu).

Jei ėminio, paimto teisių gynimo tikslais, analizės rezultatas viršija didžiausią kiekį (neatsižvelgiant į išplėstinę analitinio matavimo neapibrėžtį), tai patvirtina nustatytą neatitikimą kontroliniam ėminiui, jei dėl to nėra konkrečių nacionalinių taisyklių.

Analizės rezultatas užrašomas taip (jei taikant analizės metodą galima įvertinti išplėstinę analitinio matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydį):

a)

atlikus išgavos pataisą, jei tinkama ir aktualu, o ją atlikus – tai turi būti nurodoma. Turi būti nurodytas išgavos dydis, išskyrus atvejus, kai vidinė paklaidos pataisa yra procedūros dalis: paklaida yra išmatuotos vertės ir etaloninės koncentracijos vertės skirtumas. Pataisa dėl išgavos dydžio nebūtina, jei jis yra 90–110 %;

b)	kaip „x +/– U“, čia x – analizės rezultatas, U – išplėstinė analitinio matavimo neapibrėžtis, taikant aprėpties faktorių 2 (2), kuriuo užtikrinamas maždaug 95 % pasikliovimo lygmuo.

Tačiau jei analizės rezultatas yra gerokai (> 50 %) mažesnis nei kontroliuojama specifikacijos vertė ir jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros, o analizės tikslas yra tik patikrinti atitiktį teisės aktų nuostatoms, ataskaitoje išgavos dydžio bei išplėstinės analitinio matavimo neapibrėžties galima nenurodyti (pvz., kai nėra specifikacijų arba norminių lygių), nebent matavimo apibrėžtis būtų reikalinga rezultatų aiškinimui.

7.   Analitinio matavimo neapibrėžtis ir išgavos dydis atliekant pašarų priedų kiekio analizę

Siekiant patikrinti, ar esamas pašarų kiekis atitinka leidžiamą mažiausią ir didžiausią pašarų priedų kiekį, laikoma, kad jis neatitinka nustatyto mažiausio ir didžiausio kiekio, jei manoma, kad su pašaru, kurio drėgmės kiekis yra 12 %, susijęs analizės rezultatas (dviejų nesusijusių nustatymų vidutinė vertė):

—

viršija didžiausią kiekį, atsižvelgiant į išplėstinę analitinio matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydžio pataisą. Tai reiškia, kad atitikčiai įvertinti naudojama analizuojant gauta koncentracija (t. y. dviejų nustatymų vidutinė vertė), atlikus išgavos dydžio pataisą ir atėmus išplėstinę analitinio matavimo neapibrėžtį;

—

yra mažesnis už mažiausią kiekį, atsižvelgiant į išplėstinę analitinio matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydžio pataisą. Tai reiškia, kad atitikčiai įvertinti naudojama analizuojant gauta koncentracija (t. y. dviejų nustatymų vidutinė vertė), atlikus išgavos dydžio pataisą ir pridėjus išplėstinę analitinio matavimo neapibrėžtį.

Jei ėminio, paimto teisių gynimo tikslais, analizės rezultatas viršija didžiausią kiekį (neatsižvelgiant į išplėstinę analitinio matavimo neapibrėžtį), tai patvirtina nustatytą neatitikimą kontroliniam ėminiui, jei dėl to nėra konkrečių nacionalinių taisyklių.

Analizės rezultatas užrašomas taip (jei taikant analizės metodą galima įvertinti išplėstinę analitinio matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydį):

a)

atlikus išgavos pataisą, jei tinkama ir aktualu, o ją atlikus – tai turi būti nurodoma. Turi būti nurodytas išgavos dydis, išskyrus atvejus, kai vidinė paklaidos pataisa yra procedūros dalis: paklaida yra išmatuotos vertės ir etaloninės koncentracijos vertės skirtumas. Pataisa dėl išgavos dydžio nebūtina, jei jis yra 90–110 %;

b)	kaip „x +/– U“, čia x – analizės rezultatas (dviejų nustatymų vidutinė vertė), U – išplėstinė analitinio matavimo neapibrėžtis, taikant aprėpties faktorių 2 (3), kuriuo užtikrinamas maždaug 95 % pasikliovimo lygmuo.

„III PRIEDAS

ANALIZĖS METODAI, TAIKOMI PAŠARINIŲ ŽALIAVŲ IR KOMBINUOTŲJŲ PAŠARŲ SUDĖČIAI KONTROLIUOTI

A.   DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašarų drėgmės kiekį. Jei pašaruose yra lakiųjų medžiagų, pvz., organinių rūgščių, reikia turėti omenyje, kad nustatant drėgmės kiekį nustatomas didelis lakiųjų medžiagų skaičius.

Jis netaikomas analizuojant pieno gaminius kaip pašarines žaliavas ir kombinuotuosius pašarus, kuriuos iš esmės sudaro pieno gaminiai, gyvūninius ir augalinius riebalus bei aliejus arba aliejingąsias sėklas ir vaisius.

Drėgnis aliejingosiose sėklose nustatomas taikant standarte EN ISO 665 „Drėgmės ir lakiųjų medžiagų kiekio nustatymas“ nustatytą metodą, atsižvelgiant į tai, kad prieš nustatant drėgnį sojos turi būti susmulkinamos.

2.   Metodas

Ėminys džiovinamas nurodytomis sąlygomis, kurios priklauso nuo pašarų tipo. Masės sumažėjimas nustatomas sveriant. Tiriant kietuosius pašarus, kurių drėgmės kiekis didelis, būtina atlikti pradinį džiovinimą.

3.   Aparatūra

3.1.

Smulkintuvas, pagamintas iš drėgmės nesugeriančių medžiagų, kuris būtų lengvai valomas, kuriuo būtų galima greitai ir vienodai susmulkinti ėminį, per daug jam neįkaistant, ir kuris kuo geriau apsaugotų ėminį nuo sąlyčio su išorės oru ir atitiktų 4.1.1 ir 4.1.2 punktuose nustatytus reikalavimus (pvz., plaktukiniai ar vandeniu aušinami mikrosmulkintuvai, sudedamieji kūginiai malūnėliai, mažo apsisukimų dažnio arba krumpliaratiniai smulkintuvai).

3.2.

Analizinės svarstyklės, tikslumas 1 mg.

3.3.

Sausi korozijai atsparaus metalo arba stikliniai indai su sandariai uždengiamais dangčiais; darbinis paviršius tiriamajam ėminiui paskleisti maždaug 0,3 g/cm2 tankiu.

3.4.

Elektrinė pastovios temperatūros džiovinimo spinta (± 2 °C), tinkamai ventiliuojama ir užtikrinanti greitą temperatūros reguliavimą (1).

3.5.

Reguliuojama elektrinė vakuuminė džiovinimo spinta, turinti alyvos siurblį ir mechanizmą, kuriuo galima įleisti karšto sauso oro, arba naudojanti džioviklį (pvz., kalcio oksidą).

3.6.

Eksikatorius su stora perforuota metalo arba porceliano plokšte ir veiksmingu džiovikliu.

4.   Procedūra

Pastaba:

Šiame skirsnyje aprašyti veiksmai turi būti atliekami iškart atidarius ėminių pakuotes. Analizė turi būti atliekama bent du kartus.

4.1.   Ėminių ruošimas

4.1.1.   Pašarai, išskyrus pašarus pagal 4.1.2 ir 4.1.3 punktus

Paimama bent 50 g ėminio. Prireikus ėminys sutrupinamas arba sumalamas taip, kad būtų išvengta drėgmės kiekio pokyčio (žr. 6 punktą).

4.1.2.   Javai ir kruopos

Paimama bent 50 g ėminio. Susmulkinama į daleles, kurių bent 50 % išbyra per 0,5 mm akučių sietą ir ant 1 mm skersmens apvalių akučių sieto lieka ne daugiau kaip 10 %.

4.1.3.   Skysti ar pastų tipo pašarai, kuriuos daugiausia sudaro aliejai ir riebalai

Maždaug 25 g ėminio pasveriama 10 mg tikslumu, įdedamas reikiamas kiekis sauso smėlio, pasverto 10 mg tikslumu, ir maišoma tol, kol gaunamas homogeninis produktas.

4.2.   Džiovinimas

Indas su dangčiu (3.3 punktas) 30 min +/– 1 min. džiovinamas iki 103 °C įkaitintoje džiovinimo spintoje. Tada išimamas iš džiovinimo spintos ir laikomas eksikatoriuje (3.6 punktas), kad atvėstų iki kambario temperatūros.

4.2.1.   Pašarai, išskyrus pašarus pagal 4.2.2 ir 4.2.3 punktus

Indas su dangčiu pasveriamas 1 mg tikslumu. Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, ėminys supilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas. Neuždengtas indas dedamas į džiovinimo spintą, įkaitintą iki 103 °C. Indą reikia įdėti kuo greičiau, kad per daug nenukristų temperatūra spintoje. Džiovinama keturias valandas, skaičiuojant nuo to momento, kai spintos temperatūra vėl pasiekia 103 °C. Spinta atidaroma, indas nedelsiant uždengiamas dangčiu, išimamas iš spintos, laikomas 30–45 min. eksikatoriuje (3.6 punktas), kad atvėstų, ir pasveriamas 1 mg tikslumu.

Jei pašarus daugiausia (> 50 %) sudaro aliejai ir gyvūniniai bei augaliniai riebalai, džiovinama spintoje dar 30 min. 103 °C temperatūroje. Šių dviejų svėrimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,1 % drėgmės kiekio.

4.2.2.   Javai, miltai, kruopos ir rupūs miltai

Indas su dangčiu pasveriamas 0,5 mg tikslumu. Maždaug 5 g sutrupinto ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, ėminys suberiamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas. Neuždengtas indas dedamas į džiovinimo spintą, įkaitintą iki 130 °C. Indą reikia įdėti kuo greičiau, kad per daug nenukristų temperatūra spintoje. Džiovinama dvi valandas, skaičiuojant nuo to momento, kai spintos temperatūra vėl pasiekia 130 °C. Spinta atidaroma, indas nedelsiant uždengiamas dangčiu, išimamas iš spintos, laikomas 30–45 min. eksikatoriuje (3.6 punktas), kad atvėstų, ir pasveriamas 1 mg tikslumu.

4.2.3.   Kombinuotieji pašarai, kuriuose yra daugiau nei 4 % sacharozės arba laktozės: pašarinės žaliavos, pvz., saldžiosios ceratonijos ankštys, hidrolizuotieji javų produktai, salyklas, džiovinti runkelių griežiniai, žuvų sultys ir cukraus žlaugtai

Indas su dangčiu pasveriamas 0,5 mg tikslumu. Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, ėminys supilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas. Neuždengtas indas dedamas į vakuuminę džiovinimo spintą (3.5 punktas), įkaitintą iki 80–85 °C. Indą reikia įdėti kuo greičiau, kad per daug nenukristų temperatūra spintoje.

Slėgis sumažinamas iki 100 mm Hg stulpelio ir tokiame slėgyje keturias valandas džiovinama karšto sauso oro srove arba džiovikliu (20 ėminių reikia apie 300 g). Pastaruoju atveju, pasiekus nurodytą slėgį, vakuuminis siurblys išjungiamas. Džiovinimo trukmė skaičiuojama nuo to momento, kai džiovinimo spintos temperatūra vėl pakyla iki 80–85 °C. Džiovinimo spintos slėgis atsargiai padidinamas iki atmosferos slėgio. Spinta atidaroma, indas nedelsiant uždengiamas dangčiu, išimamas iš spintos, laikomas 30–45 min. eksikatoriuje (3.6 punktas), kad atvėstų, ir pasveriamas 1 mg tikslumu. Džiovinama dar 30 min. vakuuminėje džiovinimo spintoje 80–85 °C temperatūroje ir dar kartą pasveriama. Šių dviejų svėrimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,1 % drėgmės kiekio.

4.3.   Pradinis (dalinis) džiovinimas

Kad būtų galima ištirti stabilias medžiagas drėgnuose pašaruose, kuriuose sausųjų medžiagų masės dalis yra mažesnė nei 85 % (pvz., stambieji pašarai, suminiai sumaišyti daviniai, (ne)skystas pašaras), prieš smulkinant juos būtina iš dalies išdžiovinti; tiriant nestabiliąsias chemines medžiagas, dalinis džiovinimas negalimas.

Dalinis džiovinimas gali būti atliekamas naudojant krosnelę su ventiliatoriumi arba mikrobangų krosnį, arba džiovinimu šalčiu. Išskyrus džiovinimą šalčiu, pašarus siekiama išdžiovinti išlaikant žemesnę nei 60 °C ėminio temperatūrą, kad cheminė sudėtis būtų paveikta kuo mažiau. Džiovinant pašarus aukštesnėje kaip 60 °C temperatūroje jie chemiškai pakinta (pvz., baltymai pradeda irti). Prieš nustatant dalinę sausąją medžiagą, išdžiovinti pašarai maždaug 15 min. laikomi kambario temperatūroje pusiausvyrai nusistovėti, kad būtų kuo labiau sumažintas galimas drėgmės pokytis, kuris gali atsirasti smulkinant ir laikant pašarus. Džiovinant pašarus žemesnėje kaip 60 °C temperatūroje visas vanduo iš pašarų nepašalinamas; todėl (pradinis) dalinis džiovinimas nereiškia neatitinka suminės sausosios medžiagos. Po džiovinimo, nustačius kitas chemines sudedamąsias dalis, poėminis susmulkinamas ir nustatoma (galutinė) sausoji medžiaga iš dalies išdžiovintame ėminyje (likusi drėgmė 3–15 %).

Todėl sausajai medžiagai nustatyti rekomenduojama taikyti dviejų etapų procedūrą. Pirmiausia nustatomas dalinis sausųjų medžiagų kiekis (jei sausųjų medžiagų kiekis yra mažesnis kaip 85 %), tada susmulkintame tiriamajame ėminyje nustatomas likęs sausųjų medžiagų kiekis. Suminis sausųjų medžiagų kiekis apskaičiuojamas padauginus dalinį sausųjų medžiagų kiekį iš likusio sausųjų medžiagų kiekio.

5.   Rezultatų apskaičiavimas

Drėgmės kiekis ėminio masės procentais (X) apskaičiuojamas pagal šias formules:

5.1.   Džiovinimas, kai netaikomas pradinis džiovinimas

kurioje:

m –	=	tiriamojo ėminio pradinis svoris gramais;
m0 –	=	išdžiovinto tiriamojo ėminio svoris gramais.

5.2.   Džiovinimas, kai taikomas pradinis džiovinimas (2)

kurioje:

m –	=	tiriamojo ėminio pradinis svoris gramais;
m1 –	=	tiriamojo ėminio svoris po pradinio džiovinimo gramais;
m2 –	=	tiriamojo ėminio svoris po trupinimo arba smulkinimo gramais;
m0 –	=	išdžiovinto tiriamojo ėminio svoris gramais.

5.3.   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas ne didesnis nei 0,2 % drėgmės kiekio absoliučiosios vertės, išskyrus drėgną gyvūnų augintinių ėdalą ir šunų kramtalus, – šiuo atveju skirtumas turi būti ne didesnis nei 0,5 % drėgmės kiekio absoliučiosios vertės.

6.   Pastaba

Jei paaiškėja, kad ėminį būtina sutrupinti, ir pastebima, kad produkto drėgmės kiekis pakito, pašarų komponentų analizės rezultatus reikia perskaičiuoti pagal pradinės būklės ėminio drėgmės kiekį.

B.   GYVŪNINIŲ IR AUGALINIŲ RIEBALŲ BEI ALIEJŲ DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti vandens ir lakiųjų medžiagų kiekį gyvūniniuose ir augaliniuose riebaluose bei aliejuose.

2.   Metodas

Ėminys džiovinamas 103 °C temperatūroje iki pastoviosios masės (paeiliui sveriant du kartus, masės sumažėjimas turi neviršyti 1 mg). Masės sumažėjimas nustatomas sveriant.

3.   Aparatūra

3.1.

Indas plokščiu dugnu iš korozijai atsparios medžiagos, skersmuo 8–9 cm, aukštis – maždaug 3 cm.

3.2.

Maždaug 10 cm ilgio gyvsidabrio termometras, su padalomis nuo maždaug 80 °C iki bent 110 °C, su pastorintu burbuliuku ir plėtimosi vamzdžiu viršutiniame gale.

3.3.

Smėlio vonia arba elektrinė kaitlentė.

3.4.

Eksikatorius su veiksmingu džiovikliu.

3.5.

Analizinės svarstyklės.

4.   Procedūra

Į sausą pasvertą indą (3.1 punktas), į kurį įdėtas termometras (3.2 punktas), 1 mg tikslumu pasveriama apie 20 g homogenizuoto ėminio. Nuolat maišant termometru, kaitinama ant smėlio vonios arba kaitlentės (3.3 punktas) taip, kad maždaug per 7 min. temperatūra pasiektų 90 °C.

Kaitinimas sumažinamas, stebint, kaip dažnai nuo indo dugno kyla burbuliukai. Temperatūra turi būti ne aukštesnė kaip 105 °C. Maišoma toliau, braukiant per indo dugną tol, kol nebesusidaro burbuliukų.

Siekiant užtikrinti visišką drėgmės pašalinimą, dar keletą kartų kaitinama iki 103 °C ± 2 °C, kaskart tarp kaitinimų atvėsinant ėminį iki 93 °C. Tada paliekama eksikatoriuje (3.4 punktas) atvėsti iki kambario temperatūros ir pasveriama. Šis veiksmas kartojamas tol, kol, paeiliui sveriant du kartus, masės sumažėjimas nebeviršys 2 mg.

Pastaba:

Ėminio svorio padidėjimas po kartotinių kaitinimo veiksmų rodo, kad oksiduojasi riebalai, todėl šiuo atveju rezultatai skaičiuojami pagal svėrimo duomenis, gautus prieš tai, kai svoris pradėjo didėti.

5.   Rezultatų apskaičiavimas

Drėgmės kiekis ėminio procentine dalimi (X) apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

m –	=	tiriamojo ėminio svoris gramais;
m1 –	=	indo su turiniu svoris prieš kaitinimą gramais;
m2 –	=	indo su turiniu svoris po kaitinimo gramais.

Mažesni nei 0,05 % rezultatai turi būti užrašomi kaip „mažiau nei 0,05 %“.

Pakartojamumas

Dviejų to paties ėminio lygiagrečiai atliktos drėgmės kiekio analizės rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,1 % absoliučiąja verte.

C.   AZOTO KIEKIO NUSTATYMAS IR ŽALIŲ BALTYMŲ KIEKIO APSKAIČIAVIMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti žalių baltymų kiekį pašaruose pagal Kjeldalio metodu nustatomą azoto kiekį (3).

2.   Metodas

Ėminys skaidomas sieros rūgštimi esant katalizatoriui. Rūgštus tirpalas šarminamas natrio hidroksido tirpalu. Gautas amoniakas distiliuojamas ir surenkamas žinomame kiekyje sieros rūgšties, kurios perteklius titruojamas natrio hidroksido standartiniu tirpalu.

Pagal kitą metodą išsiskyręs amoniakas distiliuojamas į tirpalą su boro rūgšties pertekliumi, tada titruojama vandenilio chlorido rūgšties arba sieros rūgšties tirpalu.

3.   Reagentai

3.1.

Kalio sulfatas.

3.2.

Katalizatorius: vario (II) oksidas CuO arba vario (II) sulfato pentahidratas CuSO4 5H2O.

3.3.

Cinko granulės.

3.4.

Sieros rūgštis, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5.

Sieros rūgštis, standartinis titrimetrinis tirpalas, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6.

Sieros rūgštis, standartinis titrimetrinis tirpalas, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7.

Sieros rūgštis, standartinis titrimetrinis tirpalas, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8.

Indikatorius metilraudonasis: 300 mg metilraudonojo ištirpinama 100 ml etanolio, σ = 95–96 % (tūrinis proc., V/V).

3.9.

Natrio hidroksido tirpalas (galima naudoti techninį hidroksidą) β = 40 g/100 ml (m/V: 40 %).

3.10.

Natrio hidroksidas, standartinis titrimetrinis tirpalas, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11.

Natrio hidroksidas, standartinis titrimetrinis tirpalas, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12.

Pemzos granulės, išplautos vandenilio chlorido rūgštyje ir iškaitintos.

3.13.

Acetanilidas (lyd. temp. = 114 °C, N kiekis = 10,36 %).

3.14.

Sacharozė (neturinti azoto).

3.15.

Boro rūgštis (H3BO3).

3.16.

Indikatoriaus metilraudonojo tirpalas: 100 mg metilraudonojo ištirpinama 100 ml etanolio arba metanolio.

3.17.

Bromkrezolio žaliojo tirpalas: 100 mg bromkrezolio žaliojo ištirpinama 100 ml etanolio arba metanolio.

3.18.

Boro rūgšties tirpalas (10–40 g/l atsižvelgiant į naudojamą aparatūrą). Kai ekvivalentinis taškas nustatomas kolorimetriškai, į boro rūgšties tirpalus turi būti įdėta metilraudonojo ir bromkrezolio žaliojo indikatorių. Jei ruošiamas 1 litras boro rūgšties tirpalo, prieš skiedžiant iki žymės įpilama 7 ml metilraudonojo indikatoriaus tirpalo (3.16 punktas) ir 10 ml bromkrezolio žaliojo tirpalo (3.17 punktas). Priklausomai nuo naudojamo vandens, skirtingų partijų boro rūgšties tirpalų pH vertė gali skirtis. Boro rūgšties tirpalo pH vertė turi būti 4.3–4.7. Dažnai būtina koreguoti nedideliu šarmo tirpalo tūriu, kad būtų gautas teigiamas tuščiasis ėminys. Pastaba: Paprastai tinkamai korekcijai pakanka maždaug 3–4 ml NaOH (3.11 punktas) 1 litrui 10 g/l boro rūgšties. Tirpalas laikomas kambario temperatūroje, apsaugotas nuo šviesos ir amoniako garų šaltinių.

3.19.

Vandenilio chlorido rūgšties standartinis titrimetrinis tirpalas c(HCl) = 0,10 mol/l. Pastaba: Galima naudoti kitokios koncentracijos titrimetrinius tirpalus (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 ir 3.19 punktai), jei apskaičiuojant būtų daroma korekcija dėl koncentracijos. Koncentracijos vertės visuomet išreiškiamos keturiais skaičiais po kablelio.

4.   Aparatūra

Aparatūra, tinkama taikyti šlapiąjį skaidymą, distiliuoti ir titruoti pagal Kjeldalio procedūrą.

5.   Procedūra

5.1.   Šlapiasis skaidymas

1 g ėminio pasveriama 0,001 g tikslumu ir ėminys supilamas į šlapiojo skaidymo aparato kolbą. Įdedama 15 g kalio sulfato (3.1 punktas) ir atitinkamas kiekis katalizatoriaus (3.2 punktas) (0,3–0,4 g vario oksido arba 0,9–1,2 g vario (II) sulfato pentahidrato), įpilama 25 ml sieros rūgšties (3.4 punktas, prireikus įmetamos kelios pemzos granulės (3.12 punktas) ir sumaišoma.

Kolba iš pradžių šildoma, kartkartėmis ją sukiojant, ant nestiprios ugnies tol, kol masė suanglėja ir nelieka putų; tada šildoma stipriau tol, kol tirpalas pradeda nuolat virti. Kaitinimas yra pakankamas, jei verdanti rūgštis kondensuojasi ant kolbos sienelių. Reikia žiūrėti, kad neperkaistų šoninės kolbos sienelės ir prie jų nepriliptų organinių medžiagų dalelių.

Kai tirpalas tampa skaidrus ir šviesiai žalias, virinama dar dvi valandas, vėliau paliekama atvėsti.

5.2.   Distiliavimas

Atsargiai įpilama pakankamai vandens, kad visiškai ištirptų sulfatai. Paliekama atvėsti ir įdedamos kelios cinko granulės (3.3 punktas). Tęsiama pagal 5.2.1 arba 5.2.2 punktą.

5.2.1.   Distiliavimas į sieros rūgštį

Į distiliavimo aparato surinkimo kolbą įpilama lygiai 25 ml sieros rūgšties (3.5 punktas) arba (3.7 punktas) tirpalo, atsižvelgiant į tai, kiek ėminyje galėtų būti azoto. Įlašinami keli lašai metilraudonojo indikatoriaus (3.8 punktas).

Šlapiojo skaidymo kolba prijungiama prie distiliavimo aparato kondensatoriaus, kurio antgalis ne mažiau kaip per centimetrą įmerkiamas į surinkimo kolboje esantį skystį (žr. 8.3 punkto pastabą). Neleidžiant amoniakui garuoti (žr. 8.1 punkto pastabą), į šlapiojo skaidymo kolbą lėtai įpilama 100 ml natrio hidroksido tirpalo (3.9 punktas). Kolba kaitinama tol, kol amoniakas baigiamas distiliuoti.

5.2.2.   Distiliavimas į boro rūgštį

Jei amoniakas distiliate titruojamas rankiniu būdu, taikoma toliau nurodyta procedūra. Jei distiliavimo įrenginys yra visiškai automatizuotas, įskaitant amoniako distiliate titravimą, laikomasi gamintojo instrukcijų dėl distiliavimo įrenginio naudojimo.

Surinkimo kolba su 25–30 ml boro rūgšties tirpalo (3.18 punktas) statoma po kondensatoriaus išleidžiamuoju antgaliu taip, kad tiekimo vamzdis būtų žemiau boro rūgšties perteklių turinčio tirpalo paviršiaus. Distiliavimo įrenginys nustatomas dozuoti 50 ml natrio hidroksido tirpalo (3.9 punktas). Distiliavimo įrenginys naudojamas pagal gamintojo instrukcijas ir amoniakas distiliuojamas įpilant natrio hidroksido tirpalo. Distiliatas surenkamas į boro rūgšties tirpalą. Distiliato kiekis (distiliavimo garais trukmė) priklauso nuo azoto kiekio ėminyje. Laikomasi gamintojo instrukcijų.

Pastaba:

Pusiau automatizuotame distiliavimo įrenginyje natrio hidroksido pertekliaus įpylimas ir distiliavimas garais atliekamas automatiškai.

5.3.   Titravimas

Tęsiama pagal 5.3.1 arba 5.3.2 punktą.

5.3.1.   Sieros rūgštis

Priklausomai nuo naudotos sieros rūgšties koncentracijos, sieros rūgšties perteklius surinkimo kolboje titruojamas natrio šarmo (3.10 arba 3.11 punktas) tirpalu tol, kol pasiekiamas ekvivalentinis taškas.

5.3.2.   Boro rūgštis

Surinkimo kolbos turinys titruojamas iš biuretės vandenilio chlorido rūgšties standartiniu titrimetriniu tirpalu (3.19 punktas) arba sieros rūgšties standartiniu titrimetriniu tirpalu (3.6 punktas) ir užrašomas sunaudoto titranto tūris.

Kai ekvivalentinis taškas nustatomas kolorimetriškai, ekvivalentinis taškas pasiekiamas, pirmą kartą atsiradus tirpalo rožinei spalvai. Biuretės rodmuo įvertinamas 0,05 ml tikslumu. Apšviesta magnetinė maišyklė arba fotometrinis detektorius gali padėti lengviau pamatyti ekvivalentinį tašką.

Tai galima atlikti automatiškai, naudojant distiliavimo garais įrenginį su automatiniu titravimu.

Konkretus distiliatorius (titratorius) naudojamas pagal gamintojo instrukcijas.

Pastaba:

Naudojant automatizuotą titravimo sistemą, titruoti pradedama iškart, kai prasideda distiliavimas ir sunaudojama 1 % boro rūgšties tirpalo (3.18 punktas).

Jei naudojamas visiškai automatizuotas distiliavimo įrenginys, amoniako automatinį titravimą galima atlikti naudojant potenciometrinę pH sistemą ekvivalentiniam taškui nustatyti.

Šiuo atveju naudojamas automatinis titratorius su pH-metru. pH-metras tinkamai sukalibruojamas pH 4–pH 7 intervale pagal įprastas laboratorines pH-metro kalibravimo procedūras.

Titravimo ekvivalentinis taškas pagal pH atitinka pH vertę 4,6, šis taškas yra stačiausias titravimo kreivės taškas (perlinkio taškas).

5.4.   Tuščiasis bandymas

Siekiant patvirtinti, kad reagentai neturi azoto, atliekamas tuščiasis bandymas (šlapiasis skaidymas, distiliavimas ir titravimas), vietoj ėminio naudojant 1 g sacharozės (3.14 punktas).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Apskaičiuojama pagal 6.1 arba 6.2 punktą.

6.1.   Apskaičiavimas titruojant pagal 5.3.1 punktą

Žalių baltymų kiekis, išreikštas svorio procentais, apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

V0 –	=	NaOH (3.10 arba 3.11 punktas) tūris, sunaudotas tuščiajam bandymui, ml;
V1 –	=	NaOH (3.10 arba 3.11 punktas) tūris, sunaudotas ėminiui titruoti, ml;
c –	=	natrio hidroksido (3.10 arba 3.11 punktas) koncentracija, mol/l;
m –	=	ėminio svoris, g.

6.2.   Apskaičiavimas titruojant pagal 5.3.2 punktą

6.2.1.   Titravimas vandenilio chlorido rūgštimi

Žalių baltymų kiekis, išreikštas svorio procentais, apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

m –	=	tiriamosios dalies svoris, g;
c	=	vandenilio chlorido rūgšties standartinio titrimetrinio tirpalo (3.19 punktas) koncentracija, mol/l;
V0 –	=	tuščiajam bandymui sunaudotas vandenilio chlorido rūgšties tūris, ml;
V1 –	=	tiriamajai daliai sunaudotas vandenilio chlorido rūgšties tūris, ml.

6.2.2.   Titravimas sieros rūgštimi

Žalių baltymų kiekis, išreikštas svorio procentais, apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

m –	=	tiriamosios dalies svoris, g;
c –	=	sieros rūgšties standartinio titrimetrinio tirpalo (3.6 punktas) koncentracija, mol/l;
V0 –	=	tuščiajam bandymui sunaudotas sieros rūgšties (3.6 punktas) tūris, ml;
V1 –	=	tiriamajai daliai sunaudotas sieros rūgšties (3.6 punktas) tūris, ml.

7.   Metodo tikrinimas

7.1.   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei:

—	0,4 % absoliučiąja verte, kai žalių baltymų kiekis mažesnis nei 20 %,

—	2,0 % didesnės vertės, kai žalių baltymų kiekis 20–40 %,

—	0,8 % absoliučiąja verte, kai žalių baltymų kiekis didesnis nei 40 %.

7.2.   Atkuriamumas

Dviejų skirtingose laboratorijose atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei:

—	1,8 % absoliučiąja verte, kai žalių baltymų kiekis mažesnis nei 20 %,

—	9,0 % didesnės vertės, kai žalių baltymų kiekis 20–40 %,

—	3,6 % absoliučiąja verte, kai žalių baltymų kiekis didesnis nei 40 %.

7.3.   Tikslumas

Atliekama tinkamo acetanilido (3.13 punktas) kiekio (pvz., 0,2–0,3 g) analizė (šlapiasis skaidymas, distiliavimas ir titravimas), įdėjus 1 g sacharozės (3.14 punktas); 1 g acetanilido sunaudoja 14,80 ml sieros rūgšties (3.5 punktas). Išgavos dydis turi būti ne mažesnis nei 99 %.

8.   Pastabos

8.1.

Aparatūra gali būti rankinio, pusiau automatinio arba automatinio tipo. Jei naudojama aparatūra, kai ėminį po šlapiojo skaidymo reikia supilti į distiliavimo įrenginį, turi būti supilama be nuostolių. Jei distiliavimo aparato kolba neturi lašinamojo piltuvo, natrio šarmo tirpalas įpilamas prieš pat kolbą prijungiant prie kondensatoriaus, skystį iš lėto pilant kolbos sienele.

8.2.

Jei skaidymo produktas sukietėja, analizė pradedama iš naujo su didesniu nei 5.1 punkte nurodytu sieros rūgšties tirpalo (3.4 punktas) kiekiu.

8.3.

Produktams, kuriuose azoto kiekis nedidelis, į surinkimo kolbą įpilamo sieros rūgšties tirpalo (3.7 punktas) tūris prireikus gali būti sumažintas iki 10 arba 15 ml, skiedžiant vandeniu iki 25 ml.

8.4.

Atliekant įprastą analizę, galima taikyti alternatyviuosius metodus žalių baltymų kiekiui nustatyti, bet šioje C dalyje aprašytas Kjeldalio metodas yra pamatinis metodas. Rezultatų gautų alternatyviaisiais metodais (pvz., DUMAS) lygiavertiškumas palyginti su pamatiniu metodu turi būti įrodytas kiekvienai matricai atskirai. Kadangi alternatyviuoju metodu gauti rezultatai ir pamatiniu metodu gauti rezultatai gali šiek tiek skirtis, netgi patikrinus lygiavertiškumą, analizės ataskaitoje būtina nurodyti žalių baltymų kiekiui nustatyti taikytą analizės metodą.

D.   KARBAMIDO KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti kaip pašarų priedas naudojamo karbamido koncentraciją atrajotojų pašaruose.

2.   Metodas

Ėminys suspenduojamas vandenyje kartu su skaidrinančiąja medžiaga. Suspensija filtruojama. Dedama 4-dimetilaminobenzaldehido (4-DMAB), ir karbamido kiekis filtrate nustatomas matuojant absorbciją, kai bangos ilgis 420 nm.

3.   Reagentai

3.1.

4-dimetilaminobenzaldehido tirpalas: 1,6 g 4-DMAB ištirpinama 100 ml 96 % etanolio ir įpilama 10 ml vandenilio chlorido rūgšties (ρ20 = 1,19 g/ml). Šį reagentą galima laikyti ne ilgiau kaip dvi savaites.

3.2.

Carrez I tirpalas: vandenyje ištirpinama 21,9 g cinko acetato Zn(CH3COO)2 2H2O ir 3 g ledinės acto rūgšties. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.3.

Carrez II tirpalas: vandenyje ištirpinama 10,6 g kalio heksacianoferato (II) K4 Fe(CN)6 3H2O. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.4.

Aktyvintosios anglys, kurios nesugeria karbamido (turi būti patikrinta).

3.5.

Karbamido 0,1 % (m/V) tirpalas.

4.   Aparatūra

4.1.

Maišiklis (vartytuvas), dažnis maždaug 35–40 sūk./min.

4.2.

Mėgintuvėliai: 160 × 16 mm su šlifo kamščiais.

4.3.

Spektrofotometras.

5.   Procedūra

5.1.   Ėminio analizė

1 mg tikslumu pasveriama 2 g ėminio, kuris kartu su 1 g aktyvintų anglių (3.4 punktas) supilamas į 500 ml matavimo kolbą. Įpilama 400 ml vandens ir 5 ml Carrez I (3.2 punktas) tirpalo, maždaug 30 s maišoma ir įpilama 5 ml Carrez II (3.3 punktas) tirpalo. Trisdešimt minučių tirpalas maišomas vartytuve. Tirpalas skiedžiamas vandeniu iki žymės, purtomas ir filtruojamas.

Į mėgintuvėlius su šlifo kamščiais įpilama 5 ml skaidraus bespalvio filtrato, 5 ml 4-DMAB tirpalo (3.1 punktas) ir sumaišoma. Mėgintuvėliai statomi į vandens vonią 20 °C (+/–4 °C) temperatūroje. Po penkiolikos minučių spektrofotometru matuojama ėminio tirpalo absorbcija, kai bangos ilgis 420 nm. Palyginamuoju tirpalu naudojamas tuščiajam bandymui ruošti naudojamų reagentų tirpalas.

5.2.   Kalibravimo kreivė

Į 100 ml matavimo kolbas įpilama 1, 2, 4, 5 ir 10 ml karbamido tirpalo (3.5 punktas) ir skiedžiama vandeniu iki žymės. Paimama po 5 ml kiekvieno tirpalo, į kiekvieną iš jų įpilama 5 ml 4-DMAB tirpalo (3.1 punktas), sumaišoma ir, kaip nurodyta anksčiau, matuojama jų absorbcija, lyginant su kontroliniu tirpalu, turinčiu 5 ml 4-DMAB ir 5 ml vandens, neturinčio karbamido. Brėžiama kalibravimo kreivė.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Pagal kalibravimo kreivę nustatomas karbamido kiekis ėminyje.

Rezultatas išreiškiamas karbamido kiekiu mg viename ėminio kilograme.

7.   Metodo įvertinimas

7.1.   Pakartojamumas

Dviejų toje pačioje laboratorijoje to paties veiklos vykdytojo atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei:

—	esant 420 nm — 50 % didesnės vertės, kai karbamido kiekis nuo 3 000 iki mažiau kaip 5 000 mg/kg, — 25 % didesnės vertės, kai karbamido kiekis nuo 5 000 iki mažiau kaip 7 000 mg/kg, — 20 % didesnės vertės, jei karbamido kiekis 7 000 mg/kg arba didesnis;

—	esant 435 nm — 40 % didesnės vertės, kai karbamido kiekis nuo 3 000 iki mažiau kaip 5 000 mg/kg, — 25 % didesnės vertės, kai karbamido kiekis nuo 5 000 iki mažiau kaip 9 000 mg/kg, — 5 % didesnės vertės, kai karbamido kiekis 9 000 mg/kg arba didesnis.

7.2.   Atkuriamumas

Dviejų skirtingose laboratorijose ir (arba) skirtingų veiklos vykdytojų atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei:

—	esant 420 nm — 3 000 mg/kg absoliučiąja verte, kai karbamido kiekis nuo 3 000 iki mažiau kaip 12 000 mg/kg, — 4 500 mg/kg absoliučiąja verte, kai karbamido kiekis 12 000 mg/kg arba didesnis;

—	esant 435 nm — 50 % didesnės vertės, kai karbamido kiekis nuo 3 000 iki mažiau kaip 8 000 mg/kg, — 25 % didesnės vertės, kai karbamido kiekis 8 000 mg/kg arba didesnis.

8.   Jungtinio lyginamojo tyrimo rezultatai

Buvo atlikti ES tarplaboratoriniai tyrimai, kuriuose dalyvavo 18 laboratorijų. Buvo analizuojama po du atsitiktinai atrinktų penkių atrajotojų kombinuotųjų pašarų ėminius (1-oje ir 2-oje lentelėse nurodyti kaip MAT), kurių tyrimo rezultatai teigiami (1 analizė), o vienas atrajotojų kombinuotųjų pašarų tuščiasis ėminys buvo ištirtas vieną kartą.

Pašalinus riktus, taikant tinkamų verčių variacijos analizę, buvo atlikti pakartojamumo (r) ir atkuriamumo (R) ribų skaičiavimai, kaip apibrėžta tarptautinėse gairėse.

Toliau lentelėse pateikiami apskaičiuoti metodo veiksmingumo duomenys (pakartojamumas, atkuriamumas). Iš visų tirtų ėminių, įskaitant tuščiąją medžiagą, klaidingai teigiamų arba klaidingai neigiamų rezultatų nenustatyta.

1 lentelė

Metodo veiksmingumo parametrai matuojant karbamidą visose medžiagose, kai λ = 420

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Avys	Galvijai	Avys	Avys	Galvijai
Tikslinė masės dalis (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Vidutinė masės dalis (mg kg-1)	4 241	6 993	7 830	9 962	12 071
Atkuriamumo standartinis nuokrypis sR (mg kg-1)	1 141	1 303	985	994	1 711
Pakartojamumo standartinis nuokrypis sR (mg kg-1)	723	601	549	712	737
Atkuriamumo santykinis standartinis nuokrypis RSDR (%)	27	19	13	10	14
Pakartojamumo santykinis standartinis nuokrypis RSDr (%)	17	9	7	7	6
Atkuriamumo riba R [R = 2,8 × sR ]	3 195	3 649	2 759	2 784	4 790
Pakartojamumo riba r [r = 2,8 × sr ]	2 024	1 684	1 536	1 994	2 064

2 lentelė

Metodo veiksmingumo parametrai matuojant karbamidą visose medžiagose, kai λ = 435

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Avys	Galvijai	Avys	Avys	Galvijai
Tikslinė masės dalis (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Vidutinė masės dalis (mg kg-1)	4 101	6 467	7 890	10 062	11 642
Atkuriamumo standartinis nuokrypis sR (mg kg-1)	706	1 194	675	745	1 378
Pakartojamumo standartinis nuokrypis sr (mg kg-1)	570	628	613	196	167
Atkuriamumo santykinis standartinis nuokrypis RSDR (%)	17	18	9	7	12
Pakartojamumo santykinis standartinis nuokrypis RSDr (%)	14	10	8	2	1
Atkuriamumo riba R [R = 2,8 × sR ]	1 977	3 344	1 889	2 087	3 859
Pakartojamumo riba r [r = 2.8 × sr ]	1 596	1 759	1 715	549	467

9.   Pastabos

9.1.

Tais atvejais, kai karbamido kiekis yra didesnis nei 3 %, imama 1 g ėminio arba pradinis tirpalas skiedžiamas tiek, kad jo 500 ml būtų ne daugiau nei 50 mg karbamido.

9.2.

Tuo atveju, kai karbamido yra mažai, ėminio kiekis padidinamas tiek, kad filtratas dar liktų skaidrus ir bespalvis.

9.3.

Iš pirmiau pateiktų jungtinio lyginamojo tyrimo rezultatų nematyti didelio skirtumo tarp rezultatų glaudumo, išmatavus karbamidą esant 420 arba 435 nm.

E.   AMINORŪGŠČIŲ (IŠSKYRUS TRIPTOFANĄ) KIEKIO NUSTATYMAS

Analizės metodai, naudotini aminorūgštims (išskyrus triptofaną) nustatyti:

—	EN ISO 13903 „Pašarai. Aminorūgščių kiekio nustatymas“;

—	EN ISO 17180 „Pašarai. Lizino, metionino ir treonino nustatymas komerciniuose aminorūgščių produktuose ir premiksuose“  (4);

—	toliau 1–10 dalyse aprašyti analizės metodai.

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Naudojant aminorūgščių analizatorių, šiuo metodu galima nustatyti laisvųjų (sintetinių ir gamtinių) aminorūgščių ir suminį (peptidiniais ryšiais sujungtų ir laisvųjų) aminorūgščių kiekį pašarinėse žaliavose, kombinuotuosiuose pašaruose ir premiksuose, kuriuose yra mažiau nei 10 % (5) kiekvienos amino rūgšties. Šis metodas tinka šioms aminorūgštims: cisteinui (cistinui), metioninui, lizinui, treoninui, alaninui, argininui, asparto ir glutamo rūgštims, glicinui, histidinui, izoleucinui, leucinui, fenilalaninui, prolinui, serinui, tirozinui ir valinui.

Šiuo metodu negalima atskirti įvairių aminorūgščių druskų ir negalima atskirti aminorūgščių D-ir L-formų. Metodas netinka triptofano arba hidroksigrupę turintiems aminorūgščių analogams nustatyti.

2.   Metodas

2.1.   Laisvosios aminorūgštys

Laisvosios aminorūgštys ekstrahuojamos praskiesta vandenilio chlorido rūgštimi. Kartu ekstrahuojamos azoto turinčios makromolekulės nusodinamos sulfosalicilo rūgštimi ir atskiriamos filtruojant. Nustatoma filtruoto tirpalo pH vertė 2,20. Aminorūgštys atskiriamos jonų mainų chromatografija ir nustatomos fotometriškai vykdant reakciją su ninhidrinu, kai bangos ilgis 570 nm.

2.2.   Suminis aminorūgščių kiekis

Pasirinkta procedūra priklauso nuo tiriamų aminorūgščių. Cisteinas (cistinas) ir metioninas prieš hidrolizę turi būti oksiduojami iki cistino rūgšties ir metionino sulfono. Tirozinas turi būti nustatomas neoksiduotų ėminių hidrolizatuose. Visos kitos 1 punkte (Tikslas ir taikymo sritis) išvardytos aminorūgštys gali būti nustatomos arba oksiduotuose, arba neoksiduotuose ėminiuose.

Oksidacija atliekama peroksiskruzdžių rūgšties ir fenolio mišiniu 0 °C temperatūroje. Oksidacijos reagento perteklius skaidomas natrio disulfitu. Oksiduoti ar neoksiduoti ėminiai 23 valandas hidrolizuojami vandenilio chlorido rūgštimi (3.20 punktas). Nustatoma hidrolizatų pH vertė 2,20. Aminorūgštys atskiriamos taikant jonų mainų chromatografiją ir nustatomos fotometriniu metodu vykdant reakciją su ninhidrinu, kai bangos ilgis 570 nm (prolinui – 440 nm).

3.   Reagentai

Turi būti naudojamas du kartus distiliuotas arba tokios pat kokybės vanduo (laidis < 10 μS).

3.1.

Vandenilio peroksidas, (m/m) = 30 %.

3.2.

Skruzdžių rūgštis, (m/m) = 98–100 %.

3.3.

Fenolis.

3.4.

Natrio disulfitas.

3.5.

Natrio hidroksidas.

3.6.

5-sulfosalicilo rūgšties dihidratas.

3.7.

Vandenilio chlorido rūgštis, tankis maždaug 1,18 g/ml.

3.8.

Trinatrio citrato dihidratas.

3.9.

2,2’-tiodietanolis (tiodiglikolis).

3.10.

Natrio chloridas.

3.11.

Ninhidrinas.

3.12.

Petroleteris, virimo temperatūros intervalas – 40–60 °C.

3.13.

Norleucinas arba kitas junginys, kurį galima naudoti kaip vidinį etaloną.

3.14.

Azoto dujos (< 10 ppm deguonies).

3.15.

1-oktanolis.

3.16.

Aminorūgštys.

3.16.1.

1 dalyje (Tikslas ir taikymo sritis) išvardytos standartinės aminorūgščių medžiagos. Grynieji junginiai, kuriuose nėra kristalizacinio vandens. Džiovinami vakuume virš P2O5 arba H2SO4 likus savaitei iki naudojimo.

3.16.2.

Cistino rūgštis.

3.16.3.

Metionino sulfonas.

3.17.

Natrio hidroksido tirpalas, c = 7,5 mol/l: 300 g NaOH (3.5 punktas) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

3.18.

Natrio hidroksido tirpalas, c = 1 mol/l: 40 g NaOH (3.5 punktas) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

3.19.

Skruzdžių rūgšties ir fenolio tirpalas: 889 g skruzdžių rūgšties (3.2 punktas) sumaišoma su 111 g vandens ir įdedama 4,73 g fenolio (3.3 punktas).

3.20.

Hidrolizės mišinys, c = 6 mol/l HCl tirpalas, kuriame yra 1 g/l fenolio: įdedama 1 g fenolio (3.3 punktas) į 492 ml HCl (3.7 punktas) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.21.

Ekstrahavimo mišinys, c = 0,1 mol/l HCl tirpalas, kuriame yra 2 % tiodiglikolio: paimama 8,2 ml HCl (3.7 punktas), skiedžiama maždaug 900 ml vandens, įpilama 20 ml tiodiglikolio (3.9 punktas) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro (tiesiogiai nemaišyti 3.7 ir 3.9 punktuose nurodytų medžiagų).

3.22.

5-sulfosalicilo rūgštis, ß = 6 %: 60 g 5-sulfosalicilo rūgšties (3.6 punktas) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.23.

Oksidavimo mišinys (peroksiskruzdžių rūgštis ir fenolis): mažoje cheminėje stiklinėje sumaišoma 0,5 ml vandenilio peroksido (3.1 punktas) ir 4,5 ml skruzdžių rūgšties bei fenolio tirpalo (3.19 punktas). Laikoma 1 val. 20–30 °C temperatūroje, kad susidarytų peroksiskruzdžių rūgštis, ir prieš supilant į ėminį šaldoma ledo ir vandens vonioje (15 min). Įspėjimas. Vengiama patekimo ant odos ir dėvimi apsauginiai drabužiai.

3.24.

Citratinis buferinis tirpalas, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: maždaug 800 ml vandens ištirpinama 19,61 g natrio citrato (3.8 punktas), 5 ml tiodiglikolio (3.9 punktas), 1 g fenolio (3.3 punktas) ir 16,50 ml HCl (3.7 punktas). Nustatoma pH vertė 2,20. Skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.25.

Plovimo buferiniai tirpalai, paruošti pagal naudojamo analizatoriaus (4.9 punktas) sąlygas.

3.26.

Ninhidrino reagentas ruošiamas pagal analizatoriaus (4.9 punktas) sąlygas.

3.27.

Aminorūgščių standartiniai tirpalai. Šie tirpalai laikomi žemesnėje nei 5 °C temperatūroje.

3.27.1.

Aminorūgščių pradiniai standartiniai tirpalai (3.16.1 punktas). c = 2,5 μmol/ml kiekvienos rūgšties tirpalas vandenilio chlorido rūgštyje. Galima naudoti esančius prekyboje.

3.27.2.

Cistino rūgšties ir metionino sulfono pradinis standartinis tirpalas, c = 1,25 μmol/ml. 0,2115 g cistino rūgšties (3.16.2 punktas) ir 0,2265 g metionino sulfono (3.16.3 punktas) ištirpinama citratiniame buferiniame tirpale (3.24 punktas) 1 litro matavimo kolboje, iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu. Laikoma žemesnėje nei 5 °C temperatūroje ne ilgiau kaip 12 mėnesių. Šis tirpalas nenaudojamas, jei pradiniame standartiniame tirpale (3.27.1 punktas) yra cistino rūgšties ir metionino sulfono.

3.27.3.

Pradinis standartinis vidinio etalono, pvz.: norleucino, tirpalas, c = 20 μmol/ml. 0,6560 g norleucino (3.13 punktas) ištirpinama citratiniame buferiniame tirpale (3.24 punktas) 250 ml matavimo kolboje, iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu. Laikoma žemesnėje nei 5 °C temperatūroje ne ilgiau kaip 6 mėnesius.

3.27.4.

Standartinių aminorūgščių kalibravimo tirpalas, naudojamas hidrolizatams, c = 5 nmol/50 μl cistino rūgšties ir metionino sulfono ir c = 10 nmol/50 μl kitų aminorūgščių. 2,2 g natrio chlorido (3.10 punktas) ištirpinama 30 ml citratinio buferinio tirpalo (3.24 punktas) 100 ml cheminėje stiklinėje. Įpilama 4,00 ml aminorūgščių pradinio standartinio tirpalo (3.27.1 punktas), 4,00 ml cistino rūgšties ir metionino sulfono pradinio standartinio tirpalo (3.27.2 punktas) ir 0,50 ml pradinio standartinio vidinio etalono tirpalo (3.27.3 punktas), jei naudojamas. Natrio hidroksidu (3.18 punktas) nustatoma pH vertė 2,20. Kiekybiškai supilama į 50 ml matavimo kolbą, skiedžiama iki žymės citratiniu buferiniu tirpalu (3.24 punktas) ir sumaišoma. Laikoma žemesnėje nei 5 °C temperatūroje ne ilgiau kaip 3 mėnesius. Dar žr. 9.1 punkto pastabas.

3.27.5.

Standartinių aminorūgščių kalibravimo tirpalas, naudojamas hidrolizatams, paruoštiems pagal 5.3.3.1 punktą, ir ekstraktams (5.2 punktas). Kalibravimo tirpalas ruošiamas pagal 3.27.4 punktą, bet nededama natrio chlorido. Laikoma žemesnėje nei 5 °C temperatūroje ne ilgiau kaip 3 mėnesius.

4.   Aparatūra

4.1.

100 arba 250 ml apvaliadugnė kolba su grįžtamuoju kondensatoriumi.

4.2.

100 ml borosilikatinio stiklo butelis su užsukamu kamščiu ir guminiu ar tefloniniu tarpikliu (pvz.: Duran, Schott), tinkamas naudoti krosnyje.

4.3.

Ventiliuojama krosnis su temperatūros reguliatoriumi, kurio tikslumas geresnis nei ± 2 °C.

4.4.

pH-metras (trys skaičiai po kablelio).

4.5.

Membraninis filtras (0,22 μm).

4.6.

Centrifuga.

4.7.

Sukamasis vakuuminis garintuvas.

4.8.

Mechaninė purtyklė arba magnetinė maišyklė.

4.9.

Aminorūgščių analizatorius arba HPLC įranga su jonitiniu filtru, reakcijos su ninhidrinu įtaisu, pokolonėlinės derivatizacijos įtaisu ir fotometriniu detektoriumi. Kolonėlės įkrova – sulfoninto polistireno dervos, galinčios atskirti aminorūgštis vieną nuo kitos ir nuo kitų su ninhidrinu reaguojančių medžiagų. Srautas buferinio tirpalo ir ninhidrino sistemose reguliuojamas siurbliais, o srauto stabilumas – ± 0,5 % standartinio kalibravimo tirpalo ir ėminio analizės metu. Su kai kuriais aminorūgščių analizatoriais galima naudoti hidrolizės procedūras, kai hidrolizato natrio jonų koncentracija c = 0,8 mol/l ir jame yra visas po oksidacijos likęs skruzdžių rūgšties perteklius. Kitais analizatoriais negalima tinkamai atskirti tam tikrų aminorūgščių, jei hidrolizate yra skruzdžių rūgšties perteklius ir (arba) didelė natrio jonų koncentracija. Tokiu atveju po hidrolizės ir prieš pH nustatymą, rūgšties tūris sumažinamas maždaug iki 5 ml ją garinant. Garinama vakuume ne aukštesnėje nei 40 °C temperatūroje.

5.   Procedūra

5.1.   Ėminio ruošimas

Ėminys susmulkinamas taip, kad jį būtų galima sijoti per 0,5 mm sietą. Daug drėgmės turintys ėminiai prieš juos smulkinant turi būti džiovinami ore ne didesnėje nei 50 °C temperatūroje arba liofilizuojami. Daug riebalų turintys ėminiai prieš juos smulkinant ekstrahuojami petroleteriu (3.12 punktas).

5.2.   Laisvųjų aminorūgščių kiekio nustatymas

Į kūginę kolbą 0,2 mg tikslumu pasveriamas atitinkamas paruošto ėminio (5.1 punktas) kiekis (1–5 g) ir įpilama 100,0 ml ekstrahavimo mišinio (3.21 punktas). Mišinys maišomas 60 min. mechanine purtykle arba magnetine maišykle (4.8 punktas). Nuosėdoms leidžiama nusėsti ir 10,0 ml tirpalo virš nuosėdų paimama pipete į 100 ml cheminę stiklinę.

Maišant įpilama 5,0 ml sulfosalicilo rūgšties tirpalo (3.22 punktas) ir maišoma magnetine maišykle 5 min. Tirpalas virš nuosėdų filtruojamas arba centrifuguojamas visoms nuosėdoms pašalinti. 10,0 ml gauto tirpalo įpilama į 100 ml cheminę stiklinę, natrio hidroksido tirpalu (3.18 punktas) nustatoma pH vertė 2,20, plaunant citratiniu buferiniu tirpalu (3.24 punktas) supilama į tinkamo tūrio matavimo kolbą ir citratiniu buferiniu tirpalu (3.24 punktas) skiedžiama iki žymės.

Jei naudojamas vidinis etalonas, įpilama 1,00 ml vidinio etalono (3.27.3 punktas) kiekvienam 100 ml gauto tirpalo ir skiedžiama iki žymės buferiniu tirpalu (3.24 punktas).

Chromatografinė analizė atliekama pagal 5.4 punktą.

Jei ekstraktai netiriami tą pačią dieną, jie turi būti laikomi žemesnėje nei 5 °C temperatūroje.

5.3.   Suminio aminorūgščių kiekio nustatymas

5.3.1.   Oksidavimas

0,1–1 g paruošto ėminio (5.1 punktas) 0,2 mg tikslumu pasveriama:

—	į 100 ml apvaliadugnę kolbą (4.1 punktas) hidrolizei atvirame inde (5.3.2.3 punktas) arba

—	į 250 ml apvaliadugnę kolbą (4.1 punktas), jei turi būti maža natrio koncentracija (5.3.3.1 punktas), arba

—	į 100 ml butelį su užsukamu kamščiu (4.2 punktas) hidrolizei uždarytame inde (5.3.2.4 punktas).

Pasvertojoje ėminio dalyje azoto turi būti apie 10 mg, o drėgmės ne daugiau nei 100 mg.

Kolba (butelis) dedama į ledo ir vandens vonią, atšaldoma iki 0 °C, įpilama 5 ml oksidavimo mišinio (3.23 punktas) ir maišoma stikline mentele su lenktu galu. Kolba (butelis) kartu su viduje esančia mentele uždengiama orui nepralaidžia plėvele, ledo ir vandens vonia su taip uždarytu indu dedama į šaldytuvą, kuriame temperatūra yra 0 °C, ir laikoma jame 16 valandų. Po 16 valandų indas išimamas iš šaldytuvo ir oksidavimo reagento perteklius suskaidomas, pridedant 0,84 g natrio disulfito (3.4 punktas).

Tęsiama pagal 5.3.2.1 punktą.

5.3.2.   Hidrolizė

5.3.2.1.

Oksiduotų ėminių hidrolizė Į oksiduotą ėminį, paruoštą pagal 5.3.1 punktą, įpilama 25 ml hidrolizavimo mišinio (3.20 punktas), nuplaunant prie indo sienelių ir mentelės prilipusius ėminio likučius. Atsižvelgiant į taikomą procedūrą, tęsiama pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4 punktą.

5.3.2.2.

Neoksiduotų ėminių hidrolizė Į 100 ml ar 250 ml apvaliadugnę kolbą (4.1 punktas) arba į 100 ml butelį su užsukamu kamščiu (4.2 punktas) 0,2 mg tikslumu pasveriama 0,1–1 g paruošto ėminio (5.1 punktas). Pasvertojoje ėminio dalyje azoto turi būti apie 10 mg. Atsargiai įpilama 25 ml hidrolizavimo mišinio (3.20 punktas) ir sumaišoma su ėminiu. Tęsiama pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4 punktą.

5.3.2.3.

Hidrolizė atvirame inde Į kolbą su mišiniu (paruoštu pagal 5.3.2.1 arba 5.3.2.2 punktą) įdedami 3 stikliniai rutuliukai ir 23 valandas virinama su grįžtamuoju kondensatoriumi. Hidrolizei pasibaigus, kondensatorius išplaunamas 5 ml citratinio buferinio tirpalo (3.24 punktas). Kolba nuimama ir atšaldoma ledo vonioje. Tęsiama pagal 5.3.3 punktą.

5.3.2.4.

Hidrolizė uždarame inde Butelis su mišiniu, paruoštu pagal 5.3.2.1 arba 5.3.2.2 punktą, dedamas į krosnį (4.3 punktas), kurioje temperatūra yra 110 °C. Kad slėgis nedidėtų (dėl dujinių medžiagų susidarymo) ir būtų išvengta sprogimo, pirmąją hidrolizės valandą užsukamas kamštis dedamas ant indo viršaus. Kamštis neužsukamas. Po valandos kamštis užsukamas ir indas laikomas krosnyje (4.3 punktas) 23 valandas. Hidrolizei pasibaigus, indas išimamas iš krosnies, kamštis atsargiai atsukamas ir butelis statomas į ledo ir vandens vonią. Paliekama atvėsti. Atsižvelgiant į pH reguliavimo procedūrą (5.3.3 punktas), butelio turinys kiekybiškai supilamas į 250 ml cheminę stiklinę arba 250 ml apvaliadugnę kolbą, naudojant citratinį buferinį tirpalą (3.24 punktas). Tęsiama pagal 5.3.3 punktą

5.3.3.   pH reguliavimas

Atsižvelgiant į aminorūgščių analizatoriaus (4.9 punktas) jautrumą natriui, pH reguliavimas tęsiamas pagal 5.3.3.1 arba 5.3.3.2 punktą.

5.3.3.1.

Chromatografinėms analizės sistemoms (4.9 punktas), kurioms reikia mažos natrio koncentracijos. Kai naudojami aminorūgščių analizatoriai, kuriems reikia mažos natrio jonų koncentracijos (kai turi būti sumažintas rūgšties tūris), patariama naudoti pradinį standartinį vidinio etalono tirpalą (3.27.3 punktas). Šiuo atveju prieš garinimą į hidrolizatą įpilama 2,00 ml pradinio standartinio vidinio etalono tirpalo (3.27.3 punktas). Į hidrolizatus, gautus pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4 punktą, įlašinami 2 lašai 1-oktanolio (3.15 punktas). Sukamajame garintuve (4.7 punktas) garinant vakuume ir 40 °C temperatūroje, tūris sumažinamas iki 5–10 ml. Jei netyčia tūris sumažėja iki mažesnio nei 5 ml tūrio, hidrolizatas turi būti išpiltas ir analizė atliekama iš naujo. Natrio hidroksido tirpalu (3.18 punktas) nustatoma pH vertė 2,20 ir toliau tęsiama pagal 5.3.4 punktą.

5.3.3.2.

Visiems kitiems aminorūgščių analizatoriams (4.9 punktas) Hidrolizatai, gauti pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4 punktą, iš dalies neutralizuojami atsargiai įpilant 17 ml natrio hidroksido tirpalo (3.17 punktas), tirpalą visą laiką maišant ir žiūrint, kad temperatūra būtų žemesnė nei 40 °C. Kambario temperatūroje nustatoma pH vertė 2,20, naudojant natrio hidroksido tirpalą (3.17 punktas) ir vėliau natrio hidroksido tirpalą (3.18 punktas). Tęsiama pagal 5.3.4 punktą.

5.3.4.   Ėminio tirpalas chromatografijai

Hidrolizatas, kurio pH vertė nustatyta (5.3.3.1 arba 5.3.3.2 punktas), kiekybiškai supilamas į 200 ml matavimo kolbą naudojant citratinį buferinį tirpalą (3.24 punktas), ir skiedžiama iki žymės buferiniu tirpalu (3.24 punktas).

Jei vidinis etalonas dar nebuvo naudotas, įpilama 2,00 ml vidinio etalono (3.27.3 punktas) ir iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu (3.24 punktas). Gerai sumaišoma.

Atliekama chromatografinė analizė (5.4 punktas).

Jei ėminių tirpalai netiriami tą pačią dieną, jie turi būti laikomi žemesnėje nei 5 °C temperatūroje.

5.4.   Chromatografija

Prieš atliekant chromatografinę analizę ekstraktui (5.2 punktas) arba hidrolizatui (5.3.4 punktas) leidžiama pasiekti kambario temperatūrą. Mišinys purtomas ir filtruojamas per 0,22 μm membraninį filtrą (4.5 punktas). Aminorūgščių analizatoriumi (4.9 punktas) atliekama gauto skaidraus tirpalo jonų mainų chromatografija.

Įpurkšti galima rankiniu būdu arba automatiškai. Svarbu, kad matuojant etalonus ir ėminius į kolonėlę ± 0,5 % tikslumu būtų įpurškiamas vienodas tirpalo tūris, išskyrus atvejus, kai naudojamas vidinis etalonas, ir kad natrio bei aminorūgščių santykis etalone ir ėminio tirpale būtų kiek įmanoma vienodesnis.

Paprastai kalibravimo dažnis priklauso nuo ninhidrino reagento stabilumo ir analizinės sistemos. Etalonas arba ėminys skiedžiamas citratiniu buferiniu tirpalu (3.24 punktas), kad etalono smailės plotas sudarytų 30–200 % ėminio aminorūgšties smailės ploto.

Priklausomai nuo naudojamo analizatoriaus ir dervos tipo, aminorūgščių chromatografija šiek tiek skirsis. Pasirinkta sistema turi atskirti vieną aminorūgštį nuo kitos ir nuo kitų su ninhidrinu reaguojančių junginių. Atsakas į kolonėlėje analizuojamų aminorūgščių kiekio pokyčius turi būti tiesinis chromatografinės sistemos naudojimo intervale.

Atliekant chromatografinę analizę, taikomi toliau nurodyti smailių įdubos ir viršūnės aukščių santykiai, kai analizuojamas (nustatomų aminorūgščių) ekvimolinis tirpalas. Šis ekvimolinis tirpalas turi turėti bent 30 % kiekvienos aminorūgšties, kurią galima tiksliai išmatuoti aminorūgščių analizatoriaus sistema (4.9 punktas), įkrovos didžiausio kiekio.

Norint atskirti treoniną ir seriną, žemesnės iš dviejų persiklojančių aminorūgščių smailių įdubos ir viršūnės aukščių santykis chromatogramoje neturi būti didesnis nei 2:10 (jei nustatomas tik cisteinas (cistinas), metioninas, treoninas ir lizinas, nepakankamas gretimų smailių atsiskyrimas neigiamai veiktų nustatymą). Visoms kitoms aminorūgštims atskyrimas turi būti geresnis nei 1:10.

Sistema turi užtikrinti, kad lizinas būtų atskirtas nuo lizino darinių ir ornitino.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Matuojamas ėminio ir etalono kiekvienos aminorūgšties smailės plotas ir apskaičiuojamas aminorūgšties kiekis (X) gramais kg ėminio:

Jei naudojamas vidinis etalonas, dauginama iš:

A –	=	smailės plotas, hidrolizatas arba ekstraktas
B –	=	smailės plotas, kalibravimo standartinis tirpalas
C –	=	vidinio etalono hidrolizate arba ekstrakte smailės plotas
D –	=	vidinio etalono smailės plotas, kalibravimo standartinis tirpalas
M –	=	nustatomos aminorūgšties molinė masė
c –	=	etalono koncentracija μmol/ml
m –	=	ėminio masė (g) (su pataisa pradinei masei, jei ėminys buvo džiovinamas ar iš jo šalinami riebalai)
V –	=	suminis hidrolizato tūris (5.3.4 punktas) arba apskaičiuotas suminis praskiesto ekstrakto tūris (6.1 punktas) ml

Oksiduotų ėminių hidrolizatuose cistinas ir cisteinas nustatomi kaip cistino rūgštis, bet apskaičiuojami kaip cistinas (C6H12N2O4S2, M = 240,30 g/mol), naudojant M = 120,15 g/mol (0,5 × 240,30 g/mol).

Metioninas nustatomas kaip metionino sulfonas oksiduoto ėminio hidrolizatuose, bet apskaičiuojamas kaip metioninas, naudojant metionino 149,21 g/mol.

Įdėtas laisvasis metioninas nustatomas po ekstrakcijos kaip metioninas, apskaičiavimui naudojant tą pačią molinę masę.

6.1.

Suminis praskiesto ekstrakto tūris (F) laisvosioms aminorūgštims (5.2 punktas) nustatyti apskaičiuojamas taip: V – = galutinio ekstrakto tūris

7.   Metodo įvertinimas

Metodas buvo patikrintas 1990 m. atliekant palyginimą tarptautiniu lygiu, naudojant keturis skirtingus pašarus (mišriuosius kiaulių pašarus, broilerių kombinuotuosius pašarus, baltymų koncentratą, premiksus).

Pastaba.

Šis metodas buvo išbandytas 2003 m. antruose tarptautiniuose palyginamuosiuose tyrimuose, naudojant po dvi poras atsitiktinai atrinktų pašarų broileriams augimo pabaigoje, pašarų broileriams augimo pradžioje, kukurūzų, žuvų miltų ir naminių paukščių miltų ėminius. Išsamesnės informacijos žr. standartą EN ISO 13903.

1990 m. palyginimo vidurkio ir standartinio nuokrypio rezultatai, gauti atmetus riktus, pateikiami šio punkto lentelėse:

Vidurkiai g/kg

Pamatinė medžiaga	Aminorūgštis
	Treoninas	Cisteinas (cistinas)	Metioninas	Lizinas
Mišrusis kiaulių pašaras	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Broilerių kombinuotasis pašaras	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Baltymų koncentratas	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Premiksas	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n – dalyvavusių laboratorijų skaičius.

7.1.   Pakartojamumas

Pirmiau lentelėje pateikto palyginimo pakartojamumas, išreikštas kaip laboratorijos standartinis nuokrypis, pateiktas šiose lentelėse:

Pakartojamumo variacijos koeficientas (CVr) (%)

Pamatinė medžiaga	Aminorūgštis
	Treoninas	Cisteinas (cistinas)	Metioninas	Lizinas
Mišrusis kiaulių pašaras	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Broilerių kombinuotasis pašaras	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Baltymų koncentratas	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Premiksas	2,2 n = 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n – dalyvavusių laboratorijų skaičius.

7.2.   Atkuriamumas

Pirmiau nurodyto tarplaboratorinio palyginimo atkuriamumas, išreikštas kaip tarplaboratorinis standartinis nuokrypis, pateiktas šiose lentelėse:

Atkuriamumo variacijos koeficientas (CVR) (%)

Pamatinė medžiaga	Aminorūgštis
	Treoninas	Cisteinas (cistinas)	Metioninas	Lizinas
Mišrusis kiaulių pašaras	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Broilerių kombinuotasis pašaras	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Baltymų koncentratas	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Premiksas	4,3 n = 16	—	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n – dalyvavusių laboratorijų skaičius.

8.   Pamatinių medžiagų naudojimas

Tinkamas šio metodo taikymas turi būti patikrintas atliekant kartotinius sertifikuotųjų pamatinių medžiagų matavimus, jei jos yra. Rekomenduojama kalibruoti sertifikuotaisiais aminorūgščių kalibravimo tirpalais.

9.   Pastabos

9.1.

Dėl aminorūgščių analizatorių skirtumų tikrinama pagal galutinę standartinių aminorūgščių kalibravimo tirpalų (žr. 3.27.4 ir 3.27.5 punktus) ir hidrolizatų (žr. 5.3.4 punktą) koncentraciją. Prietaiso tiesinio atsako intervalas turi būti tikrinamas visoms aminorūgštims. Standartinis tirpalas skiedžiamas citratiniu buferiniu tirpalu, kad smailių plotai būtų intervalo viduryje.

9.2.

Jei hidrolizatams analizuoti naudojama efektyviosios skysčių chromatografijos įranga, bandymų sąlygas reikia optimizuoti pagal gamintojo rekomendacijas.

9.3.

Taikant metodą kombinuotiesiems pašarams arba premiksams, kuriuose yra daugiau nei 1 % chloridų (koncentratai, mineraliniai pašarai, pašaro papildai), gali būti gauti sumažinti metionino rezultatai, todėl reikia numatyti specialų apdorojimą.

10.   Veiksmingumo kriterijai

Dviejų jungtinių lyginamųjų tyrimų (1990 m. tyrimo duomenys pateikti 7 punkte, o 2005 m. – standarte EN/ISO 13903) rezultatų (išskyrus tiroziną) suvestinėje nurodyti šie pakartojamumo ir atkuriamumo kriterijai. Šiuose dviejuose tarplaboratoriniuose tyrimuose gautos vertės gali netikti kitoms nei nurodytosios koncentracijos vertėms ir matricoms.

10.1.   Pakartojamumas

Dviejų toje pačioje laboratorijoje to paties veiklos vykdytojo atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei:

—	6 % didesnės vertės suminiam šių aminorūgščių kiekiui: glicino, alanino, lizino, prolino, glutamo rūgšties, izoleucino ir histidino,

—	8 % didesnės vertės suminiam šių aminorūgščių kiekiui: treonino, fenilalalino, metionino, asparto rūgšties ir leucino,

—	10 % didesnės vertės suminiam šių aminorūgščių kiekiui: arginino ir valino,

—	12 % didesnės vertės suminiam serino aminorūgšties kiekiui,

—	15 % didesnės vertės suminiam cisteino (cistino) aminorūgšties kiekiui.

10.2.   Atkuriamumas

Dviejų skirtingose laboratorijose ir (arba) skirtingų veiklos vykdytojų atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei:

—	15 % didesnės vertės suminiam šių aminorūgščių kiekiui: glicino, alanino ir treonino,

—	20 % didesnės vertės suminiam šių aminorūgščių kiekiui: lizino, prolino, fenilalalino, metionino ir asparto rūgšties,

—	22 % didesnės vertės suminiam šių aminorūgščių kiekiui: glutamo rūgšties ir leucino,

—	27 % didesnės vertės suminiam arginino aminorūgšties kiekiui,

—	32 % didesnės vertės suminiam izoleucino aminorūgšties kiekiui,

—	35 % didesnės vertės suminiam šių aminorūgščių kiekiui: valino ir serino,

—	40 % didesnės vertės suminiam histidino aminorūgšties kiekiui,

—	50 % didesnės vertės suminiam cisteino (cistino) aminorūgšties kiekiui.

F.   TRIPTOFANO KIEKIO NUSTATYMAS

Analizės metodai, naudotini triptofanui nustatyti:

—	EN ISO 13904 „Pašarai. Triptofano kiekio nustatymas“;

—	toliau 1–9 dalyse aprašyti analizės metodai.

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašaruose esančio triptofano suminį kiekį ir laisvąjį triptofaną. Šiuo metodu negalima atskirti D-ir L-formų.

2.   Metodas

Suminiam triptofanui nustatyti ėminys 20 valandų hidrolizuojamas šarminėje terpėje sočiuoju bario hidroksido tirpalu 110 °C temperatūroje. Po hidrolizės įpilama vidinio etalono.

Laisvajam triptofanui nustatyti ėminys ekstrahuojamas silpnai rūgštinėje terpėje esant vidiniam etalonui.

Triptofanas ir vidinis etalonas hidrolizate ar ekstrakte nustatomi HPLC metodu naudojant fluorescencinį detektorių.

3.   Reagentai

3.1.

Turi būti naudojamas du kartus distiliuotas arba tokios pat kokybės vanduo (laidis < 10 μS/cm).

3.2.

Standartinė medžiaga: triptofanas (grynumas/kiekis ≥ 99 %), išdžiovintas vakuume virš fosforo pentoksido.

3.3.

Vidinio etalono medžiaga: α-metiltriptofanas (grynumas/kiekis ≥ 99 %), išdžiovintas vakuume virš fosforo pentoksido.

3.4.

Bario hidroksido oktahidratas (siekiant išvengti BaCO3 susidarymo, kuris galėtų trukdyti nustatymui, užtikrinama, kad Ba(OH)2.8 H2O visiškai nesiliestų su oru) (žr. 9.3 punkto pastabą).

3.5.

Natrio hidroksidas.

3.6.

Ortofosforo rūgštis, (m/m) = 85 %.

3.7.

Vandenilio chlorido rūgštis, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8.

Metanolis, HPLC grynumo.

3.9.

Petroleteris, virimo temperatūros intervalas – 40–60 °C.

3.10.

Natrio hidroksido tirpalas, c = 1 mol/l: 40,0 g NaOH (3.5 punktas) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro (3.1 punktas).

3.11.

Vandenilio chlorido rūgštis, c = 6 mol/l: paimama 492 ml HCl (3.7 punktas) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.12.

Vandenilio chlorido rūgštis, c = 1 mol/l: paimama 82 ml HCl (3.7 punktas) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.13.

Vandenilio chlorido rūgštis, c = 0,1 mol/l: paimama 8,2 ml HCl (3.7 punktas) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.14.

Orto fosforo rūgštis, c = 0,5 mol/l: paimama 34 ml ortofosforo rūgšties (3.6 punktas) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro (3.1 punktas).

3.15.

Koncentruotas triptofano tirpalas (3.2 punktas), c = 2,50 μmol/ml: į 500 ml matavimo kolbą įdedama 0,2553 g triptofano (3.2 punktas), ištirpinama vandenilio chlorido rūgštyje (3.13 punktas) ir skiedžiama iki žymės vandenilio chlorido rūgštimi (3.13 punktas). Laikoma – 18 °C ne ilgiau kaip keturias savaites.

3.16.

Koncentruotas vidinio etalono tirpalas, c = 2,50 μmol/ml: į 500 ml matavimo kolbą įdedama 0,2728 g α-metiltriptofano (3.3 punktas), ištirpinama vandenilio chlorido rūgštyje (3.13 punktas) ir skiedžiama iki žymės vandenilio chlorido rūgštimi (3.13 punktas). Laikoma –18 °C ne ilgiau kaip keturias savaites.

3.17.

Triptofano ir vidinio etalono kalibravimo standartinis tirpalas: paimama 2,00 ml koncentruoto triptofano tirpalo (3.15 punktas) ir 2,00 ml koncentruoto vidinio etalono (α-metiltriptofano) tirpalo (3.16 punktas). Skiedžiama vandeniu (3.1 punktas) ir metanoliu (3.8 punktas) iki maždaug tokio pat tūrio ir maždaug iki tokios pat metanolio koncentracijos (10–30 %) kaip galutinio hidrolizato tūris ir koncentracija. Šis tirpalas turi būti ruošiamas prieš pat naudojimą. Ruošiamas tirpalas saugomas nuo tiesioginių saulės spindulių.

3.18.

Acto rūgštis.

3.19.

1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolis.

3.20.

Etanolaminas, (m/m) > 98 %.

3.21.

1 g 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19 punktas) tirpalas 100 ml metanolio (3.8 punktas).

3.22.

HPLC judančioji fazė: 3,00 g acto rūgšties (3.18 punktas) + 900 ml vandens (3.1 punktas) + 50,0 ml 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19 punktas) tirpalo (3.21 punktas) metanolyje (3.8 punktas) (1 g/100 ml). Etanolaminu (3.20 punktas) nustatoma pH vertė 5,00. Skiedžiama vandeniu (3.1 punktas) iki 1 000 ml.

4.   Aparatūra

4.1.

HPLC įranga ir fluorescencinis detektorius.

4.2.

Skysčių chromatografijos kolonėlė, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm įkrova, arba lygiavertė kolonėlė.

4.3.

pH-metras.

4.4.

Kolba iš polipropileno, talpa 125 ml, su plačiu kaklu ir užsukamu dangčiu.

4.5.

Membraninis filtras (0,45 μm).

4.6.

Autoklavas, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar.

4.7.

Mechaninė purtyklė arba magnetinė maišyklė.

4.8.

Sūkurinė maišyklė.

5.   Procedūra

5.1.   Ėminių ruošimas

Ėminys susmulkinamas taip, kad jį būtų galima sijoti per 0,5 mm sietą. Daug drėgmės turintys ėminiai prieš juos smulkinant turi būti džiovinami ore ne didesnėje nei 50 °C temperatūroje arba liofilizuojami. Daug riebalų turintys ėminiai prieš juos smulkinant ekstrahuojami petroleteriu (3.9 punktas).

5.2.   Laisvojo triptofano kiekio nustatymas (ekstraktas)

Į kūginę kolbą 1 mg tikslumu pasveriamas atitinkamas kiekis (1–5 g) paruošto ėminio (5.1 punktas). Įpilama 100,0 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.13 punktas) ir 5,00 ml koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16 punktas). 60 min. purtoma mechanine purtykle arba maišoma magnetine maišykle (4.7 punktas). Nuosėdoms leidžiama nusėsti, pipete paimama į cheminę stiklinę 10,0 ml tirpalo virš nuosėdų. Įpilama 5 ml ortofosforo rūgšties (3.14 punktas). Natrio hidroksido tirpalu (3.10 punktas) nustatoma pH vertė 3,0. Įpilamas pakankamas kiekis metanolio (3.8 punktas), kad galutinio tirpalo metanolio koncentracija būtų 10–30 %. Supilama į atitinkamo tūrio matavimo kolbą ir skiedžiama vandeniu iki chromatografinei analizei tinkamo tūrio (maždaug iki to paties tūrio, kaip kalibravimo standartinio tirpalo tūris (3.17 punktas)).

Prieš įpurškiant į HPLC kolonėlę keli ml tirpalo filtruojami per 0,45 μm membraninį filtrą (4.5 punktas). Chromatografinė analizė atliekama pagal 5.4 skirsnį.

Standartinis tirpalas ir ekstraktai saugomi nuo tiesioginių saulės spindulių. Jei ekstraktų neįmanoma analizuoti tą pačią dieną, ekstraktus ne ilgiau kaip tris paras galima laikyti 5 °C temperatūroje.

5.3.   Suminio triptofano kiekio nustatymas (hidrolizatas)

Į kolbą iš polipropileno (4.4 punktas) 0,2 mg tikslumu pasveriama 0,1–1 g paruošto ėminio (5.1 punktas). Pasvertojoje ėminio dalyje azoto turi būti apie 10 mg. Įpilama 8,4 g bario hidroksido oktahidrato (3.4 punktas) ir 10 ml vandens. Sumaišoma sūkurine maišykle (4.8 punktas) arba magnetine maišykle (4.7 punktas). Teflonu padengtas magnetas paliekamas mišinyje. Indo sienelės nuplaunamos 4 ml vandens. Kolba uždengiama užsukamuoju dangčiu jo neužveržiant. Kolba įdedama į autoklavą (4.6 punktas) su verdančiu vandeniu ir garais ir laikoma 30–60 min. Autoklavas uždaromas ir 20 valandų kaitinama 110 (± 2) °C temperatūroje.

Prieš atidarant autoklavą temperatūra sumažinama iki šiek tiek žemesnės nei 100 °C. Siekiant išvengti Ba(OH)2.8 H2O išsikristalizavimo, į šiltą mišinį įpilama 30 ml kambario temperatūros vandens. Švelniai purtoma arba maišoma. Įpilama 2,00 ml koncentruoto vidinio etalono (α-metiltriptofano) tirpalo (3.16 punktas). Indai 15 min. aušinami ant vandens arba ledo vonios.

Tada įpilama 5 ml ortofosforo rūgšties (3.14 punktas). Indą laikant ant aušinamosios vonios ir maišant, turinys neutralizuojama HCl (3.11 punktas) ir HCl (3.12 punktas) nustatoma pH vertė 3,0. Įpilamas pakankamas kiekis metanolio, kad galutinio tirpalo metanolio koncentracija būtų 10–30 %. Supilama į atitinkamo tūrio matavimo kolbą ir skiedžiama vandeniu iki chromatografinei analizei reikiamo tūrio (pvz., 100 ml). Įpylus metanolio, nuosėdos nesusidaro.

Prieš įpurškiant į HPLC kolonėlę keli ml tirpalo filtruojami per 0,45 μm membraninį filtrą (4.5 punktas). Chromatografinė analizė atliekama pagal 5.4 punktą.

Standartinis tirpalas ir hidrolizatai saugomi nuo tiesioginių saulės spindulių. Jei ekstraktų neįmanoma analizuoti tą pačią dieną, ekstraktus ne ilgiau kaip tris paras galima laikyti 5 °C temperatūroje.

5.4.   HPLC nustatymas

Rekomenduojamos šios izokratinio eliuavimo sąlygos; gali būti taikomos kitos sąlygos, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai (žr. dar 9.1 ir 9.2 punktų pastabas):

Skysčių chromatografijos kolonėlė (4.2 punktas):	125 mm × 4 mm, C18, 3 μm įkrova arba lygiavertė kolonėlė
Kolonėlės temperatūra:	kambario temperatūra
Judančioji fazė (3.22 punktas):	3,00 g acto rūgšties (3.18 punktas) + 900 ml vandens (3.1 punktas) + 50,0 ml 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19 punktas) tirpalo (3.21 punktas) metanolyje (3.8 punktas) (1 g/100 ml). Etanolaminu (3.20 punktas) nustatoma pH vertė 5,00. Skiedžiama vandeniu (3.1 punktas) iki 1 000  ml
Srautas:	1 ml/min
Visa eliuavimo trukmė:	maždaug 34 min
Detektoriaus bangos ilgis:	sužadinimas: 280 nm, emisija: 356 nm
Įpurškiamas tūris:	20 μl

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Apskaičiuojamas triptofano kiekis (X) gramais 100 g ėminio.

A –	=	vidinio etalono smailės plotas, kalibravimo standartinis tirpalas (3.17 punktas)
B –	=	triptofano ekstrakte (5.2 punktas) ar hidrolizate (5.3 punktas) smailės plotas
V1 –	=	koncentruoto triptofano tirpalo (3.15 punktas), įpilamo į kalibravimo tirpalą (3.17 punktas), tūris ml (2 ml)
c –	=	koncentruoto triptofano tirpalo (3.15 punktas), įpilamo į kalibravimo tirpalą (3.17 punktas), koncentracija μmol/ml (= 2,50)
V2 –	=	koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16 punktas), įpilamo į ekstraktą (5.2 punktas) (= 5,00 ml) arba į hidrolizatą (5.3 punktas) (= 2,00 ml), tūris
C –	=	vidinio etalono ekstrakte (5.2 punktas) arba hidrolizate (5.3 punktas) smailės plotas
D –	=	triptofano kalibravimo standartiniame tirpale (3.17 punktas) smailės plotas
V3 –	=	koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16 punktas), įpilamo į kalibravimo standartinį tirpalą (3.17 punktas), tūris ml (= 2,00 ml)
m –	=	ėminio masė g (su pataisa pradinei masei, jei jis buvo išdžiovintas arba iš jo buvo pašalinti riebalai)
M –	=	triptofano molekulinė masė (= 204,23 g/mol)

7.   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio matavimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 10 % didesniojo rezultato vertės.

8.   Jungtinio lyginamojo tyrimo rezultatai

Hidrolizės metodui sertifikuoti buvo atliktas ES jungtinis lyginamasis tyrimas (4-asis tarplaboratorinis palyginimas), per kurį iki dvylikos laboratorijų analizavo tris ėminius. Kiekvienas ėminys buvo analizuojamas penkis kartus. Rezultatai pateikiami šioje lentelėje:

	1 ėminys Kiaulių pašaras	2 ėminys Kiaulių pašaras su L-triptofanu	3 ėminys Kiaulių pašaro koncentratas
L	12	12	12
n Vidurkis [g/kg]	50 2,42	55 3,40	50 4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [%]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVR [%]	6,3	6,0	2,2
L – rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius n – atskirų rezultatų, paliekamų po riktų (identifikuotų pagal Cochran, Dixon riktų kriterijų) pašalinimo, skaičius sr – pakartojamumo standartinis nuokrypis SR – atkuriamumo standartinis nuokrypis r – pakartojamumas R – atkuriamumas CVr – pakartojamumo variacijos koeficientas (%) CVR – atkuriamumo variacijos koeficientas (%)

Laisvojo triptofano ekstrahavimo metodui sertifikuoti buvo atliktas dar vienas ES jungtinis lyginamasis tyrimas (3–asis tarplaboratorinis palyginimas), per kurį iki trylikos laboratorijų analizavo du ėminius. Kiekvienas ėminys buvo analizuojamas penkis kartus. Rezultatai pateikiami šioje lentelėje:

	4 ėminys Kviečių ir sojų mišinys	5 ėminys Kviečių ir sojų mišinys (4 ėminys) su triptofanu (0,457 g/kg)
L n	12 55	12 60
Vidurkis [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [%]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [%]	4,71	5,11
L – rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius n – atskirų rezultatų, paliekamų po riktų (identifikuotų pagal Cochran, Dixon riktų kriterijų) pašalinimo, skaičius sr – pakartojamumo standartinis nuokrypis SR – atkuriamumo standartinis nuokrypis r – pakartojamumas R – atkuriamumas CVr – pakartojamumo variacijos koeficientas (%) CVR – atkuriamumo variacijos koeficientas (%)

Triptofano hidrolizės metodui sertifikuoti buvo atliktas dar vienas ES jungtinis lyginamasis tyrimas, per kurį ne daugiau kaip septynios laboratorijos analizavo keturis ėminius. Rezultatai pateikiami toliau. Kiekvienas ėminys buvo analizuojamas penkis kartus.

	1 ėminys Kombinuotasis kiaulių pašaras (CRM 117)	2 ėminys Žuvų miltai su mažu riebalų kiekiu (CRM 118)	3 ėminys Sojų miltai (CRM 119)	4 ėminys Nugriebto pieno milteliai (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Vidurkis [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [%]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [%]	1,48	4,69	4,11	4,22
L – rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius n – atskirų rezultatų, paliekamų po riktų (identifikuotų pagal Cochran, Dixon riktų kriterijų) pašalinimo, skaičius sr – pakartojamumo standartinis nuokrypis SR – atkuriamumo standartinis nuokrypis r – pakartojamumas R – atkuriamumas CVr – pakartojamumo variacijos koeficientas (%) CVR – atkuriamumo variacijos koeficientas (%)

9.   Pastabos

9.1.

Šios specialios chromatografavimo sąlygos gali pagerinti triptofano ir α-metiltriptofano atskyrimą. Izokratinis eliuavimas, po kurio kolonėlė plaunama taikant gradientinį eliuavimą: Skysčių chromatografijos kolonėlė: 125 mm × 4 mm, C18, 5 μm įkrova, arba lygiavertė kolonėlė. Kolonėlės temperatūra: 32 °C. Judančioji fazė: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanolis, 95 + 5 (V + V). B: Metanolis. Gradiento programa: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Srautas: 1,2 ml/min. Visa eliuavimo trukmė: maždaug 33 min.

9.2.

Chromatografinė analizė bus nevienoda atsižvelgiant į HPLC tipą ir naudojamą kolonėlės įkrovos medžiagą. Pasirinkta sistema turi užtikrinti triptofano ir vidinio etalono smailių atsiskyrimą iki pat bazinės linijos. Be to, svarbu, kad irimo produktai būtų gerai atskirti nuo triptofano ir vidinio etalono. Siekiant patikrinti, ar bazinėje linijoje, kur turi būti vidinio etalono smailė, nėra priemaišų, analizuojami hidrolizatai be vidinio etalono. Svarbu, kad eliuavimo trukmė būtų pakankamai ilga visiems irimo produktams išplauti, antraip pavėlavusios eliuavimo smailės gali trukdyti vėliau atliekamoms chromatografavimo procedūroms. Chromatografavimo sistemos atsakas darbinių koncentracijos verčių intervale yra tiesinis. Atsako tiesiškumas nustatomas naudojant vieną (normalią) vidinio etalono koncentraciją ir keičiant triptofano koncentraciją. Svarbu, kad triptofano ir vidinio etalono smailės būtų HPLC ir fluorescencinio detektoriaus sistemos tiesinėje dalyje. Jei triptofano ir (arba) vidinio etalono smailė (-s) yra per žemos ar per aukštos, analizė kartojama imant kito dydžio ėminį ir (arba) kitą galutinį tūrį.

9.3.   Bario hidroksidas

Sendamas bario hidroksidas vis blogiau tirpsta. Dėl šios priežasties tirpalas, naudojamas nustatymui HPLC metodu, darosi neskaidrus ir dėl to gali būti gauti mažesni triptofano kiekio rezultatai.

G.   ŽALIŲ ALIEJŲ IR RIEBALŲ KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šis metodas taikomas žalių aliejų ir riebalų kiekiui pašaruose nustatyti.

Atsižvelgiant į pašarų tipą bei sudėtį ir į analizės atlikimo priežastį taikoma viena iš dviejų aprašytų procedūrų.

Žaliems aliejams ir riebalams aliejingosiose sėklose ir vaisiuose, taip pat pašaruose, kuriuose žalio aliejaus arba riebalų kiekis yra didesnis kaip 15 %, nustatyti ekstrahavimas turėtų būti atliekamas pagal A procedūrą, o pakartotinis ekstrahavimas – pagal B procedūrą (5.3 punktas).

1.1.   A procedūra. Tiesiogiai ekstrahuojami žali aliejai ir riebalai

Šis metodas taikomas augalinėms pašarinėms žaliavoms, išskyrus pašarus, įtrauktus į B procedūros taikymo sritį.

1.2.   B procedūra. Suminis žalių aliejų ir riebalų kiekis

Šis metodas taikomas gyvūninėms pašarinėms žaliavoms ir visiems kombinuotiesiems pašarams. Šis metodas turi būti taikomas visoms medžiagoms, iš kurių žali aliejai ir riebalai negali būti visiškai ekstrahuoti prieš tai neatlikus jų hidrolizės (pvz., grūdų glitimas, mielės, bulvių baltymai ir produktai, kurie apdorojami taikant procesus, pvz., išspaudimo, dribsnių gamybos ir kaitinimo procesus).

1.3.   Rezultatų aiškinimas

Visais atvejais, kai rezultatas, gautas taikant B procedūrą, yra didesnis nei rezultatas, gautas pagal A procedūrą, teisingu turi būti laikomas rezultatas, gautas taikant B procedūrą.

2.   Metodas

2.1.   A procedūra

Ėminys ekstrahuojamas petroleteriu. Tirpiklis išgarinamas, o likutis džiovinamas ir sveriamas.

2.2.   B procedūra

Ėminys apdorojamas vandenilio chlorido rūgštimi kaitinant. Mišinys atvėsinamas ir filtruojamas. Likutis plaunamas, džiovinamas ir ekstrahuojamas pagal A procedūrą.

3.   Reagentai

3.1.

Petroleteris, virimo temperatūros intervalas – 40–60 °C. Bromo skaičius turi būti mažesnis nei 1, likutis po išgarinimo – mažesnis nei 2 mg/100 ml.

3.2.

Natrio sulfatas, bevandenis.

3.3.

Vandenilio chlorido rūgštis, c = 3 mol/l.

3.4.

Pagalbinė filtravimo priemonė, pvz., diatomitas, „hyflo-supercel“.

4.   Aparatūra

4.1.

Ekstrahavimo aparatas. Jei naudojamas sifonas (Soksleto aparatas), grąžinamo skysčio srautas yra toks, kad per valandą būtų apie 10 ciklų; jei sifonas nenaudojamas, grąžinamo skysčio srautas yra apie 10 ml/min.

4.2.

Ekstrahavimo tūtos, kurios neturėtų petroleteryje tirpių medžiagų ir kurių akytumas atitiktų 4.1 punkto reikalavimus.

4.3.

Džiovinimo spinta, vakuuminė spinta, nustatyta 75 ± 3 °C, arba spinta su oro cirkuliacija, nustatyta 100 ± 3 °C.

5.   Procedūra

5.1.   A procedūra (žr. 8.1 punktą)

5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, supilama į ekstrahavimo tūtą (4.2 punktas) ir užkemšama riebalų neturinčios vatos kamščiu.

Tūta dedama į ekstrahavimo aparatą (4.1 punktas) ir ekstrahuojama šešias valandas petroleteriu (3.1 punktas). Petroleterio ekstraktas surenkamas į pasvertą sausą kolbą su pemzos gabaliukais (6).

Tirpiklis distiliuojamas. Likutis džiovinamas kolbą laikant džiovinimo spintoje (4.3 punktas) pusantros valandos. Kolba atvėsinama eksikatoriuje ir pasveriama. Džiovinama dar 30 min, siekiant patikrinti, ar nekinta riebalų ir aliejų masė (paeiliui sveriant du kartus, masės sumažėjimas turi neviršyti 1 mg).

5.2.   B procedūra

2,5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu (žr. 8.2 punktą), supilama į 400 ml cheminę stiklinę arba 300 ml kūginę kolbą, įpilama 100 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.3 punktas) ir įmetami keli pemzos gabaliukai. Cheminė stiklinė uždengiama laikrodžio stiklu arba kūginė kolba sujungiama su grįžtamuoju kondensatoriumi. Mišinys atsargiai užverdamas virš mažos liepsnos arba ant kaitlentės ir vieną valandą virinamas. Reikia žiūrėti, kad produktas nepriliptų prie indo sienelių.

Atvėsinama ir pridedama pakankamai pagalbinės filtravimo priemonės (3.4 punktas), kad būtų išvengta aliejaus ir riebalų nuostolių filtruojant. Filtruojama per sudrėkintą, dvigubą riebalų neturintį filtravimo popierių. Likutis plaunamas šaltu vandeniu tol, kol gaunamas neutralios reakcijos filtratas. Patikrinama, ar filtrate nėra riebalų. Jų buvimas filtrate rodo, kad prieš hidrolizę ėminys turi būti ekstrahuojamas petroleteriu pagal A procedūrą.

Dvigubas filtravimo popierius su likučiu dedamas ant laikrodžio stiklo ir 100 ± 3 °C temperatūroje džiovinamas pusantros valandos džiovinimo spintoje su oro cirkuliacija (4.3 punktas).

Dvigubas filtravimo popierius su sausu likučiu įdedamas į ekstrahavimo tūtą (4.2 punktas), kuri užkemšama riebalų neturinčios vatos kamščiu. Tūta dedama į ekstrahavimo aparatą (4.1 punktas) ir tęsiama, kaip nurodyta 5.1 punkto antroje ir trečioje pastraipose.

5.3.   A procedūra ir pakartotinis ekstrahavimas pagal B procedūrą

Žaliems aliejams ir riebalams aliejingosiose sėklose ir vaisiuose, taip pat pašaruose, kuriuose žalio aliejaus arba riebalų kiekis yra didesnis kaip 15 %, nustatyti ekstrahavimas turėtų būti atliekamas pagal A procedūrą, o pakartotinis ekstrahavimas – pagal B procedūrą.

Tai reiškia, kad ekstrahavus petroleteriu (A procedūra) likutis arba jo dalis pakartotinai ekstrahuojami vandenilio chlorido rūgštimi (B procedūra). Žalių aliejų ir riebalų kiekis yra per A ir B procedūras nustatytų kiekių suma.

6.   Rezultatų išraiška

Likučio masė išreiškiama ėminio masės procentais.

7.   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties analizę atliekančio asmens atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei:

—	0,2 %, absoliučiąja verte, kai žalių aliejų ir riebalų kiekis yra mažesnis nei 5 %,

—	4,0 % didžiausio rezultato vertės, kai kiekis 5–10 %,

—	0,4 % absoliučiąja verte, kai kiekis didesnis nei 10 %.

8.   Pastabos

8.1.

Jei produktus, turinčius didelį aliejų ir riebalų kiekį, sunku sutrupinti arba jie yra netinkami sumažintajam homogeniniam tiriamajam ėminiui paimti, atliekami toliau aprašyti veiksmai. 20 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir sumaišoma su 10 g ar didesniu kiekiu bevandenio natrio sulfato (3.2 punktas). Ekstrahuojama petroleteriu (3.1 punktas), kaip nurodyta 5.1 punkte. Gautas ekstraktas skiedžiamas pertoleteriu iki 500 ml (3.1 punktas) ir tirpalas sumaišomas. 50 ml tirpalo supilama į prieš tai pasvertą nedidelę sausą kolbą su pemzos gabalėliais. Tirpiklis distiliuojamas, likutis džiovinamas ir tęsiama, kaip nurodyta 5.1 punkto paskutinėje pastraipoje. Pašalinamas tirpiklis iš tūtoje likusio ekstrahavimo likučio, likutis sutrupinamas ne didesnėmis nei 1 mm dydžio dalelėmis, sudedamas atgal į ekstrahavimo tūtą (natrio sulfato nededama) ir atliekamos 5.1 punkto antroje ir trečioje pastraipose nurodytos procedūros. Aliejų ir riebalų kiekis ėminio masės procentais apskaičiuojamas pagal šią formulę: kurioje: m1 – = likučio po pirmojo ekstrahavimo (alikvotinės ekstrakto dalies) svoris gramais; m2 – = likučio po antrojo ekstrahavimo svoris gramais.

8.2.

Tam tikruose produktuose (pvz., kuriuose yra nedaug aliejų arba riebalų) tiriamojo ėminio masė gali būti padidinta.

8.3.

Gyvūnų augintinių ėdalą, kuriame yra daug vandens, prieš hidrolizę ir ekstrahavimą gali tekti maišyti su bevandeniu natrio sulfatu, kaip tai daroma taikant B procedūrą.

8.4.

Atliekant 5.2 punkte aprašytas procedūras, likučiui po filtravimo plauti veiksmingiau būtų naudoti ne šaltą, o karštą vandenį.

8.5.

Kai kurių pašarų 1,5 val. džiovinimo trukmę gali tekti pailginti. Per ilgo džiovinimo vengiama, nes dėl to gali būti gauti mažesni rezultatai. Gali būti naudojama mikrobangų krosnis.

H.   ŽALIOS LĄSTELIENOS KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašarų neriebalines organines medžiagas, netirpias rūgštinėje ir šarminėje terpėje, kurios paprastai apibūdinamos kaip žalia ląsteliena.

Metodas netaikomas lignoceliuliozei ir augalinėms anglims (dalelės per smulkios).

2.   Metodas

Ėminys, iš kurio prireikus pašalinami riebalai, veikiamas tam tikros koncentracijos sieros rūgšties ir kalio hidroksido tirpalais virimo temperatūroje. Likutis atskiriamas filtruojant, plaunamas, džiovinamas, sveriamas ir sudeginamas 475–500 °C temperatūroje. Žalios ląstelienos kiekis tiriamajame ėminyje atitinka masės sumažėjimą po sudeginimo iki pelenų.

3.   Reagentai

3.1.

Sieros rūgštis, c = 0,13 mol/l.

3.2.

Priešputis (pvz., n-oktanolis).

3.3.

Filtravimą greitinanti priemonė (Celite 545 arba lygiavertė), iškaitinta 500 °C temperatūroje keturias valandas (8.6 punktas).

3.4.

Acetonas.

3.5.

Petroleteris, kurio virimo temperatūros intervalas 40–60 °C.

3.6.

Vandenilio chlorido rūgštis, c = 0,5 mol/l.

3.7.

Kalio hidroksido tirpalas, c = 0,23 mol/l.

4.   Aparatūra

4.1.

Kaitinimo įrenginys šlapiajam skaidymui sieros rūgštimi arba kalio hidroksido tirpalu, turintis filtravimo tiglio (4.2 punktas) laikiklį, išleidimo vamzdį su čiaupu skysčiui išleisti ir vakuuminį siurblį, gali būti suslėgtojo oro. Kiekvieną dieną prieš naudojimą blokas penkias minutes šildomas verdančiu vandeniu.

4.2.

Stiklinis filtravimo tiglis su sukepinto stiklo filtro plokšte, kurios akučių dydis 40–90 μm. Prieš naudojant pirmą kartą, tiglis kelias minutes kaitinamas iki 500 °C ir atvėsinamas (8.6 punktas).

4.3.

Ne mažesnės nei 270 ml talpos cilindras su grįžtamuoju kondensatoriumi, tinkamas virinimui.

4.4.

Džiovinimo spinta su šilumine rele.

4.5.

Mufelinė krosnis su šilumine rele.

4.6.

Ekstrahavimo įrenginys, kurį sudaro filtravimo tiglio (4.2 punktas) laikiklio plokštė ir išleidimo vamzdis su čiaupu vakuumui prijungti ir skysčiui išleisti.

4.7.

Jungiamieji žiedai kaitinimo įrenginiui (4.1 punktas), tigliui (4.2 punktas) ir cilindrui (4.3 punktas) sujungti ir šaltojo ekstrahavimo įrenginiui (4.6 punktas) bei tigliui prijungti.

5.   Procedūra

1 mg tikslumu pasveriama 1 g paruošto ėminio, ėminys dedamas į tiglį (4.2 punktas) (žr. 9.1, 9.2 ir 9.3 punktų pastabas) ir pridedamas 1 g filtravimą greitinančios priemonės (3.3 punktas).

Surenkamas kaitinimo įrenginys (4.1 punktas) ir filtravimo tiglis (4.2 punktas), tada prie tiglio prijungiamas cilindras (4.3 punktas). Į cilindro ir tiglio sąranką įpilama 150 ml verdančios sieros rūgšties (3.1 punktas) ir prireikus įlašinami keli lašai priešpučio (3.2 punktas).

Užvirinama per 5 ± 2 min. ir stipriai virinama lygiai 30 min.

Atsukamas čiaupas į išleidimo vamzdį (4.1 punktas), sieros rūgštis filtruojama vakuumu per filtravimo tiglį ir likutis tris kartus paeiliui plaunamas 30 ml verdančio vandens, užtikrinant, kad po kiekvieno plovimo likutis būtų filtruojamas sausai.

Išleidžiamasis čiaupas užsukamas, į cilindro ir tiglio sąranką įpilama 150 ml verdančio kalio hidroksido tirpalo (3.7 punktas) ir įlašinami keli lašai priešpučio (3.2 punktas). Užvirinama per 5 ± 2 min. ir stipriai virinama lygiai 30 min. Filtruojama ir kartojama plovimo procedūra, taikyta sieros rūgščiai.

Po paskutinio plovimo ir džiovinimo tiglis su jame esančia medžiaga atjungiamas ir sujungiamas su šaltojo ekstrahavimo įrenginiu (4.6 punktas). Prijungiamas vakuumas ir likutis tiglyje tris kartus iš eilės plaunamas 25 ml acetono porcijomis (3.4 punktas) užtikrinant, kad po kiekvieno plovimo likutis būtų filtruojamas sausai.

Tiglis džiovinamas džiovinimo spintoje iki pastoviosios masės 130 °C temperatūroje. Po kiekvieno džiovinimo tiglis atvėsinamas eksikatoriuje ir greitai pasveriamas. Tiglis dedamas į mufelinę krosnį ir ne mažiau nei 30 min. iškaitinamas 475–500 °C temperatūroje iki pastoviosios masės (paeiliui sveriant du kartus, masės sumažėjimas turi neviršyti 2 mg).

Po kiekvieno iškaitinimo iš pradžių atvėsinama krosnyje, vėliau eksikatoriuje, ir pasveriama.

Atliekamas tuščiasis bandymas be ėminio. Masės sumažėjimas po sudeginimo iki pelenų neturi būti didesnis nei 4 mg.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Žalios ląstelienos kiekis ėminio masės procentais gaunamas pagal lygtį:

kurioje:

m	=	ėminio svoris g;
m0	=	ėminio masės sumažėjimas po sudeginimo iki pelenų g;
m1	=	masės sumažėjimas po sudeginimo iki pelenų, atliekant tuščiąjį bandymą, g.

7.   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei:

—	0,6 % absoliučiąja verte, kai žalios ląstelienos kiekis mažesnis nei 10 %;

—	6 % didžiausiojo rezultato vertės, kai žalios ląstelienos kiekis lygus ar didesnis nei 10 %.

8.   Atkuriamumas

Dviejų skirtingose laboratorijose atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei:

—	1,0 % absoliučiąja verte, kai žalios ląstelienos kiekis mažesnis nei 10 %;

—	10 % didžiausiojo rezultato vertės, kai žalios ląstelienos kiekis lygus ar didesnis nei 10 %.

9.   Pastabos

9.1.

Jei pašaruose yra daugiau nei 10 % žalių riebalų, prieš analizę jie turi būti pašalinti petroleteriu (3.5 punktas). Filtravimo tiglis (4.2 punktas) su jame esančia medžiaga prijungiamas prie šaltojo ekstrahavimo įrenginio (4.6 punktas) ir prijungus vakuumą likutis tris kartus plaunamas 30 ml petroleterio porcijomis, užtikrinant, kad likutis būtų sausas. Tiglis su jame esančia medžiaga prijungiamas prie kaitinimo įrenginio (4.1 punktas) ir analizė tęsiama, kaip aprašyta 5 punkte.

9.2.

Jei pašaruose yra riebalų, kurių tiesiogiai negalima ekstrahuoti petroleteriu (3.5 punktas), riebalai turi būti pašalinti, kaip nurodyta 8.1 punkte, ir dar kartą šalinami po virinimo su rūgštimi. Pavirinus su rūgštimi ir išplovus, tiglis su jame esančia medžiaga prijungiamas prie šalto ekstrahavimo indo (4.6 punktas) ir tris kartus plaunamas 30 ml acetono (4.6 punktas), tada tris kartus 30 ml petroleterio porcijomis. Filtruojama prijungus vakuumą iki sauso likučio ir analizė tęsiama, kaip aprašyta 5 punkte, pradedant nuo apdorojimo kalio hidroksido tirpalu.

9.3.

Jei pašarai turi daugiau kaip 5 % karbonatų, išreikštų kalcio karbonatu, tiglis (4.2 punktas) su pasvertu ėminiu prijungiamas prie kaitinimo įrenginio (4.1 punktas). Ėminys tris kartus plaunamas 30 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.6 punktas). Kiekvieną kartą įpylus rūgšties ėminys paliekamas stovėti prieš filtravimą maždaug vieną minutę. Vieną kartą plaunama 30 ml vandens ir procedūra tęsiama, kaip aprašyta 5 punkte.

9.4.

Jei aparatas naudojamas kaip stovas (prie to paties kaitinimo įrenginio prijungti keli tigliai), atliekant vieną bandymų seriją negalima vykdyti dviejų to paties ėminio atskirų nustatymų.

9.5.

Jei po virinimo sunku filtruoti rūgštinius ir šarminius tirpalus, per kaitinimo įrenginio išleidimo vamzdį leidžiamas suslėgtasis oras ir filtravimas tęsiamas.

9.6.

Siekiant pratęsti stiklinių filtravimo tiglių naudojimo trukmę, deginimo iki pelenų temperatūra yra ne aukštesnė nei 500 °C. Reikia žiūrėti, kad kaitinant ir atvėsinant būtų išvengta staigių temperatūros svyravimų.

I.   CUKRAUS KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti redukuojančiųjų cukrų kiekį ir suminį invertuotų cukrų kiekį, išreiškiamą gliukozės kiekiu arba, jei tinka, sacharozės kiekiu, dauginant rezultatą iš faktoriaus 0,95. Metodas tinka kombinuotiesiems pašarams. Kitiems pašarams numatyti specialieji metodai. Jei būtina, laktozė nustatoma atskirai, ir į jos kiekį atsižvelgiama apskaičiuojant rezultatus.

Šis metodas naudotinas cukraus kiekiui nustatyti, siekiant apskaičiuoti pašarų energetinę vertę.

Kai cukraus kiekis turi būti nustatomas kitais tikslais, galima naudoti kitus analizės metodus.

2.   Metodas

Cukrūs ekstrahuojami praskiestu etanoliu; tirpalas skaidrinamas I ir II Carrez tirpalais. Etanolį pašalinus, cukrų kiekis prieš ir po inversijos nustatomas Luff-Schoorl metodu.

3.   Reagentai

3.1.

Etanolio tirpalas 40 % (V/V), tankis: 0,948 g/ml 20 °C temperatūroje, neutralizuotas pagal fenolftaleiną.

3.2.

Carrez I tirpalas: vandenyje ištirpinama 21,9 g cinko acetato Zn(CH3COO)2 2H2O ir 3 g ledinės acto rūgšties. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.3.

Carrez II tirpalas: vandenyje ištirpinama 10,6 g kalio heksacianoferato (II) K4 Fe(CN)6 3H2O. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.4.

Metiloranžinio 0,1 % (m/V) tirpalas.

3.5.

Vandenilio chlorido rūgšties 4 mol/l tirpalas.

3.6.

Vandenilio chlorido rūgšties 0,1 mol/l tirpalas.

3.7.

Natrio hidroksido 0,1 mol/l tirpalas.

3.8.

Luff-Schoorl reagentas: Atsargiai maišant citrinų rūgšties tirpalas (3.8.2 punktas) supilamas į natrio karbonato tirpalą (3.8.3 punktas). Įpilamas vario sulfato tirpalas (3.8.1 punktas) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro. Paliekama nusistovėti per naktį ir tirpalas filtruojamas. Tikrinama gauto reagento koncentracija (Cu – 0,05 mol/l, Na2CO3–1 mol/l), žr. 5.4 punkto paskutinę pastraipą. Tirpalo pH yra apie 9,4.

3.8.1.

Vario sulfato tirpalas: 25 g vario sulfato Cu SO4 5H2O, neturinčio geležies, ištirpinama 100 ml vandens.

3.8.2.

Citrinų rūgšties tirpalas: 50 g citrinų rūgšties C6H8O7•H2O ištirpinama 50 ml vandens.

3.8.3.

Natrio karbonato tirpalas: 143,8 g bevandenio natrio karbonato ištirpinama maždaug 300 ml šilto vandens. Paliekama atvėsti.

3.9.

Natrio tiosulfato 0,1 mol/l tirpalas.

3.10.

Krakmolo tirpalas: 5 g tirpaus krakmolo mišinys su 30 ml vandens supilamas į 1 litrą verdančio vandens. Virinama tris minutes, tirpalas atvėsinamas, prireikus į jį kaip konservanto įdedama 10 mg gyvsidabrio (II) jodido.

3.11.

Sieros rūgšties 3 mol/l tirpalas.

3.12.

Kalio jodido 30 % (m/V) tirpalas.

3.13.

Pemzos granulės, virintos vandenilio chlorido rūgšties tirpale, išplautos ir išdžiovintos.

3.14.

3-metilbutan-1-olis.

4.   Aparatūra

Maišiklis (vartytuvas), dažnis maždaug 35–40 sūk./min.

5.   Procedūra

5.1.   Ėminio ekstrahavimas

2,5 g ėminio, pasverto 1 mg tikslumu, supilama į 250 ml matavimo kolbą. Įpilama 200 ml etanolio (3.1 punktas) ir vieną valandą maišoma vartytuve. Įpilama 5 ml Carrez I tirpalo (3.2 punktas) ir maišoma maždaug 30 s. Įpilama 5 ml Carrez II tirpalo (3.3 punktas) ir vėl maišoma 1 min. Skiedžiama etanoliu (3.1 punktas) iki žymės, sumaišoma ir filtruojama. Imama 200 ml filtrato ir garinama didesnei daliai etanolio pašalinti tol, kol tūris sumažėja maždaug du kartus. Likutis po išgarinimo naudojant šiltą vandenį kiekybiškai supilamas į 200 ml matavimo kolbą, tirpalas atvėsinamas, skiedžiamas iki žymės vandeniu, sumaišomas ir prireikus filtruojamas. Šis tirpalas naudojamas redukuojančiųjų cukrų kiekiui nustatyti ir, po inversijos, suminiam cukrų kiekiui nustatyti.

5.2.   Redukuojančiųjų cukrų kiekio nustatymas

Pipete paimama ne daugiau kaip 25 ml tirpalo, kuriame yra mažiau nei 60 mg redukuojančiųjų cukrų, kurių kiekis išreiškiamas gliukozės kiekiu. Prireikus skiedžiama distiliuotu vandeniu iki 25 ml ir redukuojančiųjų cukrų kiekis nustatomas Luff-Schoorl metodu. Rezultatas išreiškiamas gliukozės kiekiu ėminyje procentais.

5.3.   Suminio invertuotų cukrų kiekio nustatymas

Pipete paimama 50 ml tirpalo ir supilama į 100 ml matavimo kolbą. Įlašinami keli lašai metiloranžinio tirpalo (3.4 punktas) ir atsargiai, nuolat maišant, pilama vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (3.5 punktas) tol, kol neišnyksta tirpalo raudona spalva. Įpilama 15 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.6 punktas), kolba nuleidžiama į stipriai verdančio vandens vonią, kurioje laikoma trisdešimt minučių. Tirpalas greitai atvėsinamas iki maždaug 20 °C temperatūros ir į jį įpilama 15 ml natrio hidroksido tirpalo (3.7 punktas). Skiedžiama vandeniu iki 100 ml ir sumaišoma. Paimama ne daugiau 25 ml šio tirpalo, kuriame yra mažiau nei 60 mg redukuojančiųjų cukrų, perskaičiuotų į gliukozės kiekį. Prireikus distiliuotu skiedžiama vandeniu iki 25 ml ir redukuojančiųjų cukrų kiekis nustatomas Luff-Schoorl metodu. Rezultatas išreiškiamas gliukozės procentiniu kiekiu arba, jei tinka, sacharozės kiekiu, gautą rezultatą padauginus iš faktoriaus 0,95.

5.4.   Titravimas Luff-Schoorl metodu

Pipete įpilama 25 ml Luff-Schoorl reagento (3.8 punktas) ir supilama į 300 ml Erlenmejerio kolbą; įpilama lygiai 25 ml skaidrinto cukraus tirpalo. Įdedamos dvi pemzos (3.13 punktas) granulės, tirpalas šildomas ir maišomas, laikant kolbą rankoje virš vidutinės atviros liepsnos, kad tirpalas užvirtų maždaug per dvi minutes. Erlenmejerio kolba iš karto statoma ant asbestu padengto vielos tinklelio su maždaug 6 cm skersmens skyle, po kuria dega liepsna. Liepsna reguliuojama taip, kad būtų šildomas tik Erlenmejerio kolbos dugnas. Prie Erlenmejerio kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius. Virinama lygiai dešimt minučių. Iš karto po to kolba atvėsinama šaltame vandenyje ir maždaug po penkių minučių titruojama taip:

įpilama 10 ml kalio jodido tirpalo (3.12 punktas) ir tuojau pat (atsargiai, nes gali stipriai putoti) įpilama 25 ml sieros rūgšties tirpalo (3.11 punktas). Titruojama natrio tiosulfato tirpalu (3.9 punktas) tol, kol spalva tampa vos gelsva, įpilama krakmolo tirpalo (3.10 punktas) indikatoriaus ir baigiama titruoti.

Toks pats titravimas, tik nevirinant, atliekamas su tiksliai 25 ml Luff-Schoorl reagento (3.8 punktas) ir 25 ml vandens mišiniu, įpilant 10 ml kalio jodido tirpalo (3.12 punktas) ir 25 ml sieros rūgšties tirpalo (3.11 punktas).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Pagal pridedamą lentelę nustatomas gliukozės kiekis mg, kuris atitinka dviejų titravimų rezultatų skirtumą, išreiškiamą 0,1 mol/l natrio tiosulfato tirpalo ml. Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

7.   Specialiosios procedūros

7.1.

Pašarų, turinčių daug melasos, ir kitų nelabai homogeninių pašarų atveju pasveriama 20 g pašarų ir su 500 ml vandens jie supilami į 1 litro matavimo kolbą. Vieną valandą maišoma vartytuve. Skaidrinama, naudojant Carrez I (3.2 punktas) ir II (3.3 punktas) tirpalus, kaip aprašyta 5.1 punkte, tačiau naudojant keturiskart didesnius reagentų kiekius. Skiedžiama iki žymės 80 % (V/V) etanoliu. Sumaišoma ir filtruojama. Etanolis pašalinamas, kaip aprašyta 5.1 punkte. Jei ėminyje nėra dekstrinizuoto krakmolo, skiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymės.

7.2.

Melasos ir pašarinių žaliavų, kuriuose yra daug cukraus ir beveik nėra krakmolo (saldžiosios ceratonijos vaisiai, džiovinti runkelių griežiniai ir pan.) atveju 5 g ėminio sudedama į 250 ml matavimo kolbą, įpilama 200 ml distiliuoto vandens ir valandą maišoma vartytuve, prireikus, ir ilgiau. Skaidrinama, naudojant Carrez I (3.2 punktas) ir II (3.3 punktas) tirpalus, kaip aprašyta 5.1 punkte. Skiedžiama šaltu vandeniu iki žymės, sumaišoma ir filtruojama. Norint nustatyti suminį cukrų kiekį, atliekami 5.3 punkte aprašyti veiksmai.

8.   Pastabos

8.1.

Siekiant išvengti putojimo, prieš virinant su Luff-Schoorl reagentu įpilama (nepaisant tūrio) apie 1 ml 3-metilbutan-1-olio (3.14 punktas).

8.2.

Suminio invertuotų cukrų kiekio, perskaičiuoto į gliukozės kiekį, ir redukuojančiųjų cukrų kiekio, perskaičiuoto į gliukozės kiekį, skirtumą padauginus iš 0,95 gaunamas sacharozės kiekis procentais.

8.3.

Norint nustatyti redukuojančiųjų cukrų, išskyrus laktozę, kiekį, galima taikyti du metodus.

8.3.1.

Skaičiuojant apytiksliai, kitu analizės metodu nustatytas laktozės kiekis dauginamas iš 0,675 ir gautas rezultatas atimamas iš redukuojančiųjų cukrų kiekio.

8.3.2.

Redukuojančių cukrų, išskyrus laktozę, kiekį skaičiuojant tiksliai, tas pats ėminys turi būti naudojamas dviem galutiniams nustatymams. Viena analizė atliekama su alikvotine dalimi tirpalo, gauto pagal 5.1 punktą, kita – su alikvotine dalimi tirpalo, gauto nustatant laktozę pagal šiam tikslui nustatytą metodą (atlikus kitų cukrų fermentaciją ir skaidrinimą). Abiem atvejais turimas cukrų kiekis nustatomas Luff-Schoorl metodu ir perskaičiuojamas į gliukozės kiekį miligramais. Viena iš verčių atimama iš kitos ir skirtumas išreiškiamas ėminio masės procentais. Pavyzdys Du kiekvienam nustatymui paimti tūriai atitinka 250 mg ėminį. Pirmuoju atveju sunaudota 17 ml natrio tiosulfato 0,1 mol/l tirpalo ir tai atitinka 44,2 mg gliukozės; antruoju atveju sunaudota 11 ml ir tai atitinka 27,6 mg gliukozės. Skirtumas yra 16,6 mg gliukozės. Taigi redukuojančiųjų cukrų (išskyrus laktozę) kiekis, perskaičiuotas į gliukozės kiekį, yra lygus: Verčių lentelė, naudojant 25 ml Luff-Schoorl reagento Na2 S2 O3 0,1 mol/l tūris ml, dviejų minučių trukmės šildymas, dešimties minučių trukmės virimas Na2 S2 O3 0,1 mol/l Gliukozė, fruktozė, invertuoti cukrūs C6 H12 O6 Laktozė C12 H22 O11 Na2 S2 O3 0,1 mol/l ml mg skirtumas mg skirtumas ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

J.   LAKTOZĖS KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti laktozės koncentraciją pašaruose, kai jos yra daugiau nei 0,5 %.

2.   Metodas

Cukrūs ištirpinami vandenyje. Tirpalas fermentuojamas, pridedant mielių Saccharomyces cerevisiae, kurios laktozės neliečia. Po skaidrinimo ir filtravimo laktozės kiekis filtrate nustatomas Luff-Schoorl metodu.

3.   Reagentai

3.1.

Saccharomyces cerevisiae suspensija: 25 g šviežių mielių maišoma su 100 ml vandens. Šaldytuve suspensiją galima laikyti ne ilgiau kaip savaitę.

3.2.

Carrez I tirpalas: vandenyje ištirpinama 21,9 g cinko acetato Zn(CH3COO)2 2H2O ir 3 g ledinės acto rūgšties. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.3.

Carrez II tirpalas: vandenyje ištirpinama 10,6 g kalio heksacianoferato (II) K4 Fe(CN)6 3H2O. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.4.

Luff-Schoorl reagentas: Atsargiai maišant citrinų rūgšties tirpalas (3.4.2 punktas) supilamas į natrio karbonato tirpalą (3.4.3 punktas). Įpilamas vario sulfato tirpalas (3.4.1 punktas) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro. Paliekama nusistovėti per naktį ir tirpalas filtruojamas. Tikrinama gauto reagento koncentracija (Cu – 0,05 mol/l; Na2 CO3–1 mol/l). Tirpalo pH yra apie 9,4.

3.4.1.

Vario sulfato tirpalas: 25 g vario sulfato Cu SO4 5H2O, neturinčio geležies, ištirpinama 100 ml vandens.

3.4.2.

Citrinų rūgšties tirpalas: 50 g citrinų rūgšties C6H8O7•H2O ištirpinama 50 ml vandens.

3.4.3.

Natrio karbonato tirpalas: 143,8 g bevandenio natrio karbonato ištirpinama maždaug 300 ml šilto vandens. Paliekama atvėsti.

3.5.

Pemzos granulės, virintos vandenilio chlorido rūgšties tirpale, išplautos ir išdžiovintos.

3.6.

Kalio jodido 30 % (m/V) tirpalas.

3.7.

Sieros rūgšties 3 mol/l tirpalas.

3.8.

Natrio tiosulfato 0,1 mol/l tirpalas.

3.9.

Krakmolo tirpalas: 5 g tirpaus krakmolo mišinys su 30 ml vandens supilamas į 1 litrą verdančio vandens. Virinama tris minutes, tirpalas atvėsinamas, prireikus į jį kaip konservanto įdedama 10 mg gyvsidabrio (II) jodido.

4.   Aparatūra

Vandens vonia su šilumine rele, nustatyta 38–40 °C.

5.   Procedūra

1 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir supilama į 100 ml matavimo kolbą. Įpilama 25–30 ml vandens. Kolba 30 minučių laikoma ant verdančio vandens vonios ir po to aušinama iki maždaug 35 °C temperatūros. Įpilama apie 5 ml mielių suspensijos (3.1 punktas) ir sumaišoma. Kolba laikoma dvi valandas vandens vonioje 38–40 °C temperatūroje. Atvėsinama iki maždaug 20 °C temperatūros.

Įpilama 2,5 ml Carrez I tirpalo (3.2 punktas) ir trisdešimt sekundžių maišoma, tada įpilama 2,5 ml Carrez II tirpalo (3.3 punktas) ir vėl maišoma trisdešimt sekundžių. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml, sumaišoma ir filtruojama. Ne daugiau nei 25 ml šio tirpalo, kuriame turėtų būti 40–80 mg laktozės, pipete paimama į 300 ml Erlenmejerio kolbą. Prireikus iki 25 ml skiedžiama vandeniu.

Tokiu pačiu būdu atliekamas tuščiasis bandymas su 5 ml mielių suspensijos (3.1 punktas). Laktozės kiekis Luff-Schoorl metodu nustatomas taip: įpilama lygiai 25 ml Luff-Schoorl reagento (3.4 punktas) ir įdedamos dvi pemzos (3.5 punktas) granulės. Tirpalas maišomas laikant kolbą rankoje ir tuo pat metu šildant virš vidutinės atviros liepsnos, kad tirpalas užvirtų maždaug per dvi minutes. Erlenmejerio kolba iš karto statoma ant asbestu padengto vielos tinklelio su maždaug 6 cm skersmens skyle, po kuria dega liepsna. Liepsna reguliuojama taip, kad būtų šildomas tik Erlenmejerio kolbos dugnas. Prie Erlenmejerio kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius. Virinama lygiai dešimt minučių. Iš karto po to kolba atvėsinama šaltame vandenyje ir maždaug po penkių minučių titruojama taip:

įpilama 10 ml kalio jodido tirpalo (3.6 punktas) ir tuojau pat (atsargiai, nes gali stipriai putoti) įpilama 25 ml sieros rūgšties tirpalo (3.7 punktas). Titruojama natrio tiosulfato tirpalu (3.8 punktas) tol, kol spalva tampa vos gelsva, įpilama krakmolo tirpalo (3.9 punktas) indikatoriaus ir baigiama titruoti.

Toks pats titravimas, tik nevirinant, atliekamas su tiksliai 25 ml Luff-Schoorl reagento (3.4 punktas) ir 25 ml vandens mišiniu, įpilant 10 ml kalio jodido tirpalo (3.6 punktas) ir 25 ml sieros rūgšties tirpalo (3.7 punktas).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Pagal pridedamą lentelę nustatomas laktozės kiekis mg, kuris atitinka dviejų titravimų rezultatų skirtumą, išreiškiamą 0,1 mol/l natrio tiosulfato tirpalo ml.

Rezultatas pateikiamas kaip bevandenės laktozės kiekis, išreikštas ėminio masės procentais.

7.   Pastaba

1.

Jei produktuose yra daugiau nei 40 % fermentuojamo cukraus, naudojama daugiau nei 5 ml mielių suspensijos (3.1 punktas).

2.

Pašaruose su sumažintu laktozės kiekiu (pvz., piene katėms) laktozė paverčiama fruktoze, o ji per 2 val. nevisiškai fermentuojama, todėl gaunami didesni arba klaidingai teigiami rezultatai (nes fruktozės likučiai lieka ekstrakte). Verčių lentelė, naudojant 25 ml Luff-Schoorl reagento Na2 S2 O3 0,1 mol/l tūris ml, dviejų minučių trukmės šildymas, dešimties minučių trukmės virimas Na2 S2 O3 0,1 mol/l Gliukozė, fruktozė, invertuoti cukrūs C6 H12 O6 Laktozė C12 H22 O11 Na2 S2 O3 0,1 mol/l ml mg skirtumas mg skirtumas ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   KRAKMOLO KIEKIO NUSTATYMAS

POLIARIMETRINIS METODAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti krakmolo ir didelės molekulinės masės krakmolo skilimo produktų koncentraciją pašaruose, siekiant patikrinti atitiktį nurodomai energinei vertei (VII priedo nuostatoms) ir Reglamentui (EB) Nr. 767/2009.

Šis metodas naudotinas krakmolo kiekiui nustatyti, siekiant apskaičiuoti pašarų energetinę vertę.

Kai krakmolo kiekis turi būti nustatomas kitais tikslais, galima naudoti kitus analizės metodus.

2.   Metodas

Metodas sudarytas iš dviejų nustatymo būdų. Nustatant pirmuoju būdu, ėminys veikiamas praskiesta vandenilio chlorido rūgštimi. Po tirpalo skaidrinimo ir filtravimo poliarimetriškai matuojamas per jį praeinančios poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas.

Nustatant antruoju būdu, ėminys ekstrahuojamas 40 % etanoliu. Filtratas rūgštinamas vandenilio chlorido rūgštimi, skaidrinamas, filtruojamas ir matuojamas per jį praeinančios poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas, kaip tai buvo daroma pirmuoju būdu.

Dviejų matavimų skirtumas, padaugintas iš žinomo faktoriaus, atitinka krakmolo kiekį ėminyje.

3.   Reagentai

3.1.

Vandenilio chlorido rūgštis, 25 % (m/m) tirpalas, tankis 1,126 g/ml.

3.2.

Vandenilio chlorido rūgštis, 1,13 % (m/V) tirpalas. Koncentracija turi būti patikrinta titruojant 0,1 mol/l natrio hidroksido tirpalu, įlašinus metilraudonojo 0,1 % (m/V) tirpalo 94 % (V/V) etanolyje. Reikia 30,94 ml 0,1 mol/l NaOH, norint neutralizuoti 10 ml.

3.3.

Carrez I tirpalas: vandenyje ištirpinama 21,9 g cinko acetato Zn(CH3COO)2 2H2O ir 3 g ledinės acto rūgšties. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.4.

Carrez II tirpalas: vandenyje ištirpinama 10,6 g kalio heksacianoferato (II) K4 Fe(CN)6 3H2O. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.5.

Etanolio 40 % (V/V) tirpalas, tankis: 0,948 g/ml 20 °C temperatūroje.

4.   Aparatūra

4.1.

250 ml Erlenmejerio kolba su tipine šlifo jungtimi ir grįžtamasis kondensatorius.

4.2.

Poliarimetras arba sacharimetras.

5.   Procedūra

5.1.   Ėminio ruošimas

Ėminys sutrupinamas taip, kad jį visą būtų galima persijoti per sietą su 0,5 mm apvaliomis akutėmis.

5.2.   Suminio poliarizuotos šviesos plokštumos sukimo (P ar S) nustatymas (žr. 7.1 punkto pastabą)

1 mg tikslumu pasveriama 2,5 g sutrupinto ėminio ir suberiama į 100 ml matavimo kolbą. Įpilama 25 ml vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (3.2 punktas), purtoma, kad tiriamasis ėminys tolygiai pasiskirstytų, ir dar įpilama 25 ml vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (3.2 punktas). Kolba panardinama į verdančio vandens vonią, pirmąsias tris minutes stipriai ir visą laiką kratoma, kad nesusidarytų aglomeratų. Vandens vonioje turi būti pakankamai daug, kad panardinus į ją matavimo kolbą, jis nenustotų viręs. Purtomos kolbos negalima išimti iš vonios. Lygiai po 15 min. kolba išimama iš vonios, įpilama 30 ml šalto vandens ir iš karto atvėsinama iki 20 °C.

Įpilama 5 ml Carrez I tirpalo (3.3 punktas) ir purtoma maždaug 30 s. Įpilama 5 ml Carrez II tirpalo (3.4 punktas) ir purtoma dar maždaug 30 s. Tirpalas skiedžiamas vandeniu iki žymės, maišomas ir filtruojamas. Jei filtratas nėra visiškai skaidrus (tai pasitaiko retai), nustatymas kartojamas naudojant daugiau Carrez I ir II tirpalų, pvz., 10 ml.

200 mm ilgio vamzdyje poliarimetru arba sacharimetru matuojama, kokiu kampu tirpalas suka poliarizuotos šviesos plokštumą.

5.3.   Medžiagų, tirpstančių 40 % etanolyje, poliarizuotos šviesos plokštumos sukimo (P’ ar S’) nustatymas

1 mg tikslumu pasveriama 5 g ėminio, ėminys supilamas į 100 ml matavimo kolbą ir įpilama apie 80 ml etanolio (3.5 punktas) (žr. 7.2 punkto pastabą). Kolba laikoma vieną valandą kambario temperatūroje; per tą laiką šešis kartus kolba stipriai purtoma, kad tiriamasis ėminys gerai susimaišytų su etanoliu. Skiedžiama iki žymės etanoliu (3.5 punktas), sumaišoma ir filtruojama.

50 ml filtrato (atitinka 2,5 g ėminio) įpilama į 250 ml Erlenmejerio kolbą, įpilama 2,1 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1 punktas) ir stipriai purtoma. Prie Erlenmejerio kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius, kolba panardinama į verdančio vandens vonią. Lygiai po 15 min. Erlenmejerio kolba išimama iš vonios, jos turinys supilamas į 100 ml matavimo kolbą, plaunant Erlenmejerio kolbą trupučiu šalto vandens, ir atvėsinama iki 20 °C.

Skaidrinama, naudojant Carrez I (3.3 punktas) ir II (3.4 punktas) tirpalus, skiedžiama iki žymės vandeniu, sumaišoma, filtruojama ir matuojamas poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas, kaip nurodyta 5.2 punkto antroje ir trečioje pastraipoje.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Krakmolo kiekis (%) ėminyje apskaičiuojamas taip:

6.1.   Matavimas poliarimetru

P	=	suminis poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas laipsniais
P’	=	40 % (V/V) etanolyje tirpių medžiagų tirpalo poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas laipsniais;
	=	savitasis gryno krakmolo tirpalo poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas. Visuotinai priimtos skaitmeninės šio faktoriaus vertės yra šios:

+ 185,9 °	:	ryžių krakmolo
+ 185,7 °	:	bulvių krakmolo
+ 184,6 °	:	kukurūzų krakmolo
+ 182,7 °	:	kviečių krakmolo
+ 181,5 °	:	miežių krakmolo
+ 181,3 °	:	avižų krakmolo
+ 184,0 °	:	kitų rūšių krakmolo, taip pat krakmolo mišinių kombinuotuose pašaruose

6.2.   Matavimas sacharimetru

S	=	suminis poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas sacharimetro laipsniais
S’	=	40 % (V/V) etanolyje tirpių medžiagų tirpalo poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas sacharimetro laipsniais
N	=	sacharozės masė g/100 ml vandens, kai 200 mm ilgio vamzdyje poliarizuotos šviesos plokštuma pasukama 100o sacharimetro laipsnių 16,29 g prancūziškų sacharimetrų 26,00 g vokiškų sacharimetrų 20,00 g kitų sacharimetrų
	=	savitasis gryno krakmolo poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas (žr. 6.1 punktą).

6.3.   Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,4 absoliučiąja verte, kai krakmolo yra mažiau nei 40 %, ir 1 % santykine verte, kai krakmolo yra 40 % arba daugiau.

7.   Pastabos

7.1.

Jei ėminyje yra daugiau nei 6 % karbonatų, skaičiuojamų kaip kalcio karbonatas, jie prieš suminio poliarizuotos šviesos plokštumos sukimo matavimą turi būti suardomi įpilant lygiai tiek, kiek reikia praskiestos sieros rūgšties.

7.2.

Jei produkte yra daug laktozės, pvz., pieno miltelių serume ar nugriebto pieno milteliuose, įpylus 80 ml etanolio (3.5 punktas), atliekami šie veiksmai: prie kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius ir kolba 30 min. panardinama į vandens vonią 50 °C temperatūroje. Kolba paliekama atvėsti ir analizė tęsiama kaip nurodyta 5.3 punkte.

7.3.

Yra žinoma, kad šios pašarinės žaliavos, kai jų pašaruose yra didelis kiekis, sukelia trukdžius, nustatant krakmolo kiekį poliarimetriniu metodu, todėl gali būti gauti netikslūs rezultatai: — (cukrinių) runkelių produktai, pvz., (cukrinių) runkelių išspaudos, (cukrinių) runkelių melasa, (cukrinių) runkelių išspaudos su melasa, (cukrinių) runkelių žlaugtai, (runkelių) cukrus, — citrusinių vaisių minkštimas, — sėmenys, sėmenų išspaudos, ekstrahuoti sėmenys, — rapsai, rapsų išspaudos, rapsų rupiniai, rapsų lukštai, — saulėgrąžos, išlukštentų saulėgrąžų rupiniai, aplukštentų saulėgrąžų rupiniai, — kokosų išspaudos, kokosų rupiniai, — bulvių tarkiai, — dehidratuotos mielės, — produktai, kurių sudėtyje yra daug inulino (pvz., bulvinių saulėgrąžų trupiniai ir miltai), — spirgai, — sojų produktai. Tokiais atvejais gali būti taikomas Komisijos reglamente (EB) Nr. 121/2008 (7) nustatytas analizės metodas. Šis metodas taip pat gali būti taikomas pašarams, kuriuose yra mažiau kaip 1 % krakmolo.

L.   ŽALIŲ PELENŲ KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti žalių pelenų kiekį pašaruose.

2.   Metodas

Ėminys sudeginamas 550 °C temperatūroje; likutis pasveriamas.

3.   Reagentai

Amonio nitrato 20 % (m/V) tirpalas.

4.   Aparatūra

4.1.

Kaitlentė.

4.2.

Elektrinė mufelinė krosnis su šilumine rele.

4.3.

Kvarciniai, porcelianiniai arba platininiai deginimo tigliai, stačiakampiai (maždaug 60 × 40 × 25 mm) arba apvalieji (skersmuo: 60–75 mm, aukštis: 20–40 mm).

5.   Procedūra

Maždaug 5 g ėminio (2,5 g tuo atveju, kai analizuojami linkę išsipūsti produktai) pasveriama 1 mg tikslumu ir supilama į deginimo tiglį, kuris pats prieš tai buvo iškaitintas 550 °C temperatūroje, atvėsintas ir pasvertas. Tiglis statomas ant kaitlentės ir iš lėto kaitinamas tol, kol medžiaga suanglėja. Iškaitinama pagal 5.1 arba 5.2 punktą.

5.1.

Tiglis dedamas į reguliuojamos temperatūros mufelinę krosnį, nustatytą 550 °C. Medžiaga laikoma toje temperatūroje, kol virsta baltais, šviesiai pilkais ar rausvais pelenais, kuriuose greičiausiai nebeliko anglingųjų dalelių. Tiglis dedamas į eksikatorių atvėsti ir iš karto sveriamas.

5.2.

Tiglis dedamas į reguliuojamos temperatūros mufelinę krosnį, nustatytą 550 °C. Kaitinama 3 valandas. Tiglis dedamas į eksikatorių atvėsti ir iš karto sveriamas. Kaitinama dar 30 min, siekiant užtikrinti, kad pelenų masė nekinta (paeiliui sveriant du kartus, masės sumažėjimas turi neviršyti 1 mg).

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Likučio masė apskaičiuojama, atimant tiglio masę.

Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

7.   Pastabos

7.1.

Medžiagų, kurias sunku paversti pelenais, pelenai iš pradžių turi būti deginami ne trumpiau kaip tris valandas, atvėsinami ir į juos įlašinami keli lašai 20 % amonio nitrato tirpalo arba vandens (lašinama atsargiai, kad pelenai neišsisklaidytų arba nesušoktų į gabalus). Išdžiovinus, toliau kaitinama krosnyje. Prireikus veiksmas kartojamas tol, kol medžiaga visiškai virsta pelenais.

7.2.

Jei medžiagos atsparios apdorojimui, aprašytam 7.1 punkte, atliekami šie veiksmai: po trijų valandų deginimo, pelenai supilami į šiltą vandenį ir filtruojami per mažą bepelenį filtrą. Filtras su turiniu sudeginamas prieš tai naudotame tiglyje. Į atvėsintą tiglį supilamas filtratas, tirpalas išgarinamas iki sauso likučio, likutis iškaitinamas ir pasveriamas.

7.3.

Analizuojant aliejus ir riebalus, tinkamo dydžio tiglyje tiksliai pasveriamas 25 g ėminys. Ėminys anglinamas padegant jį bepelenio filtravimo popieriaus juostele. Sudeginus likutis sudrėkinamas kiek įmanoma mažesniu kiekiu vandens. Likutis džiovinamas ir iškaitinamas, kaip aprašyta 5 punkte.

M.   VANDENILIO CHLORIDO RŪGŠTYJE NETIRPIŲ PELENŲ KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti neorganinių medžiagų, kurios netirpsta vandenilio chlorido rūgštyje, koncentraciją pašaruose. Atsižvelgiant į ėminio tipą, galima taikyti du metodus.

1.1.

A metodas. Taikomas organinėms pašarinėms žaliavoms ir daugumai kombinuotųjų pašarų.

1.2.

B metodas. Taikomas neorganiniams junginiams ir mišiniams, taip pat kombinuotiesiems pašarams, kuriuose A metodu nustatytas vandenilio chlorido rūgštyje netirpių medžiagų kiekis yra didesnis nei 1 %.

2.   Metodas

2.1.

A metodas. Ėminys paverčiamas pelenais, pelenai virinami vandenilio chlorido rūgštyje, neištirpusi dalis filtruojama ir sveriama.

2.2.

B metodas. Ėminys apdorojamas vandenilio chlorido rūgštimi. Tirpalas filtruojamas, likutis paverčiamas pelenais, kurie apdorojami pagal A metodą.

3.   Reagentai

3.1.

Vandenilio chlorido rūgštis 3 mol/l.

3.2.

Trichloracto rūgštis, 20 % (m/V) tirpalas.

3.3.

Trichloracto rūgštis, 1 % (m/V) tirpalas.

4.   Aparatūra

4.1.

Kaitlentė.

4.2.

Elektrinė mufelinė krosnis su šilumine rele.

4.3.

Kvarciniai, porcelianiniai arba platininiai deginimo tigliai, stačiakampiai (maždaug 60 × 40 × 25 mm) arba apvalieji (skersmuo: 60–75 mm, aukštis: 20–40 mm).

4.4.

Bepeleniai filtrai.

5.   Procedūra

5.1.   A metodas

Ėminys sudeginamas taip pat, kaip nustatant žalių pelenų kiekį. Galima panaudoti pelenus, gautus atliekant šią analizę.

Pelenai supilami į 250–400 ml cheminę stiklinę, naudojant 75 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1 punktas). Mišinys lėtai užvirinamas ir atsargiai virinamas penkiolika minučių. Šiltas tirpalas filtruojamas per bepelenį filtrą ir likutis plaunamas šiltu vandeniu tol, kol plovimo vanduo nerodo rūgščios reakcijos. Filtras su likučiu džiovinamas ir pasvertame tiglyje sudeginamas ne žemesnėje nei 550 °C, bet ne aukštesnėje nei 700 °C temperatūroje. Tiglis atvėsinamas eksikatoriuje ir pasveriamas.

5.2.   B metodas

5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir supilama į 250–400 ml cheminę stiklinę. Įpilama 25 ml vandens ir 25 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1 punktas), sumaišoma ir palaukiama, kol nustoja skirtis burbuliukai. Įpilama dar 50 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1 punktas). Palaukiama dar galimo dujų skyrimosi pabaigos, cheminė stiklinė statoma į verdančio vandens vonią ir laikoma joje trisdešimt minučių, prireikus ir ilgiau, kad visiškai būtų hidrolizuotas krakmolas, kurio galėjo būti ėminyje. Šiltas tirpalas filtruojamas per bepelenį filtrą, likutis plaunamas 50 ml šilto vandens (žr. 7 punkto pastabą). Filtras su likučiu dedamas į deginimo tiglį, džiovinamas ir sudeginamas iki pelenų ne žemesnėje nei 550 °C, bet ne aukštesnėje nei 700 °C temperatūroje. Pelenai supilami į 250–400 ml cheminę stiklinę, naudojant 75 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1 punktas); tęsiama, kaip nurodyta 5.1 punkto antroje pastraipoje.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Likučio masė apskaičiuojama, atimant tiglio masę. Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

7.   Pastaba

Jei ėminys sunkiai filtruojamas, analizė atliekama iš naujo, 50 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.1 punktas) pakeičiant 50 ml trichloracto rūgšties 20 % (m/V) tirpalu (3.2 punktas) ir plaunant filtrą šiltu 1 % trichloracto rūgšties tirpalu (3.3 punktas).

N.   SUMINIO FOSFORO KIEKIO NUSTATYMAS

Suminis fosforo kiekis nustatomas:

—	taikant analizės metodą, nustatytą standartu EN 15510 „Pašarai. Ėminių ėmimo ir analizės metodai. Kalcio, natrio, fosforo, magnio, kalio, geležies, cinko, vario, mangano, kobalto, molibdeno ir švino nustatymas induktyviai susietos plazmos atominės emisinės spektroskopijos metodu (ICP-AES)“, arba

—

taikant analizės metodą, nustatytą standartu EN 15621 „Pašarai. Ėminių ėmimo ir analizės metodai. Kalcio, natrio, fosforo, magnio, kalio, sieros, geležies, cinko, vario, mangano ir kobalto nustatymas induktyviai susietos plazmos atominės emisinės spektrometrijos metodu (ICP-AES), mineralizavus aukštame slėgyje“, arba

—	toliau aprašytu fotometriniu metodu.

FOTOMETRINIS METODAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti suminį fosforo kiekį pašaruose. Jis labiausiai tinka analizuoti produktus, kuriuose nedaug fosforo. Kai kuriais atvejais (kai produkte daug fosforo) galima taikyti gravimetrinį metodą.

2.   Metodas

Ėminys mineralizuojamas sausuoju deginimu (organinių pašarų) arba taikant šlapiąjį skaidymą rūgštyje (mineralinių junginių ir skystųjų pašarų) ir įdedamas į rūgšties tirpalą. Tirpalas veikiamas molibdovanadato reagentu. Taip susidariusio geltono tirpalo absorbcija matuojama spektrofotometru esant 430 nm bangos ilgiui.

3.   Reagentai

3.1.

Kalcio karbonatas.

3.2.

Vandenilio chlorido rūgštis, ρ20 = 1,10 g/ml (maždaug 6 mol/l).

3.3.

Nitrato rūgštis, ρ20 = 1,045 g/ml.

3.4.

Nitrato rūgštis, ρ20 = 1,38–1,42 g/ml.

3.5.

Sieros rūgštis, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.6.

Molibdovanadato reagentas: 1 litro matavimo kolboje sumaišoma 200 ml amonio heptamolibdato tirpalo (3.6.1 punktas), 200 ml amonio monovanadato tirpalo (3.6.2 punktas) ir 134 ml nitrato rūgšties (3.4 punktas). Skiedžiama vandeniu iki žymės.

3.6.1.

Amonio heptamolibdato tirpalas: karštame vandenyje ištirpinama 100 g amonio heptamolibdato tetrahidrato (NH4) 6Mo7O24.4H2O. Įpilama 10 ml amoniako (tankis 0,91 kg/l) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.6.2.

Amonio monovanadato tirpalas: 2,35 g amonio monovanadato NH4VO3 ištirpinama 400 ml karšto vandens. Nuolat maišant lėtai įpilama 20 ml praskiestos nitrato rūgšties (7 ml HNO3 (3.4 punktas) ir 13 ml H2O) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.7.

Standartinis fosforo tirpalas (1 mg/ml): vandenyje ištirpinama 4,387 g kalio dihidrofosfato KH2PO4. Skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

4.   Aparatūra

4.1.

Kvarciniai, porcelianiniai arba platininiai deginimo tigliai.

4.2.

Elektrinė mufelinė krosnis su šilumine rele, nustatyta 550 °C temperatūrai.

4.3.

250 ml Kjeldalio kolba.

4.4.

Matavimo kolbos ir tikslios pipetės.

4.5.

Spektrofotometras.

4.6.

Maždaug 16 mm skersmens mėgintuvėliai su 14,5 mm skersmens kamščiais; talpa: 25–30 ml.

5.   Procedūra

5.1.   Tirpalo ruošimas

Atsižvelgiant į ėminio tipą, ruošiamas tirpalas, kaip nurodyta 5.1.1 arba 5.1.2 punkte.

5.1.1.   Įprastinė procedūra

Pasveriama 1 g arba daugiau ėminio 1 mg tikslumu. Tiriamasis ėminys dedamas į Kjeldalio kolbą, įpilama 20 ml sieros rūgšties (3.5 punktas), kolba purtoma, kad medžiaga visiškai susimaišytų su rūgštimi ir nepriliptų ant kolbos sienelių, pakaitinama iki virimo ir virinama 10 min. Kolba paliekama šiek tiek atvėsti, įpilama 2 ml nitrato rūgšties (3.4 punktas), nestipriai pakaitinama, šiek tiek atvėsinama, įpilamas dar nedidelis kiekis nitrato rūgšties (3.4 punktas) ir vėl užvirinama. Procedūra kartojama tol, kol gaunamas bespalvis tirpalas. Atvėsinama, įpilama truputį vandens, skystis supilamas į 500 ml matavimo kolbą, Kjeldalio kolbą plaunant karštu vandeniu. Kolba paliekama atvėsti, skiedžiama vandeniu iki žymės, sumaišoma ir filtruojama.

5.1.2.   Ėminiai, kuriuose yra organinių cheminių medžiagų ir nėra kalcio ir magnio dihidrofosfatų

Deginimo tiglyje 1 mg tikslumu pasveriama maždaug 2,5 g ėminio. Tiriamasis ėminys labai gerai sumaišomas su 1 g kalcio karbonato (3.1 punktas). Deginama krosnyje 550 °C temperatūroje tol, kol gaunami balti ar pilki pelenai (nedidelis anglių kiekis netrukdo). Pelenai supilami į 250 ml cheminę stiklinę. Įpilama 20 ml vandens ir vandenilio chlorido rūgšties (3.2 punktas), kol nustoja skirtis burbuliukai. Įpilama dar 10 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.2 punktas). Cheminė stiklinė statoma ant smėlio vonios ir skystis garinamas iki sauso likučio netirpiam silicio dioksidui gauti. Likutis ištirpinamas 10 ml nitrato rūgšties (3.3 punktas) ir tirpalas virinamas ant smėlio vonios arba kaitlentės 5 min, neišgarinant iki sauso likučio. Skystis supilamas į 500 ml matavimo kolbą, keletą kartų cheminę stiklinę plaunant karštu vandeniu. Kolba paliekama atvėsti, skiedžiama vandeniu iki žymės, sumaišoma ir filtruojama.

5.2.   Spalvos gavimas ir absorbcijos matavimas

Pagal 5.1.1 arba 5.1.2 punktą gauto filtrato alikvotinė dalis skiedžiama taip, kad gauta fosforo koncentracija būtų ne didesnė nei 40 μg/ml. Į mėgintuvėlį (4.6 punktas) įpilama 10 ml šio tirpalo ir 10 ml molibdovanadato reagento (3.6 punktas). Tirpalai sumaišomi ir paliekami stovėti bent 10 min. 20 °C temperatūroje. Spektrofotometru matuojama absorbcija, kai bangos ilgis 430 nm, ir palyginamuoju tirpalu naudojant tirpalą, gautą įpylus 10 ml molibdovanadato reagento (3.6 punktas) į 10 ml vandens.

5.3.   Kalibravimo kreivė

Iš standartinio tirpalo (3.7 punktas) ruošiami tirpalai, kurių fosforo koncentracija 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 30 μg/ml ir 40 μg/ml. Paimama po 10 ml kiekvieno iš šių tirpalų ir į juos įpilama po 10 ml molibdovanadato reagento (3.6 punktas). Tirpalai sumaišomi ir paliekami stovėti bent 10 min. 20 °C temperatūroje. Matuojama absorbcija, kaip nurodyta 5.2 punkte. Brėžiama kalibravimo kreivė, kurios ordinatė – absorbcija, abscisė – fosforo koncentracija. Koncentracijos verčių intervale nuo 0 μg/ml iki 40 μg/ml kreivės dalis yra tiesinė.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Fosforo kiekis tiriamajame ėminyje nustatomas pagal kalibravimo kreivę.

Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas ne didesnis nei:

—	3 % didžiausiojo rezultato vertės, kai fosforo kiekis mažesnis nei 5 %,

—	0,15 % absoliučiąja verte, kai fosforo kiekis 5 % arba didesnis.

O.   CHLORIDŲ CHLORO KIEKIO NUSTATYMAS

1.   Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti vandenyje tirpių chloridų chloro kiekį, paprastai išreiškiamą natrio chlorido kiekiu. Metodas tinka visiems pašarams.

2.   Metodas

Chloridai ištirpinami vandenyje. Jei produkte yra organinių medžiagų, jis skaidrinamas. Tirpalas šiek tiek parūgštinamas nitrato rūgštimi ir chloridai nusodinami sidabro chlorido pavidalu, veikiant sidabro nitrato tirpalu. Sidabro perteklius yra titruojamas amonio tiocianatu pagal Volhardo metodą.

3.   Reagentai

3.1.

Amonio tiocianato tirpalas, 0,1 mol/l.

3.2.

Sidabro nitrato tirpalas, 0,1 mol/l.

3.3.

Sotusis amonio-geležies (III) sulfato ((NH4)Fe(SO4)2 tirpalas.

3.4.

Nitrato rūgštis, tankis: 1,38 g/ml.

3.5.

Dietileteris.

3.6.

Acetonas.

3.7.

Carrez I tirpalas: vandenyje ištirpinama 21,9 g cinko acetato Zn(CH3COO)2 2H2O ir 3 g ledinės acto rūgšties. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.8.

Carrez II tirpalas: vandenyje ištirpinama 10,6 g kalio heksacianoferato (II) K4Fe(CN)6 3H2O. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.9.

Aktyvintosios anglys, neturinčios chloridų ir jų neabsorbuojančios.

4.   Aparatūra

Maišiklis (vartytuvas), dažnis maždaug 35–40 sūk./min.

5.   Procedūra

5.1.   Tirpalo ruošimas

Atsižvelgiant į ėminio pobūdį, tirpalas ruošiamas pagal 5.1.1, 5.1.2 arba 5.1.3 punktą.

Kartu atliekamas tuščiasis bandymas, nededant analizuotino ėminio.

5.1.1.   Organinių medžiagų neturintys ėminiai

1 mg tikslumu pasveriama ne daugiau nei 10 g ėminio, kuriame chloro chloridų pavidalu būtų ne daugiau nei 3 g. 400 ml vandens įpilama į 500 ml matavimo kolbą maždaug 20 °C temperatūroje. Trisdešimt minučių maišoma vartytuve, skiedžiama iki žymės, sumaišoma ir filtruojama.

5.1.2.   Ėminiai, kuriuose yra organinių medžiagų, išskyrus 5.1.3 punkte išvardytus produktus

1 mg tikslumu pasveriama apie 5 g ėminio, kuris kartu su 1 g aktyvintųjų anglių supilamas į 500 ml matavimo kolbą. Įpilama 400 ml vandens, kurio temperatūra apie 20 °C, ir 5 ml Carrez I tirpalo (3.7 punktas), maišoma 30 s, įpilama 5 ml Carrez II tirpalo (3.8 punktas). Trisdešimt minučių maišoma vartytuve, skiedžiama iki žymės, sumaišoma ir filtruojama.

5.1.3.   Virti pašarai, linų sėmenų išspaudos ir miltai, produktai, kuriuose daug linų sėmenų miltų, ir kiti produktai, kuriuose daug glitėsių ar koloidinių medžiagų (pvz., dekstrinuotas krakmolas)

Tirpalas ruošiamas taip, kaip aprašyta 5.1.2 punkte, bet nefiltruojamas. Skystis nupilamas nuo nuosėdų (prireikus, centrifuguojamas), 100 ml skysčio įpilama į 200 ml matavimo kolbą. Skystis maišomas su acetonu (3.6 punktas), šiuo tirpikliu skiedžiamas iki žymės, tirpalas sumaišomas ir filtruojamas.

5.2.   Titravimas

Pipete į Erlenmejerio kolbą paimama 25–100 ml (pagal numatomą chlorido kiekį) tirpalo, paruošto pagal 5.1.1, 5.1.2 arba 5.1.3 punktą. Paimtoje alikvotinėje tirpalo dalyje turi būti ne daugiau nei 150 mg chloro (Cl). Prireikus tirpalas skiedžiamas ne mažiau nei 50 ml vandens, įpilama 5 ml nitrato rūgšties (3.4 punktas), 2 ml sočiojo amonio-geležies (III) sulfato tirpalo (3.3 punktas) ir du lašai amonio tiocianato tirpalo (3.1 punktas), lašinamo iš biuretės, pripildytos iki nulinės žymės. Iš biuretės įpilama tiek sidabro nitrato tirpalo (3.2 punktas), kad susidarytų 5 ml perteklius. Įpilama 5 ml dietileterio (3.5 punktas) ir stipriai purtoma, kad nuosėdos koaguliuotų. Sidabro nitrato perteklius titruojamas amonio tiocianato tirpalu (3.1 punktas) tol, kol atsiradusi raudonai ruda spalva neišnyksta per vieną minutę.

6.   Rezultatų apskaičiavimas

Chloro kiekis, išreikštas natrio chlorido kiekio % (X), apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

kurioje:

V1	=	įpilto 0,1 mol/l sidabro nitrato tirpalo tūris ml;
V2	=	analizei suvartoto 0,1 mol/l amonio tiocianato tirpalo tūris ml;
m	=	ėminio svoris g alikvotinėje dalyje.

Jei tuščiasis bandymas rodo, kad 0,1 mol/l sidabro nitrato tirpalo buvo sunaudota, ši vertė atimama iš tūrio (V1 – V2).

7.   Pastabos

7.1.

Titravimą taip pat galima atlikti potenciometriškai arba amperometriškai.

7.2.

Jei produktuose yra daug aliejų ir riebalų, iš pradžių dietileteriu ar petroleteriu pašalinami riebalai.

7.3.

Analizuojant žuvų miltus, chloridus galima titruoti Mohro metodu.