”LIITE I

NÄYTTEENOTTOMENETELMÄT

1.   TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Rehujen virallisessa valvonnassa käytettävät näytteet on otettava seuraavassa esitettyjen menetelmien mukaisesti. Näin saatujen näytteiden katsotaan edustavan koko tutkittavaa erää.

Edustavan näytteenoton tarkoituksena on ottaa erästä pieni osaerä siten, että osaerästä määritettävä tekijä edustaa keskimääräisesti koko tutkittavaa rehuerää. Erästä tulee ottaa osanäytteitä kauttaaltaan useista kohdista erää. Nämä osanäytteet yhdistetään sekoittamalla kokoomanäytteeksi, josta muodostetaan edustavan jakomenettelyn avulla erää edustavat lopulliset näytteet.

Jos rehuerän visuaalisessa tarkastuksessa tai muun asiaankuuluvan tiedon perusteella todetaan, että näytteenoton kohteena oleva rehuerän osa eroaa laadultaan muusta rehusta niin se käsitellään erillisenä osaeränä. Jos rehua ei ole mahdollista jakaa erillisiin osaeriin, sitä käsitellään yhtenä eränä. Tällöin asia mainitaan näytteenottoraportissa.

Jos todetaan, että rehu, josta on otettu näytteet tämän asetuksen säännösten mukaisesti, ei täytä EU:n vaatimuksia ja kyseinen rehu on osa samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää, on oletettava, että tämä säädöstenvastaisuus koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

Näytteenotto voi koskea myös rehua, jota rehualan toimijat tarjoavat myytäväksi etäviestintävälineiden välityksellä Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 767/2009 (1) 11 artiklan 3 kohdan mukaisesti. Etäviestintävälineiden välityksellä myytäväksi tarjottavan rehun näytteenottoon sovelletaan periaatteessa tässä liitteessä vahvistettuja kohtia. Etämyyntinäytteiden näytteenottoa koskevat erityisnäkökohdat kuvataan 11 kohdassa.

2.   MÄÄRITELMÄT

—

Erä: tunnistettava määrä rehua, jolla on määritetty olevan yhteisiä ominaisuuksia kuten alkuperä, lajike, pakkaustapa, pakkaaja, lähettäjä tai pakkausmerkinnät, jos kyse on tuotantoprosessista, yksittäisessä laitoksessa samoja tuotantoparametreja käyttäen tuotettu tuotantoerä tai useita tällaisia tuotantoeriä, jos ne on tuotettu yhtäjaksoisesti ja varastoidaan yhdessä.

—	Tutkittava erä: erä tai tunnistettava osa erästä tai osaerästä.

—	Sinetöity näyte: näyte, joka on sinetöity siten, ettei näytteeseen pääse käsiksi rikkomatta tai poistamatta sinettiä.

—	Osanäyte: määrä, joka on otettu tutkittavan erän yhdestä kohdasta.

—	Kokoomanäyte: tutkittavan erän eri kohdista otetuista osanäytteistä muodostettu yhteisnäyte.

—	Supistettu näyte: kokoomanäytteen osa, joka on saatu kokoomanäytteestä edustavasti supistamalla.

—	Lopullinen näyte: kokoomanäytteen osa (sekoitettu) tai supistetun näytteen osa tai homogenoidun kokoomanäytteen osa valvonnan tyypin mukaan (katso 9.4 kohta).

—	Laboratorionäyte: laboratoriolle tarkoitettu näyte (laboratorion vastaanottama näyte), joka voi olla lopullinen näyte, supistettu näyte tai kokoomanäyte.

—	Etämyyntinäyte: näyte etäviestintävälineillä myytäväksi tarjottavasta rehuerästä.

3.   YLEISET SÄÄNNÖKSET

—	Näytteitä ottavat toimivaltaisen viranomaisen tähän tehtävään valtuuttamat henkilöt.

—	Etämyyntinäytettä varten toimivaltainen viranomainen pyytää rehualan toimijalta tietyn määrän rehua etäviestintävälineiden välityksellä.

—	Näyte on sinetöitävä siten, ettei näytteeseen pääse käsiksi rikkomatta tai poistamatta sinettiä.

Sinetin merkin olisi oltava selvästi tunnistettavissa ja selvästi näkyvillä.

—	Näytteen tunnistaminen: näyte on merkittävä pysyvästi ja siten, että yhteys näytteenottopöytäkirjaan on selvä.

—

Kustakin kokoomanäytteestä tai supistetusta näytteestä otetaan seuraavat lopulliset näytteet: yksi valvontaa (valvontatoimenpiteitä) varten ja yksi rehualan toimijaa varten (oikeuksien suojaamiseen tarkoitettu näyte). Näiden lisäksi yksi lopullinen näyte voidaan ottaa vertailunäytteeksi. Jos kokoomanäyte homogenoidaan kokonaisuudessaan, niin lopulliset näytteet otetaan homogenoidusta kokoomanäytteestä edellyttäen, että tällainen menettely on jäsenvaltiossa noudatettavien rehualan toimijoiden oikeuksia koskevien sääntöjen mukainen.

—

Jos se on tarpeen virallisen näytteenoton suorittamiseksi, asetuksen (EU) 2017/625 15 artiklan 1 ja 2 kohdan mukaisesti rehualan toimijoiden on toimivaltaisen viranomaisen pyynnöstä — annettava toimivaltaisen viranomaisen henkilöstölle pääsy toimijoiden valvonnassa oleviin laitteisiin, mukaan lukien mahdollisuus asianmukaisten näytteenottovälineiden ja henkilösuojainten käyttöön; — avustettava toimivaltaisen viranomaisen henkilöstöä näytteenoton mahdollistamiseksi, mukaan lukien rehun asettaminen toimivaltaisen viranomaisen henkilöstön saataville.

4.   VÄLINEISTÖ

4.1   Näytteenottovälineiden on oltava valmistettu materiaaleista, jotka eivät aiheuta kontaminaatiota tuotteista otettuihin näytteisiin. Välineiden, joita käytetään useita kertoja, tulee olla ristiinkontaminaation välttämiseksi helppoja puhdistaa.

4.2   Kiinteiden rehujen näytteenottoon suositellut välineet

4.2.1   Manuaalinen näytteenotto

4.2.1.1

Tasapohjainen näytteenottokauha, jossa on pystysuorat sivuseinämät.

4.2.1.2

Näytteenottokaira, jossa on pitkä ura tai osastoja. Kairan mittojen on oltava oikeassa suhteessa tutkittavaan erään (esim. säiliön syvyys, säkin mitat) sekä rehun raekokoon. Jos näytteenottokairassa on useita aukkoja, tulee aukkojen olla kairassa osastoittain jaettuna tai aueta eriaikaisesti, jotta voidaan varmistaa, että näytettä saadaan kerättyä koko kairan pituudelta.

4.2.2   Mekaaninen näytteenotto

Asianmukaista mekaanista laitetta voidaan käyttää otettaessa näytteitä liikkeessä olevasta rehuerästä. Mekaanista laitetta pidetään asianmukaisena, kun näytettä otetaan ainakin liikkeessä olevan rehun koko kerrostumasta.

Rehun ollessa liikkeessä (voimakkaasti virtaavana) rehuerän näytteenotossa voidaan käyttää automaattisia näytteenkerääjiä.

4.2.3   Näytteenjakolaite

Supistettujen näytteiden valmistukseen edustavasti olisi käytettävä laitetta, joka on suunniteltu jakamaan näyte suunnilleen yhtä suuriin osiin, jos se on mahdollista ja asianmukaista.

5.   OSANÄYTTEIDEN LUKUMÄÄRÄÄ KOSKEVAT MÄÄRÄLLISET VAATIMUKSET

—

Osanäytteiden lukumäärää koskevia 5.1 ja 5.2 kohdan määrällisiä vaatimuksia sovelletaan tutkittaviin eriin, joiden koko on enintään 500 tonnia ja joista voidaan ottaa näyte edustavasti. Kuvattu näytteenottomenettely pätee myös rehumääriin, jotka ovat suurempia kuin tutkittavalle erälle määrätty enimmäiskoko edellyttäen, että jäljempänä 5.1.1, 5.1.3 ja 5.1.5 kohdan taulukoissa esitetty osanäytteiden enimmäismäärä jätetään huomiotta ja osanäytteiden lukumäärä määritetään menettelyn asianomaisessa osassa (katso 5.3 kohta) annetulla neliöjuurikaavalla ja kokoomanäytteen vähimmäiskokoa korotetaan suhteessa tarkastettavaan rehumäärään. Tämä ei estä suuren rehuerän jakamista pienempiin osaeriin, joista kustakin otetaan näytteet 5.1 ja 5.2 kohdassa kuvatun menettelyn mukaisesti.

—	Tutkittavan erän on oltava sen kokoinen, että näyte voidaan ottaa kaikista erän kohdista.

—	Hyvin suuriin eriin tai osaeriin (> 500 tonnia) sekä eriin, jotka kuljetetaan tai varastoidaan siten, että näytteenottoa ei voida suorittaa tämän kohdan 5.1 ja 5.2 kohdassa esitetyn näytteenottomenettelyn mukaisesti, sovelletaan 5.3 kohdan mukaista näytteenottomenettelyä.

—	Toimivaltaisella viranomaisella ei usein ole etämyyntinäytteiden osalta tietoa siitä, kuinka suuresta erästä määrää pyydetään. Sen vuoksi 5.1 ja 5.2 kohdassa tarkoitettuja menettelyjä ei voi käyttää. Tällöin noudatetaan 11 kohdassa esitettyä menettelyä.

—

Jos lainsäädännössä edellytetään, että rehualan toimija noudattaa tätä asetusta pakollisen laadunvarmistusmenettelynsä puitteissa, rehualan toimija voi toiminnallisia ominaisuuksia huomioon ottaakseen poiketa tässä kohdassa säädetyistä määrällisistä vaatimuksista, jos rehualan toimija on toimivaltaista viranomaista tyydyttävällä tavalla osoittanut näytteenottomenettelyn vastaavuuden edustavuuden osalta ja jos toimivaltainen viranomainen on antanut siihen luvan.

—

Jos edellä kuvattua näytteenottomenetelmää ei poikkeustapauksissa ole mahdollista määrällisten vaatimusten osalta soveltaa ilman erälle aiheutuvaa kaupallista vahinkoa (esimerkiksi pakkausmuotojen tai kuljetus- tai varastointitapojen vuoksi), joka ei ole hyväksyttävissä, voidaan soveltaa vaihtoehtoista näytteenottomenetelmää edellyttäen, että se on mahdollisimman edustava sekä tarkkaan kuvattu ja dokumentoitu.

5.1   Osanäytteitä koskevat määrälliset vaatimukset sellaisten aineiden tai tuotteiden valvonnan osalta, jotka ovat tasaisesti jakautuneina rehussa

5.1.1   Kiinteä irtorehu

Tutkittavan erän koko	Pienin vaadittu osanäytteiden lukumäärä
≤ 2,5 tonnia	7
>2,5 tonnia	√ (20 x tutkittavan erän tonnimäärä) (*1), kuitenkin enintään 40 osanäytettä

5.1.2   Nestemäinen irtorehu

Tutkittavan erän koko	Pienin vaadittu osanäytteiden lukumäärä
≤ 2,5 tonnia tai ≤ 2 500 litraa	4  (*2)
> 2,5 tonnia tai > 2 500 litraa	7  (*2)

5.1.3   Pakattu rehu

Rehu (kiinteä ja nestemäinen) voidaan pakata pusseihin, säkkeihin, tölkkeihin, tynnyreihin jne., joihin viitataan seuraavassa taulukossa yksikköinä. Näytteet suurista yksiköistä (≥ 500 kiloa tai litraa) on otettava irtorehua koskevien säännösten mukaisesti (katso 5.1.1 ja 5.1.2 kohta).

Tutkittavan erän koko	Pienin vaadittu yksiköiden lukumäärä, joista on otettava (vähintään) yksi osanäyte (*3)
1 –20 yksikköä	1 yksikkö (*4)
21 –150 yksikköä	3 yksikköä (*4)
151 –400 yksikköä	5 yksikköä (*4)
> 400 yksikköä	¼ sellaisten yksiköiden √ lukumäärästä, joista tutkittava erä koostuu (*5), kuitenkin enintään 40 yksikköä

5.1.4   Rehukakut ja nuolukivet

Näyte on otettava vähintään yhdestä rehukakusta tai yhdestä nuolukivestä tutkittavan erän jokaista 25:tä yksikköä kohti, kuitenkin enintään 4 rehukakusta tai nuolukivestä.

Jos rehukakun tai nuolukiven paino on enintään yksi kilo, osanäyte on yhden rehukakun tai yhden nuolukiven sisältö.

5.1.5   Karkearehu/nurmirehu

Tutkittavan erän koko	Pienin vaadittu osanäytteiden lukumäärä (*6)
≤ 5 tonnia	5
> 5 tonnia	√ (5 x tutkittavan erän tonnimäärä) (*7) , kuitenkin enintään 40 osanäytettä

5.2   Osanäytteitä koskevat määrälliset vaatimukset sellaisten ainesosien tai aineiden valvonnan osalta, jotka todennäköisesti ovat epätasaisesti jakautuneina rehussa

Näitä osanäytteitä koskevia määrällisiä vaatimuksia käytetään seuraavissa tilanteissa:

—	rehuaineiden sisältämien aflatoksiinien, torajyvän, muiden mykotoksiinien ja haitallisten kasviperäisten epäpuhtauksien valvonta

—	ainesosan, mukaan lukien muuntogeeninen aines, tai sellaisen aineen, jonka odotetaan olevan epätasaisesti jakautuneena rehussa, ristikontaminaation valvonta.

Jos valvontaviranomaisella on vahva epäilys siitä, että tällaista epätasaista jakautumista tapahtuu myös rehuseoksen sisältämän ainesosan tai aineen ristikontaminaatiotapauksessa, voidaan soveltaa seuraavassa taulukossa olevia määrällisiä vaatimuksia.

Tutkittavan erän koko	Pienin vaadittu osanäytteiden lukumäärä
< 80 tonnia	Katso 5.1 kohdan määrälliset vaatimukset. Otettavien osanäytteiden lukumäärä on kerrottava 2,5:llä.
≥ 80 tonnia	100

5.3   Osanäytteitä koskevat määrälliset vaatimukset hyvin suurten erien osalta

Jos kyseessä ovat suuret tutkittavat erät (tutkittavat erät > 500 tonnia), otettavien osanäytteiden lukumäärä = 40 osanäytettä + √tonnimäärä sellaisten aineiden tai tuotteiden valvonnan osalta, jotka ovat tasaisesti jakautuneina rehussa, tai 100 osanäytettä + √tonnimäärä sellaisten ainesosien tai aineiden valvonnan osalta, jotka ovat todennäköisesti epätasaisesti jakautuneina rehussa.

6.   KOKOOMANÄYTETTÄ KOSKEVAT MÄÄRÄLLISET VAATIMUKSET

Tutkittavaa erää kohti riittää yksi kokoomanäyte.

	Rehujen tyyppi	Kokoomanäytteen vähimmäiskoko (*8)  (*9)
6.1	Irtorehu	4  kg
6.2	Pakattu rehu	4  kg (*10)
6.3	Nestemäinen tai puolijuokseva rehu	4 litraa
6.4	Rehukakut ja nuolukivet:
6.4.1	yksikköpaino yli 1 kg	4  kg
6.4.2	yksikköpaino enintään 1 kg	neljän alkuperäisen rehukakun tai nuolukiven paino
6.5	Karkearehu/nurmirehu	4  kg (*11)

7.   LOPULLISIA NÄYTTEITÄ KOSKEVAT MÄÄRÄLLISET VAATIMUKSET

Lopulliset näytteet

Analyysi tehdään vähintään yhdestä lopullisesta näytteestä. Analyysia varten valmistetun lopullisen näytteen määrän on oltava vähintään:

Kiinteä rehu	500  g (*12)  (*13)  (*14)  (*15)
Nestemäinen tai puolijuokseva rehu	500 ml (*12)

8.   NÄYTTEENOTTOMENETELMÄ ERITTÄIN SUURIA ERIÄ TAI SELLAISIA ERIÄ VARTEN, JOTKA VARASTOIDAAN TAI KULJETETAAN SITEN, ETTÄ NÄYTTEENOTTO KOKO ERÄSTÄ EI OLE TOTEUTETTAVISSA

8.1   Yleiset periaatteet

Jos erän kuljetus- tai varastointitapa on sellainen, ettei osanäytettä voida ottaa koko erästä, suositetaan näytteenotto tehtäväksi silloin kuin rehuerä on liikkeessä.

Jos kyse on suurista rehun varastointiin tarkoitetuista varastoista, toimijoita olisi rohkaistava asentamaan varastoon sellaiset laitteet, joilla on mahdollista ottaa näytteet (koneellinen näytteenottolaite) koko varastoidusta erästä.

Jos sovelletaan tässä kohdassa säädettyjä näytteenottomenettelyjä, rehualan toimijalle tai sen edustajalle on ilmoitettava näytteenottomenettelystä. Jos rehualan toimija tai sen edustaja kyseenalaistaa tämän näytteenottomenettelyn, rehualan toimijan tai sen edustajan on annettava toimivaltaiselle viranomaiselle mahdollisuus ottaa näytteet koko erästä toimijan kustannuksella.

8.2   Laivalla kuljetettavat suuret erät

8.2.1   Dynaaminen näytteenotto laivalla kuljetettavista suurista eristä

Näytteenotto laivalla kuljetettavista suurista eristä suoritetaan mieluiten silloin, kun rehuerä on liikkeessä (dynaaminen näytteenotto).

Näytteenotto suoritetaan lastiruumakohtaisesti (yksikkö, joka voidaan erottaa fyysisesti). Lastiruumat tyhjennetään kuitenkin osittain yksi toisensa jälkeen siten, että alkuperäinen fyysinen erottelu ei enää varastotiloihin siirron jälkeen ole voimassa. Näytteenotto voidaan sen vuoksi suorittaa alkuperäisen fyysisen erottamisen mukaan tai varastotiloihin siirron jälkeisen erottamisen mukaan.

Laivan lastin purku voi kestää useita päiviä. Näytteenotto on yleensä suoritettava säännöllisin väliajoin koko purkamisen keston ajan. Virallisen tarkastajan läsnäolo näytteenotossa koko purkamisen keston ajan ei kuitenkaan välttämättä aina ole toteutettavissa tai tarkoituksenmukaista. Näytteet voidaan sen vuoksi ottaa koko erän osasta (tutkittava erä). Osanäytteiden lukumäärä määritetään tutkittavan erän koon mukaan.

Jos näyte otetaan osasta samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää ja on todettu, että kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, on oletettava, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

Vaikka virallinen näyte otettaisiin automaattisesti, tarkastajan läsnäolo on tarpeen. Jos automaattisessa näytteenotossa käytetään kuitenkin ennalta asetettuja parametreja, joita ei voida muuttaa näytteenoton aikana ja jos osanäytteet kerätään sinetöityyn astiaan, joka estää mahdolliset väärinkäytökset, tarkastajan läsnäolo vaaditaan ainoastaan näytteenoton alussa, aina kun astia on tarpeen vaihtaa ja näytteenoton lopussa.

8.2.2   Staattinen näytteenotto laivalla kuljetettavista eristä

Jos näytteenotossa käytetään staattista tapaa, on sovellettava samaa menettelyä kuin ylhäältä käsin päästäviin varastointitiloihin (siilot) on säädetty käytettäväksi (katso 8.4.1 kohta).

Näytteenotto on suoritettava erän/lastiruuman siitä osasta, johon on pääsy (yläpuolelta). Osanäytteiden lukumäärä määritetään tutkittavan erän koon mukaan. Jos näyte otetaan osasta samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää ja on todettu, että kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, on oletettava, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

8.3   Näytteenotto varastoihin sijoitetuista suurista eristä

Näytteenotto on suoritettava erän siitä osasta, johon on pääsy. Osanäytteiden lukumäärä määritetään tutkittavan erän koon mukaan. Jos näyte otetaan osasta samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää ja on todettu, että kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, on oletettava, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

8.4   Näytteenotto varastotiloista (siilot)

8.4.1   Näytteenotto siiloista, joihin on (helppo) pääsy yläpuolelta

Näytteenotto on suoritettava erän siitä osasta, johon on pääsy. Osanäytteiden lukumäärä määritetään tutkittavan erän koon mukaan. Jos näyte otetaan osasta samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää ja on todettu, että kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, on oletettava, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

8.4.2   Näytteenotto siiloista, joihin ei ole pääsyä yläpuolelta (suljetut siilot)

8.4.2.1   Siilot, joihin ei ole pääsyä yläpuolelta (suljetut siilot) ja joiden koko on > 100 tonnia

Tällaisiin siiloihin varastoiduista rehuista ei voida ottaa näytteitä staattisesti. Jos siilossa olevasta rehusta on otettava näyte, eikä lähetystä ole mahdollista siirtää, on sovittava toimijan kanssa siitä, että toimija ilmoittaa tarkastajalle, milloin siilo tyhjennetään, jotta näytteenotto voidaan suorittaa liikkuvasta rehusta.

8.4.2.2   Siilot, joihin ei ole pääsyä yläpuolelta (suljetut siilot) ja joiden koko on < 100 tonnia

Menettelyssä näyte otetaan kaatamalla 50–100 kilon suuruinen määrä astiaan, josta näyte otetaan. Kokoomanäytteen koko vastaa koko erää ja osanäytteiden lukumäärä on suhteessa siilosta astiaan näytteenottoa varten kaadettuun määrään. Jos näyte otetaan osasta samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää ja on todettu, että kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, on oletettava, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

8.5   Näytteenotto suurissa suljetuissa säiliöissä olevasta irtorehusta

Tällaisista eristä voidaan usein ottaa näytteet vain purkamisen yhteydessä. Joissakin tapauksissa, kun rehuerän purkua ei ole mahdollista suorittaa tuonti- ja tarkastuspaikassa, olisi näytteet otettava tällaisten säiliöiden purun yhteydessä.

9.   NÄYTTEIDEN OTTAMISTA, VALMISTAMISTA JA PAKKAAMISTA KOSKEVAT OHJEET

9.1   Yleistä

Näytteet on otettava ja valmistettava viipymättä noudattaen varotoimenpiteitä, joilla varmistetaan, ettei tuote muutu tai saastu. Kaikkien näytteiden kanssa kosketuksiin joutuvien välineiden, pintojen ja säiliöiden on oltava puhtaita ja kuivia.

9.2   Osanäytteet

Osanäytteet on otettava satunnaisesti ja tasaisesti kaikkialta koko tutkittavasta erästä, ja niiden on oltava suunnilleen samansuuruisia.

Osanäytteen koon on oltava vähintään 100 grammaa tai karkearehun/nurmirehun tapauksessa vähintään 25 grammaa johtuen tällaisen rehun pienestä ominaistiheydestä.

Jos 8 kohdassa vahvistetun näytteenottomenettelyn sääntöjen mukaisesti on otettava alle 40 osanäytettä, niin osanäytteiden koon on oltava suhteessa vaadittuun kokoomanäytteen vähimmäiskokoon (katso 6 kohta).

Jos kyse on pakattujen rehujen näytteenotosta pienistä eristä, jolloin määrällisten vaatimusten mukaan on otettava rajallinen määrä osanäytteitä, osanäyte on yhden alkuperäisen yksikön sisältö, joka ei ylitä yhtä kiloa tai yhtä litraa.

Jos kyse on pakattujen rehujen näytteenotosta pienistä yksiköistä (esim. < 250 g), niin osanäytteen koko riippuu yksikön koosta.

Jos kyse on etämyyntinäytteistä, osanäytteen koko riippuu yksikön koosta ja voi yksittäisissä tapauksissa olla pienempi kuin 100 g tai 100 ml.

9.2.1   Irtorehu

Näytteenotto voidaan tarvittaessa tehdä rehuerää siirrettäessä (lastauksen tai purkamisen yhteydessä).

9.2.2   Pakattu rehu

Kun 5 kohdan mukainen lukumäärä yksiköitä on valittu näytteenottoa varten, kunkin yksikön sisällöstä otetaan osa kairaa tai kauhaa käyttäen. Tarvittaessa näytteet otetaan vasta, kun yksiköt on erikseen tyhjennetty.

9.2.3   Homogeeniset ja homogenoituvat nestemäiset tai puolijuoksevat rehut

Kun 5 kohdan mukainen lukumäärä yksiköitä on valittu näytteenottoa varten, sisältö on tarvittaessa homogenoitava ja vaadittava määrä näytettä otettava kustakin yksiköstä.

Osanäytteet voidaan ottaa myös sisältöä tyhjennettäessä.

9.2.4   Nestemäiset tai puolijuoksevat rehut, joita ei voi homogenoida

Kun 5 kohdan mukainen lukumäärä yksiköitä on valittu näytteenottoa varten, on näytettä otettava rehun eri kerroksista.

Osanäytteet voidaan ottaa myös sisältöä tyhjennettäessä, kuitenkin siten, että ensimmäisiä fraktioita ei oteta talteen.

Kummassakin tapauksessa näytteen kokonaismäärän on oltava vähintään 10 litraa.

9.2.5   Rehukakut ja nuolukivet

Kun 5 kohdan mukainen lukumäärä rehukakkuja tai nuolukiviä on valittu näytteenottoa varten, niin jokaisesta kakusta tai kivestä voidaan ottaa pala. Jos epäillään, että rehukakku tai nuolukivi on epähomogeeninen, näytteeksi voidaan ottaa koko rehukakku tai nuolukivi.

Jos rehukakun tai nuolukiven paino on enintään yksi kilo, osanäyte on yhden rehukakun tai yhden nuolukiven sisältö.

9.3   Kokoomanäytteen koostaminen

Kokoomanäyte muodostetaan sekoittamalla osanäytteet keskenään.

9.4   Lopullisen näytteen valmistaminen

Kokoomanäytteen sisältämä näytemateriaali on sekoitettava huolellisesti (2).

Kukin näyte laitetaan asianmukaiseen säiliöön/astiaan. On toteutettava kaikki tarvittavat varotoimenpiteet, jotta vältetään näytteen koostumuksen muuttuminen, saastuminen tai turmeltuminen kuljetuksen tai varastoinnin aikana.

9.4.1   Tasaisesti jakautuneet aineet

Jos kyse on rehuun tasaisesti jakautuneiden ainesosien tai aineiden valvonnasta, kokoomanäyte voidaan edustavasti supistaa vähintään 2,0 kiloon tai 2,0 litraan (supistettu näyte) (3) ensisijaisesti käyttämällä joko koneellista tai automaattista näytteenjakolaitetta. Jos valvotaan torjunta-ainejäämien esiintymistä palkokasveissa, viljanjyvissä ja pähkinöissä, supistetun näytteen vähimmäiskoko on 3 kiloa. Jos rehutyyppi on sellaista, että näytteenjakolaitetta ei voida käyttää tai laitetta ei ole käytettävissä, näyte voidaan supistaa neljännesmenetelmällä.

Kokoomanäytteestä tai supistetuista näytteistä otetaan sen jälkeen lopulliset näytteet (valvontaa, oikeussuojaa ja mahdollisesti vertaamista varten), jotka ovat likimäärin saman kokoisia ja täyttävät 7 kohdassa vahvistetut määrälliset vaatimukset.

9.4.2   Epätasaisesti jakautuneet aineet

Jos kyse on sellaisten ainesosien, muuntogeeninen aines mukaan lukien, tai aineiden valvonnasta, jotka ovat todennäköisesti epätasaisesti jakautuneina rehussa, kokoomanäytteen on oltava:

i)	täydellisesti homogenoitu. Homogenoidusta kokoomanäytteestä otetaan sen jälkeen lopulliset näytteet (valvontaa, oikeussuojaa ja mahdollisesti vertaamista varten), jotka ovat likimäärin saman kokoisia ja täyttävät 7 kohdassa vahvistetut määrälliset vaatimukset. tai

ii)

supistettu vähintään 2 kiloksi tai 2 litraksi (4) käyttämällä mekaanista tai automaattista näytteenjakolaitetta. Vain siinä tapauksessa, että rehutyyppi on sellainen, ettei näytteenjakolaitetta voida käyttää, näyte voidaan tarvittaessa supistaa neljännesmenetelmällä. Asetuksen (EU) N:o 619/2011 puitteissa suoritettavan muuntogeenisen aineksen esiintymisen valvontaa varten supistetussa näytteessä on oltava vähintään 35 000 siementä/jyvää, jotta olisi mahdollista ottaa vähintään 10 000 siemenen/jyvän lopulliset näytteet valvontatoimenpiteitä, oikeussuojaa ja mahdollisesti vertaamista varten (katso 6 kohdan alaviite (**) ja 7 kohdan alaviite (*)).

Supistetusta näytteestä otetaan sen jälkeen lopulliset näytteet, jotka ovat likimäärin saman kokoisia ja täyttävät 7 kohdassa vahvistetut määrälliset vaatimukset.

9.5   Näytteiden pakkaaminen

Säiliöt tai pakkaukset sinetöidään ja varustetaan etiketillä siten, ettei niitä voi avata vahingoittamatta sinettiä. Koko etiketin on oltava suljettu sinetillä. Vaihtoehtoisesti näyte voidaan panna astiaan, joka voidaan sulkea siten, ettei sitä voi avata ilman, että astia tai säiliö rikkoutuu pysyvästi; näin estetään astian tai säiliön käyttö uudelleen.

9.6   Näytteiden toimittaminen laboratorioon

Näyte lähetetään viipymättä nimettyyn viralliseen laboratorioon yhdessä analyysin suorittajan tarvitsemien tietojen kanssa.

10.   NÄYTTEENOTTOPÖYTÄKIRJA

Jokaisesta näytteenotosta on laadittava näytteenottopöytäkirja, josta jokainen tutkittava erä ja sen määrä voidaan yksiselitteisesti tunnistaa.

Näytteenottopöytäkirjassa on mainittava myös mahdolliset poikkeamat tässä asetuksessa säädetystä näytteenottomenettelystä.

Sen lisäksi, että näytteenottopöytäkirja toimitetaan virallisen tutkimuslaboratorion saataville, se toimitetaan rehualan toimijan saataville ja/tai rehualan toimijan nimeämän laboratorion saataville.

11.   ETÄMYYNTINÄYTE

—	Etämyyntinäytettä varten rehu pyydetään rehualan toimijalta etäviestintävälineiden välityksellä. Toimivaltaisen viranomaisen ei tässä tapauksessa ole rehua pyydettäessä ilmoitettava rehualan toimijalle virallista henkilöllisyyttään, ja se voi myös käyttää valehenkilöllisyyttä.

—

Tehtävään valtuutetun henkilön on otettava etämyyntinäytteestä kokoomanäyte ja lopulliset näytteet välittömästi sen jälkeen, kun lähetys on vastaanotettu. Kokoomanäytteen valmistamiseksi on otettava riittävä määrä osanäytteitä sattumanvaraisesti ja tasaisesti koko vastaanotetusta ja huolellisesti sekoitetusta/homogenoidusta määrästä, mahdollisuuksien mukaan 5 kohdassa sekä 9.2 ja 9.3 kohdassa vahvistettujen periaatteiden mukaisesti. Jos rehu on pakattu yksittäisiksi yksiköiksi, olisi hankittava vähintään neljä yksikköä, joista on otettava vähintään yksi osanäyte. Mikäli tapauskohtaisesti ilmenee, että hankitut yksiköt ovat peräisin eri eristä, tutkittavien yksiköiden lukumäärää on vähennettävä ja rajoitettava samasta erästä peräisin oleviin yksiköihin. Jos kyseessä on rehuun epätasaisesti jakautuneiden ainesosien tai aineiden määrittäminen etämyyntinäytteestä, osanäytteiden lukumäärän on oltava vähintään 2,5 kertaa suurempi kuin rehuun tasaisesti jakautuneiden aineiden määrittämiseen tarvittavien näytteiden lukumäärä. Kokoomanäytteestä otetaan sitä vastaavat lopulliset näytteet (valvontaa, oikeussuojaa ja mahdollisesti vertaamista varten) 9.4 kohdassa vahvistettujen periaatteiden mukaisesti siinä määrin kuin on mahdollista, ja näytteenottopöytäkirjasta ilmenee, että näyte on etämyyntinäyte. Toimivaltainen viranomainen ilmoittaa tämän jälkeen välittömästi rehualan toimijalle näytteen ottamisesta. Rehualan toimijalle ilmoitetaan myös, että toimivaltainen viranomainen säilyttää, aina kun mahdollista, yhden näytteen (oikeussuojaa varten) toimijan saatavilla määritellyssä paikassa, tai että näyte on lähetetty rehualan toimijalle tai tämän nimeämään laboratorioon voimassa olevien kansallisten sääntöjen mukaisesti. Jos näyte lähetetään suoraan viralliseen laboratorioon, lopullisen näytteen valmistuksen ja sinetöinnin tekevät tähän tehtävään valtuutetut henkilöt tai se tehdään tähän tehtävään valtuutettujen henkilöiden läsnäollessa. Lopullisten näytteiden muodostamisen jälkeen etämyyntinäytteiden näytteenottopöytäkirja on välittömästi lähetettävä toimivaltaiselle viranomaiselle, joka ilmoittaa rehualan toimijalle näytteen ottamisesta. Määrän, jonka toimivaltainen viranomainen on hankkinut rehualan toimijalta, katsotaan edustavan samaan luokkaan kuuluvan tai samaa kuvausta vastaavan rehuerän osaa. Jos kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 178/2002 (5) 15 artiklan mukaisesti on oletettava – myös etämyyntinäytteen osalta –, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista (tarvittaessa paikan päällä tehtävässä tarkastuksessa) ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

”LIITE II

REHUJEN MÄÄRITYSMENETELMIÄ KOSKEVAT YLEISET SÄÄNNÖKSET

A.   NÄYTTEIDEN VALMISTAMINEN MÄÄRITYSTÄ VARTEN

1.   Tarkoitus

Tässä liitteessä esitettävät menettelyt koskevat näytteiden valmistusta määritystä varten; näytteet lähetetään tutkimuslaboratorioihin sen jälkeen, kun ne on otettu liitteessä I vahvistettujen säännösten mukaisesti.

Laboratorionäytteet on valmistettava siten, että määritysmenetelmää varten punnittava määrä näytettä on homogeeninen ja edustaa tutkittavaa lopullista näytettä.

Tässä liitteessä kuvattujen menettelyjen lisäksi on noudatettava EN ISO 6498 -standardin mukaisia näytteiden valmistelua koskevia suuntaviivoja.

2.   Varotoimenpiteet

Näytteen valmistuksessa noudatettava menettely riippuu käytettävistä määritysmenettelyistä ja valvonnan kohteena olevista ainesosista tai aineista. Tästä syystä on olennaisen tärkeää, että näytteiden esikäsittely on käytettävien määritysmenettelyjen ja valvonnan kohteena olevien ainesosien tai aineiden kannalta asianmukainen.

Kaikki toimenpiteet on suoritettava siten, että vältetään mahdollisimman hyvin näytteen saastuminen ja sen koostumuksen muuttuminen.

Näyte on jauhettava, sekoitettava ja seulottava viipymättä siten, että se altistuu ilmalle ja valolle mahdollisimman vähän. Sellaisia myllyjä ja jauhatuslaitteita, joissa näytteen huomattava lämpeneminen on todennäköistä, ei pidä käyttää.

On suositeltavaa jauhaa erityisen lämmönarat rehut käsin. Lisäksi on huolehdittava siitä, ettei itse välineistö ole kontaminaation lähde.

On osoittautunut, että tietyissä tapauksissa näytteen homogenointi siten, että siitä valmistetaan liete veden kanssa käyttämällä korkean leikkausvoiman sekoitusta, tuottaa homogeenisempiä osanäytteitä kuin kuivana homogenointi tai jauhaminen, etenkin kun kyseessä ovat heterogeenisesti jakautuneet kemialliset aineet Myös homogenointi riittävällä kuivajauhamisella voi kuitenkin tuottaa homogeenisiä alinäytteitä.

Joissain tapauksissa, kuten torajyvän ja haitallisten kasviperäisten epäpuhtauksien määrityksessä, näytteen homogenointia ei voi tehdä jauhamalla, vaan se on tehtävä sekoittamalla näytettä riittävästi.

Jos näytettä ei voida valmistaa ilman, että sen kosteuspitoisuus muuttuu merkittävästi, on kosteuspitoisuus määritettävä ennen valmistusta ja sen jälkeen liitteessä III olevassa A osassa säädetyn menetelmän mukaisesti.

3.   Menettely

3.1   Yleinen menettely

Näyte määritysmenetelmää varten otetaan lopullisesta homogenoidusta näytteestä. Kartiomurskaimen ja neljännesmenetelmän käyttöä ei suositella, koska ne saattavat aiheuttaa suuren jakovirheriskin.

3.1.1   Sellaisenaan jauhettavat rehut

—	Lopullinen näyte sekoitetaan ja kerätään tarkoituksenmukaiseen puhtaaseen, kuivaan ja ilmatiiviisti suljettavaan säiliöön. Näyte sekoitetaan uudelleen täydellisen homogenoinnin varmistamiseksi välittömästi ennen määritysmenetelmää varten tehtävää näytteen punnitsemista.

3.1.2   Kuivauksen jälkeen jauhettavat rehut

—

Jollei määritysmenetelmissä toisin mainita, lopullinen näyte kuivataan kosteuspitoisuuteen 8–12 prosenttia käyttäen esikuivatusmenettelyä, joka esitetään liitteessä III olevan A osan 4.3 kohdassa kuvatun kosteudenmääritysmenettelyn yhteydessä. Tämän jälkeen käsittelyä jatketaan edellä 3.1.1 kohdassa esitetyllä tavalla.

3.1.3   Nestemäinen tai puolijuokseva rehu

—	Lopullinen näyte kerätään sopivaan puhtaaseen, kuivaan ja ilmatiiviisti suljettavaan säiliöön. Näyte sekoitetaan perusteellisesti täydellisen homogenoinnin varmistamiseksi välittömästi ennen määritystä varten tehtävää määräosan punnitsemista.

3.1.4   Muut rehut

—	Jos lopullista näytettä ei voida valmistaa jollain edellä esitetyllä tavalla, se on valmistettava sellaisella menettelyllä, jolla varmistetaan, että määritysmenetelmää varten punnitut näytteet ovat homogeenisia ja edustavat lopullisia näytteitä.

3.2   Erityismenettely, jos kyse on visuaalisesta tarkastuksesta tai mikroskooppitutkimuksesta tai jos koko kokoomanäyte homogenoidaan

—	Jos kyse on visuaalisesta tarkastuksesta (ilman mikroskooppia), niin tutkitaan kokoomanäyte tai lopullinen näyte kokonaisuudessaan.

—

Jos kyse on mikroskooppitutkimuksesta, laboratorio saa supistaa kokoomanäytettä tai siitä supistettua näytettä edelleen. Lopulliset näytteet toimijan oikeussuojan takaamiseksi ja mahdollisesti vertailumittauksia varten otetaan samalla näytteenjakomenettelyllä kuin otetaan vastaavasti lopullinen näyte valvontatoimenpiteitä varten.

—	Jos koko kokoomanäyte homogenoidaan, lopulliset näytteet otetaan homogenoidusta kokoomanäytteestä.

—

Torajyvän ja haitallisten kasviperäisten epäpuhtauksien määritystä varten lopullinen näyte on jaettava kahdeksi samanpainoiseksi alinäytteeksi, joiden koko on noin 500 grammaa. Yksi alinäyte tutkitaan. Jos alinäytteestä saatu tulos on enintään 50 prosenttia enimmäispitoisuudesta (analyyttinen kynnysarvo), näyte on enimmäispitoisuusvaatimuksen mukainen. Jos tulos on yli 50 prosenttia enimmäispitoisuudesta, myös toinen alinäyte on tutkittava, ja näiden kahden alinäytteen tulosten keskiarvoa on käytettävä sen tarkastamiseen, onko näyte enimmäispitoisuusvaatimuksen mukainen.

4.   Näytteiden säilytys

Näytteet on säilytettävä lämpötilassa, jossa niiden koostumus ei muutu. Vitamiinien tai valolle erityisen herkkien aineiden määritykseen tarkoitetut näytteet on varastoitava olosuhteissa, joissa valo ei pääse vaikuttamaan niihin haitallisesti.

B.   MÄÄRITYSMENETELMISSÄ KÄYTETTÄVIÄ REAGENSSEJA JA VÄLINEITÄ KOSKEVAT SÄÄNNÖKSET

1.

Jollei määritysmenetelmissä toisin mainita, kaikkien reagenssien on oltava analyysilaatua (p.a.). Hivenainejäämiä määritettäessä reagenssien puhtaus on tarkistettava nollanäytteellä. Saatujen tuloksien mukaan voi reagenssien lisäpuhdistus olla tarpeen.

2.

Määritysmenetelmän työvaiheissa, joihin liittyy liuosten valmistusta, laimennusta, huuhtelua tai pesua ja joissa käytettävän liuottimen tai laimennusliuoksen laatua ei ole mainittu, on käytettävä vettä. Pääsääntöisesti tämän veden on oltava demineralisoitua tai tislattua. Tietyissä erityistapauksissa, jotka on mainittu määritysmenetelmissä, on vesi puhdistettava erityisillä puhdistusmenettelyillä.

3.

Tutkimuslaboratorioissa käytettävistä välineistä määritysmenetelmissä mainitaan ainoastaan erikoisinstrumentit ja -välineet tai erityiskäyttöön tarkoitetut instrumentit ja välineet. Niiden on oltava puhtaita etenkin määritettäessä hyvin pieniä ainemääriä.

C.   MÄÄRITYSMENETELMIEN KÄYTTÖ JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN

1.   Uuttomenettely

Useat menetelmät edellyttävät erityistä uuttomenettelyä. Pääsääntöisesti voidaan soveltaa myös muita uuttomenettelyjä kuin menetelmän kuvauksessa tarkoitettu menettely, jos voidaan osoittaa, että käytetyn menettelyn uuttoteho on analysoitavan materiaalin osalta samantasoinen kuin menetelmässä kuvatun menettelyn uuttoteho.

2.   Puhdistusmenettely

Useat menetelmät edellyttävät erityistä puhdistusmenettelyä. Pääsääntöisesti voidaan soveltaa myös muita puhdistusmenettelyjä kuin menetelmän kuvauksessa tarkoitettu menettely, jos voidaan osoittaa, että käytetty puhdistusmenettely johtaa tutkittavaa materiaalia analysoitaessa analyysituloksiin, jotka vastaavat menetelmässä mainittua menettelyä käytettäessä saatuja tuloksia.

3.   Määritysten lukumäärä

Jos haitallisten aineiden määrityksessä ensimmäisen määrityksen tulos on merkittävästi (> 50 %) valvottavaa arvoa alempi, lisämääritykset eivät ole tarpeen edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu. Muissa tapauksissa rinnakkaismääritys (toinen määritys) on tarpeen, jotta voidaan sulkea pois mahdollinen sisäinen ristikontaminaatio tai näytteiden sekoittuminen vahingossa. Tarkempaan arviointiin käytetään näiden kahden määrityksen keskiarvoa.

Jos rehun lisäaineiden vähimmäis- tai enimmäispitoisuuksien valvonnassa ensimmäisen määrityksen tulokset ylittävät vähimmäispitoisuuden tai alittavat enimmäispitoisuuden, lisämääritykset eivät ole tarpeen edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu. Muissa tapauksissa rinnakkaismääritys (toinen määritys) on tarpeen, jotta voidaan sulkea pois mahdollinen sisäinen ristikontaminaatio tai näytteiden sekoittuminen vahingossa. Tarkempaan arviointiin käytetään näiden kahden määrityksen keskiarvoa.

Jos kyse on aineen tai ainesosan ilmoitetun pitoisuuden valvonnasta ja jos ensimmäisen määrityksen tulos vahvistaa ilmoitetun pitoisuuden eli määrityksen tulos on ilmoitetun pitoisuuden hyväksyttävällä vaihteluvälillä, lisämääritykset eivät ole tarpeen edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu. Muissa tapauksissa rinnakkaismääritys (toinen määritys) on tarpeen, jotta voidaan sulkea pois mahdollinen sisäinen ristikontaminaatio tai näytteiden sekoittuminen vahingossa. Tarkempaan arviointiin käytetään näiden kahden määrityksen keskiarvoa (keskimääräinen määritystulos on tai ei ole ilmoitetun pitoisuuden hyväksyttävällä vaihteluvälillä).

Joissain tapauksissa hyväksyttävä vaihteluväli määritellään lainsäädännössä, esimerkiksi Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksessa (EY) N:o 767/2009 ja (EU) 2019/4 (1).

4.   Käytetyn määritysmenetelmän ilmoittaminen

Tutkimustodistuksessa on mainittava käytetty määritysmenetelmä.

5.   Määritystuloksen ilmoittaminen

Määritystulos on ilmaistava määritysmenetelmässä vahvistetulla tavalla asianmukaisella merkitsevien numeroiden tarkkuudella, ja tulos on tarvittaessa korjattava sen mukaan, mikä lopullisen näytteen kosteuspitoisuus oli ennen näytteen valmistamista.

Useimmat EU:n rehulainsäädännössä säännellyt tasot (esim. enimmäispitoisuus ja vähimmäispitoisuus) on vahvistettu rehulle, jonka kosteuspitoisuus on 12 prosenttia. Jotta näytteestä mitattua määritystulosta voidaan arvioida suhteessa säänneltyyn tasoon, määritystulos on sen vuoksi ensin jaettava näytteen kuiva-ainepitoisuudella (prosentteina) ja kerrottava luvulla 88, kuten seuraavassa yhtälössä esitetään:

Tässä yhtälössä:

Mc	:	näytteen kosteuspitoisuus (prosentteina). 100 – Mc vastaa näin ollen näytteen kuiva-ainepitoisuutta (prosentteina).
Rana	:	näytteestä mitattu määritystulos
R12 %	:	tulos rehussa, jonka kosteuspitoisuus on 12 prosenttia; arvioidaan suhteessa säänneltyyn tasoon.

Lisäksi, jos seuraavat edellytykset täyttyvät:

—	määrityksen tulos on merkittävästi (> 50 %) tuotemerkintöjä / valvottavia arvoja alempi tai korkeampi (sen mukaan, onko tuotemerkintä/arvo enimmäispitoisuus vai vähimmäispitoisuus);

—

näytteenoton kohteena olevan rehun kosteuspitoisuus on tiedossa ja voidaan varmistaa, että kosteuspitoisuuden korjaus ei muuta arviointia, siinä tapauksessa – edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu ja määrityksen ainoana tarkoituksena on todeta säännösten noudattaminen – kosteuspitoisuuden korjaus voidaan jättää tekemättä (esimerkiksi tapauksissa, joissa arvoa tai säädeltyä tasoa ei ole), ellei se ole tarpeen tulkintaa varten.

Jos määritystulos korjataan kosteuspitoisuuden mukaan, myös vastaava mittauksen epävarmuus on korjattava saman menettelyn mukaisesti.

Jos kyseessä on torajyvän tai haitallisten kasviperäisten epäpuhtauksien määritys visuaalisen tarkastuksen tai mikroskooppitutkimuksen avulla, kosteuspitoisuuden korjaus ei ole tarpeen.

6.   Mittauksen analyyttinen epävarmuus ja saanto haitallisten aineiden määrityksessä

Direktiivissä 2002/32/EY tarkoitettujen haitallisten aineiden ollessa kyseessä eläinten rehuksi tarkoitettua tuotetta ei pidetä vahvistetun enimmäispitoisuuden mukaisena, kun kyse on kosteuspitoisuudeltaan 12 prosentin rehusta, jos kahden toisistaan riippumattoman määritystuloksen keskiarvon katsotaan ylittävän enimmäispitoisuuden, kun otetaan huomioon mittaukseen liittyvä laajennettu analyyttinen epävarmuus, joka saadaan käyttämällä kattavuuskerrointa 2 ja jolla saadaan noin 95 prosentin luottamustaso, sekä korjaus saannon suhteen. Tämä tarkoittaa, että vaatimustenmukaisuuden arvioinnissa käytetään määritettyä pitoisuutta, joka on korjattu saannon suhteen ja josta on vähennetty mittaukseen liittyvä laajennettu analyyttinen epävarmuus. Tätä menettelyä voidaan soveltaa ainoastaan tapauksiin, joissa määritysmenetelmä on sellainen, että mittaukseen liittyvä laajennettu analyyttinen epävarmuus sekä korjaus saannon suhteen voidaan arvioida (ei esimerkiksi vaadita, jos kyse on visuaalisesta tarkastuksesta / mikroskooppitutkimuksesta).

Jos oikeussuojaa varten otetusta näytteestä saatu määritystulos ylittää enimmäispitoisuuden (ottamatta huomioon mittaukseen liittyvää laajennettua analyyttistä epävarmuutta), se vahvistaa virallista valvontaa varten otetun näytteen vaatimustenvastaisuuden, ellei asiasta ole annettu erityisiä kansallisia sääntöjä.

Määritystulos on esitettävä seuraavalla tavalla (sikäli kuin käytetty määritysmenetelmä sallii mittaukseen liittyvän analyyttisen epävarmuuden arvioinnin):

a)

tarvittaessa saannon suhteen korjattuna, ja jos korjataan, siitä on ilmoitettava. Saantoaste on ilmoitettava, ellei systemaattisen virheen olennainen korjaaminen ole osa menettelyä, jolloin systemaattinen virhe on mitatun arvon ja vertailupitoisuuden välinen ero. Korjaus saannon suhteen ei ole tarpeen, jos saantoaste on 90–110 prosenttia.

b)	muodossa x +/– U, jossa x on määritystulos ja U on mittaukseen liittyvä laajennettu analyyttinen epävarmuus, käyttäen kattavuuskerrointa 2 (2), jolloin luottamustaso on noin 95 prosenttia.

Jos määrityksen tulos on kuitenkin merkittävästi (> 50 %) valvottavaa arvoa alempi ja edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu ja määrityksen ainoana tarkoituksena on todeta säännösten noudattaminen, saantoasteen ja mittaukseen liittyvän laajennetun analyyttisen epävarmuuden ilmoittaminen voidaan jättää pois (esimerkiksi tapauksissa, joissa arvoa tai säädeltyä tasoa ei ole), ellei se ole tarpeen tulkintaa varten.

7.   Mittauksen analyyttinen epävarmuus ja saanto rehun lisäaineiden määrityksessä

Rehun lisäaineiden hyväksyttyjen vähimmäis- ja enimmäispitoisuuksien noudattamisen toteamista varten lisäaineen määrää ei pidetä vahvistettujen vähimmäis- ja enimmäispitoisuuksien mukaisena, jos katsotaan, että kahden toisistaan riippumattoman määritystuloksen keskiarvo, suhteutettuna kosteuspitoisuudeltaan 12 prosentin rehuun, on:

—

suurempi kuin enimmäispitoisuus, kun otetaan huomioon mittaukseen liittyvä laajennettu analyyttinen epävarmuus sekä korjaus saannon suhteen. Tämä tarkoittaa, että vaatimustenmukaisuuden arvioinnissa käytetään määritettyä pitoisuutta (eli kahden määrityksen keskiarvoa), joka on korjattu saannon suhteen ja josta on vähennetty mittaukseen liittyvä laajennettu analyyttinen epävarmuus.

—

pienempi kuin vähimmäispitoisuus, kun otetaan huomioon mittaukseen liittyvä laajennettu analyyttinen epävarmuus sekä korjaus saannon suhteen. Tämä tarkoittaa, että vaatimustenmukaisuuden arvioinnissa käytetään määritettyä pitoisuutta (eli kahden määrityksen keskiarvoa), joka on korjattu saannon suhteen ja johon on lisätty mittaukseen liittyvä laajennettu analyyttinen epävarmuus.

Jos oikeussuojaa varten otetusta näytteestä saatu määritystulos ylittää enimmäispitoisuuden (ottamatta huomioon mittaukseen liittyvää laajennettua analyyttistä epävarmuutta), se vahvistaa virallista valvontaa varten otetun näytteen vaatimustenvastaisuuden, ellei asiasta ole annettu erityisiä kansallisia sääntöjä.

Määritystulos on esitettävä seuraavalla tavalla (sikäli kuin käytetty määritysmenetelmä sallii mittaukseen liittyvän analyyttisen epävarmuuden arvioinnin):

a)

tarvittaessa saannon suhteen korjattuna, ja jos korjataan, siitä on ilmoitettava. Saantoaste on ilmoitettava, ellei systemaattisen virheen olennainen korjaaminen ole osa menettelyä, jolloin systemaattinen virhe on mitatun arvon ja vertailupitoisuuden välinen ero. Korjaus saannon suhteen ei ole tarpeen, jos saantoaste on 90–110 prosenttia.

b)	muodossa x +/– U, jossa x on määritystulos (kahden määrityksen keskiarvo) ja U on mittaukseen liittyvä laajennettu analyyttinen epävarmuus, käyttäen kattavuuskerrointa 2 (3), jolloin luottamustaso on noin 95 prosenttia.

”LIITE III

REHUAINEIDEN JA REHUSEOSTEN KOOSTUMUKSEN VALVONNASSA KÄYTETTÄVÄT MÄÄRITYSMENETELMÄT

A.   KOSTEUDEN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehun kosteuspitoisuus. Jos rehu sisältää haihtuvia aineita, kuten orgaanisia happoja, on huolehdittava siitä, että kosteuspitoisuuden kanssa määritetään myös merkittäviä määriä haihtuvia aineita.

Menetelmä ei koske pääasiassa maitotuotteista koostuvien rehuaineiden ja rehuseosten analyysiä, eläin- ja kasvirasvojen ja -öljyjen analyysiä eikä öljysiementen ja öljypitoisten hedelmien analyysiä.

Öljysiementen kosteuspitoisuuden määritys tehdään kosteuspitoisuuden ja haihtuvien aineiden pitoisuuden määritystä koskevan EN ISO 665 -standardin (Determination of moisture and volatile matter content) mukaisen menetelmän mukaisesti sillä oletuksella, että soijapavut on jauhettava ennen kosteuspitoisuuden määritystä.

2.   Periaate

Näyte kuivataan määrätyissä olosuhteissa, jotka vaihtelevat rehun laadun mukaan. Painohäviö määritetään punnitsemalla. Hyvin kosteat, kiinteät rehunäytteet on syytä esikuivata ennen varsinaista kosteusmääritystä.

3.   Välineistö

3.1

Kosteutta imemättömästä materiaalista valmistettu mylly, joka on helppo puhdistaa ja jolla saadaan aikaan nopea, tasainen jauhautuminen mutta jolla vältetään havaittavissa oleva kuumentuminen ja ulkopuolisen ilman vaikutus mahdollisimman hyvin ja joka on 4.1.1 ja 4.1.2 kohdassa säädettyjen vaatimusten mukainen (esimerkiksi vasaramyllyt, vesijäähdytteiset pienoismyllyt, kartiomyllyt, hitaasti liikkuvat tai hammaspyörillä varustetut hienonnuslaitteet).

3.2

Analyysivaaka, jonka tarkkuus on 1 mg.

3.3

Lasisia tai korroosionkestävästä metallista valmistettuja kuivausastioita, jotka voidaan sulkea ilmatiiviisti kannella; työtaso, jolle testattava näyte voidaan levittää niin, että sitä on noin 0,3 g/cm2.

3.4

Sähkölämmitteinen, tasalämpöinen ja nopeasti säädettävissä oleva lämpökaappi (± 2 °C), jossa on tuuletusjärjestelmä (1).

3.5

Säädettävä sähkölämmitteinen vakuumilämpökaappi, jossa on öljypumppu ja johon voidaan johtaa kuumaa, kuivaa ilmaa tai jossa voidaan käyttää kuivausainetta (kuten kalsiumoksidia).

3.6

Eksikkaattori, jossa on paksu rei’itetty metalli- tai posliinilevy ja joka sisältää tehokasta kuivausainetta.

4.   Menettely

Huom.

Tässä jaksossa kuvatut toimenpiteet on suoritettava välittömästi näytelähetyksen avaamisen jälkeen. Määritykset on suoritettava ainakin kahtena rinnakkaismäärityksenä.

4.1   Valmistaminen

4.1.1   Muut kuin 4.1.2 ja 4.1.3 kohdassa tarkoitetut rehut

Punnitaan vähintään 50 g näytettä. Tarvittaessa se jauhetaan tai jaetaan sopivalla tavalla kosteuspitoisuuden muuttumista välttäen (ks. 6 kohta).

4.1.2   Vilja ja suurimot

Punnitaan vähintään 50 g näytettä. Se jauhetaan niin hienoksi, että vähintään 50 prosenttia näytteestä läpäisee seulan, jonka reikien koko on 0,5 mm, ja enintään 10 prosenttia näytteestä ei läpäise 1 mm:n pyöreäreikäistä seulaa.

4.1.3   Nestemäiset ja liisterimäiset rehut sekä pääasiassa öljyistä ja rasvoista koostuvat rehut

Punnitaan noin 25 g näytettä 10 mg:n tarkkuudella, lisätään sopiva määrä 10 mg:n tarkkuudella punnittua vedetöntä hiekkaa ja sekoitetaan kunnes saadaan homogeeninen seos.

4.2   Kuivaus

Näyteastia (3.3) kuivataan kansineen 103 °C:seen asetetussa lämpökaapissa 30 minuuttia +/- 1 minuutti. Astia poistetaan lämpökaapista ja annetaan jäähtyä ympäristön lämpötilaan eksikkaattorissa (3.6).

4.2.1   Muut kuin 4.2.2 ja 4.2.3 kohdassa tarkoitetut rehut

Näyteastia punnitaan kansineen 1 mg:n tarkkuudella. Siihen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g hienonnettua näytettä, joka levitetään tasaisesti. Astia asetetaan ilman kantta 103 °C:ssa olevaan lämpökaappiin. Kaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään sen sisään mahdollisimman nopeasti. Annetaan kuivua neljän tunnin ajan laskettuna siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 103 °C. Lämpökaappi avataan, astia suljetaan välittömästi kannella, otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30–45 minuuttia eksikkaattorissa (3.6) ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella.

Pääasiassa (> 50 %) eläimistä ja kasveista peräisin olevista öljyistä ja rasvoista koostuvia rehuja kuivataan lämpökaapissa 103 °C:ssa vielä 30 minuutin ajan. Kahden punnituksen välinen ero saa olla enintään 0,1 prosenttia kosteudesta.

4.2.2   Vilja, jauhot, suurimot ja rouheet

Näyteastia punnitaan kansineen 0,5 mg:n tarkkuudella. Siihen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g hienonnettua näytettä, joka levitetään tasaisesti. Astia asetetaan ilman kantta 130 °C:ssa olevaan lämpökaappiin. Kaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään sen sisään mahdollisimman nopeasti. Annetaan kuivua kahden tunnin ajan laskettuna siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 130 °C. Lämpökaappi avataan, astia suljetaan välittömästi kannella, otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30–45 minuuttia eksikkaattorissa (3.6) ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella.

4.2.3   Rehuseokset, jotka sisältävät yli 4 prosenttia sakkaroosia tai laktoosia: rehuaineet, kuten johanneksenleipäpuun palot, hydrolysoidut viljatuotteet, maltaat, kuivatut juurikasleikkeet, kala ja liukoisia sokereita sisältävät rehut

Näyteastia punnitaan kansineen 0,5 mg:n tarkkuudella. Siihen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g hienonnettua näytettä, joka levitetään tasaisesti. Astia asetetaan ilman kantta vakuumilämpökaappiin (3.5), joka on kuumennettu 80–85 °C:seen. Kaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään sen sisään mahdollisimman nopeasti.

Paine säädetään 100 torriksi ja annetaan kuivua vielä neljän tunnin ajan tässä paineessa joko kuumassa, kuivassa ilmavirrassa tai kuivausainetta käyttäen (noin 300 g 20:tä näytettä kohden). Jälkimmäisessä tapauksessa vakuumipumppu kytketään pois päältä, kun vaadittu paine on saavutettu. Kuivausaika lasketaan siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 80–85 °C. Kuivausajan päätyttyä lämpökaapin paine palautetaan varovasti normaalipaineeseen. Lämpökaappi avataan, astia suljetaan välittömästi kannella, otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30–45 minuuttia eksikkaattorissa (3.6) ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella. Näytteen annetaan kuivua vielä 30 minuuttia vakuumilämpökaapissa 80–85 °C:ssa ja se punnitaan uudelleen. Kahden punnituksen välinen ero saa olla enintään 0,1 prosenttia kosteudesta.

4.3   Esikuivaus (osittainen kuivaus)

Alle 85 prosenttia kuiva-ainetta sisältävät ”märät” rehut (esim. nurmirehu, seosrehut, (ei)-nestemäiset rehut) on tarpeen kuivata osittain, ennen kun ne jauhetaan pysyvien aineiden määritystä varten; hajoavien aineiden osalta osittainen kuivaus ei ole mahdollista.

Osittainen kuivaus voidaan suorittaa käyttämällä kiertoilma- tai mikroaaltouunia tai pakastekuivaamalla. Tarkoitus on – pakastekuivaamalla tehtävää osittaista kuivausta lukuun ottamatta – kuivattaa rehua siten, että näytteen lämpötila pysyy alle 60 °C:ssa, jotta vaikutus kemialliseen koostumukseen on mahdollisimman vähäinen. Kuivaus yli 60 °C:n lämpötiloissa aiheuttaa kemiallisia muutoksia rehussa (esimerkiksi proteiinien hajoamista). Kuivattu rehu tasapainotetaan huoneenlämpötilassa noin 15 minuutin ajan ennen osittaisen kuiva-ainepitoisuuden mittaamista, jotta jauhamisen ja säilyttämisen aikana tapahtuvan kosteuspitoisuuden muutoksen mahdollisuus on mahdollisimman vähäinen. Kuivaus alle 60 °C:n lämpötiloissa ei poista rehusta kaikkea vettä; sen vuoksi (alustava) osittainen kuivaus ei anna kuvaa rehun kuiva-aineen kokonaispitoisuudesta. Kuivauksen jälkeen alinäyte jauhetaan ja analysoitavan aineen (lopullinen) kuiva-ainepitoisuus osittain kuivatusta näytteestä (jäljellä oleva kosteuspitoisuus 3–15 %) analysoidaan ja siitä määritetään muut kemialliset ainesosat.

Sen vuoksi kuiva-aineen määritykseen suositellaan kaksivaiheista menettelyä. Ensin määritetään osittainen kuiva-ainepitoisuus (jos kuiva-ainepitoisuus on alle 85 %), sen jälkeen määritetään jäljellä olevan kuiva-aineen pitoisuus jauhetusta näytteestä. Kuiva-aineen kokonaispitoisuuden määrittämiseksi osittainen kuiva-ainepitoisuus kerrotaan jäljellä olevan kuiva-aineen pitoisuudella.

5.   Tulosten laskeminen

Kosteuspitoisuus (X), joka ilmoitetaan prosentteina näytteestä, lasketaan käyttäen seuraavia kaavoja:

5.1   Kosteuspitoisuus ilman esikuivausta

jossa:

m	=	näytteen alkuperäinen paino grammoina,
m0	=	näytteen paino grammoina kuivauksen jälkeen.

5.2   Kosteuspitoisuus esikuivausta käyttäen (2)

jossa:

m	=	näytteen alkuperäinen paino grammoina,
m1	=	näytteen paino grammoina esikuivauksen jälkeen,
m2	=	näytteen paino grammoina hienontamisen tai jauhamisen jälkeen,
m0	=	näytteen paino grammoina kuivauksen jälkeen.

5.3   Toistettavuus

Samasta näytteestä tehdyn kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla suurempi kuin 0,2 prosenttia kosteuden absoluuttisesta arvosta, paitsi lemmikkieläinten märkäruoan ja koiran puruluiden osalta, jolloin ero ei saa olla suurempi kuin 0,5 prosenttia kosteuden absoluuttisesta arvosta.

6.   Huomautus

Jos jauhaminen on tarpeen ja sen havaitaan muuttavan tuotteen kosteuspitoisuutta, rehun komponenttien määritystulokset on korjattava alkuperäisen näytteen kosteuspitoisuuden perusteella.

B.   ELÄIN- JA KASVIRASVOJEN JA -ÖLJYJEN KOSTEUDEN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää eläin- ja kasvirasvojen ja -öljyjen vesipitoisuus ja haihtuvien aineiden pitoisuus.

2.   Periaate

Näyte kuivataan vakiopainoon 103 °C:ssa (kahden peräkkäisen punnituksen välisen painoeron on oltava enintään 1 mg). Painohäviö määritetään punnitsemalla.

3.   Välineistö

3.1

Korroosionkestävästä materiaalista valmistettu tasapohjainen astia, jonka läpimitta on 8–9 cm ja jonka korkeus on noin 3 cm.

3.2

Lämpömittari, jossa on vahvistettu säiliö ja yläpäässä oleva paisuntaputki ja joka on varustettu asteikolla noin 80 °C:sta ainakin 110 °C:seen ja jonka pituus on noin 10 cm.

3.3

Hiekkahaude tai sähkölevy.

3.4

Eksikkaattori, jossa on tehokasta kuivausainetta.

3.5

Analyysivaaka.

4.   Menettely

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 20 g homogenoitua näytettä kuivaan punnittuun astiaan (3.1), jossa on lämpömittari (3.2). Näytettä kuumennetaan hiekkahauteella tai sähkölevyllä (3.3), sekoittaen jatkuvasti lämpömittarilla niin, että lämpötila saavuttaa 90 °C:n noin 7 minuutissa.

Lämpöä vähennetään pitäen silmällä lautasen pohjasta nousevien kuplien syntymisnopeutta. Lämpötila ei saa nousta yli 105 °C:n. Sekoittamista jatketaan astian pohjaa raaputtaen, kunnes kuplien muodostus lakkaa.

Kosteuden täydellisen poistumisen varmistamiseksi kuumennetaan useita kertoja 103 ± 2 °C:seen jäähdyttäen peräkkäisten kuumennusten välillä 93 °C:seen. Sen jälkeen astian sisältöineen annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan eksikkaattorissa (3.4) ja punnitaan. Tämä menettely toistetaan niin monta kertaa, että kahden peräkkäisen punnituksen välinen ero ei ole yli 2 mg:aa.

Huomautus:

Näytteen painon kasvu toistettujen kuumennusten jälkeen viittaa rasvan hapettumiseen, ja tällaisessa tapauksessa tulos lasketaan siitä punnituksesta, joka on tehty välittömästi ennen kuin paino on alkanut kasvaa.

5.   Tulosten laskeminen

Kosteuspitoisuus (X), joka ilmoitetaan prosentteina näytteestä, saadaan seuraavasta kaavasta:

jossa:

m	=	näytteen paino grammoina;
m1	=	astian paino sisältöineen grammoina ennen kuumennusta;
m2	=	astian paino sisältöineen grammoina kuumennuksen jälkeen.

Tulokset, jotka ovat pienempiä kuin 0,05 prosenttia, on varustettava merkinnällä ”alle 0,05 %”.

Toistettavuus

Samasta näytteestä suoritetun kahden samanaikaisen rinnakkaismäärityksen ero absoluuttisena arvona ilmoitettuna saa olla enintään 0,1 prosenttia.

C.   TYPPIPITOISUUDEN MÄÄRITYS JA RAAKAVALKUAISPITOISUUDEN LASKENTA

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan laskea Kjeldahlin menetelmän mukaan saadusta typpipitoisuudesta rehujen raakavalkuaispitoisuus (3).

2.   Periaate

Näyte hajotetaan rikkihapolla katalyytin läsnä ollessa. Hapan liuos tehdään emäksiseksi natriumhydroksidiliuoksella. Ammoniakki tislataan ja kerätään mitattuun määrään rikkihappoa, ja ylimääräinen rikkihappo titrataan natriumhydroksidin standardiliuoksella.

Vapautunut ammoniakki voidaan vaihtoehtoisesti tislata ylimäärään boorihappoliuosta, jonka jälkeen se titrataan kloorivetyhappo- tai rikkihappoliuoksella.

3.   Reagenssit

3.1

Kaliumsulfaatti.

3.2

Katalyytti: kupari(II)oksidi CuO tai kupari(II)sulfaattipentahydraatti, CuSO4 5H2 O.

3.3

Sinkki, rakeinen.

3.4

Rikkihappo, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5

Rikkihappo, standardiliuos, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6

Rikkihappo, standardiliuos, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7

Rikkihappo, standardiliuos, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8

Metyylipunaindikaattori: 300 mg metyylipunaista liuotetaan 100 ml:aan etanolia, σ = 95–96 % (v/v)

3.9

Natriumhydroksidiliuos (teknisen laadun käyttö mahdollista) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10

Natriumhydroksidi, standardiliuos c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11

Natriumhydroksidi, standardiliuos c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12

Kiehumakiviä, kloorivetyhapossa pestyjä ja hehkutettuja.

3.13

Asetanilidi (sulamispiste = 114 °C, typpipitoisuus = 10,36 %).

3.14

Typetön sakkaroosi.

3.15

Boorihappo (H3BO3).

3.16

Metyylipunaindikaattoriliuos: liuotetaan 100 mg metyylipunaa 100 ml:aan etanolia tai metanolia.

3.17

Bromikresolivihreäliuos: liuotetaan 100 mg bromikresolivihreää 100 ml:aan etanolia tai metanolia.

3.18

Boorihappoliuos (10–40 g/l, käytettävien laitteiden mukaan) Jos loppupisteen toteamiseksi käytetään kolorimetristä menetelmää, boorihappoliuoksiin on lisättävä metyylipuna- ja bromikresoli-indikaattoreita. Kun boorihappoliuosta valmistetaan 1 litra, siihen on ennen tilavuuden säätämistä lisättävä 7 ml metyylipunaindikaattoriliuosta (3.16) ja 10 ml bromikresolivihreäliuosta (3.17). Sen mukaan, millaista vettä on käytetty, boorihappoliuoksen pH saattaa vaihdella erien välillä. Boorihappoliuoksen pH:n on oltava 4,3–4,7. Usein on lisättävä vähän emästä, jotta nollanäyte saadaan positiiviseksi. Huomautus: Säätäminen onnistuu yleensä lisäämällä noin 3–4 ml NaOH:ta (3.11) 1 litraan boorihappoa, jonka pitoisuus on 10 g/l. Liuos säilytetään huoneen lämpötilassa suojattuna valolta ja ammoniakkihöyryiltä.

3.19

Kloorivetyhapon standardiliuos c(HCl) = 0,10 mol/l. Huomautus: Myös muita standardiliuosten konsentraatioita (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 ja 3.19) voidaan käyttää, jos konsentraatio korjataan laskelmissa. Konsentraatiot on aina ilmaistava neljän desimaalin tarkkuudella.

4.   Välineistö

Välineet näytteen hajottamista, tislausta ja titrausta varten Kjeldahlin menetelmän mukaan.

5.   Menettely

5.1   Hajotus

Punnitaan 1 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella Kjeldahl-kolviin hajotuspolttoa varten. Lisätään 15 g kaliumsulfaattia (3.1), sopiva määrä katalyyttiä (3.2) (0,3–0,4 g kupari(II)oksidia tai 0,9–1,2 g kupari(II)sulfaattipentahydraattia, 25 ml rikkihappoa (3.4) ja tarvittaessa muutamia kiehumakiviä (3.12) ja sekoitetaan.

Kolvia kuumennetaan varovasti tarvittaessa ajoittain pyörittäen, kunnes massa on hiiltynyt ja kuohu hävinnyt. Tämän jälkeen kuumennetaan voimakkaammin, kunnes neste kiehuu tasaisesti. Kuumennus on sopiva, jos kiehuva happo tiivistyy kolvin seinämiin. Kolvin seinämien ylikuumennusta ja orgaanisen aineksen tarttumista kolvin seinämiin on vältettävä.

Kun liuos on muuttunut kirkkaaksi ja kirkkaanvihreäksi, keittämistä jatketaan vielä kahden tunnin ajan; tämän jälkeen kolvin annetaan jäähtyä.

5.2   Tislaus

Kolviin lisätään varovasti riittävä määrä vettä, jotta sulfaatit liukenisivat täysin. Annetaan jäähtyä ja lisätään tarvittaessa muutama sinkkirae (3.3). Jatketaan 5.2.1 tai 5.2.2 kohdan mukaisesti.

5.2.1   Tislaus rikkihappoon

Tislauslaitteen keräilyastiaan lisätään oletetun typpipitoisuuden mukaan 25 ml rikkihappoa (3.5) tai (3.7) tarkasti mitattuna. Lisätään muutama pisara metyylipunaindikaattoria (3.8).

Kolvi yhdistetään tislauslaitteen jäähdyttimeen ja jäähdyttimen pää upotetaan keräilyastiassa olevaan liuokseen vähintään 1 cm:n syvyyteen (ks. huomautus 8.3). Kolviin lasketaan hitaasti 100 ml natriumhydroksidiliuosta (3.9) siten, ettei ammoniakkia katoa (ks. 8.1 huomautus). Kolvia kuumennetaan siten, että ammoniakki tislautuu kokonaan.

5.2.2   Tislaus boorihappoon

Kun tisleestä titrataan ammoniakki manuaalisesti, noudatetaan alla olevaa menettelyä. Jos tislauslaite on täysin automaattinen ja suorittaa ammoniakin titraamisen tisleestä, noudatetaan valmistajan käyttöohjeita.

Keräilyastia, joka sisältää 25–30 ml boorihappoliuosta (3.18), asetetaan jäähdyttimen ulostulon alle siten, että poistoputki jää boorihappoliuoksen pinnan alapuolelle. Tislauslaite säädetään annostelemaan 50 ml natriumhydroksidiliuosta (3.9). Tislauslaitetta käytetään valmistajan ohjeiden mukaan ja tislataan pois natriumhydroksidiliuoksen lisäyksen tuloksena vapautunut ammoniakki. Tisle kerätään boorihappoa sisältävään vastaanottoliuokseen. Tisleen määrä (vesihöyrytislauksen aika) riippuu näytteen sisältämän typen määrästä. Valmistajan ohjeita noudatetaan.

Huomautus:

Puoliautomaattisessa tislauslaitteessa natriumhydroksidiylimäärän lisäys ja vesihöyrytislaus tapahtuvat automaattisesti.

5.3   Titraus

Jatketaan 5.3.1 tai 5.3.2 kohdan mukaisesti.

5.3.1   Rikkihappo

Keräilyastiassa oleva rikkihappoylimäärä titrataan käytetyn rikkihapon konsentraation mukaan natriumhydroksidiliuoksella (3.10 tai 3.11), kunnes loppupiste saavutetaan.

5.3.2   Boorihappo

Keräilyastian sisältö titrataan kloorivetyhapon standardiliuoksella (3.19) tai rikkihapon standardiliuoksella (3.6) byrettiä käyttäen ja todetaan käytetyn titrausliuoksen määrä.

Jos loppupisteen toteamiseksi käytetään kolorimetristä menetelmää, loppupiste on saavutettu, kun sisältöön alkaa ilmestyä vaaleanpunaista väriä. Byretin lukema arvioidaan 0,05 ml:n tarkkuudella. Loppupisteen havaitseminen saattaa olla helpompaa valaistun magneettisekoittimen tai fotometrisen detektorin avulla.

Tämä voidaan tehdä automaattisesti vesihöyrytislaimella, jossa on automaattinen titraus.

Tislauslaitteen tai tislaus-/titrauslaitteen käytössä noudatetaan valmistajan ohjeita.

Huomautus:

Kun käytetään automaattista titrausjärjestelmää, titraus alkaa välittömästi tislauksen alettua ja kun 1-prosenttinen boorihappoliuos (3.18) on kulunut.

Käytettäessä täysin automaattista tislausyksikköä ammoniakki voidaan titrata automaattisesti ja loppupiste detektoida käyttämällä potentiometristä pH-järjestelmää.

Tässä tapauksessa käytetään automaattista titrauslaitetta, jossa on pH-mittari. pH-mittari on kalibroitava asianmukaisesti välille pH 4–7 noudattaen tavanomaisia laboratorioiden pH-kalibrointimenettelyjä.

Titrauksen pH-loppupiste saavutetaan, kun pH on 4,6, mikä on titrauskäyrän jyrkin kohta (käännekohta).

5.4   Nollakoe

Reagenssien typettömyyden varmistamiseksi suoritetaan nollakoe (hajotus, tislaus ja titraus) käyttämällä 1 g sakkaroosia (3.14) näytteen sijasta.

6.   Tulosten laskeminen

Tulokset lasketaan 6.1 tai 6.2 kohdan mukaisesti.

6.1   Tuloksen laskeminen 5.3.1 kohdan mukaisessa titrauksessa

Raakavalkuaispitoisuus ilmaistuna painoprosentteina lasketaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

V0	=	nollakokeessa kulunut NaOH:n (3.10 tai 3.11) määrä (ml),
V1	=	näytteen titrauksessa kulunut NaOH:n (3.10 tai 3.11) määrä (ml),
c	=	natriumhydroksidin (3.10 tai 3.11) konsentraatio (mol/l),
m	=	näytteen paino (g).

6.2   Tuloksen laskeminen 5.3.2 kohdan mukaisessa titrauksessa

6.2.1   Titraus kloorivetyhapolla

Raakavalkuaispitoisuus ilmaistuna painoprosentteina lasketaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

m	=	näytteen paino (g),
c	=	kloorivetyhapon standardiliuoksen (3.19) konsentraatio (mol/l),
V0	=	nollakokeessa kuluneen kloorivetyhapon määrä (ml),
V1	=	näytteen titrauksessa kuluneen kloorivetyhapon määrä (ml).

6.2.2   Titraus rikkihapolla

Raakavalkuaispitoisuus ilmaistuna painoprosentteina lasketaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

m	=	näytteen paino (g),
c	=	rikkihapon standardiliuoksen (3.6) konsentraatio (mol/l),
V0	=	nollakokeessa kuluneen rikkihapon (3.6) määrä (ml),
V1	=	näytteen titrauksessa kuluneen rikkihapon (3.6) määrä (ml).

7.   Menetelmän varmistus

7.1   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä saa olla suurempi kuin

—	0,4 % absoluuttisena arvona, kun raakavalkuaispitoisuus on alle 20 %,

—	2,0 %, suhteellisena arvona suuremmasta tuloksesta, kun raakavalkuaispitoisuus on 20–40 %,

—	0,8 % absoluuttisena arvona, kun raakavalkuaispitoisuus on yli 40 %.

7.2   Uusittavuus

Samasta näytteestä eri laboratorioissa tehdyn kahden määrityksen välinen ero ei saa olla suurempi kuin

—	1,8 % absoluuttisena arvona, kun raakavalkuaispitoisuus on alle 20 %,

—	9,0 %, suhteellisena arvona suuremmasta tuloksesta, kun raakavalkuaispitoisuus on 20–40 %,

—	3,6 % absoluuttisena arvona, kun raakavalkuaispitoisuus on yli 40 %.

7.3   Tarkkuus

Määritys (hajotus, tislaus ja titraus) tehdään riittävällä määrällä asetanilidia (3.13) (esim. 0,2–0,3 g) siten, että läsnä on 1 gramma sakkaroosia (3.14); 1 g asetanilidia kuluttaa 14,80 ml rikkihappoa (3.5). Saannon on oltava vähintään 99 prosenttia.

8.   Huomautukset

8.1

Välineet voivat olla käsikäyttöisiä, puoliautomaattisia tai automaattisia. Jos liuos joudutaan siirtämään astiasta toiseen hajotuksen ja tislauksen välillä, siirto on suoritettava siten, ettei häviöitä tapahdu. Jos tislauslaitteen kolvissa ei ole tiputussuppiloa, lisätään natriumhydroksidi välittömästi ennen kolvin liittämistä jäähdyttimeen kaataen liuos hitaasti kolvin seinämää myöten.

8.2

Jos hajotettu tuote kiinteytyy, määritys on aloitettava alusta käyttämällä suurempaa määrää rikkihappoa (3.4) kuin 5.1 kohdassa on mainittu.

8.3

Kun tuotteiden typpipitoisuus on alhainen, voidaan rikkihapon (3.7) määrä keräilyastiassa tarvittaessa vähentää 10–15 ml:aan ja täyttää 25 ml:ksi vettä lisäämällä.

8.4

Raakavalkuaisen rutiinimäärityksissä voidaan käyttää vaihtoehtoisia menetelmiä, mutta vertailumenetelmänä on käsillä olevassa C osassa kuvailtu Kjeldahlin menetelmä. Vaihtoehtoisilla menetelmillä (kuten Dumas-menetelmällä) saatujen tulosten vastaavuus on osoitettava erikseen kunkin analysoitavan materiaalin osalta. Koska vaihtoehtoisilla menetelmillä saadut tulokset saattavat vastaavuuden varmistamisesta huolimatta hieman poiketa vertailumenetelmällä saaduista tuloksista, määritysselosteessa on mainittava, mitä menetelmää raakavalkuaisen määrityksessä on käytetty.

D.   UREAN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää märehtijöiden rehussa lisäaineena käytetyn urean pitoisuus.

2.   Periaate

Näyte suspendoidaan veteen sellaisen aineen läsnä ollessa, joka saa suspension kirkastumaan. Suspensio suodatetaan. Suodoksen ureamäärä määritetään sen jälkeen kun siihen on lisätty 4-dimetyyliaminobentsaldehydiä (4-DMAB) mittaamalla liuoksen absorbanssi 420 nm:n aallonpituudella.

3.   Reagenssit

3.1

4-Dimetyyliaminobentsaldehydiliuos: 1,6 g 4-DMAB:ta liuotetaan 100 ml:aan 96-prosenttista etanolia ja siihen lisätään 10 ml kloorivetyhappoa (ρ20 1,19 g/ml). Tämä reagenssi säilyy korkeintaan kahden viikon ajan.

3.2

Carrez-liuos I: liuotetaan veteen 21,9 g sinkkiasetaattia Zn(CH3COO)2 2H2O ja 3 g jääetikkaa. Tilavuus säädetään 100 ml:ksi vedellä.

3.3

Carrez-liuos II: liuotetaan veteen 10,6 g kaliumferrosyanidia K4Fe(CN)6 3H2O. Tilavuus säädetään 100 ml:ksi vedellä.

3.4

Aktiivihiili, joka ei absorboi ureaa (tarkastettava).

3.5

Urealiuos 0,1 % (w/v).

4.   Välineistö

4.1

Sekoitin: noin 35–40 kierr./min.

4.2

Lasihiostulpallisia koeputkia 160 × 16 mm.

4.3

Spektrofotometri.

5.   Menettely

5.1   Näytteen määritys

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 2 g näytettä sekä 1 g aktiivihiiltä (3.4) 500 ml:n mittapulloon. Lisätään 400 ml vettä ja 5 ml Carrez I -liuosta (3.2), sekoitetaan noin 30 sekunnin ajan ja lisätään 5 ml Carrez II -liuosta (3.3). Pidetään sekoittimessa 30 minuutin ajan. Lisätään vettä merkkiin asti, sekoitetaan ja suodatetaan.

Läpinäkyvästä, värittömästä suodoksesta pipetoidaan 5 ml lasihiostulpallisiin koeputkiin, lisätään 5 ml 4-DMAB -liuosta (3.1) ja sekoitetaan. Putket asetetaan 20 °C:ssa (+/– 4 °C) olevaan vesihauteeseen. Viidentoista minuutin kuluttua mitataan näyteliuoksen absorbanssi spektrofotometrillä 420 nm:n aallonpituudella. Lukemaa verrataan reagensseista valmistettuun nollakoeliuokseen.

5.2   Kalibrointikäyrä

Pipetoidaan 100 ml:n mittapulloihin 1, 2, 4, 5 ja 10 ml urealiuosta (3.5) ja täytetään merkkiin asti vedellä. Kutakin liuosta pipetoidaan koeputkiin 5 ml, lisätään 5 ml 4-DMAB -liuosta (3.1), homogenoidaan ja niiden absorbanssi mitataan edellä kuvatulla tavalla verrattuna kontrolliliuokseen, joka sisältää 5 ml 4-DMAB:ta ja 5 ml vettä ja jossa ei ole ureaa. Piirretään kalibrointikäyrä.

6.   Tulosten laskeminen

Urean määrä näytteessä määritetään kalibrointikäyrää käyttäen.

Tulokset ilmoitetaan milligrammoina ureaa näytekiloa kohti.

7.   Menetelmän arviointi

7.1   Toistettavuus

Samasta näytteestä saman henkilön samassa laboratoriossa tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla suurempi kuin:

—	420 nm:ssä — 50 % suuremmasta tuloksesta, kun ureapitoisuus on vähintään 3 000 mg/kg mutta alle 5 000 mg/kg. — 25 % suuremmasta tuloksesta, kun ureapitoisuus on vähintään 5 000 mg/kg mutta alle 7 000 mg/kg. — 20 % suuremmasta tuloksesta, kun ureapitoisuus on vähintään 7 000 mg/kg;

—	435 nm:ssä — 40 % suuremmasta tuloksesta, kun ureapitoisuus on vähintään 3 000 mg/kg mutta alle 5 000 mg/kg. — 25 % suuremmasta tuloksesta, kun ureapitoisuus on vähintään 5 000 mg/kg mutta alle 9 000 mg/kg. — 5 % suuremmasta tuloksesta, kun ureapitoisuus on vähintään 9 000 mg/kg.

7.2   Uusittavuus

Samasta näytteestä eri laboratorioissa tehdyn ja/tai eri henkilöiden tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla suurempi kuin

—	420 nm:ssä — 3 000 mg/kg absoluuttisena arvona, kun ureapitoisuus on vähintään 3 000 mg/kg mutta alle 12 000 mg/kg. — 4 500 mg/kg absoluuttisena arvona, kun ureapitoisuus on vähintään 12 000 mg/kg;

—	435 nm:ssä — 50 % suuremmasta tuloksesta, kun ureapitoisuus on vähintään 3 000 mg/kg mutta alle 8 000 mg/kg. — 25 % suuremmasta tuloksesta, kun ureapitoisuus on vähintään 8 000 mg/kg.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

EU:n laboratorioiden välillä järjestettyyn vertailuun osallistui 18 laboratoriota. Viisi positiivista märehtijöille tarkoitettua rehuseosnäytettä (taulukoissa 1 ja 2 ’MAT’) analysoitiin (1 analyysi) kaksoissokkonäytteinä, ja yksi nollanäyte analysoitiin kerran.

Kansainvälisten ohjeistuksien mukaiset toistettavuuden (r) ja uusittavuuden (R) raja-arvojen laskelmat suoritettiin sen jälkeen, kun poikkeavat arvot oli poistettu pätevien arvojen varianssianalyysin avulla.

Seuraavissa taulukoissa esitetään menetelmän suorituskyvylle lasketut arvot (toistettavuus ja uusittavuus) Testatuista näytteistä, nollanäyte mukaan lukien, ei saatu yhtäkään virheellisesti positiivista tai virheellisesti negatiivista tulosta.

Taulukko 1

Menetelmän suorituskykyominaisuudet urean osalta, mitattu λ = 420 nm kaikissa aineissa

	Aine 2	Aine 5	Aine 3	Aine 4	Aine 6
	Lampaat	Nautaeläimet	Lampaat	Lampaat	Nautaeläimet
Tavoitemassaosuus (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Keskimääräinen massaosuus (mg kg-1)	4 241	6 993	7 830	9 962	12 071
Uusittavuuden keskihajonta sR (mg kg-1)	1 141	1 303	985	994	1 711
Toistettavuuden keskihajonta sr (mg kg-1)	723	601	549	712	737
Uusittavuuden suhteellinen keskihajonta RSDR (%)	27	19	13	10	14
Toistettavuuden suhteellinen keskihajonta RSDr (%)	17	9	7	7	6
Uusittavuuden raja-arvo, R [R = 2,8 × sR ]	3 195	3 649	2 759	2 784	4 790
Toistettavuuden raja-arvo, r [r = 2,8 × sr ]	2 024	1 684	1 536	1 994	2 064

Taulukko 2

Menetelmän suorituskykyominaisuudet urean osalta, mitattu λ = 435 nm kaikissa aineissa

	Aine 2	Aine 5	Aine 3	Aine 4	Aine 6
	Lampaat	Nautaeläimet	Lampaat	Lampaat	Nautaeläimet
Tavoitemassaosuus (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Keskimääräinen massaosuus (mg kg-1)	4 101	6 467	7 890	10 062	11 642
Uusittavuuden keskihajonta sR (mg kg-1)	706	1 194	675	745	1 378
Toistettavuuden keskihajonta sr (mg kg-1)	570	628	613	196	167
Uusittavuuden suhteellinen keskihajonta RSDR (%)	17	18	9	7	12
Toistettavuuden suhteellinen keskihajonta RSDr (%)	14	10	8	2	1
Uusittavuuden raja-arvo, R [R = 2,8 × sR ]	1 977	3 344	1 889	2 087	3 859
Toistettavuuden raja-arvo, r [r = 2,8 × sr ]	1 596	1 759	1 715	549	467

9.   Huomautukset

9.1

Kun urean määrä ylittää 3 prosenttia, näytteen määrä vähennetään 1 g:ksi tai alkuperäinen liuos laimennetaan siten, ettei siinä ole yli 50 mg ureaa 500 ml:ssa.

9.2

Kun ureapitoisuus on alhainen, näytteen kokoa suurennetaan, kunhan suodos säilyy läpinäkyvänä ja värittömänä.

9.3

Edellä olevat laboratorioiden välisen vertailun tulokset eivät viittaa merkittävään tarkkuuseroon urean määrityksessä 420 nm:ssä ja 435 nm:ssä.

E.   AMINOHAPPOJEN MÄÄRITYS (TRYPTOFAANIA LUKUUN OTTAMATTA)

Aminohappojen määritykseen (tryptofaania lukuun ottamatta) käytettävät menetelmät ovat

—	EN ISO 13903 -standardi (Animal feeding stuffs – Determination of amino acids content), joka koskee aminohappopitoisuuksien määritystä rehusta

—	EN ISO 17180 -standardi (Animal feeding stuffs – Determination of lysine, methionine, and threonine in commercial amino acid products and premixtures), joka koskee lysiinin, metioniinin ja treoniinin määritystä rehujen kaupallisissa aminohappotuotteissa ja esiseoksissa (4)

—	jäljempänä 1–10 kohdassa kuvattu määritysmenetelmä.

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää vapaat aminohapot (synteettiset ja luonnon aminohapot) ja kokonaisaminohapot (peptideihin kiinnittyneet ja vapaat) aminohappoanalysaattorilla rehuaineissa, rehuseoksissa ja esiseoksissa, joissa kutakin aminohappoa on alle 10 prosenttia (5). Se sopii seuraaviin aminohappoihin: kyst(e)iini, metioniini, lysiini, treoniini, alaniini, arginiini, asparagiinihappo, glutamiinihappo, glysiini, histidiini, isoleusiini, leusiini, fenyylialaniini, proliini, seriini, tyrosiini ja valiini.

Menetelmä ei erota toisistaan aminohappojen eri suoloja eikä aminohappojen D- ja L-muotoja. Se ei sovellu tryptofaanin eikä aminohappojen hydroksianalogien määritykseen.

2.   Periaate

2.1   Vapaat aminohapot

Vapaat aminohapot uutetaan laimealla kloorivetyhapolla. Mukana uuttuneet typpipitoiset makromolekyylit saostetaan sulfosalisyylihapolla ja poistetaan suodattamalla. Suodatetun liuoksen pH säädetään arvoon 2,20. Aminohapot erotetaan ioninvaihtokromatografialla ja määritetään fotometrillä ninhydriinijohdoksina aallonpituudella 570 nm.

2.2   Kokonaisaminohapot

Menetelmä valitaan tutkittavien aminohappojen mukaan. Kyst(e)iini ja metioniini on hapetettava kysteiinihapoksi ja metioniinisulfoniksi ennen hydrolyysiä. Tyrosiini on määritettävä näytteistä, joita ei hapeteta ennen hydrolyysiä. Kaikki muut 1 kohdassa (Tarkoitus ja soveltamisala) mainitut aminohapot voidaan määrittää joko hapetetusta tai hapettamattomasta näytteestä.

Hapettaminen tapahtuu 0 °C:ssa permuurahaishapon ja fenolin seoksella. Hapetusreagenssin ylimäärä hajotetaan natriumdisulfiitin avulla. Hapetettu tai hapettamaton näyte hydrolysoidaan kloorivetyhapolla (3.20) 23 tunnin ajan. Hydrolyysituotteen pH säädetään arvoon 2,20. Aminohapot erotetaan ioninvaihtokromatografialla ja määritetään fotometrillä ninhydriinijohdoksina aallonpituudella 570 nm (proliini 440 nm).

3.   Reagenssit

Veden on oltava kaksoistislattua tai vastaavan laatuista (johtokyky < 10 μS).

3.1

Vetyperoksidi, w (w/w) = 30 %.

3.2

Muurahaishappo, w (w/w) = 98-100 %.

3.3

Fenoli.

3.4

Natriumdisulfiitti.

3.5

Natriumhydroksidi.

3.6

5-Sulfosalisyylihappodihydraatti.

3.7

Kloorivetyhappo, tiheys noin 1,18 g/ml.

3.8

Trinatriumsitraattidihydraatti.

3.9

2,2’-Tiodietanoli (tiodiglykoli).

3.10

Natriumkloridi.

3.11

Ninhydriini.

3.12

Petrolieetteri, kiehumislämpötila 40–60 °C.

3.13

Norleusiini tai muu yhdiste, jota voidaan käyttää sisäisenä standardina.

3.14

Typpikaasu (< 10 ppm happea).

3.15

1-Oktanoli.

3.16

Aminohapot.

3.16.1

Edellä 1 kohdassa (Tarkoitus ja soveltamisala) lueteltujen aminohappojen standardina käytettävät yhdisteet. Puhtaat yhdisteet, jotka eivät sisällä kidevettä. Kuivataan tyhjiössä P2O5:n tai H2SO4:n päällä viikon ajan ennen käyttöä.

3.16.2

Kysteiinihappo.

3.16.3

Metioniinisulfoni.

3.17

Natriumhydroksidiliuos, c = 7,5 mol/l: liuotetaan 300 g NaOH:ta (3.5) veteen ja laimennetaan 1 litraksi.

3.18

Natriumhydroksidiliuos, c = 1 mol/l: liuotetaan 40 g NaOH:ta (3.5) veteen ja laimennetaan 1 litraksi.

3.19

Muurahaishappo-fenoliliuos: sekoitetaan 889 g muurahaishappoa (3.2) ja 111 g vettä ja lisätään 4,73 g fenolia (3.3).

3.20

Hydrolyysiseos, c = 6 mol HCl / l ja 1 g fenolia litrassa: lisätään 1 g fenolia (3.3) 492 ml:aan HCl (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.21

Uuttoseos, c = 0,1 mol HCl / l ja 2 % tiodiglykolia: laimennetaan 8,2 ml HCl:ää (3.7) noin 900 ml:aan vettä, lisätään 20 ml tiodiglykolia (3.9) ja täytetään vedellä yhdeksi litraksi (ei sekoiteta suoraan aineita 3.7 ja 3.9).

3.22

5-Sulfosalisyylihappo, ß = 6 %: Liuotetaan 60 g 5-sulfosalisyylihappoa (3.6) veteen ja laimennetaan vedellä litraksi.

3.23

Hapetusseos (permuurahaishappo-fenoli): sekoitetaan 0,5 ml vetyperoksidia (3.1) 4,5 ml:aan muurahaishappo-fenoliliuosta (3.19) pienessä dekantterilasissa. Inkuboidaan 20–30 °C:ssa tunnin ajan, jotta saadaan permuurahaishappoa, annetaan sitten jäähtyä jäävesihauteessa (15 min) ennen näytteeseen lisäämistä. Varoitus: vältettävä ihokosketusta ja käytettävä suojavaatteita.

3.24

Sitraattipuskuriliuos, c = 0,2 mol Na+ / l, pH 2,20: liuotetaan 19,61 g natriumsitraattia (3.8), 5 ml tiodiglykolia (3.9), 1 g fenolia (3.3) ja 16,50 ml HCl:ää (3.7) noin 800 ml:aan vettä. Säädetään pH arvoon 2,20. Täytetään 1 litraksi vedellä.

3.25

Eluointipuskurit, valmistetaan analysaattorin vaatimusten mukaisesti (4.9).

3.26

Ninhydriinireagenssi, valmistetaan analysaattorin vaatimusten mukaisesti (4.9).

3.27

Aminohappojen standardiliuokset. Nämä liuokset säilytetään alle 5 °C:n lämpötilassa.

3.27.1

Aminohappojen standardin kantaliuos (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml kutakin aminohappoa kloorivetyhapossa. Saatavana kaupallisesti.

3.27.2

Kysteiinihapon ja metioniinisulfonin standardin kantaliuos, c = 1,25 μmol/ml. Liuotetaan 0,2115 g kysteiinihappoa (3.16.2) ja 0,2265 g metioniinisulfonia (3.16.3) sitraattipuskuriin (3.24) litran mittapullossa ja täytetään merkkiin asti sitraattipuskurilla. Säilytetään alle 5 °C:n lämpötilassa enintään 12 kuukautta. Tätä liuosta ei tarvita, jos standardin kantaliuos (3.27.1) sisältää kysteiinihappoa ja metioniinisulfonia.

3.27.3

Sisäisen standardin kantaliuos, esimerkiksi norleusiini, c = 20 μmol/ml. Liuotetaan 0,6560 g norleusiinia (3.13) sitraattipuskuriin (3.24) mittapullossa ja täytetään 250 ml:ksi sitraattipuskurilla. Säilytetään alle 5 °C:n lämpötilassa enintään 6 kuukautta.

3.27.4

Aminohappojen kalibrointiliuos hydrolysaateille: kysteiinihappo ja metioniinisulfoni, c = 5 nmol/50 μl, muut aminohapot c = 10 nmol/50 μl. Liuotetaan 2,2 g natriumkloridia (3.10) 30 ml:aan sitraattipuskuria (3.24) 100 ml:n dekantterilasissa. Lisätään 4,00 ml aminohappojen standardin kantaliuosta (3.27.1), 4,00 ml kysteiinihapon ja metioniinisulfonin standardin kantaliuosta (3.27.2) ja tarvittaessa 0,50 ml sisäisen standardin kantaliuosta (3.27.3). Säädetään pH arvoon 2,20 natriumhydroksidilla (3.18). Siirretään kvantitatiivisesti 50 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti sitraattipuskurilla (3.24) ja sekoitetaan. Säilytetään alle 5 °C:n lämpötilassa enintään 3 kuukautta. Katso myös huomautus 9.1.

3.27.5

Aminohappojen kalibrointiliuos 5.3.3.1 kohdan mukaisesti valmistetuille hydrolysaateille ja uutteille (5.2). Kalibrointiliuos valmistetaan 3.27.4 kohdan mukaisesti kuitenkin jättäen natriumkloridi pois. Säilytetään alle 5 °C:n lämpötilassa enintään 3 kuukautta.

4.   Välineistö

4.1

100 ml:n tai 250 ml:n pyörökolvi, joka on varustettu palautusjäähdyttimellä.

4.2

Borosilikaattilasinen 100 ml:n pullo, jossa on kumi/teflontiivisteinen kierrettävä uuninkestävä korkki (esimerkiksi Duran, Schott).

4.3

Koneellisella ilmanvaihdolla varustettu ja lämpötilaltaan säädettävä kuivausuuni, jonka tarkkuus on parempi kuin ± 2 °C.

4.4

pH-mittari (lukemat kolmen desimaalin tarkkuudella).

4.5

Kalvosuodatin (0,22 μm).

4.6

Sentrifugi.

4.7

Vakuumipyöröhaihdutin.

4.8

Mekaaninen ravistelija tai magneettisekoitin.

4.9

Aminohappoanalysaattori tai HPLC-laitteisto, jossa on ioninvaihtokolonni, välineistö kolonnin jälkeistä ninhydriiniderivointia varten ja fotometri. Kolonni täytetään sellaisella sulfonoidulla polystyreenihartsilla, jolla voidaan erottaa eri aminohapot toisistaan ja muista ninhydriinin kanssa reagoivista yhdisteistä. Puskuri- ja ninhydriinipumpun virtausnopeuden stabiilisuuden tulee olla ± 0,5 prosenttia ajanjaksona, jona analysoidaan sekä standardiliuos että näyte. Tietyissä aminohappoanalysaattoreissa voidaan käyttää hydrolyysimenetelmää, jossa hydrolysaatin natriumpitoisuus on c = 0,8 mol/l ja se sisältää näin kaiken hapetuksessa jäljelle jääneen muurahaishapon. Muut laitteet eivät erota tyydyttävästi tiettyjä aminohappoja, jos hydrolysaatti sisältää liikaa muurahaishappoa ja/tai natriumionipitoisuus on suuri. Tässä tapauksessa hapon määrää vähennetään haihduttamalla hydrolysaatti noin 5 ml:aan ennen pH:n säätämistä. Haihduttamisen on tapahduttava tyhjiössä enintään 40 °C:ssa.

5.   Menettely

5.1   Näytteen valmistaminen

Näyte jauhetaan siten, että se läpäisee 0,5 mm:n seulan. Näytteet, joiden kosteuspitoisuus on suuri, on ilmakuivattava enintään 50 °C:ssa tai pakastekuivattava ennen jauhamista. Näytteet, joiden rasvapitoisuus on suuri, on uutettava petrolieetterillä (3.12) ennen jauhamista.

5.2   Vapaiden aminohappojen määritys

Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella sopiva määrä (1–5 g) valmistettua näytettä (5.1) erlenmeyerkolviin ja lisätään 100,0 ml uuttoseosta (3.21). Ravistellaan seosta 60 minuuttia mekaanisella ravistelijalla tai magneettisekoittimella (4.8). Annetaan sakan laskeutua ja pipetoidaan 10,0 ml supernatanttiliuosta 100 ml:n dekantterilasiin.

Lisätään koko ajan sekoittaen 5,0 ml sulfosalisyylihappoliuosta (3.22) ja jatketaan sekoittamista 5 minuutin ajan magneettisekoittimella. Suodatetaan tai sentrifugoidaan liuos mahdollisen sakan erottamiseksi. Pipetoidaan 10,0 ml saatua liuosta 100 ml:n dekantterilasiin, säädetään pH arvoon 2,20 natriumhydroksidiliuoksella (3.18), huuhdotaan sopivan kokoiseen mittapulloon sitraattipuskurilla (3.24) ja täytetään merkkiin asti puskuriliuoksella (3.24).

Jos käytetään sisäistä standardia (3.27.3), sitä lisätään 1,00 ml lopullisen liuoksen kutakin 100 ml:aa kohden ja täytetään merkkiin asti puskuriliuoksella (3.24).

Siirrytään kromatografiavaiheeseen 5.4 kohdan mukaisesti.

Jos kromatografiaa ei tehdä samana päivänä, uutteet säilytetään alle 5 °C:n lämpötilassa.

5.3   Kokonaisaminohappojen määritys

5.3.1   Hapettaminen

Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella 0,1–1 g valmistettua näytettä (5.1):

—	100 ml:n pyörökolviin (4.1) avointa hydrolyysiä (5.3.2.3) varten, tai

—	250 ml:n pyörökolviin (4.1), jos tarvitaan alhaista natriumpitoisuutta (5.3.3.1), tai

—	100 ml:n kierrekorkilliseen pulloon (4.2) suljettua hydrolyysiä (5.3.2.4) varten.

Punnitun näytemäärän typpipitoisuuden on oltava noin 10 mg ja kosteuspitoisuuden enintään 100 mg.

Asetetaan pyörökolvi tai pullo jää-vesihauteeseen ja jäähdytetään 0 °C:seen, lisätään 5 ml hapetusseosta (3.23) ja sekoitetaan kaarevakärkisellä lasilastalla. Suljetaan kolvi/pullo lastoineen ilmatiiviin kalvon avulla, asetetaan jää-vesihaude näin suljettuine astioineen jääkaappiin, jonka lämpötila on 0 °C, ja jätetään sinne 16 tunniksi. Tämän jälkeen se otetaan jääkaapista ja hajotetaan hapetusreagenssin ylimäärä lisäämällä 0,84 g natriumdisulfiittia (3.4).

Siirrytään 5.3.2.1 kohtaan.

5.3.2   Hydrolyysi

5.3.2.1

Hapetettujen näytteiden hydrolyysi Edellä 5.3.1. kohdan mukaisesti valmistettuun hapetettuun näytteeseen lisätään 25 ml hydrolyysiseosta (3.20) huolehtien siitä, että astian seinämiin ja lastaan jäänyt näyte huuhdellaan pois. Jatketaan valitun hydrolyysimenetelmän mukaan 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 kohdasta.

5.3.2.2

Hapettamattomien näytteiden hydrolyysi Punnitaan 100 ml:n tai 250 ml:n pyörökolviin (4.1) tai 100 ml:n kierrekorkilliseen pulloon (4.2) 0,1–1,0 g valmistettua näytettä (5.1) 0,2 mg:n tarkkuudella. Punnitun näytemäärän typpipitoisuuden on oltava noin 10 mg. Lisätään varovasti 25 ml hydrolyysiseosta (3.20) ja sekoitetaan näytteeseen. Jatketaan joko 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 kohdasta.

5.3.2.3

Avoin hydrolyysi Lisätään kolme lasihelmeä kolvissa olevaan seokseen (valmistettu 5.3.2.1 tai 5.3.2.2 kohdan mukaisesti) ja keitetään tasaisesti kuplittaen palautusjäähdyttimen alla 23 tuntia. Hydrolyysin jälkeen huuhdellaan jäähdytin 5 ml:lla sitraattipuskuria (3.24). Kolvi irrotetaan ja jäähdytetään jäähauteessa. Jatketaan 5.3.3 kohdan mukaisesti.

5.3.2.4

Suljettu hydrolyysi Asetetaan 5.3.2.1 tai 5.3.2.2 kohdan mukaisesti valmistettua näyteseosta sisältävä pullo uuniin (4.3) 110 °C:seen. Ensimmäisen tunnin aikana pidetään kierrekorkki sulkematta pullon päällä, jottei kaasun muodostuksen vuoksi syntyisi painetta ja jotta vältyttäisiin räjähdyksiltä. Pulloa ei saa sulkea korkilla. Tunnin kuluttua pullo suljetaan kierrekorkilla ja sen annetaan olla uunissa (4.3) 23 tunnin ajan. Hydrolyysin jälkeen pullo otetaan uunista, avataan korkki varovasti ja asetetaan pullo jää-vesihauteeseen. Annetaan jäähtyä. Riippuen tavasta, jolla pH säädetään (5.3.3), siirretään pullon sisältö kvantitatiivisesti sitraattipuskurin avulla (3.24) 250 ml:n dekantterilasiin tai 250 ml:n pyörökolviin. Jatketaan 5.3.3 kohdan mukaisesti.

5.3.3   pH:n säätäminen

Aminohappoanalysaattorin (4.9) natriuminsietokyvyn mukaan noudatetaan 5.3.3.1 tai 5.3.3.2 kohtaa pH:n säätämiseksi.

5.3.3.1

Kromatografit (4.9), jotka edellyttävät alhaista natriumpitoisuutta On suositeltavaa käyttää sisäisen standardin kantaliuosta (3.27.3), jos käytetään aminohappoanalysaattoreita, jotka edellyttävät alhaista natriumpitoisuutta (kun hapon määrää on vähennettävä). Tässä tapauksessa lisätään 2,00 ml sisäisen standardin kantaliuosta (3.27.3) hydrolysaattiin ennen haihdutusta. Lisätään 2 tippaa 1-oktanolia (3.15) 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 kohdan mukaisesti saatuun hydrolysaattiin. Haihdutetaan näyte 5–10 ml:aan pyöröhaihduttimella (4.7), jonka hauteen lämpötila on 40 °C. Jos tilavuus pienenee vahingossa alle viiden millilitran, hydrolysaatti on hylättävä ja analyysi aloitettava uudelleen. pH säädetään arvoon 2,20 natriumhydroksidiliuoksella (3.18) ja jatketaan 5.3.4 kohdasta.

5.3.3.2

Muut aminohappoanalysaattorit (4.9): Kohdan 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 mukaisesti saatu hydrolysaatti neutraloidaan osittain lisäämällä varovasti koko ajan sekoittaen 17 ml natriumhydroksidiliuosta (3.17) ja huolehditaan siitä, että lämpötila on alle 40 °C. Lopullinen pH:n säätäminen 2,20:een tapahtuu huoneen lämpötilassa 3.17 kohdan mukaisen natriumhydroksidiliuoksen avulla ja lopuksi 3.18 kohdan mukaisella natriumhydroksidiliuoksella. Siirrytään 5.3.4 kohtaan.

5.3.4   Näyteliuos kromatografiaa varten

Siirretään kvantitatiivisesti hydrolysaatti, jonka pH on säädetty (5.3.3.1 tai 5.3.3.2), sitraattipuskurilla (3.24) 200 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin asti puskurilla (3.24).

Jos sisäistä standardia ei ole vielä käytetty, lisätään sitä 2,00 ml (3.27.3) ja täytetään merkkiin asti sitraattipuskurilla (3.24). Sekoitetaan huolellisesti.

Siirrytään kromatografiavaiheeseen (5.4).

Jos kromatografiaa ei tehdä samana päivänä, näyteliuokset säilytetään alle 5 °C:n lämpötilassa.

5.4   Kromatografia

Annetaan uutteen (5.2) tai hydrolysaatin (5.3.4) tasoittua huoneenlämpöisiksi ennen kromatografiaa. Ravistellaan seosta ja suodatetaan sopiva määrä 0,22 μm:n kalvosuodattimen (4.5) läpi. Saatu kirkas liuos analysoidaan aminohappoanalysaattorilla käyttäen ioninvaihtokromatografiaa (4.9).

Injektio voidaan suorittaa käsin tai automaattisesti. On tärkeää, että kolonniin lisätään aina sama määrä (± 0,5 %) vertailu- tai näyteliuosta, paitsi silloin kun käytetään sisäistä standardia, ja että natriumin ja aminohappojen suhde standardi- ja näyteliuoksissa on mahdollisimman lähellä toisiaan.

Kalibrointiajojen tiheys riippuu ninhydriinireagenssin ja analysaattorin toiminnan stabiilisuudesta. Standardi- tai näyteliuosta laimennetaan sitraattipuskurilla (3.24), siten, että standardiliuoksen antama piikin pinta-ala on 30–200 prosenttia näytteen aminohapon antaman piikin pinta-alasta.

Aminohappojen kromatografia vaihtelee jonkin verran käytetyn analysaattorin tyypin ja käytetyn hartsin mukaan. Valitun menetelmän on mahdollistettava aminohappojen erottaminen toisistaan ja muista ninhydriinin kanssa reagoivista aineista. Pylvääseen ruiskutettujen yhdisteiden pitoisuuden muutosten on käyttöalueella annettava lineaarinen vaste.

Analysoitaessa aminohappojen ekvimolaarisia liuoksia sovelletaan seuraavassa kappaleessa määriteltyjä laakson ja piikin välisiä suhteita. Ekvimolaarisen liuoksen tulee sisältää vähintään 30 prosenttia kunkin aminohapon siitä enimmäismäärästä, joka voidaan määrittää tarkasti käytetyllä aminohappoanalysaattorilla (4.9).

Kromatogrammissa treoniinin ja seriinin osittain päällekkäisten piikkien välisen laakson suhde matalamman piikin korkeuteen ei saa olla suurempi kuin 2:10. (Jos määritetään ainoastaan kyst(e)iiniä, metioniiniä, treoniiniä ja lysiiniä, vierekkäisten piikkien riittämätön erottuminen toisistaan häiritsee määritystä.) Muiden aminohappojen osalta erottumisen on oltava parempi kuin 1:10.

Kromatografiajärjestelmän on pystyttävä erottamaan lysiini lysiiniartefaktoista ja ornitiinistä.

6.   Tulosten laskeminen

Näytteen ja vertailuliuoksen piikkien pinta-ala mitataan kunkin yksittäisen aminohapon osalta ja määrä (X) lasketaan seuraavan kaavan mukaisesti; tulos ilmoitetaan grammoina aminohappoa näytekiloa kohden.

Jos sisäistä standardia käytetään, kerrotaan kaava vielä termillä

A	=	analysoitavan piikin pinta-ala, hydrolysaatti tai uute
B	=	analysoitavan piikin pinta-ala, standardiliuos
C	=	sisäisen standardin piikin pinta-ala hydrolysaatissa tai uutteessa
D	=	sisäisen standardin piikin pinta-ala kalibrointiliuoksessa
M	=	analysoitavan aminohapon molekyylipaino
c	=	standardin konsentraatio μmol/ml
m	=	näytteen paino grammoina (korjataan alkuperäiseen painoon, jos kuivattu tai rasva poistettu)
V	=	ml kokonaishydrolysaattia (5.3.4) tai ml uutteen laskettua kokonaislaimennosta (6.1).

Sekä kystiini että kysteiini määritetään kysteiinihappona hapetetun näytteen hydrolysaateista, mutta ne lasketaan kystiiniksi (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) käyttäen molekyylipainoa 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metioniini määritetään metioniinisulfonina hapetetun näytteen hydrolysaateista, mutta lasketaan metioniiniksi käyttäen metioniinin molekyylipainoa 149,21 g/mol.

Lisätty vapaa metioniini määritetään uuttamisen jälkeen metioniinina; laskennassa käytetään samaa molekyylipainoa.

6.1

Uutteiden kokonaislaimennoksen tilavuus (F) vapaiden aminohappojen määrittämistä varten (5.2) lasketaan seuraavasti: V = lopullisen uutteen määrä.

7.   Menetelmän arviointi

Menetelmä on testattu vuonna 1990 tehdyssä kansainvälisessä laboratorioiden välisessä vertailussa käyttäen neljää eri rehua (sikojen täysrehu, broilereiden täysrehu, valkuaistiiviste ja esiseos).

Huomautus:

Menetelmä on testattu toisen kansainvälisen vertailututkimuksen aikana vuonna 2003 käyttäen kaksoissokkopareja, joissa näytteet olivat broilereiden loppukasvatusrehusta, broilereiden aloitusrehusta, maissista, kalajauhosta ja siipikarjasta valmistetusta jauhosta. Lisätietoja varten katso EN ISO 13903 -standardi.

Vuoden 1990 vertailututkimuksen tulosten keskiarvo ja standardipoikkeama poikkeavien arvojen poissulkemisen jälkeen on esitetty tämän kohdan taulukoissa.

Keskiarvot g/kg

Vertailuaine	Aminohappo
	Treoniini	Kyst(e)iini	Metioniini	Lysiini
Sikojen täysrehu	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Broilereiden täysrehu	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Valkuaistiiviste	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Esiseos	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä.

7.1   Toistettavuus

Edellä olevassa taulukossa esitetyn laboratorioiden välisen vertailun toistettavuus on ilmaistu alla olevissa taulukoissa muodossa ”laboratorion sisäinen standardipoikkeama”:

Variaatiokerroin (%) laskettuna toistettavuudesta (CVr)

Vertailuaine	Aminohappo
	Treoniini	Kyst(e)iini	Metioniini	Lysiini
Sikojen täysrehu	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Broilereiden täysrehu	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Valkuaistiiviste	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Esiseos	2,2 n = 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä.

7.2   Uusittavuus

Laboratorioiden välisten standardipoikkeamien tulokset edellä mainitussa vertailussa on esitetty seuraavassa taulukossa.

Variaatiokerroin (%) laskettuna uusittavuudesta (CVR)

Vertailuaine	Aminohappo
	Treoniini	Kyst(e)iini	Metioniini	Lysiini
Sikojen täysrehu	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Broilereiden täysrehu	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Valkuaistiiviste	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Esiseos	4,3 n = 16	-	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä.

8.   Vertailumateriaalin käyttö

Menetelmän oikea soveltaminen tarkistetaan sertifioidulla vertailumateriaalilla, jos sellainen on saatavilla, tehdyllä kaksoismäärityksellä. Kalibrointi sertifioidulla aminohappojen kalibrointiliuoksella on suotavaa.

9.   Huomautukset

9.1

Aminohappoanalysaattoreiden välisten erojen vuoksi annettuja aminohappojen kalibrointiliuosten (ks. 3.27.4 ja 3.27.5 kohta) ja hydrolysaattien (ks. 5.3.4 kohta) lopullisia konsentraatioita on pidettävä suuntaa antavina. Laitteiston lineaarisen vasteen alue on tarkistettava kaikkien aminohappojen osalta. Standardiliuos laimennetaan sitraattipuskurilla siten, että piikit sijoittuvat alueen keskivaiheille.

9.2

Kun hydrolysaattien analysointiin käytetään suuren erotuskyvyn nestekromatografialaitteistoa, koeolosuhteet on optimoitava valmistajan suositusten mukaisesti.

9.3

Jos menetelmää sovelletaan rehuseoksiin tai esiseoksiin, jotka sisältävät enemmän kuin yhden prosentin kloridia (tiiviste, kivennäisaineita sisältävät ravinteet tai täydennysrehut), sillä saatetaan saada metioniinille liian pieniä arvoja, ja erityiskäsittely on tarpeen.

10.   Suorituskykyvaatimukset

Yhdistämällä tulokset (muiden kuin tyrosiinin osalta) näistä kahdesta vertailututkimuksesta (edellä 7 kohdassa esitetystä vuoden 1990 tutkimuksesta ja EN/ISO 13903 -standardissa esitetystä vuoden 2005 tutkimuksesta) saadaan seuraavat toistettavuutta ja uusittavuutta koskevat vaatimukset. Näistä kahdesta laboratorioiden välisestä testistä saatuja arvoja ei välttämättä voi soveltaa muihin kuin esitettyihin pitoisuusalueisiin ja -matriiseihin.

10.1   Toistettavuus

Samasta näytteestä saman henkilön samassa laboratoriossa tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla suurempi kuin:

—	6 % suuremmasta tuloksesta, kun kyse on aminohappojen kokonaismäärästä glysiinin, alaniinin, lysiinin, proliinin, glutamiinihapon, isoleusiinin ja histidiinin osalta.

—	8 % suuremmasta tuloksesta, kun kyse on aminohappojen kokonaismäärästä treoniinin, fenyylialaniinin, metioniinin, asparagiinihapon ja leusiinin osalta.

—	10 % suuremmasta tuloksesta, kun kyse on aminohappojen kokonaismäärästä arginiinin ja valiinin osalta.

—	12 % suuremmasta tuloksesta, kun kyse on aminohapon seriini kokonaismäärästä.

—	15 % suuremmasta tuloksesta, kun kyse on aminohapon kyst(e)iini kokonaismäärästä.

10.2   Uusittavuus

Samasta näytteestä eri laboratorioissa tehdyn ja/tai eri henkilöiden tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla suurempi kuin

—	15 % suuremmasta tuloksesta, kun kyse on aminohappojen kokonaismäärästä glysiinin, alaniinin ja treoniinin osalta.

—	20 % suuremmasta tuloksesta, kun kyse on aminohappojen kokonaismäärästä lysiinin, proliinin, fenyylialaniinin, metioniinin ja asparagiinihapon osalta.

—	22 % suuremmasta tuloksesta, kun kyse on aminohappojen kokonaismäärästä glutamiinihapon ja leusiinin osalta.

—	27 % suuremmasta tuloksesta, kun kyse on aminohapon arginiini kokonaismäärästä.

—	32 % suuremmasta tuloksesta, kun kyse on aminohapon isoleusiini kokonaismäärästä.

—	35 % suuremmasta tuloksesta, kun kyse on aminohappojen kokonaismäärästä valiinin ja seriinin osalta.

—	40 % suuremmasta tuloksesta, kun kyse on aminohapon histidiini kokonaismäärästä.

—	50 % suuremmasta tuloksesta, kun kyse on aminohapon kyst(e)iini kokonaismäärästä.

F.   TRYPTOFAANIN MÄÄRITYS

Tryptofaanin määritykseen käytettävät menetelmät ovat

—	EN ISO 13904 -standardi (Animal feeding stuffs – Determination of tryptophan content), joka koskee tryptofaanipitoisuuden määritystä rehusta

—	jäljempänä 1–9 kohdassa kuvattu määritysmenetelmä.

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmän avulla voidaan määrittää rehuissa olevan tryptofaanin kokonaismäärä ja vapaan tryptofaanin määrä. Menetelmällä ei voi erottaa D- ja L-muotoja toisistaan.

2.   Periaate

Tryptofaanin kokonaismäärän määrittämiseksi näyte hydrolysoidaan kyllästetyllä bariumhydroksidiliuoksella emäksisissä olosuhteissa ja kuumennetaan 110 °C:ssa 20 tuntia. Hydrolyysin jälkeen lisätään sisäinen standardi.

Vapaan tryptofaanin määrittämiseksi näytettä uutetaan lievästi happamissa olosuhteissa yhdessä sisäisen standardin kanssa.

Tryptofaani ja sisäinen standardi hydrolysaatissa tai uutteessa määritetään HPLC:llä käyttäen fluoresenssidetektoria.

3.   Reagenssit

3.1

Veden on oltava kaksoistislattua tai vastaavan laatuista (johtokyky < 10 μS/cm).

3.2

Standardiyhdiste: tryptofaani (puhtaus/pitoisuus ≥ 99 %), kuivattu tyhjiössä fosforipentoksidin päällä.

3.3

Sisäinen standardi: α-metyylitryptofaani (puhtaus/pitoisuus ≥ 99 %), kuivattu tyhjiössä fosforipentoksidin päällä.

3.4

Bariumhydroksidioktahydraatti (on varottava, ettei Ba(OH)2 8 H2O joudu liiaksi kosketuksiin ilman kanssa; tällöin muodostuisi BaCO3:a, joka voi häiritä määritystä) (ks. huomautus 9.3).

3.5

Natriumhydroksidi.

3.6

Ortofosforihappo, w (w/w) = 85 %

3.7

Kloorivetyhappo, ρ20 1,19 g/ml.

3.8

Metanoli, HPLC-laatua vastaava.

3.9

Petrolieetteri, kiehumislämpötila 40–60 °C.

3.10

Natriumhydroksidiliuos, c = 1 mol/l: Liuotetaan 40,0 g NaOH:ta (3.5) veteen ja täytetään 1 litraksi vedellä (3.1).

3.11

Kloorivetyhappo, c = 6 mol/l: Mitataan 492 ml HCl:ää (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.12

Kloorivetyhappo, c = 1 mol/l: Mitataan 82 ml HCl:ää (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.13

Kloorivetyhappo, c = 0,1 mol/l: Mitataan 8,2 ml HCl:ää (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.14

Ortofosforihappo, c = 0,5 mol/l: Mitataan 34 ml ortofosforihappoa (3.6) ja täytetään 1 litraksi vedellä (3.1).

3.15

Väkevä tryptofaaniliuos (3.2), c = 2,50 μmol/ml: Liuotetaan 500 ml:n mittapullossa 0,2553 g tryptofaania (3.2) kloorivetyhappoon (3.13) ja täytetään merkkiin asti kloorivetyhapolla (3.13). Säilyy –18 °C:ssa enintään 4 viikkoa.

3.16

Konsentroitu sisäisen standardin liuos, c = 2,50 μmol/ml: Liuotetaan 500 ml:n mittapullossa 0,2728 g α-metyylitryptofaania (3.3) kloorivetyhappoon (3.13) ja täytetään merkkiin asti kloorivetyhapolla (3.13). Säilyy –18 °C:ssa enintään 4 viikkoa.

3.17

Tryptofaanin ja sisäisen standardin kalibrointistandardiliuos: Mitataan 2,00 ml konsentroitua tryptofaaniliuosta (3.15) ja 2,00 ml konsentroitua sisäisen standardin (α-metyylitryptofaanin) liuosta (3.16). Laimennetaan vedellä (3.1) ja metanolilla (3.8) siten, että liuoksen tilavuus ja metanolipitoisuus on suunnilleen sama kuin valmiin hydrolysaatin (metanolia 10–30 %). Tämä liuos on valmistettava juuri ennen käyttöä. Liuos suojataan suoralta auringonvalolta valmistuksen aikana.

3.18

Etikkahappo.

3.19

1,1,1-Trikloori-2-metyyli-2-propanoli.

3.20

Etanoliamiini w (w/w) > 98 %.

3.21

Liuos, jossa on 1 g 1,1,1-trikloori-2-metyyli-2-propanolia (3.19) 100 ml:ssa metanolia (3.8).

3.22

HPLC:ssä käytettävä liikkuva faasi: 3,00 g etikkahappoa (3.18) + 900 ml vettä (3.1) + 50,0 ml liuosta (3.21), jossa on 1,1,1-trikloori-2-metyyli-2-propanolia (3.19) metanolissa (3.8) (1 g / 100 ml). pH säädetään arvoon 5,00 etanoliamiinilla (3.20). Täytetään 1 000 ml:ksi vedellä (3.1).

4.   Välineistö

4.1

HPLC-laitteisto, jossa on spektrofluorimetri-detektori.

4.2

Nestekromatografiakolonni, 125 mm × 4 mm, C18, hartsin (pakkausaineen) hiukkaskoko 3 μm, tai vastaava.

4.3

pH-mittari.

4.4

Polypropyleenipullo, tilavuus 125 ml, jossa on leveä kaula ja kierretulppa.

4.5

Kalvosuodatin, 0,45 μm.

4.6

Autoklaavi, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar.

4.7

Mekaaninen ravistelija tai magneettisekoitin.

4.8

Vortex-sekoitin.

5.   Menettely

5.1   Näytteiden valmistaminen

Näyte jauhetaan siten, että se läpäisee 0,5 mm:n seulan. Näytteet, joiden kosteuspitoisuus on suuri, on ilmakuivattava enintään 50 °C:ssa tai pakastekuivattava ennen jauhamista. Näytteet, joiden rasvapitoisuus on suuri, on uutettava petrolieetterillä (3.9) ennen jauhamista.

5.2   Vapaan tryptofaanin määritys (uutteesta)

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella sopiva määrä (1–5 g) valmistettua näytettä (5.1) erlenmeyerkolviin. Lisätään 100,0 ml kloorivetyhappoa (3.13) ja 5,00 ml konsentroitua sisäisen standardin liuosta (3.16). Ravistellaan tai sekoitetaan 60 minuuttia mekaanisella ravistelijalla tai magneettisekoittimella (4.7). Annetaan sakan laskeutua ja pipetoidaan 10,0 ml supernatanttiliuosta dekantterilasiin. Lisätään 5 ml ortofosforihappoa (3.14). Säädetään pH arvoon 3 natriumhydroksidilla (3.10). Lisätään metanolia (3.8) niin että lopputilavuudessa on 10–30 prosenttia metanolia. Siirretään liuos sopivankokoiseen mittapulloon ja laimennetaan vedellä sopivaan tilavuuteen kromatografiaa varten (suunnilleen sama tilavuus kuin kalibrointistandardiliuoksella (3.17)).

Suodatetaan muutama ml liuosta 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.5) läpi ennen HPLC-kolonniin injektointia. Siirrytään kromatografiavaiheeseen 5.4 kohdan mukaisesti.

Standardiliuos ja uutteet suojataan suoralta auringonvalolta. Jos näyteliuoksia ei voida analysoida samana päivänä, uutteita voi säilyttää 5 °C:ssa enintään 3 päivää.

5.3   Tryptofaanin kokonaismäärän määritys (hydrolysaatista)

Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella 0,1–1 g valmistettua näytettä (5.1) polypropyleenipulloon (4.4). Punnitun näytemäärän typpipitoisuuden on oltava noin 10 mg. Lisätään 8,4 g bariumhydroksidioktahydraattia (3.4) ja 10 ml vettä. Sekoitetaan vortex-sekoittimella (4.8) tai magneettisekoittimella (4.7). Teflon-päällystetty magneetti jätetään seokseen. Huuhdotaan pullon seinämät 4 ml:lla vettä. Pullo suljetaan löyhästi kierrekorkilla. Pullo pannaan autoklaaviin (4.6), jossa on kiehuvaa vettä, ja autoklavoidaan 30–60 minuutin ajan. Suljetaan autoklaavi ja autoklavoidaan 110 (± 2) °C:ssa 20 tuntia.

Lämpötila on laskettava juuri alle 100 °C:een ennen kuin autoklaavi avataan. Jotta Ba(OH)2.8 H2O ei kiteytyisi, lämpimään seokseen lisätään 30 ml huoneenlämpöistä vettä. Ravistellaan tai sekoitetaan varovasti. Lisätään 2,00 ml konsentroitua sisäisen standardin liuosta (α-metyylitryptofaania, 3.16). Jäähdytetään pulloja vesi/jäähauteessa 15 minuuttia.

Lisätään 5 ml ortofosforihappoa (3.14). Pullo pidetään jäähdytyshauteessa ja liuos neutraloidaan HCl:llä (3.11) sekoittaen samalla, ja pH säädetään arvoon 3,0 HCl:llä (3.12). Lisätään metanolia niin että lopputilavuudessa on 10–30 prosenttia metanolia. Siirretään liuos sopivankokoiseen mittapulloon ja laimennetaan vedellä tiettyyn sopivaan tilavuuteen kromatografiaa varten (esim. 100 ml). Metanolin lisääminen ei saa aiheuttaa saostumista.

Suodatetaan muutama ml liuosta 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.5) läpi ennen HPLC-kolonniin injektointia. Siirrytään kromatografiavaiheeseen 5.4 kohdan mukaisesti.

Standardiliuos ja hydrolysaatit suojataan suoralta auringonvalolta. Jos hydrolysaatteja ei voida analysoida samana päivänä, niitä voi säilyttää 5 °C:ssa enintään 3 päivää.

5.4   HPLC-määritys

Seuraavat isokraattisen erotuksen olosuhteet ovat ohjeellisia; ajo voidaan suorittaa muissa olosuhteissa, jos niillä saadaan samanlaiset tulokset (ks. myös huomautukset 9.1 ja 9.2):

Nestekromatografia- kolonni (4.2):	125 mm × 4 mm, C18, hiukkaskoko 3 μm, tai vastaava
Kolonnin lämpötila:	huoneenlämpötila
Liikkuva faasi (3.22):	3,00 g etikkahappoa (3.18) + 900 ml vettä (3.1) + 50,0 ml liuosta (3.21), jossa on 1,1,1-trikloori-2-metyyli-2-propanolia (3.19) metanolissa (3.8)(1 g/100 ml). Säädetään pH arvoon 5,00 etanoliamiinilla (3.20). Täytetään 1 000 ml:ksi vedellä (3.1).
Virtausnopeus:	1 ml/min
Kokonaisajoaika:	noin 34 min
Detektioaallonpituus:	eksitaatio: 280 nm, emissio: 356 nm
Injektiotilavuus:	20 μl

6.   Tulosten laskeminen

Lasketaan tryptofaanin määrä (X) grammoina 100 grammassa näytettä.

A	=	sisäisen standardin piikin pinta-ala, kalibrointistandardiliuos (3.17)
B	=	tryptofaanin piikin pinta-ala, uute (5.2) tai hydrolysaatti (5.3)
V1	=	kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn konsentroidun tryptofaaniliuoksen (3.15) tilavuus ml (2 ml)
c	=	kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn konsentroidun tryptofaaniliuoksen (3.15) pitoisuus μmol/ml (= 2,50)
V2	=	uuttovaiheessa (5.2) lisätyn (= 5,00 ml) tai hydrolysaattiin (5.3) lisätyn (= 2,00 ml) konsentroidun sisäisen standardiliuoksen (3.16) tilavuus ml
C	=	sisäisen standardin piikin pinta-ala, uute (5.2) tai hydrolysaatti (5.3)
D	=	tryptofaanin piikin pinta-ala, kalibrointistandardiliuos (3.17)
V3	=	kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn konsentroidun sisäisen standardiliuoksen (3.16) tilavuus ml (= 2,00 ml)
m	=	näytteen paino grammoina (korjataan alkuperäiseen painoon, jos kuivattu ja/tai rasva poistettu)
M	=	tryptofaanin molekyylipaino (= 204,23 g/mol).

7.   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin 10 prosenttia suuremmasta tuloksesta.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

Järjestetyssä EU-vertailussa (4. vertailututkimus) 12 laboratoriota analysoi kolme näytettä hydrolyysimenetelmän varmentamiseksi. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä. Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa.

	Näyte 1 Sian rehu	Näyte 2 Sian rehu, johon on lisätty L-tryptofaania	Näyte 3 Sian rehutiiviste
L	12	12	12
n Keskiarvo [g/kg]	50 2,42	55 3,40	50 4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [%]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVR [%]	6,3	6,0	2,2
L = laboratorioiden lukumäärä n = keskiarvoon mukaan otettujen yksittäisten tulosten lukumäärä, kun on poistettu poikkeavat arvot (tunnistettu Cochranin ja Dixonin poikkeavien arvojen testillä) sr = toistettavuuden keskihajonta SR = uusittavuuden keskihajonta r = toistettavuus R = uusittavuus CVr = toistettavuuden variaatiokerroin, % CVR = uusittavuuden variaatiokerroin, %.

Toisessa EU-vertailussa (3. vertailututkimus) 13 laboratoriota analysoi kaksi näytettä vapaan tryptofaanin uuttomenetelmän varmentamiseksi. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä. Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa.

	Näyte 4 Vehnä-soijaseos	Näyte 5 Vehnä-soijaseos (= näyte 4), johon on lisätty tryptofaania (0,457 g/kg)
L n	12 55	12 60
Keskiarvo [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [%]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [%]	4,71	5,11
L = laboratorioiden lukumäärä n = keskiarvoon mukaan otettujen yksittäisten tulosten lukumäärä, kun on poistettu poikkeavat arvot (tunnistettu Cochranin ja Dixonin poikkeavien arvojen testillä) sr = toistettavuuden keskihajonta SR = uusittavuuden keskihajonta r = toistettavuus R = uusittavuus CVr = toistettavuuden variaatiokerroin, % CVR = uusittavuuden variaatiokerroin, %.

Vielä järjestettiin EU-vertailututkimus, jossa seitsemän laboratoriota analysoi neljä näytettä, tarkoituksena tryptofaanin varmentaminen hydrolyysissä. Tulokset esitetty seuraavassa taulukossa. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä.

	Näyte 1 Sikarehuseos (CRM 117)	Näyte 2 Vähärasvainen kalajauho (CRM 118)	Näyte 3 Soijajauho (CRM 119)	Näyte 4 Rasvaton maitojauhe (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Keskiarvo [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [%]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [%]	1,48	4,69	4,11	4,22
L = laboratorioiden lukumäärä n = keskiarvoon mukaan otettujen yksittäisten tulosten lukumäärä, kun on poistettu poikkeavat arvot (tunnistettu Cochranin ja Dixonin poikkeavien arvojen testillä) sr = toistettavuuden keskihajonta SR = uusittavuuden keskihajonta r = toistettavuus R = uusittavuus CVr = toistettavuuden variaatiokerroin, % CVR = uusittavuuden variaatiokerroin, %.

9.   Huomautukset

9.1

Seuraavilla erityisillä kromatografiaolosuhteilla voidaan erottaa paremmin tryptofaani ja α-metyylitryptofaani. Isokraattinen erotus, jonka jälkeen kolonni puhdistetaan gradienteilla: Nestekromatografiakolonni: 125 mm × 4 mm, C18, hiukkaskoko 5 μm, tai vastaava Kolonnin lämpötila: 32 °C Liikkuva faasi: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanoli, 95 + 5 (V+V). B: Metanoli. Gradientti: 0 min 100 % A 15 min 100 % A 17 min 60 % A 19 min 60 % A 21 min 100 % A 33 min 100 % A Virtausnopeus: 1,2 ml/min Kokonaisajoaika: noin 33 min.

9.2

Kromatografia vaihtelee HPLC-laitetyypin ja käytetyn kolonnin täytemateriaalin mukaan. Valitun järjestelmän on pystyttävä erottamaan tryptofaanin piikki ja sisäisen standardin piikki pohjaviivalle asti. Lisäksi on tärkeää, että hajoamistuotteet eroavat hyvin tryptofaanista ja sisäisestä standardista. Hydrolysaatteja on ajettava myös ilman sisäistä standardia, jotta voidaan tarkistaa epäpuhtauksien esiintyminen sisäisen standardin kohdalla olevan pohjaviivan avulla. On tärkeää, että ajoaika on riittävän pitkä, jotta kaikki hajoamistuotteet eluoituvat; myöhään eluoituvat piikit saattavat muuten häiritä myöhempiä kromatografia-ajoja. Kromatografiajärjestelmän vasteen on oltava lineaarinen toiminta-alueella. Lineaarinen vaste on mitattava sisäisen standardin vakiopitoisuudella (normaalilla pitoisuudella) ja erilaisilla tryptofaanipitoisuuksilla. On tärkeää, että sekä tryptofaanin että sisäisen standardin piikkien koot ovat HPLC-fluoresenssijärjestelmän lineaarisella alueella. Jos joko tryptofaanin ja/tai sisäisen standardin piikki on liian pieni tai liian suuri (piikit ovat liian pienet tai suuret), analyysi on toistettava käyttäen erilaista näytemäärää ja/tai muuttaen lopputilavuutta.

9.3   Bariumhydroksidi

Bariumhydroksidi tulee vanhetessaan vaikealiukoisemmaksi. HPLC-määritystä varten tehty liuos voi sen vuoksi olla samea, minkä vuoksi voidaan saada alhaisia tryptofaanituloksia.

G.   RAAKARASVAN JA RAAKAÖLJYN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä määritetään rehuissa olevan raakarasvan ja -öljyn määrä.

Jäljempänä kuvattavan kahden menettelytavan käyttö riippuu rehun luonteesta ja koostumuksesta sekä määrityksen käyttötarkoituksesta.

Raakarasvan ja raakaöljyn määrittämiseen öljysiemenistä ja öljypitoisista hedelmistä sekä rehusta, jonka raakarasva-/raakaöljypitoisuus on yli 15 prosenttia, tulisi uutto tehdä menettelytavan A mukaisesti ja uudelleen uutto menettelytavan B mukaisesti (5.3).

1.1   Menettelytapa A – Suoraan uutettavissa oleva raakarasva ja -öljy

Tätä menetelmää voidaan käyttää kasviperäisiin rehuaineisiin lukuun ottamatta niitä, jotka kuuluvat menettelytavan B soveltamisalaan.

1.2   Menettelytapa B – Raakarasvan ja -öljyn kokonaismäärä

Menetelmää voidaan soveltaa eläinperäisiin rehuaineisiin sekä kaikkiin rehuseoksiin. Sitä käytetään kaikkiin sellaisiin aineisiin, joista rasvaa ja öljyä ei voida täysin uuttaa ilman sitä edeltävää hydrolysointia (esim. gluteeni, hiiva, perunaproteiinit ja tuotteet, joita on käsitelty muun muassa ekstrudoimalla, kuumentamalla tai hiutaleiksi tekemällä).

1.3   Tulosten tulkitseminen

Aina, kun menettelytapaa B käyttäen saadaan suurempi tulos kuin menettelytapaa A käyttäen, menettelytavalla B saatua tulosta pidetään todellisena arvona.

2.   Periaate

2.1   Menettelytapa A

Näyte uutetaan petrolieetterillä. Liuotin tislataan pois ja jäännös kuivataan ja punnitaan.

2.2   Menettelytapa B

Näyte käsitellään kuumentamalla sitä kloorivetyhapon kanssa. Seos jäähdytetään ja suodatetaan. Jäännös pestään ja kuivataan ja määritystä jatketaan menettelytavan A mukaisesti.

3.   Reagenssit

3.1

Petrolieetteri, kiehumislämpötila: 40–60 °C. Bromiluvun on oltava alle 1 ja haihdutusjäännöksen alle 2 mg/100 ml.

3.2

Natriumsulfaatti, vedetön.

3.3

Kloorivetyhappo, c = 3 mol/l.

3.4

Suodatuksen apuaine, esim. Kieselgur, Hyflo-supercel.

4.   Välineistö

4.1

Uuttolaitteisto. Jos käytetään Soxhlet-laitteistoa (jossa on sifoni), refluksointinopeuden on oltava sellainen, että Soxhlet-väliosan täyttyminen liuottimella ja tyhjeneminen siitä tapahtuvat noin 10 kertaa tunnissa. Jos laitteistoon kuuluu suoramallinen väliosa, refluksointinopeuden on oltava noin 10 ml minuutissa.

4.2

Uuttohylsyjä, joissa ei ole petrolieetteriin liukenevaa materiaalia ja joiden huokoisuus täyttää 4.1 kohdassa esitetyt vaatimukset.

4.3

Lämpökaappi, joko vakuumikaappi, joka on säädetty 75 ± 3 °C:seen tai kiertoilmakaappi, joka on säädetty 100 ± 3 °C:seen.

5.   Menettely

5.1   Menettelytapa A (katso 8.1 kohta)

Näytettä punnitaan 5 g 1 mg:n tarkkuudella uuttohylsyyn (4.2) ja se peitetään rasvattomalla puuvillavanulla.

Hylsy asetetaan uuttolaitteeseen (4.1) ja sitä uutetaan kuusi tuntia petrolieetterillä (3.1). Petrolieetteriuute otetaan talteen kuivaan, punnittuun pulloon, joka sisältää kiehumakiviä (6).

Liuotin tislataan pois. Pullon ja sen sisältämän jäännöksen annetaan kuivua puolentoista tunnin ajan lämpökaapissa (4.3). Pullon jäännöksineen annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja se punnitaan. Kuivausta jatketaan edelleen 30 minuutin ajan sen varmistamiseksi, että rasvan ja öljyn paino pysyy vakiona (kahden peräkkäisen punnituksen välinen painoero saa olla enintään 1 mg).

5.2   Menettelytapa B

Näytettä punnitaan 2,5 g 1 mg:n tarkkuudella (ks. 8.2 kohta) 400 ml:n dekantterilasiin tai 300 ml:n erlenmeyerkolviin ja astiaan lisätään 100 ml kloorivetyhappoa (3.3) ja kiehumakiviä. Dekantterilasi peitetään kellonlasilla tai erlenmeyerkolvi yhdistetään palautusjäähdyttimeen. Seos saatetaan varovasti kiehuvaksi käyttäen pientä liekkiä tai sähkölevyä ja seoksen annetaan kiehua hiljalleen tunnin ajan. Näytteen tarttumista astian seinämiin tulee välttää.

Astian sisällön annetaan jäähtyä ja lisätään suodatuksen apuainetta (3.4) sen verran, ettei rasvaa ja öljyä häviä suodatuksessa. Suodatukseen käytetään kostutettua, rasvatonta, kaksinkertaista suodatinpaperia. Jäännös pestään kylmällä vedellä, kunnes saadaan neutraali suodos. Tarkastetaan, ettei suodos sisällä öljyä tai rasvaa. Jos sitä esiintyy, näyte on ennen hydrolysointia uutettava petrolieetterillä menettelytapaa A käyttäen.

Jäännöksen sisältävä kaksinkertainen suodatinpaperi asetetaan kellonlasille ja sen annetaan kuivua puolitoista tuntia 100 ± 3 °C:ssa lämpökaapissa (4.3).

Kuivan jäännöksen sisältävä kaksinkertainen suodatinpaperi pannaan uuttohylsyyn (4.2) ja peitetään rasvattomalla puuvillavanulla. Hylsy pannaan uuttolaitteeseen (4.1) ja määritystä jatketaan 5.1 kohdan toisessa ja kolmannessa kappaleessa esitetyllä tavalla.

5.3   Menettelytapa A ja uudelleen uutto menettelytavan B mukaisesti

Raakarasvan ja raakaöljyn määrittämiseen öljysiemenistä ja öljypitoisista hedelmistä sekä rehusta, jonka raakarasva-/raakaöljypitoisuus on yli 15 prosenttia, tulisi uutto tehdä menettelytavan A mukaisesti ja uudelleen uutto menettelytavan B mukaisesti.

Tämä tarkoittaa, että petrolieetterillä uuttamisen (menettelytapa A) jälkeen jäännös tai osa jäännöksestä uutetaan uudelleen kloorivetyhapolla (menettelytapa B). Raakarasvan ja -öljyn pitoisuus on menettelytapojen A ja B tuloksen summa.

6.   Tuloksen ilmoittaminen

Jäännöksen paino ilmoitetaan prosentteina näytteen painosta.

7.   Toistettavuus

Samasta näytteestä saman henkilön tekemän kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli:

—	0,2 %:a absoluuttisena arvona, kun raakarasva- ja -öljypitoisuus on alle 5 %,

—	4,0 %:a suhteellisena arvona suuremmasta tuloksesta, kun raakarasva- ja -öljypitoisuus on 5–10 %,

—	0,4 %:a absoluuttisena arvona, kun raakarasva- ja -öljypitoisuus on yli 10 %.

8.   Huomautukset

8.1

Runsaasti rasvaa ja öljyä sisältäviä tuotteita, joita on hankala jauhaa tai joista on vaikea saada homogeenista näytettä, käsitellään seuraavasti: Näytettä punnitaan 20 g 1 mg:n tarkkuudella ja siihen sekoitetaan vähintään 10 g vedetöntä natriumsulfaattia (3.2). Sitä uutetaan petrolieetterillä (3.1) 5.1 kohdassa esitetyllä tavalla. Saadun uutteen tilavuus täydennetään 500 ml:ksi petrolieetterillä (3.1) ja se sekoitetaan. Liuosta otetaan 50 ml ja kaadetaan pieneen, kuivaan, punnittuun pulloon, joka sisältää kiehumakiviä. Liuotin tislataan pois, jäännös kuivataan ja määritystä jatketaan 5.1 kohdan viimeisessä kappaleessa kuvatulla tavalla. Liuottimen annetaan haihtua hylsyssä olevasta uuttojäännöksestä, jäännös jauhetaan 1 mm raekokoon ja siirretään takaisin hylsyyn (lisäämättä natriumsulfaattia) ja määritystä jatketaan 5.1 kohdan toisessa ja kolmannessa kappaleessa kuvatulla tavalla. Rasvan ja öljyn pitoisuus prosentteina näytteestä lasketaan seuraavalla kaavalla: jossa: m1 = ensimmäisen uuton jälkeen saadun jäännöksen (määräosa uutteesta) paino grammoina, m2 = toisen uuton jälkeen saadun jäännöksen paino grammoina.

8.2

Joidenkin (esimerkiksi pieniä rasva- ja öljymääriä sisältävien) tuotteiden osalta näytteiden määrää voidaan nostaa.

8.3

Lemmikkieläinten ruokiin, joiden vesipitoisuus on suuri, voi olla tarvetta sekoittaa vedetöntä natriumsulfaattia ennen hydrolysointia ja uuttoa, joka suoritetaan menettelytavassa B kuvatulla tavalla.

8.4

Edellä 5.2 kohdassa voi olla tehokkaampaa käyttää kuumaa vettä kylmän veden sijaan jäännöksen pesemiseksi suodatuksen jälkeen.

8.5

Mainittua 1,5 tunnin kuivatusaikaa saatetaan joutua pidentämään joidenkin rehujen osalta. Liiallista kuivaamista on kuitenkin vältettävä, sillä se voi johtaa alhaisempiin tuloksiin. Myös mikroaaltouunia voidaan käyttää.

H.   RAAKAKUIDUN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehusta sen rasvaton orgaaninen aines, joka ei liukene happo- ja emäsliuoksen kanssa keitettäessä ja jota kutsutaan sovitusti raakakuiduksi.

Menetelmää ei voida soveltaa lignoselluloosan ja kasvihiilen tapauksessa (aines liian hienojakoista).

2.   Periaate

Näyte, josta tarvittaessa on poistettu rasva, käsitellään peräkkäin tietyn väkevyisillä kiehuvilla rikkihappo- ja kaliumhydroksidiliuoksilla. Jäännös erotetaan suodattamalla näyte lasisintterisuodattimella, se pestään, kuivataan, punnitaan ja poltetaan tuhkaksi 475–500 °C:ssa. Tuhkaamisesta aiheutuva painohäviö vastaa näytteen raakakuitupitoisuutta.

3.   Reagenssit

3.1

Rikkihappo, c = 0,13 mol/l.

3.2

Kuohunestoaine (esimerkiksi n-oktanoli).

3.3

Suodatuksen apuaine (Celite 545 tai vastaava), jota on kuumennettu 500 °C:n lämpötilassa neljän tunnin ajan (8.6).

3.4

Asetoni.

3.5

Petrolieetteri, kiehumislämpötila 40–60 °C.

3.6

Kloorivetyhappo, c = 0,5 mol/l.

3.7

Kaliumhydroksidiliuos, c = 0,23 mol/l.

4.   Välineistö

4.1

Lämmityslaitteisto rikkihappoliuoksella tai kaliumhydroksidiliuoksella tehtävään kuumauuttoon; lämmityslaitteistoon kuuluu suodatinupokkaan (4.2) jalusta ja letku, jossa on ilmanpoisto- ja tyhjennysventtiili; tarvittaessa laitteistoon saadaan paineilmaa. Ennen kutakin päivittäistä käyttöönottoa laitteisto esilämmitetään keittämällä siinä vettä viiden minuutin ajan.

4.2

Lasinen suodatinupokas, jossa on huokoisuudeltaan 40–90 μm:n lasisintterisuodatin. Ennen ensimmäistä käyttökertaa upokasta kuumennetaan 500 °C:ssa muutaman minuutin ajan ja jäähdytetään (8.6).

4.3

Vetoisuudeltaan vähintään 270 ml oleva sylinteri, jossa on kiehumisen kestävä palautusjäähdytin.

4.4

Termostaattisäätöinen lämpökaappi.

4.5

Termostaattisäätöinen muhveliuuni.

4.6

Uuttoyksikkö, johon kuuluu suodatinupokkaan jalusta (4.2) ja poistoletku, jossa on ilmanpoisto- ja tyhjennysventtiili.

4.7

Osia lämmityslaitteiston (4.1), upokkaan (4.2) ja sylinterin (4.3) kokoamiseen sekä kylmäuuttoyksikön (4.6) ja upokkaan liittämiseen.

5.   Menettely

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 1 g esikäsiteltyä näytettä upokkaaseen (4.2) (ks. huomautukset 9.1, 9.2 ja 9.3) ja lisätään 1 g suodatuksen apuainetta (3.3).

Liitetään suodatinupokas (4.2) lämmityslaitteistoon (4.1), ja tämän jälkeen liitetään sylinteri (4.3) upokkaaseen. Sylinteri-upokasyhdistelmä täytetään 150 ml:lla kiehuvaa rikkihappoa (3.1) ja tarvittaessa lisätään muutama pisara kuohunestoainetta (3.2).

Neste saatetaan kiehuvaksi 5 ± 2 minuutissa ja annetaan kiehua voimakkaasti tarkalleen 30 minuuttia.

Avataan poistoletkun venttiili (4.1), ja suodatetaan rikkihappo tyhjiössä suodatinupokkaan läpi ja pestään jäännös kolme kertaa peräkkäin 30 ml:lla kiehuvaa vettä huolehtien siitä, että jäännös suodatetaan kuivaksi jokaisen pesukerran jälkeen.

Suljetaan tyhjennysventtiili, kaadetaan 150 ml kiehuvaa kaliumhydroksidiliuosta (3.7) sylinteriupokasyhdistelmään ja lisätään muutama pisara kuohunestoainetta (3.2). Neste saatetaan kiehuvaksi 5 ± 2 minuutissa ja annetaan kiehua voimakkaasti tarkalleen 30 minuuttia. Suodatetaan ja toistetaan pesumenettelyt samalla tavoin kuin rikkihapon kanssa.

Viimeisen pesun ja kuivauksen jälkeen upokas sisältöineen irrotetaan ja upokas yhdistetään uudelleen kylmäuuttoyksikköön (4.6). Poistetaan ilma ja pestään jäännös upokkaassa kolme kertaa peräkkäin 25 ml:lla asetonia (3.4) huolehtien siitä, että jäännös kuivuu jokaisen pesukerran jälkeen.

Annetaan upokkaan kuivua vakiopainoon lämpökaapissa, jonka lämpötila on 130 °C. Jokaisen kuivauksen jälkeen jäähdytetään eksikkaattorissa ja punnitaan nopeasti. Upokas asetetaan muhveliuuniin, jossa näytteen annetaan palaa tuhkaksi vakiopainoon (kahden peräkkäisen punnituksen välinen painoero saa olla enintään 2 mg) 475–500 °C:ssa vähintään 30 minuuttia.

Jokaisen kuumennuksen jälkeen upokkaan annetaan jäähtyä ensin uunissa ja tämän jälkeen eksikkaattorissa ennen punnitusta.

Nollakoe suoritetaan ilman näytettä. Tuhkaamisesta johtuva painohäviö saa olla enintään 4 mg.

6.   Tulosten laskeminen

Raakakuitupitoisuus prosentteina näytteestä saadaan seuraavasti:

jossa:

m	=	näytteen paino grammoina,
m0	=	määrityksen aikana näytteen polttamisesta aiheutuva painohäviö grammoina,
m1	=	nollakokeessa polttamisesta aiheutuva painohäviö grammoina.

7.   Toistettavuus

Kahden samasta näytteestä suoritetun määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli:

—	0,6 %:a absoluuttisena arvona, kun raakakuitupitoisuus on alle 10 %,

—	6 %:a suhteellisena arvona suuremmasta tuloksesta, kun raakakuitupitoisuus on vähintään 10 %.

8.   Uusittavuus

Samasta näytteestä eri laboratorioissa tehdyn kahden määrityksen välinen ero ei saa olla suurempi kuin

—	1,0 %:a absoluuttisena arvona, kun raakakuitupitoisuus on alle 10 %,

—	10 %:a suhteellisena arvona suuremmasta tuloksesta, kun raakakuitupitoisuus on vähintään 10 %.

9.   Huomautukset

9.1

Rehuista, jotka sisältävät yli 10 prosenttia raakarasvaa, on rasva ennen määritystä poistettava petrolieetterillä (3.5). Liitetään suodatinupokas (4.2) sisältöineen kylmäuuttoyksikköön (4.6), poistetaan ilma ja pestään jäännös kolme kertaa 30 ml:lla petrolieetteriä; varmistetaan, että jäännös on kuiva. Yhdistetään upokas sisältöineen lämmityslaitteistoon (4.1) ja jatketaan 5 kohdassa esitetyllä tavalla.

9.2

Rehuista, jotka sisältävät öljyjä ja rasvoja, joita ei voida uuttaa suoraan petrolieetterillä (3.5), rasva on poistettava 8.1 kohdassa esitetyllä tavalla ja tämän jälkeen rasva on poistettava vielä uudelleen hapolla kiehuttamisen jälkeen. Hapolla kiehuttamisen ja sitä seuraavien pesujen jälkeen upokas sisältöineen yhdistetään kylmäuuttoyksikköön (4.6) ja jäännöstä pestään kolme kertaa 30 ml:lla asetonia ja tämän jälkeen kolme kertaa 30 ml:lla petrolieetteriä. Suodatetaan tyhjiössä kunnes jäännös on kuiva ja jatketaan määritystä kaliumhydroksidikäsittelyllä 5 kohdassa esitetyllä tavalla.

9.3

Jos näyte sisältää yli 5 prosenttia karbonaatteja kalsiumkarbonaattina ilmaistuna, upokas (4.2) yhdistetään punnittuine näytteineen lämmityslaitteistoon (4.1). Näyte pestään kolme kertaa 30 ml:lla kloorivetyhappoa (3.6). Jokaisen lisäämiskerran jälkeen odotetaan noin yksi minuutti ennen suodatuksen aloittamista. Näyte pestään kerran 30 ml:lla vettä ja tämän jälkeen jatketaan 5 kohdassa esitetyllä tavalla.

9.4

Jos käytetään telineenmuotoista laitteistoa (useita upokkaita on liitetty samaan lämmityslaitteistoon), kahta koetta samasta näytteestä ei saa suorittaa samalla kertaa.

9.5

Jos kiehuttamisen jälkeen happamien ja emäksisten liuosten suodatus osoittautuu vaikeaksi, käytetään lämmityslaitteiston tyhjennysletkun kautta annettavaa paineilmaa, minkä jälkeen jatketaan suodatusta.

9.6

Tuhkauslämpötila ei saa olla yli 500:aa °C lasisten suodatinupokkaiden käyttöiän pidentämiseksi. Kuumennus- ja jäähdytysjaksojen aikana on vältettävä suuria lämpötilanvaihteluita.

I.   SOKERIN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää pelkistävien sokerien ja kokonaissokerien määrä invertoinnin jälkeen glukoosina, tai tarvittaessa sakkaroosina käyttäen muunnoskerrointa 0,95. Menetelmä soveltuu rehuseoksiin. Muita rehuja varten on säädetty erityismenetelmistä. Laktoosi on tarvittaessa mitattava erikseen ja otettava huomioon tuloksia laskettaessa.

Menetelmää käytetään sokeripitoisuuden määrittämiseen rehun energiasisällön laskemista varten.

Jos sokeripitoisuus määritetään muuta tarkoitusta varten, voidaan käyttää muita määritysmenetelmiä.

2.   Periaate

Sokerit uutetaan laimeaan etanoliin ja liuos kirkastetaan Carrez-liuoksilla I ja II. Etanolin poiston jälkeen määritykset suoritetaan ennen invertointia ja sen jälkeen saadut Luff-Schoorl-menetelmällä.

3.   Reagenssit

3.1

Etanoli 40 % (v/v), tiheys: 0,948 g/ml 20 °C:ssa, neutraalia fenolftaleiinilla määritettynä.

3.2

Carrez-liuos I: liuotetaan veteen 21,9 g sinkkiasetaattia Zn(CH3COO)2 2H2O ja 3 g jääetikkaa. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.3

Carrez-liuos II: Liuotetaan veteen 10,6 g kaliumferrosyanidia K4Fe(CN)6 3H2O. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.4

Metyylioranssiliuos 0,1 % (w/v).

3.5

Kloorivetyhappo 4 mol/l.

3.6

Kloorivetyhappo 0,1 mol/l.

3.7

Natriumhydroksidiliuos 0,1 mol/l.

3.8

Luff-Schoorl-reagenssi: Kaadetaan sitruunahappoliuos (3.8.2) natriumkarbonaattiliuokseen (3.8.3) varovasti sekoittaen. Tämän jälkeen lisätään kuparisulfaattiliuos (3.8.1) ja täytetään 1 litraksi vedellä. Annetaan seistä yön yli ja suodatetaan. Näin saadun reagenssin (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l) konsentraatio tarkistetaan; ks. 5.4 kohdan viimeinen kappale. Liuoksen pH:n on oltava noin 9,4.

3.8.1

Kuparisulfaattiliuos: liuotetaan 25 g raudatonta kuparisulfaattia, CuSO4 5H2O, 100 ml:aan vettä.

3.8.2

Sitruunahappoliuos: liuotetaan 50 g sitruunahappoa, C6H8O7•H2O, 50 ml:aan vettä.

3.8.3

Natriumkarbonaattiliuos: liuotetaan 143,8 g vedetöntä natriumkarbonaattia noin 300 ml:aan lämmintä vettä. Annetaan jäähtyä.

3.9

Natriumtiosulfaattiliuos 0,1 mol/l.

3.10

Tärkkelysliuos: 5 g liukoista tärkkelystä lisätään 30 ml:aan vettä, seos lisätään 1 litraan kiehuvaa vettä. Keitetään kolme minuuttia, annetaan jäähtyä ja tarvittaessa lisätään 10 mg elohopeajodidia säilyteaineeksi.

3.11

Rikkihappo, 3 mol/l.

3.12

Kaliumjodidiliuos, 30 % (w/v).

3.13

Kiehumakiviä, jotka keitetään kloorivetyhapossa, pestään vedellä ja kuivataan.

3.14

3-metyylibutan-1-oli.

4.   Välineistö

Sekoitin: noin 35–40 kierr./min.

5.   Menettely

5.1   Näytteen uutto

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 2,5 g näytettä 250 ml:n mittapulloon. Lisätään 200 ml etanolia (3.1) ja sekoitetaan sekoittajassa yhden tunnin ajan. Lisätään 5 ml Carrez-liuosta I (3.2) ja sekoitetaan noin 30 sekunnin ajan. Lisätään 5 ml Carrez-liuosta II (3.3) ja sekoitetaan uudelleen yhden minuutin ajan. Täytetään pullo etanolilla (3.1), homogenoidaan ja suodatetaan. Otetaan 200 ml suodosta ja haihdutetaan se noin puoleen tilavuuteen, jotta saadaan poistetuksi suurin osa etanolista. Haihdutusjäännös siirretään kvantitatiivisesti 200 ml:n mittapulloon käyttäen lämmintä vettä, jäähdytetään, täytetään vedellä merkkiin asti, homogenoidaan ja suodatetaan tarvittaessa. Tätä liuosta käytetään pelkistävien sokerien määrittämiseksi ja invertointireaktion jälkeen kokonaissokerien määrittämiseksi.

5.2   Pelkistävien sokerien määritys

Pipetoidaan enintään 25 ml liuosta, joka sisältää alle 60 mg glukoosina ilmoitettuja pelkistäviä sokereita. Tarvittaessa tilavuus säädetään 25 ml:ksi tislatulla vedellä, ja pelkistävien sokerien pitoisuus määritetään Luff-Schoorl-menetelmällä. Tulos ilmoitetaan glukoosiprosenttina.

5.3   Kokonaissokerien määritys invertointireaktion jälkeen

Pipetoidaan 50 ml liuosta 100 ml:n mittapulloon. Lisätään muutama pisara metyylioranssiliuosta (3.4) ja tämän jälkeen lisätään varovasti ja jatkuvasti sekoittaen kloorivetyhappoa (3.5), kunnes neste muuttuu selvästi punaiseksi. Lisätään 15 ml kloorivetyhappoa (3.6), pullo upotetaan voimakkaasti kiehuvaan vesihauteeseen ja pidetään siinä 30 minuutin ajan. Jäähdytetään nopeasti noin 20 °C:seen ja lisätään 15 ml natriumhydroksidiliuosta (3.7). Tilavuus säädetään 100 ml:ksi vedellä ja homogenoidaan. Otetaan enintään 25 ml:n erä, joka sisältää alle 60 mg glukoosina ilmoitettuja pelkistäviä sokereita. Tarvittaessa tilavuus säädetään 25 ml:ksi tislatulla vedellä, ja pelkistävien sokerien pitoisuus määritetään Luff-Schoorl-menetelmällä. Tulos ilmoitetaan glukoosiprosenttina tai tarvittaessa sakkaroosina kertomalla kertoimella 0,95.

5.4   Titraus Luff-Schoorl-menetelmällä

Pipetoidaan 25 ml Luff-Schoorl-reagenssia (3.8) 300 ml:n erlenmeyerkolviin, lisätään tarkalleen 25 ml kirkastettua sokeriliuosta. Lisätään kaksi kiehumakiveä (3.13), lämmitetään keskikokoisen liekin yläpuolella käsin sekoittaen ja kuumennetaan neste kiehumapisteeseen noin kahdessa minuutissa. Erlenmeyerkolvi asetetaan välittömästi asbestiverkolle, jossa on noin 6 cm:n läpimittainen reikä ja verkon alla on etukäteen sytytetty liekki. Säädetään liekki sellaiseksi, että erlenmeyerkolvi kuumenee ainoastaan pohjastaan. Tämän jälkeen erlenmeyerkolviin kiinnitetään pystyjäähdytin. Keitetään tarkalleen 10 minuutin ajan. Jäähdytetään välittömästi kylmässä vedessä ja noin viiden minuutin kuluttua titrataan seuraavasti:

Lisätään 10 ml kaliumjodidiliuosta (3.12) ja välittömästi tämän jälkeen (varoen, koska liuos voi vaahdota runsaasti) lisätään 25 ml rikkihappoa (3.11). Titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella (3.9) kunnes väri muuttuu samean keltaiseksi, lisätään tärkkelysindikaattori (3.10) ja titraus suoritetaan loppuun.

Sama titraus suoritetaan liuoksesta, jossa on tarkasti mitattuna 25 ml Luff-Schoorl-reagenssia (3.8) ja 25 ml vettä, sen jälkeen kun 10 ml kaliumjodidiliuosta (3.12) ja 25 ml rikkihappoa (3.11) on lisätty kohottamatta lämpötilaa kiehumispisteeseen.

6.   Tulosten laskeminen

Oheisen taulukon avulla määritetään milligrammoissa se glukoosimäärä, joka vastaa näiden kahden titrauksen erotusta ilmaistuna millilitroina natriumtiosulfaattia, 0,1 mol/l. Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

7.   Menettely erityistapauksissa

7.1

Runsaasti melasseja sisältävistä rehuista ja rehuista, jotka eivät ole homogeenisia, punnitaan 20 g näyte 1 litran mittapulloon ja lisätään 500 ml vettä. Sekoitetaan 1 tunti sekoittajassa. Selkeytetään käyttäen Carrez-liuos I- (3.2) ja Carrez-liuos II (3.3) -reagensseja 5.1 kohdassa kuvatulla tavalla kuitenkin tällä kertaa käyttäen nelinkertaiset määrät kutakin reagenssia. Täytetään merkkiin asti 80-prosenttisella (v/v) etanolilla. Homogenoidaan ja suodatetaan. Poistetaan etanoli 5.1 kohdan mukaisesti. Jos yhtään dekstrinoitua tärkkelystä ei esiinny, täytetään merkkiin asti tislatulla vedellä.

7.2

Melassista ja runsaasti sokeria sisältävistä ja tärkkelysköyhistä rehuaineista (kuten johanneksenleipäpuun hedelmät, kuivatut sokerijuurikasleikkeet) punnitaan 5 gramman näyte 250 ml:n mittapulloon, lisätään 200 ml tislattua vettä ja sekoitetaan ravistelijassa yhden tunnin ajan tai tarvittaessa kauemmin. Kirkastetaan käyttäen Carrez-liuos I- (3.2) ja Carrez-liuos II (3.3) -reagensseja 5.1 kohdassa kuvatulla tavalla. Mittapullo täytetään vedellä merkkiin, liuos homogenoidaan ja suodatetaan. Kokonaissokerien määrän toteamiseksi suoritusta jatketaan 5.3 kohdan mukaisesti.

8.   Huomautukset

8.1

Vaahdonmuodostuksen estämiseksi on suositeltavaa lisätä noin 1 ml 3-metyylibutan-1-olia (3.14) (riippumatta tilavuudesta) ennen Luff-Schoorl-reagenssin kanssa keittämistä.

8.2

Invertoinnin jälkeen saadun glukoosina ilmoitetun kokonaissokeripitoisuuden ja glukoosina ilmoitetun pelkistävien sokerien pitoisuuden välisestä erosta 0,95:lla kerrottuna saadaan sakkaroosin prosentuaalinen pitoisuus.

8.3

Pelkistävien sokerien, paitsi laktoosin, pitoisuuden määrittämiseksi voidaan käyttää kahta menetelmää:

8.3.1

Likimääräisen arvion laskemiseksi laktoosipitoisuus, joka on saatu eri analyysimenetelmällä, kerrotaan 0,675:llä ja saatu tulos vähennetään pelkistävien sokerien pitoisuudesta.

8.3.2

Pelkistävien sokerien, paitsi laktoosin, määrän tarkkaa laskemista varten on tehtävä kaksi lopullista määritystä samasta näytteestä. Toinen määrityksistä suoritetaan liuokselle, joka saadaan osasta 5.1 kohdan mukaisesti saatua liuosta, ja toinen määrityksistä suoritetaan osasta liuosta, joka saadaan laktoosimäärityksen yhteydessä tähän tarkoitukseen kehitetyn menetelmän mukaisesti (sen jälkeen kun muut sokerit on fermentoitu ja liuos kirkastettu). Molemmissa tapauksissa sokerin määrä määritetään Luff-Schoorl-menetelmällä ja lasketaan milligrammoina glukoosia. Arvot vähennetään toisistaan ja erotus ilmoitetaan prosentteina näytteestä. Esimerkki Kaksi tilavuutta vastaa 250 mg:n näytteestä tehtyjä määrityksiä. Ensimmäisessä tapauksessa on kulunut 17 ml natriumtiosulfaattiliuosta, 0,1 mol/l, joka vastaa 44,2 mg:aa glukoosia; toisessa tapauksessa 11 ml, joka vastaa 27,6 mg:aa glukoosia. Erotus on 16,6 mg glukoosia. Pelkistävien sokerien, laktoosia lukuun ottamatta, glukoosina laskettu määrä on: Taulukko 25 ml:lle Luff-Schoorl-reagenssia Na2 S2 O3, 0,1 mol/l, millilitroina, kahden minuutin kuumennus, kymmenen minuutin keitto Na2 S2 O3 0,1 mol/l Glukoosi, fruktoosi, inverttisokerit C6 H12 O6 Laktoosi C12 H22 O11 Na2 S2 O3 0,1 mol/l ml mg erotus mg erotus ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

J.   LAKTOOSIN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää laktoosin pitoisuus rehuissa, jotka sisältävät yli 0,5 prosenttia laktoosia.

2.   Periaate

Sokerit liuotetaan veteen. Liuokselle suoritetaan fermentointi käyttäen Saccharomyces cerevisiae -hiivaa, joka ei kuluta laktoosia. Selkeyttämisen ja suodatuksen jälkeen määritetään suodoksen laktoosipitoisuus Luff-Schoorl-menetelmällä.

3.   Reagenssit

3.1

Saccharomyces cerevisiae -suspensio: suspendoidaan 25 g tuoretta hiivaa 100 ml:aan vettä. Suspensio säilyy jääkaapissa enintään yhden viikon ajan.

3.2

Carrez-liuos I: liuotetaan veteen 21,9 g sinkkiasetaattia Zn(CH3COO)2 2H2O ja 3 g jääetikkaa. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.3

Carrez-liuos II: Liuotetaan veteen 10,6 g kaliumferrosyanidia K4Fe(CN)6 3H2O. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.4

Luff-Schoorl-reagenssi: Kaadetaan sitruunahappoliuos (3.4.2) natriumkarbonaattiliuokseen (3.4.3) sekoittaen varovasti lisäyksen aikana. Tämän jälkeen lisätään kuparisulfaattiliuos (3.4.1) ja täytetään 1 litraksi vedellä. Annetaan seistä yön yli ja suodatetaan. Näin saadun reagenssin (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l) konsentraatio tarkistetaan. Liuoksen pH:n on oltava noin 9,4.

3.4.1

Kuparisulfaattiliuos: liuotetaan 25 g raudatonta kuparisulfaattia, CuSO4 5H2O, 100 ml:aan vettä.

3.4.2

Sitruunahappoliuos: liuotetaan 50 g sitruunahappoa, C6H8O7•H2O, 50 ml:aan vettä.

3.4.3

Natriumkarbonaattiliuos: liuotetaan 143,8 g vedetöntä natriumkarbonaattia noin 300 ml:aan lämmintä vettä. Annetaan jäähtyä.

3.5

Kiehumakiviä, jotka keitetään kloorivetyhapossa, pestään vedellä ja kuivataan.

3.6

Kaliumjodidiliuos, 30 % (w/v).

3.7

Rikkihappo, 3 mol/l.

3.8

Natriumtiosulfaattiliuos, 0,1 mol/l.

3.9

Tärkkelysliuos: 5 g liukoista tärkkelystä lisätään 30 ml:aan vettä, seos lisätään 1 litraan kiehuvaa vettä. Keitetään kolme minuuttia, annetaan jäähtyä ja tarvittaessa lisätään 10 mg elohopeajodidia säilyteaineeksi.

4.   Välineistö

Vesihaude, jonka termostaatti on säädetty 38–40 °C:seen.

5.   Menettely

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 1 g näytettä 100 ml:n mittapulloon. Lisätään 25–30 ml vettä. Pullo asetetaan kiehuvaan vesihauteeseen 30 minuutin ajaksi ja tämän jälkeen se jäähdytetään noin 35 °C:seen. Lisätään 5 ml hiivasuspensiota (3.1) ja homogenoidaan. Annetaan pullon seistä kaksi tuntia vesihauteessa 38–40 °C:n lämpötilassa. Jäähdytetään noin 20 °C:seen.

Lisätään 2,5 ml Carrez-liuosta I (3.2) ja sekoitetaan 30 sekuntia, tämän jälkeen lisätään 2,5 ml Carrez-liuosta II (3.3) ja sekoitetaan uudelleen 30 sekuntia. Täytetään 100 ml:ksi vedellä, sekoitetaan ja suodatetaan. Suodosta pipetoidaan 300 ml:n erlenmeyerkolviin sellainen määrä (korkeintaan 25 ml), joka sisältää 40–80 mg laktoosia. Tarvittaessa täytetään vedellä 25 ml:ksi.

Nollakoe suoritetaan samalla tavoin käyttäen 5 ml hiivasuspensiota (3.1). Laktoosimäärä määritetään Luff-Schoorlin mukaan seuraavasti. Lisätään tarkalleen 25 ml Luff-Schoorl-reagenssia (3.4) ja kaksi kiehumakiveä (3.5). Lämmitetään keskikokoisen liekin yläpuolella käsin ravistellen ja kuumennetaan neste kiehumispisteeseen noin kahdessa minuutissa. Erlenmeyerkolvi asetetaan välittömästi asbestiverkolle, jossa on noin 6 cm:n läpimittainen reikä ja verkon alla on etukäteen sytytetty liekki. Säädetään liekki sellaiseksi, että erlenmeyerkolvi kuumenee ainoastaan pohjastaan. Tämän jälkeen erlenmeyerkolviin kiinnitetään pystyjäähdytin. Keitetään tarkalleen 10 minuutin ajan. Jäähdytetään välittömästi kylmässä vedessä ja noin viiden minuutin kuluttua titrataan seuraavasti:

Lisätään 10 ml kaliumjodidiliuosta (3.6) ja välittömästi tämän jälkeen (varovasti, koska liuos voi vaahdota voimakkaasti) lisätään 25 ml rikkihappoa (3.7). Titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella (3.8) kunnes väri muuttuu samean keltaiseksi, lisätään tärkkelysindikaattori (3.9) ja titraus suoritetaan loppuun.

Sama titraus suoritetaan liuoksesta, johon pipetoidaan tarkalleen mitattuna 25 ml Luff-Schoorl-reagenssia (3.4) ja 25 ml vettä, sen jälkeen kun 10 ml kaliumjodidiliuosta (3.6) ja 25 ml rikkihappoa (3.7) on lisätty ilman keittämistä.

6.   Tulosten laskeminen

Oheisen taulukon avulla määritetään milligrammoina se laktoosimäärä, joka vastaa näiden kahden titraustuloksen erotusta ilmaistuna natriumtiosulfaattia, 0,1 mol/l, millilitroissa.

Tulos ilmoitetaan vedettömän laktoosin prosentteina näytteestä.

7.   Huomautus

1.

Yli 40 prosenttia fermentoituvaa sokeria sisältäville tuotteille käytetään yli 5 ml hiivasuspensiota (3.1).

2.

Tuotteissa, joissa laktoosin määrää on vähennetty (esim. kissanmaito), laktoosi on muunnettu fruktoosiksi, joka ei fermentoidu täysin kahdessa tunnissa, mikä johtaa korkeampiin tai virheellisesti positiivisiin tuloksiin (koska uutteessa on jäljellä fruktoosin jäämiä). Taulukko 25 ml:lle Luff-Schoorl-reagenssia Na2 S2 O3, 0,1 mol/l, millilitroina, kahden minuutin kuumennus, kymmenen minuutin keitto Na2 S2 O3 0,1 mol/l Glukoosi, fruktoosi, inverttisokerit C6 H12 O6 Laktoosi C12 H22 O11 Na2 S2 O3 0,1 mol/l ml mg erotus mg erotus ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   TÄRKKELYKSEN MÄÄRITYS

POLARIMETRINEN MENETELMÄ

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää tärkkelyksen ja tärkkelyksen suurimolekyylisten pilkkoutumistuotteiden pitoisuus rehuissa tarkoituksena todeta, onko niiden ilmoitettu energiamäärä liitteen VII mukainen ja ovatko ne asetuksen (EY) N:o 767/2009 säännösten mukaisia.

Menetelmää käytetään tärkkelyspitoisuuden määrittämiseen rehun energiasisällön laskemista varten.

Jos tärkkelyspitoisuus määritetään muuta tarkoitusta varten, voidaan käyttää muita määritysmenetelmiä.

2.   Periaate

Menetelmä perustuu kahteen määritykseen. Ensimmäisessä määrityksessä näyte käsitellään laimealla kloorivetyhapolla. Kun liuos on saatu kirkkaaksi ja suodatettu, liuoksen optinen kiertokyky mitataan polarimetrisesti.

Toisessa määrityksessä näyte uutetaan 40-prosenttisella etanolilla. Kun suodos on tehty happamaksi kloorivetyhapolla ja se on saatu kirkkaaksi ja suodatettu, optinen kiertokyky mitataan kuten ensimmäisessä määrityksessä.

Kun näiden kahden mittauksen erotus kerrotaan tunnetulla kertoimella, saadaan näytteen tärkkelyspitoisuus.

3.   Reagenssit

3.1

Kloorivetyhappoliuos 25 % (w/w) tiheys: 1,126 g/ml.

3.2

Kloorivetyhappoliuos 1,13 % (w/v) Konsentraatio on tarkistettava titraamalla natriumhydroksidiliuoksella 0,1 mol/l, indikaattorina 0,1 % (w/v) metyylipuna 94 % (v/v) etanolissa. 10 ml:n neutralointiin tarvitaan 30,94 ml NaOH:ta, 0,1 mol/l.

3.3

Carrez-liuos I: liuotetaan veteen 21,9 g sinkkiasetaattia Zn(CH3COO)2 2H2O ja 3 g jääetikkaa. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.4

Carrez-liuos II: Liuotetaan veteen 10,6 g kaliumferrosyanidia K4Fe(CN)6 3H2O. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.5

Etanoli 40 % (v/v), tiheys: 0,948 g/ml 20 °C:ssa.

4.   Välineistö

4.1

250 ml:n vakiohioksellinen erlenmeyerkolvi, jossa on palautusjäähdytin.

4.2

Polarimetri tai sakkarimetri.

5.   Menettely

5.1   Näytteen valmistaminen

Näyte jauhetaan niin hienoksi, että se läpäisee kokonaan 0,5 mm:n pyöreäreikäisen seulan.

5.2   Optisen kokonaiskiertokyvyn (P tai S) määritys (ks. huomautus 7.1)

Punnitaan 2,5 g hienoksi jauhettua näytettä 1 mg:n tarkkuudella 100 ml:n mittapulloon. Lisätään 25 ml kloorivetyhappoa (3.2), ravistellaan kunnes näyte on jakaantunut tasaisesti, sen jälkeen lisätään vielä 25 ml kloorivetyhappoa (3.2). Pullo pannaan kiehuvaan vesihauteeseen ja sitä ravistellaan voimakkaasti ja yhtäjaksoisesti ensimmäisten kolmen minuutin ajan kokkaroitumisen estämiseksi. Vesihauteen vesimäärän on oltava riittävän suuri, jotta haude pysyy kiehuvana kun pullo upotetaan siihen. Pulloa ravisteltaessa sitä ei saa ottaa pois hauteesta. Tarkalleen 15 minuutin kuluttua pullo otetaan hauteesta, lisätään 30 ml kylmää vettä ja jäähdytetään välittömästi 20 °C:een.

Lisätään 5 ml Carrez-liuosta I (3.3) ja ravistellaan noin 30 sekunnin ajan. Lisätään 5 ml Carrez-liuosta II (3.4) ja ravistellaan uudestaan 30 sekunnin ajan. Täytetään merkkiin asti vedellä, sekoitetaan ja suodatetaan. Jos suodos ei ole täysin kirkas (mikä tapahtuu harvoin), määritys uusitaan käyttäen suurempaa määrää Carrez-liuoksia I ja II (esimerkiksi 10 ml).

Liuoksen optinen kiertokyky mitataan 200 mm:n putkessa polarimetrillä tai sakkarimetrillä.

5.3   40-prosenttiseen etanoliin liukoisten yhdisteiden optisen kiertokyvyn (P’ tai S’) määritys

Punnitaan 5 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 100 ml:n mittapulloon ja lisätään noin 80 ml etanolia (3.5) (ks. huomautus 7.2). Mittapullon annetaan seistä yhden tunnin ajan huoneenlämmössä; tänä aikana sitä ravistellaan voimakkaasti kuusi kertaa siten, että näyte sekoittuu perusteellisesti etanoliin. Täytetään merkkiin asti etanolilla (3.5), sekoitetaan ja suodatetaan.

Pipetoidaan 50 ml suodosta (vastaa 2,5:tä grammaa näytettä) 250 ml:n erlenmeyerkolviin, lisätään 2,1 ml kloorivetyhappoa (3.1) ja ravistellaan voimakkaasti. Erlenmeyerkolviin kiinnitetään palautusjäähdytin ja kolvi pannaan kiehuvaan vesihauteeseen. Tarkalleen 15 minuutin kuluttua erlenmeyerkolvi otetaan hauteesta ja liuos siirretään 100 ml:n mittapulloon huuhtomalla pienellä määrällä kylmää vettä ja jäähdytetään 20 °C:een.

Tämän jälkeen näyteliuos tehdään kirkkaaksi Carrez-liuoksilla I (3.3) ja II (3.4), täytetään merkkiin vedellä, sekoitetaan, suodatetaan ja mitataan optinen kiertokyky 5.2 kohdan toisessa ja kolmannessa alakohdassa esitetyllä tavalla.

6.   Tulosten laskeminen

Tärkkelyspitoisuus (%) lasketaan seuraavalla tavalla:

6.1   Polarimetriset mittaukset

P	=	optinen kokonaiskiertokyky asteina
P’	=	40-prosenttiseen etanoliin (V/V) liukoisten yhdisteiden optinen kiertokyky asteina
	=	puhtaan tärkkelyksen ominaiskiertokyky. Tälle on sovittu seuraavat numeeriset arvot:

+ 185,9°	:	riisitärkkelys
+ 185,7°	:	perunatärkkelys
+ 184,6°	:	maissitärkkelys
+ 182,7°	:	vehnätärkkelys
+ 181,5°	:	ohratärkkelys
+ 181,3°	:	kauratärkkelys
+ 184,0°	:	muut tärkkelyslajit sekä tärkkelysseokset rehuseoksissa.

6.2   Sakkarimetriset mittaukset

S	=	optinen kokonaiskiertokyky sakkarimetrin asteina
S’	=	40-prosenttiseen (v/v) etanoliin liukoisten yhdisteiden optinen kiertokyky asteina
N	=	sellainen sakkaroosin määrä grammoina, jonka optinen kiertokyky on 100 sakkarimetrin astetta 100 ml:ssa vettä ja 200 mm:n putkessa mitattuna 16,29 g ranskalaisella sakkarimetrillä 26,00 g saksalaisella sakkarimetrillä 20,00 g muilla sakkarimetreillä.
	=	puhtaan tärkkelyksen ominaiskiertokyky (ks. 6.1).

6.3   Toistettavuus

Samasta näytteestä tehdyn kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero saa olla enintään 0,4 absoluuttisena arvona, jos tärkkelyspitoisuus on alle 40 prosenttia, ja 1 prosentti suhteessa tärkkelyspitoisuuteen, jos tärkkelyspitoisuus on vähintään 40 prosenttia.

7.   Huomautukset

7.1

Jos näyte sisältää yli 6 prosenttia karbonaatteja, kalsiumkarbonaattina laskettuna, on ne ennen optisen kokonaiskiertokyvyn määritystä hajotettava juuri tarkalleen sopivalla määrällä laimeaa rikkihappoa.

7.2

Paljon laktoosia sisältävien tuotteiden, kuten herajauheen tai rasvattoman maitojauheen, määritystä jatketaan 80 ml:n etanolilisäyksen (3.5) jälkeen seuraavasti. Palautusjäähdytin kiinnitetään pulloon ja pullo pannaan 50 °C:n vesihauteeseen 30 minuutin ajaksi. Annetaan jäähtyä ja jatketaan määritystä 5.3 kohdassa esitetyllä tavalla.

7.3

Seuraavien rehuissa merkittävinä määrinä esiintyvien rehuaineiden tiedetään häiritsevän tärkkelyspitoisuuden määritystä polarimetrisellä menetelmällä ja näin ollen voidaan saada vääriä tuloksia: — (sokeri)juurikastuotteet, kuten (sokeri)juurikasleike, (sokeri)juurikasmelassi, melassoitu (sokeri)juurikasleike, (sokeri)juurikasrankki, (juurikas)sokeri; — sitrushedelmämassa; — pellavansiemenet, pellavansiemenkakku, pellavansiemenrouhe; — rypsinsiemenet, rypsikakku, rypsirouhe, rypsinsiementen kuoret; — auringonkukansiemenet, auringonkukkarouhe, auringonkukkarouhe osaksi kuorituista siemenistä; — kookoskakku, kookosrouhe; — perunapulppa; — kuivahiiva; — runsaasti inuliinia sisältävät tuotteet (esim. maa-artisokkaleike ja -jauho); — rasvan sulatuksessa muodostuva valkuaisjäänne; — soijatuotteet. Näiden osalta voidaan soveltaa komission asetuksen (EY) N:o 121/2008 (7) mukaista määritysmenetelmää. Kyseistä menetelmää voi käyttää myös rehuun, jonka tärkkelyspitoisuus on alle 1 prosentti.

L.   RAAKATUHKAN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen raakatuhkapitoisuus.

2.   Periaate

Näyte poltetaan tuhkaksi 550 °C:ssa, jäännös punnitaan.

3.   Reagenssit

Ammoniumnitraattiliuos, 20 % (w/v).

4.   Välineistö

4.1

Sähkölevy.

4.2

Sähkökäyttöinen muhveliuuni, jossa on termostaatti.

4.3

Hehkutusupokkaita, jotka on valmistettu kvartsista, posliinista tai platinasta, joko suorakulmaisia (noin 60 × 40 × 25 mm) tai pyöreitä (läpimitta 60–75 mm, korkeus 20–40 mm).

5.   Menettely

Noin 5 grammaa näytettä (2,5 g sellaisia tuotteita, joilla on pyrkimys turvota) punnitaan 1 mg:n tarkkuudella hehkutusupokkaaseen, joka on ensin hehkutettu 550 °C:seen, jäähdytetty ja taarattu. Upokas asetetaan sähkölevylle ja sitä kuumennetaan vähitellen kunnes aine hiiltyy. Tuhkataan 5.1 tai 5.2 kohdan mukaisesti.

5.1

Upokas asetetaan kalibroituun muhveliuuniin, joka on säädetty 550 °C:seen. Upokasta pidetään tässä lämpötilassa, kunnes saadaan valkea, vaaleanharmaa tai punertava tuhka, jossa ei näytä enää olevan orgaanista ainesta. Upokas asetetaan eksikkaattoriin, sen annetaan jäähtyä ja se punnitaan välittömästi.

5.2

Upokas asetetaan kalibroituun muhveliuuniin, joka on säädetty 550 °C:seen. Poltetaan tuhkaksi 3 tunnin ajan. Upokas asetetaan eksikkaattoriin, sen annetaan jäähtyä ja se punnitaan välittömästi. Kuivausta jatketaan edelleen 30 minuutin ajan sen varmistamiseksi, että tuhkan paino pysyy vakiona (kahden peräkkäisen punnituksen välinen painoero saa olla enintään 1 mg).

6.   Tulosten laskeminen

Jäännöksen paino lasketaan vähentämällä taarapaino.

Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

7.   Huomautukset

7.1

Niille näytteille, joita on vaikea polttaa tuhkaksi, on alustava tuhkaksi polttaminen tehtävä ainakin kolmen tunnin ajan, jonka jälkeen näyte jäähdytetään ja siihen lisätään muutama pisara 20-prosenttista ammoniumnitraattiliuosta tai vettä (varovasti, välttäen tuhkan leviämistä tai paakkuuntumista). Hehkutusta jatketaan uunissa kuivaamisen jälkeen. Menettely toistetaan tarvittaessa, kunnes näyte on tuhkaantunut täydellisesti.

7.2

Ne aineet, joihin 7.1 kohdan käsittely ei vaikuta, käsitellään seuraavasti: Kolmen tunnin polttamisen jälkeen tuhkan joukkoon lisätään lämmintä vettä ja se suodatetaan pienen tuhkattoman suodattimen läpi. Suodatin ja sen sisältö poltetaan tuhkaksi alkuperäisessä upokkaassa. Suodos siirretään jäähtyneeseen upokkaaseen, haihdutetaan kuivaksi, poltetaan tuhkaksi ja punnitaan.

7.3

Jos kyse on öljyistä ja rasvoista, punnitaan tarkasti 25 g näytettä sopivan kokoiseen upokkaaseen. Näytteen annetaan hiiltyä sytyttämällä se tuhkattomalla suodatinpaperiliuskalla. Palamisen jälkeen näytettä kostutetaan mahdollisimman pienellä määrällä vettä. Kuivataan ja poltetaan tuhkaksi 5 kohdan mukaisesti.

M.   KLOORIVETYHAPPOON LIUKENEMATTOMAN TUHKAN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää kloorivetyhappoon liukenemattomien kivennäisainesten pitoisuus rehuissa. Näytteen laadun mukaan voidaan käyttää kahta eri menetelmää.

1.1

Menetelmä A: soveltuu orgaanista ainetta oleviin rehuaineisiin ja useimpiin rehuseoksiin;

1.2

Menetelmä B: soveltuu kivennäisrehuihin ja kivennäisrehuseoksiin sekä rehuseoksiin, joiden kloorivetyhappoon liukenemattomien ainesten pitoisuus menetelmällä A määritettynä on suurempi kuin 1 prosentti.

2.   Periaate

2.1

Menetelmä A: näyte poltetaan tuhkaksi, tuhka keitetään kloorivetyhapossa ja liukenematon jäännös suodatetaan ja punnitaan.

2.2

Menetelmä B: näytettä käsitellään kloorivetyhapolla. Liuos suodatetaan, jäännös poltetaan tuhkaksi ja näin saatu tuhka käsitellään menetelmän A mukaan.

3.   Reagenssit

3.1

Kloorivetyhappo, 3 mol/l.

3.2

Trikloorietikkahappoliuos, 20 % (w/v).

3.3

Trikloorietikkahappoliuos, 1 % (w/v).

4.   Välineistö

4.1

Sähkölevy.

4.2

Sähkökäyttöinen muhveliuuni, jossa on termostaatti.

4.3

Hehkutusupokkaita, jotka on valmistettu kvartsista, posliinista tai platinasta, joko suorakulmaisia (noin 60 × 40 × 25 mm) tai pyöreitä (läpimitta 60–75 mm, korkeus 20–40 mm).

4.4

Tuhkattomia suodattimia

5.   Menettely

5.1   Menetelmä A:

Näyte poltetaan tuhkaksi raakatuhkan määritystä varten esitettyä menetelmää käyttäen. Myös tästä määrityksestä saatua tuhkaa voidaan käyttää.

Tuhka siirretään 250–400 ml:n dekantterilasiin käyttäen 75 ml kloorivetyhappoa (3.1). Liuos kuumennetaan hitaasti kiehumapisteeseen ja sitä keitetään varovasti 15 minuuttia. Lämmin liuos suodatetaan tuhkattoman suodatinpaperin läpi ja jäännös pestään lämpimällä vedellä kunnes pesuvesi ei enää ole hapan. Jäännöksen sisältävä suodatinpaperi kuivataan ja poltetaan tuhkaksi taaratussa upokkaassa 550–700 °C:n lämpötilassa. Sen annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja se punnitaan.

5.2   Menetelmä B:

Punnitaan 5 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 250–400 ml:n dekantterilasiin. Siihen lisätään ensin 25 ml vettä ja sen jälkeen 25 ml kloorivetyhappoa (3.1), sekoitetaan ja odotetaan kunnes kuohuminen lakkaa. Lisätään vielä 50 ml kloorivetyhappoa (3.1). Kun kaasuja ei enää muodostu, dekantterilasi asetetaan kiehuvaan vesihauteeseen ja pidetään siinä 30 minuuttia tai tarvittaessa pitempään, jotta mahdollinen jäljellä oleva tärkkelys tulisi kokonaan hydrolysoiduksi. Liuos suodatetaan lämpimänä käyttäen tuhkatonta suodatinpaperia, joka pestään 50 ml:lla lämmintä vettä (ks. 7 kohdan huomautus). Suodatinpaperi jäännöksineen siirretään hehkutusupokkaaseen, kuivataan ja poltetaan tuhkaksi 550–700 °C:n lämpötilassa. Tuhka siirretään 250–400 ml:n dekantterilasiin käyttäen 75 ml kloorivetyhappoa (3.1), jatketaan 5.1 kohdan toisen alakohdan mukaan.

6.   Tulosten laskeminen

Jäännöksen paino lasketaan vähentämällä taarapaino. Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

7.   Huomautus

Jos suodatus osoittautuu vaikeaksi, suoritetaan määritys uudelleen korvaamalla 50 ml kloorivetyhappoa (3.1) 50 ml:lla 20-prosenttista trikloorietikkahappoliuosta (3.2) ja suodatinpaperin pesuun käytetään lämmintä 1-prosenttista trikloorietikkahappoliuosta (3.3).

N.   KOKONAISFOSFORIN MÄÄRITYS

Kokonaisfosforin määritys tehdään

—

EN 15510 -standardin (Animal feeding stuffs: Methods of sampling and analysis – Determination of calcium, sodium, phosphorus, magnesium, potassium, iron, zinc, copper, manganese, cobalt, molybdenum and lead by ICP-AES), joka koskee kalsiumin, natriumin, fosforin, magnesiumin, kaliumin, raudan, sinkin, kuparin, mangaanin, koboltin, molybdeenin ja lyijyn määritystä rehusta ICP-AES:llä, mukaisella määritysmenetelmällä, tai

—

EN 15621 -standardin (Animal feeding stuffs: Methods of sampling and analysis – Determination of calcium, sodium, phosphorus, magnesium, potassium, sulphur, iron, zinc, copper, manganese and cobalt after pressure digestion by ICP-AES), joka koskee kalsiumin, natriumin, fosforin, magnesiumin, kaliumin, rikin, raudan, sinkin, kuparin, mangaanin ja koboltin määritystä rehusta ICP-AES:llä painehajoituksen jälkeen, mukaisella määritysmenetelmällä, tai

—	jäljempänä esitetyllä fotometrisellä menetelmällä.

FOTOMETRINEN MENETELMÄ

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen kokonaisfosforipitoisuus. Se soveltuu erityisesti alhaisten fosforipitoisuuksien analysoimiseen. Tietyissä tapauksissa (runsaasti fosforia sisältävät tuotteet) voidaan käyttää gravimetristä menetelmää.

2.   Periaate

Näyte mineralisoidaan joko polttamalla kuivana (orgaaniset rehut) tai happokeiton avulla (mineraaliyhdisteet ja nestemäiset rehut), ja se siirtämällä se happamaan liuokseen. Liuos käsitellään molybdovanadaattireagenssilla. Muodostuneen keltaisen liuoksen optinen tiheys mitataan spektrofotometrissä 430 nm:ssä.

3.   Reagenssit

3.1

Kalsiumkarbonaatti.

3.2

Kloorivetyhappo, ρ20 = 1,10 g/ml (noin 6 mol/l).

3.3

Typpihappo, ρ20 = 1,045 g/ml.

3.4

Typpihappo, ρ20 = 1,38–1,42 g/ml.

3.5

Rikkihappo, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.6

Molybdovanadaattireagenssi: sekoitetaan 200 ml ammoniumheptamolybdaattiliuosta (3.6.1), 200 ml ammoniummonovanadaattiliuosta (3.6.2) ja 134 ml typpihappoa (3.4) 1 litran mittapullossa. Täytetään merkkiin asti vedellä.

3.6.1

Ammoniumheptamolybdaattiliuos: liuotetaan 100 g ammoniumheptamolybdaattia (NH4) 6Mo7O24.4H2O kuumaan veteen. Lisätään 10 ml ammoniakkia (tiheys 0,91 g/ml) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.6.2

Ammoniumonovanadaattiliuos: liuotetaan 2,35 g ammoniummonovanadaattia NH4VO3 400 ml:aan kuumaa vettä. Lisätään hitaasti, samalla sekoittaen 20 ml laimeaa typpihappoa (7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

3.7

Fosforistandardiliuos, 1 mg/ml: liuotetaan 4,387 g kaliumdivetyfosfaattia KH2PO4 veteen. Täytetään 1 litraksi vedellä.

4.   Välineistö

4.1

Kvartsi-, posliini- tai platinaupokkaita.

4.2

Sähkölämmitteinen muhveliuuni, jossa on 550 °C:seen säädetty termostaatti.

4.3

250 ml:n Kjeldahl-kolvi.

4.4

Mittapulloja ja tarkkuuspipettejä.

4.5

Spektrofotometri.

4.6

Noin 16 mm:n läpimittaisia koeputkia, joissa on 14,5 mm:n läpimittaiset tulpat ja joiden vetoisuus on 25–30 ml.

5.   Menettely

5.1   Liuoksen valmistaminen

Näytteen pitoisuuden mukaan valmistetaan 5.1.1 tai 5.1.2 kohdassa esitetty liuos.

5.1.1   Tavallinen menettely

Punnitaan vähintään 1 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella. Näyte pannaan Kjeldahl-kolviin, lisätään 20 ml rikkihappoa (3.5), ravistellaan, jotta happo imeytyisi aineeseen täydellisesti eikä aine tarttuisi pullon seinämiin, kuumennetaan ja pidetään kiehuvana 10 minuutin ajan. Annetaan jäähtyä hieman, lisätään 2 ml typpihappoa (3.4), kuumennetaan varovasti, annetaan jäähtyä hieman, lisätään uudelleen hieman typpihappoa (3.4) ja kohotetaan lämpötila jälleen kiehumispisteeseen. Tämä menettely toistetaan kunnes saadaan väritön liuos. Jäähdytetään, lisätään hieman vettä, neste dekantoidaan 500 ml:n mittapulloon huuhtomalla Kjeldahl-kolvi kuumalla vedellä. Annetaan jäähtyä, täytetään merkkiin asti vedellä, homogenoidaan ja suodatetaan.

5.1.2   Orgaanisia aineita sisältävät näytteet, jotka eivät sisällä kalsium- ja magnesiumdivetyfosfaatteja

Hehkutusupokkaaseen punnitaan noin 2,5 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella. Näytteeseen lisätään 1 g kalsiumkarbonaattia (3.1) ja sekoitetaan kunnes se on täysin sekoittunut näytteeseen. Poltetaan tuhkaksi uunissa 550 °C:ssa kunnes saadaan valkoista tai harmaata tuhkaa (pieni määrä hiiltä ei häiritse). Tuhka siirretään 250 ml:n dekantterilasiin. Lisätään 20 ml vettä ja kloorivetyhappoa (3.2) kunnes kuohuminen lakkaa. Lisätään vielä 10 ml kloorivetyhappoa (3.2). Dekantterilasi asetetaan hiekkahauteelle ja haihdutetaan kuivaksi piin saostamiseksi. Jäännös liuotetaan uudelleen 10 ml:aan typpihappoa (3.3) ja keitetään hiekkahauteella tai sähkölevyllä 5 minuuttia haihduttamatta sitä kuivaksi. Neste dekantoidaan 500 ml:n mittapulloon huuhtomalla dekantterilasi useaan kertaan kuumalla vedellä. Annetaan jäähtyä, täytetään merkkiin asti vedellä, homogenoidaan ja suodatetaan.

5.2   Värin kehitys ja optisen tiheyden mittaus

Laimennetaan 5.1.1 tai 5.1.2 kohdassa saatu suodos siten, että fosforipitoisuus on enintään 40 μg/ml. Pipetoidaan 10 ml tätä liuosta koeputkeen (4.6) ja lisätään siihen 10 ml molybdovanadaattireagenssia (3.6). Homogenoidaan ja annetaan seistä ainakin 10 minuuttia 20 °C:ssa. Mitataan optinen tiheys spektrofotometrissä 430 nm:ssä sellaiseen liuokseen nähden, joka on saatu lisäämällä 10 ml molybdovanadaattireagenssia (3.6) 10 ml:aan vettä.

5.3   Kalibrointikäyrä

Standardiliuoksesta (3.7) valmistetaan liuokset, joissa on 5, 10, 20, 30 tai 40 μg fosforia/ml. Kaikista liuoksista otetaan 10 ml:n erä ja siihen lisätään 10 ml molybdovanadaattireagenssia (3.6). Homogenoidaan ja annetaan seistä ainakin 10 minuuttia 20 °C:ssa. Optinen tiheys mitataan 5.2 kohdan mukaisesti. Kalibrointikäyrä laaditaan piirtämällä optisia tiheyksiä ja näitä vastaavia fosforimääriä esittävä kuvaaja. Käyrä on lineaarinen välillä 0–40 μg/ml olevien konsentraatioiden osalta.

6.   Tulosten laskeminen

Tutkittavassa näytteessä oleva fosforimäärä määritetään kalibrointikäyrää käyttäen.

Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

Toistettavuus

Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli:

—	3 %:a, suhteessa korkeampaan tulokseen, alle 5 % olevien fosforipitoisuuksien osalta,

—	0,15 %:a, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, vähintään 5 % olevien fosforipitoisuuksien osalta.

O.   KLOORIN MÄÄRITYS KLORIDEISTA

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää vesiliukoisten kloridien määrä; tulokset ilmoitetaan yleensä natriumkloridina. Menetelmä soveltuu käytettäväksi kaikkiin rehuihin.

2.   Periaate

Kloridit liuotetaan veteen. Jos tuote sisältää orgaanista ainetta, se kirkastetaan. Liuos tehdään hieman happamaksi typpihapolla ja kloridit saostetaan hopeakloridin muodossa hopeanitraattiliuosta käyttäen. Hopeanitraatin ylimäärä titrataan ammoniumtiosyanaattiliuoksella Volhardin menetelmän mukaan.

3.   Reagenssit

3.1

Ammoniumtiosyanaattiliuos 0,1 mol/l.

3.2

Hopeanitraattiliuos 0,1 mol/l.

3.3

Ammoniumferrisulfaattiliuos, kyllästetty liuos (NH4)Fe(SO4)2.

3.4

Typpihappo, tiheys 1,38 g/ml.

3.5

Dietyylieetteri.

3.6

Asetoni.

3.7

Carrez-liuos I: liuotetaan veteen 21,9 g sinkkiasetaattia Zn(CH3COO)2 2H2O ja 3 g jääetikkaa. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.8

Carrez-liuos II: liuotetaan veteen 10,6 g kaliumferrosyanidia K4Fe(CN)6 3H2O. Täytetään 100 ml:ksi vedellä.

3.9

Aktiivihiili, jossa ei ole klorideja ja joka ei absorboi niitä.

4.   Välineistö

Sekoitin: noin 35–40 kierr./min.

5.   Menettely

5.1   Liuoksen valmistaminen

Näytteen mukaan valmistetaan 5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3 kohdassa esitetty liuos.

Samanaikaisesti suoritetaan nollakoe, josta määritettävä näyte on jätetty pois.

5.1.1   Näytteet, joissa ei ole orgaanista ainesta

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella enintään 10 g näytettä, joka sisältää alle 3 g kloridien muodossa olevaa klooria. Lisätään 500 ml:n mittapulloon näyte ja 400 ml noin 20 °C:n lämpöistä vettä. Sekoitetaan 30 minuuttia sekoittajassa, täytetään merkkiin asti, homogenoidaan ja suodatetaan.

5.1.2   Orgaanista ainesta sisältävät näytteet, paitsi 5.1.3 kohdassa luetellut tuotteet

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g näytettä sekä 1 g aktiivihiiltä 500 ml:n mittapulloon. Lisätään 400 ml noin 20 C:n lämpöistä vettä ja 5 ml Carrez-liuosta I (3.7), sekoitetaan 30 sekunnin ajan ja tämän jälkeen lisätään 5 ml Carrez-liuosta II (3.8). Sekoitetaan 30 minuuttia sekoittajassa, täytetään merkkiin asti, homogenoidaan ja suodatetaan.

5.1.3   Keitetyt rehut, pellavansiemenkakut ja -jauho, pellavajauhoa runsaasti sisältävät tuotteet ja muut tuotteet, joissa on runsaasti lima-ainesta tai kolloidisia aineksia (esim. dekstrinoitu tärkkelys)

Valmistetaan liuos 5.1.2 kohdassa esitetyllä tavalla, mutta sitä ei suodateta. Dekantoidaan (tarvittaessa sentrifugoidaan), siirretään 100 ml supernatanttia 200 ml:n mittapulloon. Sekoitetaan asetonin (3.6) kanssa ja täytetään merkkiin asti asetonilla, homogenoidaan ja suodatetaan.

5.2   Titraus

Pipetoidaan erlenmeyerkolviin 25–100 ml suodosta (oletetun klooripitoisuuden mukaan), joka on saatu 5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3 kohdassa esitetyllä tavalla. Pipetoitu erä saa sisältää korkeintaan 150 mg klooria (Cl). Laimennetaan tarvittaessa vähintään 50 ml:ksi vedellä, lisätään 5 ml typpihappoa (3.4), 2 ml kyllästettyä ammoniumferrisulfaattiliuosta (3.3) ja kaksi tippaa ammoniumtiosyanaattiliuosta (3.1), joka annostellaan nollamerkkiin täytetystä byretistä. Byrettiä käyttäen lisätään hopeanitraattiliuosta (3.2) siten, että saadaan 5 ml:n ylimäärä. Lisätään 5 ml dietyylieetteriä (3.5) ja ravistellaan voimakkaasti saostuman koaguloimiseksi. Ylimäärä hopeanitraattia titrataan ammoniumtiosyanaattiliuoksella (3.1) kunnes punaruskea väri säilyy noin yhden minuutin ajan.

6.   Tulosten laskeminen

Kloorimäärä (X), joka ilmoitetaan natriumkloridiprosentteina, lasketaan seuraavaa kaavaa käyttäen:

jossa:

V1	=	lisätyn hopeanitraattiliuoksen 0,1 mol/l määrä millilitroina
V2	=	titraukseen käytetyn ammoniumtiosyanaatin 0,1 mol/l määrä millilitroina.
m	=	näytteen määräosan paino grammoina.

Jos hopeanitraattiliuosta, 0,1 mol/l, on kulunut nollakoetta titrattaessa, kuluneen liuoksen määrä vähennetään tilavuudesta (V1 – V2).

7.   Huomautukset

7.1

Titraus voidaan suorittaa myös potentiometrisesti tai amperometrisesti.

7.2

Jos määritettävät tuotteet sisältävät runsaasti öljyjä ja rasvoja, öljyt ja rasvat on ensin poistettava dietyylieetterillä tai petroolieetterillä.

7.3

Kalajauhon osalta titraus voidaan suorittaa Mohrin menetelmällä.