Komisjoni direktiiv 98/73/EÜ, 18. september 1998, millega kohandatakse kahekümne neljandat korda tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohtaEMPs kohaldatav tekst.

Euroopa Liidu Teataja L 305 , 16/11/1998 Lk 0001 - 0181
CS.ES Peatükk 13 Köide 21 Lk 139 - 316
ET.ES Peatükk 13 Köide 21 Lk 139 - 316
HU.ES Peatükk 13 Köide 21 Lk 139 - 316
LT.ES Peatükk 13 Köide 21 Lk 139 - 316
LV.ES Peatükk 13 Köide 21 Lk 139 - 316
MT.ES Peatükk 13 Köide 21 Lk 139 - 316
PL.ES Peatükk 13 Köide 21 Lk 139 - 316
SK.ES Peatükk 13 Köide 21 Lk 139 - 316
SL.ES Peatükk 13 Köide 21 Lk 139 - 316

Komisjoni direktiiv 98/73/EÜ,

18. september 1998,

millega kohandatakse kahekümne neljandat korda tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta

(EMPs kohaldatav tekst)

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse nõukogu 27. juuni 1967. aasta direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta, [1] viimati muudetud komisjoni direktiiviga 97/69/EÜ, [2] eriti selle artiklit 28,

ning arvestades, et:

direktiivi 67/548/EMÜ I lisa sisaldab ohtlike ainete loetelu koos iga aine liigitamise ja märgistamise korra üksikasjadega; praegused teadus- ja tehnikaalased teadmised on näidanud, et kõnealuses lisas sisalduvat ohtlike ainete loetelu tuleks kohandada ja täiendada;

direktiivi 67/548/EMÜ V lisas on sätestatud ainete ja valmististe füüsikaliste ja keemiliste omaduste, toksilisuse ning ökotoksilisuse määramise meetodid; kõnealust lisa on vaja kohandada tehnika arenguga;

käesolevas direktiivis sätestatud meetmed on kooskõlas ohtlike ainete ja valmististe tehniliste kaubandustõkete kõrvaldamist käsitlevaid direktiive tehnika arenguga kohandava komitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:

Artikkel 1

Käesolevaga muudetakse direktiivi 67/548/EMÜ järgmiselt.

1. I lisa muudetakse järgmiselt:

a) käesoleva direktiivi I lisa kanded asendavad direktiivi 67/548/EMÜ I lisa vastavad kanded;

b) käesoleva direktiivi II lisa kanded lisatakse direktiivi 67/548/EMÜ I lisa kannetele.

2. V lisa muudetakse järgmiselt:

a) käesoleva direktiivi lisade III A, III B ja III C tekst lisatakse direktiivi 67/548/EMÜ V lisa A osale;

b) käesoleva direktiivi lisa III D tekst lisatakse direktiivi 67/548/EMÜ V lisa C osale.

Artikkel 2

Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud õigus- ja haldusnormid hiljemalt 31. oktoobriks 1999. Nad teatavad sellest viivitamata komisjonile.

Kui liikmesriigid need sätted vastu võtavad, lisavad nad nendesse või nende ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Sellise viitamise viisi näevad ette liikmesriigid.

Artikkel 3

Käesolev direktiiv jõustub 20. päeval pärast selle avaldamist Euroopa Ühenduste Teatajas.

Artikkel 4

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.

Brüssel, 18. september 1998

Komisjoni nimel

komisjoni liige

Ritt Bjerregaard

[1] EÜT 196, 16.8.1967, lk 1.

[2] EÜT L 343, 13.12.1997, lk 19.

--------------------------------------------------

ANEXO IBILAG IANHANG IΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IANNEX IANNEXE IALLEGATO IBIJLAGE IANEXO ILIITE IBILAGA I

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

ANEXO IIBILAG IIANHANG IIΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IIANNEX IIANNEXE IIALLEGATO IIBIJLAGE IIANEXO IILIITE IIBILAGA II

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

LISA III A

A.18. POLÜMEERIDE ARVKESKMINE MOLEKULMASS JA MOLEKULMASSIDE JAOTUS

1. MEETOD

Käesolev geelkromatograafia (GPC) meetod on OECD katsejuhendi nr 118 (1996) koopia. Meetodi põhimõte ja tehniline lisainformatsioon on toodud kirjandusviites 1.

1.1. Sissejuhatus

Kuna polümeeride omadused on väga erinevad, siis on võimatu kirjeldada ühtainust meetodit, mis kirjeldaks täpselt eraldamis- ja analüüsitingimusi, mis kataks kõiki polümeeride eraldamisel esinevaid võimalikke juhtumeid ja olukordi. Eelkõige on keeruliste polümeerisegude lahutamine geelkromatograafia abil sageli võimatu. Kui geelkromatograafia ei ole kasutatav, siis võib molekulmassi määramiseks kasutada teisi meetodeid (vt lisa). Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendused.

Kirjeldatav meetod põhineb DIN standardil nr 55672 (1). Üksikasjalik informatsioon katsete läbiviimiseks ja andmete hindamiseks on toodud nimetatud DIN standardis. Kui katse tingimuste muutmine osutub vajalikuks, siis peab vastavaid muudatusi põhjendama. Muude standardite kasutamisel peab nende jaoks andma täielikud viited. Kirjeldatava meetodi kalibreerimiseks kasutatakse teadaoleva polüdisperssusega polüstüreeniproove ja teatud polümeeride (näiteks vesilahustuvad ja pika ahelaga hargnenud polümeerid) analüüsimiseks võib osutuda vajalikuks meetodis muudatuste tegemine.

1.2. Definitsioonid ja ühikud

Arvkeskmise molekulmassi Mn ja masskeskmise molekulmassi Mw arvutamiseks kasutatakse järgmisi valemeid:

+++++ TIFF +++++

kus

Hi on detektori signaali kõrgus mõõdetuna baasjoonelt retensiooniruumala Vi jaoks

Mi on retensiooniruumalale Vi vastava polümeerifraktsiooni molekulmass, ja

n on mõõtepunktide arv.

Molekulmassi jaotuse ulatus, mis iseloomustab segu disperssust, leitakse Mw/Mn suhtest.

1.3. Võrdlusained

Kuna geelkromatograafia on suhteline meetod, siis peab seda kalibreerima. Selleks otstarbeks kasutatakse tavaliselt kitsa fraktsioonilise jaotusega lineaarseid polüstüreenistandardeid, mille keskmised molekulmassid Mn ja Mw ning molekulmasside jaotus on teada. Kalibreerimiskõverat võib kasutada tundmatu proovi molekulmassi määramiseks vaid siis, kui proovi ja standardi lahutamiseks kasutatavad tingimused on valitud ühesuguselt.

Molekulmassi ja elueerunud ruumala vaheline suhe on õige vaid konkreetsele katsele iseloomulikel tingimustel. Nimetatud tingimused hõlmavad eelkõige temperatuuri, lahustit (või lahustite segu), kromatograafilisi tingimusi ja kasutatavat kolonni või kolonnisüsteemi.

Sellisel viisil proovist määratud molekulmassid on suhtelised ja neid nimetatakse "polüstüreeniekvivalendi molekulmassideks". See tähendab seda, et sõltuvalt proovi ja standardi vahelistest struktuurilistest ja keemilistest erinevustest võivad molekulmassid hälbida absoluutsetest väärtustest rohkemal või vähemal määral. Juhul kui kasutatakse teisi standardeid nagu näiteks polüetüleenglükool, polüetüleenoksiid, polümetüül metakrülaat, polüakrüülhape, siis peab seda põhjendama.

1.4. Katsemeetodi põhimõte

Geelkromatograafia abil võib määrata nii proovi molekulmassi jaotust kui keskmisi molekulmasse (Mn, Mw). Geelkromatograafia on spetsiaalne vedelikkromatograafia liik, milles proov lahutatakse üksikute koostisosade hüdrodünaamiliste ruumalade järgi (2).

Lahutamiseks juhitakse proov läbi poorse materjaliga, tavaliselt orgaanilise geeliga, täidetud kolonni. Väikesed molekulid suudavad tungida pooridesse, kuhu suurte molekulide juurdepääs on takistatud. Seetõttu on suurte molekulide teepikkus lühem ja nad elueeruvad kiiremini. Keskmise suurusega molekulid tungivad osadesse pooridesse, mistõttu nad elueeruvad mõnevõrra aeglasemalt. Kõige väiksemad molekulid, mille keskmine hüdrodünaamiline raadius on väiksem kui geeli poorid, tungivad kõikidesse pooridesse ja elueeruvad viimastena.

Ideaaljuhul mõjutab lahutamist ainult molekulide suurus, kuid praktikas on raske vältida vähemalt mõningaid adsorptsioonist tingitud segavaid mõjusid. Kolonni ebaühtlane täitematerjal ja suurem omaruumala võivad olukorda halvendada (2).

Detekteerimiseks kasutatakse näiteks refraktsiooni indeksit või UV-absorptsiooni ja tulemuseks saadakse lihtne jaotuskõver. Selleks, et omistada saadud kõverale tegelikke molekulmassi väärtusi, tuleb kolonni kalibreerida teadaolevate molekulmassidega ja ideaaljuhul üldjoontes sarnase struktuuriga polümeeridega nagu näiteks erinevad polüstüreenistandardid. Tüüpiliselt saadakse Gaussi kõver, mis on mõnikord madalate molekulmasside osas väljaveninud sabaga, kusjuures vertikaalsel teljel on elueerunud erinevate molekulmassiga ühendite kogus massi järgi ja horisontaalsel teljel on logaritmilises skaalas molekulmass.

1.5. Kvaliteedikriteeriumid

Elutsiooniruumala korratavus (suhteline standardhälve, RSD) peaks olema parem kui 0,3 %. Kui kromatogrammi hinnatakse ajalise sõltuvuse põhjal ja see ei vasta ülaltoodud kriteeriumitele, tagatakse nõutav analüüsi korratavus sisestandardi kasutamisega (1). Polüdisperssused sõltuvad standardite molekulmassidest. Polüstüreenistandardite kasutamisel on tüüpilised väärtused järgmised:

Mp < 2000 | Mw/Mn < 1,20 |

2000 ≤ Mp ≤ 106 | Mw/Mn < 1,05 |

Mp > 106 | Mw/Mn < 1,20 |

(Mp on piigi maksimumile vastav standardi molekulmass)

1.6. Katsemeetodi kirjeldus

1.6.1. Polüstüreeni standardlahuste valmistamine

Polüstüreenistandardid lahustatakse ettevaatlikul segamisel valitud eluendiga. Lahuste valmistamisel peab arvestama tootjapoolseid soovitusi.

Valitud standardi kontsentratsioonid sõltuvad mitmetest erinevatest teguritest nagu näiteks süsteruumala, lahuse viskoossus ja analüütilise detektori tundlikkus. Maksimaalset süsteruumala peab kohandama vastavalt kolonni pikkusele, et vältida kolonni ülelaadimist. Geelkromatograafia analüütiliste meetodite korral jäävad tüüpilised süsteruumalad vahemikku 40 kuni 100 μl, kui kolonni mõõdud on 30 cm × 7,8 mm. Võimalik on kasutada ka suuremaid ruumalasid, kuid need ei tohiks ületada 250 μl. Enne kolonni tegelikku kalibreerimist tuleb kindlaks teha süsteruumala ja kontsentratsiooni vaheline optimaalne suhe.

1.6.2. Proovi lahuse valmistamine

Põhimõtteliselt kehtivad ülaltoodud nõudmised ka proovi lahuste valmistamisel. Proov lahustatakse sobivas lahustis, näiteks tetrahüdrofuraanis (THF), ettevaatlikul loksutamisel. Mitte mingil juhul ei tohi lahustamiseks kasutada ultrahelivanni. Vajaduse korral puhastatakse proovi lahust membraanfiltriga, mille pooride suurus on 0,2 kuni 2 μm.

Lahustumatute osakeste olemasolu peab ära märkima ka lõplikus protokollis, kuna see võib olla tingitud kõrge molekulmassiga ühenditest. Lahustunud osakeste massiprotsendi määramiseks peab kasutama sobivat meetodit. Valmistatud lahuseid peab kasutama 24 tunni jooksul.

1.6.3. Seadmed

- mahuti lahustile,

- degaseerija (vajadusel),

- pump,

- pulsatsioonisummuti (vajadusel),

- injektsioonisüsteem,

- kromatograafilised kolonnid,

- detektor,

- kulumõõtja (vajadusel),

- andmesalvesti ja -töötleja,

- nõu jääkide jaoks.

Eelnevalt peab kindlaks tegema, et geelkromatograafia süsteem oleks kasutatavate lahustite suhtes inertne (näiteks tetrahüdrofuraani jaoks kasutada teraskapillaare).

1.6.4. Injektsiooni ja lahusti etteandmise süsteem

Proovi lahuse etteantud kogus sisestatakse automaatse injektoriga või käsitsi täpselt kindlaksmääratud kolonni piirkonda. Käsitsi injektsiooni korral võib süstla kolvi liiga kiire tagasitõmbamine või vabastamine põhjustada muutusi mõõdetava molekulmassi jaotuses. Lahusti etteandmise süsteem peaks olema võimalikult pulseerimisvaba, sisaldades ideaaljuhul pulsatsioonisummutit. Voolukiirus on suurusjärgus 1 ml/min.

1.6.5. Kolonn

Sõltuvalt proovist kasutatakse polümeeri analüüsiks kas ühte lihtsat kolonni või mitut järjestikku ühendatud kolonni. Kolonni täitematerjalidena on kaubanduslikult kättesaadavad paljud poorsed kindlate omadustega ained (näiteks poori suurus, eksklusioonipiirid). Lahutamiseks kasutatava geeli või kolonni pikkuse valik sõltub nii proovi omadustest (hüdrodünaamiline ruumala, molekulmasside jaotus) kui ka spetsiifilistest lahutamistingimustest, nagu näiteks lahusti, temperatuur ja voolukiirus (1) (2) (3).

1.6.6. Teoreetilised taldrikud

Lahutamiseks kasutatavat kolonni või kolonnide süsteemi iseloomustatakse teoreetiliste taldrikute arvuga. Tetrahüdrofuraani kasutamisel eluendina hinnatakse seda etüülbenseeni või mõne muu sobiva mittepolaarse lahustunud aine (soluudi) laadimisel teadaoleva pikkusega kolonni. Teoreetiliste taldrikute arv saadakse järgmiste valemite põhjal:

N = 5,54

või

N = 16

kus

N on teoreetiliste taldrikute arv

Ve on piigi maksimumile vastav elutsiooniruumala

W on piigi laius baasjoonel

W1/2 on piigi laius poolel piigi kõrgusel.

1.6.7. Lahutamise efektiivsus

Lisaks ribalaiust määravale teoreetiliste taldrikute arvule on tähtis ka lahutamise efektiivsus, mis sõltub sellest, kui järsk on kalibreerimiskõvera tõus. Kolonni lahutamisefektiivsus saadakse järgmisest valemist:

e,M

≥ 6,0

cm3cm2

kus

Ve,Mx on polüstüreeni molekulmassiga Mx elutsiooniruumala

Ve,(10Mx) on 10 korda suurema molekulmassiga polüstüreeni elutsiooniruumala.

Süsteemi lahutusvõime defineeritakse tavaliselt järgmiselt:

= 2×

kus

Ve1, Ve2 on kahe polüstüreenistandardi elutsiooniruumalad piigi maksimumil

W1, W2 on piigi laiused baasjoonel

M1, M2 on piigi maksimumile vastavad molekulmassid (peaksid erinema 10 korda).

Kolonnisüsteemi R-väärtus peaks olema suurem kui 1,7 (4).

1.6.8. Lahustid

Kõik lahustid peavad olema kõrge puhtusastmega (kasutatava tetrahüdrofuraani puhtus on 99,5 %). Lahusti mahuti (vajadusel paigutatud inertgaasi atmosfääri) peab olema piisavalt suur, et võimaldada kolonni kalibreerimist ja proovide analüüsi. Enne pumpamist kolonni peab lahustit degaseerima.

1.6.9. Temperatuurikontroll

Kriitilise tähtsusega komponentide (injektsioonisilmus, kolonnid, detektor ja torustik) temperatuur peab olema konstantne ja sobima kasutatavale lahustile.

1.6.10. Detektor

Detektori eesmärgiks on kolonnist elueeruva proovi kontsentratsiooni kvantitatiivne mõõtmine. Selleks, et vältida piikide tarbetut laienemist, peab detektori mõõteraku küveti ruumala olema võimalikult väike. See ei tohiks olla suurem kui 10 μl, välja arvatud valguse hajuvust ja viskoossust mõõtvate detektorite korral. Detekteerimiseks kasutatakse tavaliselt diferentsiaalrefraktomeetriat. Tingituna proovi või eluendi spetsiifilistest omadustest võib kasutada ka muid detektsioonimeetodeid nagu näiteks UV/VIS, IR, viskoossusdetektorid, jms.

2. ANDMED JA NENDE ESITAMINE

2.1. Andmed

Hindamiskriteeriumitele ning andmete kogumisele ja töötlemisele esitatavate üksikasjaliste nõuete osas peaks järgima DIN standardit (1).

Iga proovi jaoks peab läbi viima kaks teineteisest sõltumatut katset. Neid katseid peab eraldi analüüsima.

Iga mõõtmise tulemused peavad hõlmama Mn, Mw, Mw/Mn ja Mp väärtusi. Üheselt mõistetavalt peab näitama, et mõõdetud väärtused on suhtelised väärtused, mis on ekvivalentsed kasutatud standardi molekulmassidega.

Peale retensiooniruumalade või -aegade kindlaksmääramist (mida võib parandada sisestandardite kasutamisega) esitatakse log Mp väärtused (kus Mp on kalibreerimiseks kasutatava standardi piigi maksimum) ühe eelnevalt toodud suuruse funktsioonina. Molekulmassi dekaadi (10-kordse vahemiku) kohta on vaja vähemalt kahte kalibreerimiskõvera punkti ja terve kõvera jaoks on vaja vähemalt viit mõõtepunkti, mis peaks hinnanguliselt katma proovi molekulmassi. Kalibreerimiskõvera madala molekulmassiga osa lõpp-punkt määratakse kindlaks n-heksüülbenseeni või muu sobiva mittepolaarse soluudi abil. Arvkeskmised ja masskeskmised molekulmassid arvutatakse tavaliselt elektroonilise andmetöötlusega, mis põhineb punktis 1.2 toodud valemitel. Käsitsi digitaliseerimise kasutamisel võib eeskujuks võtta standardi ASTM D 3536-91 (3).

Jaotuskõvera peab esitama tabeli või joonise kujul (diferentsiaalne sagedus või protsentide summa log M funktsioonina). Graafilisel kujutamisel peab üks molekulmassi kümnekordne vahemik olema umbes 4 cm laiune ja piigi maksimum peab olema umbkaudu 8 cm kõrgune. Integraalsete jaotuskõverate korral peab ordinaadi 0 ja 100 % vahemik olema umbes 10 cm laiune.

2.2. Katseprotokoll

Katseprotokoll peab sisaldama järgmist informatsiooni:

2.2.1. Katsetatav aine

- olemasolev informatsioon analüüsitava aine kohta (identifitseerimiskood, lisandid, ebapuhtused),

- proovi eeltöötluse täpne kirjeldus, tähelepanekud, probleemid.

2.2.2. Aparatuur

- eluendi mahuti, inertgaas, eluendi degaseerimine, eluendi koostis, ebapuhtused,

- pump, pulsatsioonisummuti, injektsioonisüsteem,

- lahutuskolonnid (tootja, kõik kolonni näitajad, nagu poori suurus, täitematerjali liik jms, kasutatavate kolonnide arv, pikkus ja järjekord),

- kolonni (või nende kombinatsiooni) teoreetiliste taldrikute arv, lahutamise efektiivsus (süsteemi lahutusvõime),

- andmed piikide sümmeetria kohta,

- kolonni temperatuur, temperatuurikontrolli liik,

- detektor (mõõtmise põhimõte, tüüp, küveti ruumala),

- kulumõõtja, kui kasutati (tootja, mõõte põhimõte),

- andmete salvestamise ja töötlemise süsteem (riist- ja tarkvara).

2.2.3. Süsteemi kalibreerimine

- kalibreerimiskõvera koostamiseks kasutatud meetodi täpne kirjeldus,

- andmed selle meetodi kvaliteedikriteeriumite kohta (näiteks korrelatsioonikoefitsient, ruutsumma viga jms),

- andmed kõikide ekstrapoleerimiste, oletuste ja lähenduste kohta, mis tehti eksperimendi ning andmete hindamise ja töötlemise käigus,

- kõik kalibreerimiskõvera koostamiseks tehtud mõõtmised peavad olema dokumenteeritud tabelis, mis sisaldab kalibreerimiskõvera iga punkti kohta alljärgnevat informatsiooni:

- proovi nimetus,

- proovi tootja,

- tootjapoolsed või mõõtmistel saadud standardit iseloomustavad Mp, Mn, Mw ja Mw/Mn väärtused, koos määramismeetodi üksikasjadega,

- süsteruumala ja -kontsentratsioon,

- kalibreerimisel kasutatud Mp väärtus,

- piigi maksimumile vastav mõõdetud elutsiooniruumala või parandatud retensiooniaeg,

- piigi maksimumile arvutatud Mp,

- arvutatud Mp protsentuaalne viga ja kalibreerimistulemus.

2.2.4. Hindamine

- aja põhjal hindamine: nõutava korratavuse tagamiseks kasutatavad meetodid (parandusmeetod, sisestandard jms),

- informatsioon selle kohta, kas hindamine viidi läbi elutsiooniruumala või retentsiooniaja põhjal,

- informatsioon hindamise piiratuse kohta, kui piik ei ole täielikult analüüsitud,

- silumismeetodite kirjeldus, kui neid kasutati,

- proovi ettevalmistamise ja eeltöötluse protseduurid,

- lahustumatute osakeste olemasolu,

- süsteruumala (μl) ja -kontsentratsioon (mg/ml),

- tähelepanekud seikade kohta, mis võivad põhjustada kõrvalekaldumist ideaalsest geelkromatograafia profiilist,

- kõikide katseprotseduurides tehtud muudatuste üksikasjalik kirjeldus,

- veapiiride üksikasjalikud andmed,

- mis tahes muu informatsioon ja tähelepanekud, mis puudutavad tulemuste tõlgendamist.

3. VIITED

(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

--------------------------------------------------

LISA III B

A.19 MADALAMOLEKULAARSETE AINETE SISALDUS POLÜMEERIS

1. MEETOD

Käesolev geelkromatograafia (GPC) meetod on OECD katsejuhendi nr 119 (1996) koopia. Meetodi põhimõte ja tehniline lisainformatsioon on toodud kirjandusviidetes.

1.1. Sissejuhatus

Kuna polümeeride omadused on väga erinevad, siis on võimatu kirjeldada ühtainust meetodit, mille lahutamis- ja analüüsitingimused katavad kõiki polümeeride eraldamisel esinevaid võimalikke juhtumeid ja iseärasusi. Sageli ei ole keeruliste polümeerisegude koostisosadeks lahutamine geelkromatograafiaga võimalik. Kui geelkromatograafia ei ole kasutatav, siis võib molekulmassi määramiseks kasutada teisi meetodeid (vt lisa). Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendused.

Kirjeldatav meetod põhineb DIN standardil nr 55672 (1). Üksikasjalik informatsioon katsete läbiviimiseks ja andmete hindamiseks on toodud nimetatud DIN standardis. Kui katse tingimuste muutmine osutub vajalikuks, siis peab vastavaid muudatusi põhjendama. Kasutada võib ka muid standardeid, kui neile antakse täielikud viited. Kirjeldatava meetodi kalibreerimiseks kasutatakse teadaoleva polüdisperssusega polüstüreenproove ja teatud polümeeride (näiteks vesilahustuvad ja pika ahelaga hargnenud polümeerid) analüüsil võib osutuda vajalikuks meetodi muutmine.

1.2. Definitsioonid ja ühikud

Madal molekulmass on kokkuleppeliselt molekulmass, mis on väiksem kui 1000 daltonit.

Arvkeskmise molekulmassi Mn ja masskeskmise molekulmassi Mw arvutamiseks kasutatakse järgmisi valemeid:

+++++ TIFF +++++

kus

Hi on detektori signaali kõrgus mõõdetuna baasjoonelt retensioonimahu Vi jaoks

Mi on retensioonimahule Vi vastava polümeerifraktsiooni molekulmass, ja

n on mõõtepunktide arv.

Molekulmassi jaotuse laius, mis iseloomustab segu disperssust, saadakse Mw/Mn suhtest.

1.3. Võrdlusained

Kuna geelkromatograafia on suhteline meetod, siis peab seda kalibreerima. Selleks otstarbeks kasutatakse tavaliselt kitsa fraktsioonilise jaotusega lineaarseid polüstüreenstandardeid, mille keskmised molekulmassid Mn ja Mw ja molekulmasside jaotus on teada. Kalibreerimiskõverat võib kasutada tundmatu proovi molekulmassi määramiseks vaid siis, kui proovi ja standardi lahutamiseks kasutatavad tingimused on valitud ühtviisi.

1.4. Katsemeetodi põhimõte

Geelkromatograafiaga võib määrata nii proovi molekulmassi jaotust kui keskmisi molekulmasse (Mn, Mw). Geelkromatograafia on spetsiaalne vedelikkromatograafia liik, milles proov lahutatakse üksikute koostisosade hüdrodünaamiliste ruumalade järgi (2).

Lahutamiseks juhitakse proov läbi poorse materjaliga, tavaliselt orgaanilise geeliga täidetud kolonni. Väikesed molekulid suudavad tungida pooridesse, kuhu suurte molekulide juurdepääs on takistatud. Seetõttu on suurte molekulide teepikkus lühem ja nad elueeruvad kiiremini. Keskmise suurusega molekulid tungivad osadesse pooridesse, mistõttu nad elueerivad mõnevõrra aeglasemalt. Kõige väiksemad molekulid, mille keskmine hüdrodünaamiline raadius on väiksem kui geeli poorid, tungivad kõikidesse pooridesse ja elueeruvad viimastena.

Detekteerimiseks kasutatakse näiteks refraktsiooni indeksit või UV-absorptsiooni ja tulemuseks saadakse lihtne jaotuskõver. Selleks, et omistada saadud kõverale tegelikke molekulmassi väärtusi, tuleb kolonni kalibreerida teadaolevate molekulmassidega ja ideaaljuhul üldjoontes sarnase struktuuriga polümeeridega nagu näiteks erinevad polüstüreenstandardid. Tüüpiliselt saadakse Gaussi kõver, mis on mõnikord madalate molekulmasside osas väljaveninud sabaga, kusjuures vertikaalsel teljel on elueerunud erinevate molekulmassiga ühendite kogus massi järgi ja horisontaalsel teljel on logaritmilises skaalas molekulmass.

Nimetatud kõveralt saadakse madalmolekulaarsete ainete sisaldus. Arvutused saavad olla täpsed vaid siis, kui madala molekulmassiga ühendid annavad massi alusel detektorile samase signaali kui kogu polümeer.

1.5. Kvaliteedikriteeriumid

Elutsiooniruumala korratavus (suhteline standardhälve, RSD) peaks olema parem kui 0,3 %. Kui kromatogrammi hinnatakse ajalise sõltuvuse põhjal ja see ei vasta ülaltoodud kriteeriumitele, tagatakse analüüsi nõutav korratavus sisestandardi kasutamisega (1). Polüdisperssused sõltuvad standardite molekulmassidest. Polüstüreenistandardite kasutamisel on tüüpilised väärtused järgmised:

Mp < 2000 | Mw/Mn < 1,20 |

2000 ≤ Mp ≤ 106 | Mw/Mn < 1,05 |

Mp > 106 | Mw/Mn < 1,20 |

(Mp on piigi maksimumile vastav standardi molekulmass).

1.6. Katsemeetodi kirjeldus

1.6.1. Polüstüreeni standardlahuste valmistamine

Polüstüreeni standardid lahustatakse ettevaatlikul segamisel valitud eluendiga. Lahuste valmistamisel peab arvestama tootjapoolseid soovitusi.

Valitud standardi kontsentratsioonid sõltuvad mitmetest erinevatest teguritest, nagu näiteks süsteruumala, lahuse viskoossus ja analüütilise detektori tundlikkus. Maksimaalset süsteruumala peab kohandama vastavalt kolonni pikkusele, et vältida kolonni ülelaadimist. Geelkromatograafia analüütiliste meetodite korral jäävad tüüpilised süsteruumalad vahemikku 40 kuni 100 μl, kui kolonni mõõdud on 30 cm × 7,8 mm. Võimalik on kasutada ka suuremaid ruumalasid, kuid need ei tohiks ületada 250 μl. Enne kolonni tegelikku kalibreerimist tuleb kindlaks teha süsteruumala ja kontsentratsiooni vaheline optimaalne suhe.

1.6.2. Proovi lahuse valmistamine

1.6.3. Parandused ebapuhtuste ja lisandite sisalduse jaoks

Tavaliselt on vajalik ühendite molekulmassiga M < 1000 sisalduse korrigeerimine, mis on tingitud mittepolümeersetest komponentidest (näiteks ebapuhtused ja/või lisandid), välja arvatud juhul, kui nende ühendite mõõdetud sisaldus on niigi < 1 %. Selleks analüüsitakse otse polümeerilahust või geelkromatograafi eluaati.

Kui eluaat on peale kolonni läbimist liiga lahja edasiseks analüüsiks, siis peab seda kontsentreerima. Vajalik võib olla eluaadi kuivaks aurutamine ja saadud jäägi uuesti lahustamine. Eluaati peab kontsentreerima tingimustel, mis ei põhjusta eluaadis muutusi. Geelkromatograafi eluaadi töötlemine sõltub kvantitatiivseks määramiseks kasutatavast analüütilisest meetodist.

1.6.4. Seadmed

Geelkromatograafia seadmed sisaldavad järgmisi komponente:

- mahuti lahustile,

- degaseerija (vajadusel),

- pump,

- pulsatsioonisummuti (vajadusel),

- injektsioonisüsteem,

- kromatograafilised kolonnid,

- detektor,

- kulumõõtja (vajadusel),

- andmesalvesti ja -töötleja,

- nõu jääkide jaoks.

Eelnevalt peab kindlaks tegema, et geelkromatograafia süsteem oleks kasutatavate lahustite suhtes inertne (näiteks tetrahüdrofuraani jaoks kasutada teraskapillaare).

1.6.5. Injektsiooni ja lahusti etteandmise süsteem

1.6.6. Kolonn

Sõltuvalt proovist kasutatakse polümeeri iseloomustamiseks kas ühte kolonni või mitut järjestikku ühendatud kolonni. Kolonni täitematerjalidena on kaubanduslikult kättesaadavad paljud poorsed kindlate omadustega ained (näiteks poori suurus, eksklusioonipiirid). Lahutamiseks kasutatava geeli või kolonni pikkuse valik sõltub nii proovi omadustest (hüdrodünaamiline ruumala, molekulmasside jaotus) kui ka spetsiifilistest lahutamistingimustest, nagu näiteks lahusti, temperatuur ja voolukiirus (1) (2) (3).

1.6.7. Teoreetilised taldrikud

N = 5,54

või

N = 16

kus

N on teoreetiliste taldrikute arv

Ve on piigi maksimumile vastav elutsiooniruumala

W on piigi laius baasjoonel

W1/2 on piigi laius poolel piigi kõrgusel.

1.6.8. Lahutamise efektiivsus

Lisaks ribalaiust määravale teoreetiliste taldrikute arvule on tähtis ka lahutamise efektiivsus, mis sõltub sellest, kui järsk on kalibreerimiskõvera tõus. Kolonni lahutuse efektiivsus saadakse järgmisest seosest:

– V

10M

≥ 6,0

cm3cm2

kus

Ve,Mx on polüstüreeni molekulmassiga Mx elutsiooniruumala

Ve,(10 Mx) on 10 korda suurema molekulmassiga polüstüreeni elutsiooniruumala.

Süsteemi lahutusvõimet defineeritakse tavaliselt järgmiselt:

= 2×

kus

Ve1, Ve2 on kahe polüstüreenistandardi elutsiooniruumalad piigi maksimumil

W1, W2 on piigi laiused baasjoonel

M1, M2 on piigi maksimumile vastavad molekulmassid (peaksid erinema 10 korda).

Kolonnisüsteemi R-väärtus peaks olema suurem kui 1,7 (4).

1.6.9. Lahustid

1.6.10. Temperatuurikontroll

Kriitilise tähtsusega komponentide (injektsioonisilmus, kolonnid, detektor ja torustik) temperatuur peab olema konstantne ja sobima kasutatavale lahustile.

1.6.11. Detektor

Detektori eesmärgiks on kolonnist elueeruva proovi kontsentratsiooni kvantitatiivne mõõtmine. Selleks, et vältida piikide tarbetut laienemist, peab detektori mõõteraku küveti ruumala olema võimalikult väike. See ei tohiks olla suurem kui 10 μl, välja arvatud valguse hajuvust ja viskoossust mõõtvate detektorite korral. Detektorina kasutatakse tavaliselt diferentsiaalrefraktomeetriat. Tingituna proovi või eluendi spetsiifilistest omadustest võib kasutada ka muud tüüpi detektsioonimeetodeid, nagu näiteks UV/VIS, IR, viskoossusdetektorid jms.

2. ANDMED JA NENDE ESITAMINE

2.1. Andmed

Hindamiskriteeriumitele ning andmete kogumisele ja töötlemisele esitatavate üksikasjaliste nõuete osas peaks järgima DIN standardit (1).

Iga proovi jaoks peab läbi viima kaks teineteisest sõltumatut katset. Neid katseid peab eraldi analüüsima. Kõikidel juhtudel on oluline arvestada ka pimekatse andmeid, mis on läbi viidud prooviga samadel katsetingimustel.

Üheselt mõistetavalt peab näitama, et mõõdetud väärtused on suhtelised väärtused, mis on ekvivalentsed kasutatud standardi molekulmassidega.

Peale retensiooniruumalade või -aegade kindlaksmääramist (mida võib parandada sisestandardite kasutamisega) esitatakse log Mp väärtused (kus Mp on kalibratsioonistandardi piigi maksimum) ühe järgnevalt toodud suuruse funktsioonina: Mn, Mw või Mw/Mn. Molekulmassi dekaadi (10-kordse vahemiku) kohta on vaja vähemalt kahte kalibreerimiskõvera punkti ja terve kõvera jaoks on vaja vähemalt viit mõõtepunkti, mis peaks hinnanguliselt katma proovi molekulmassi. Kalibreerimiskõvera madala molekulmassiga osa lõpp-punkt määratakse kindlaks n-heksüülbenseeni või muu sobiva mittepolaarse soluudi abil. Kõvera osa, mis vastab molekulmassidele alla 1000, analüüsitakse ja parandatakse ebapuhtuste ja lisandite suhtes. Elutsioonikõveraid analüüsitakse tavaliselt elektrooniliste andmetöötluse vahenditega. Käsitsi digitaliseerimise kasutamisel võib eeskujuks võtta standardi ASTM D 3536-91 (3).

Juhul, kui mis tahes lahustumatu polümeer jääb kolonni, siis on selle molekulmass tõenäoliselt suurem kui mis tahes komponendi oma lahustuvas fraktsioonis ja selle arvesse võtmata jätmisel hinnatakse üle madala molekulmassiga komponentide sisaldust. Madala molekulmassiga komponentide sisalduse määramise parandusjuhised lahustumatu polümeeri jaoks on toodud lisas.

2.2. Katseprotokoll

Katseprotokoll peab sisaldama järgmist informatsiooni:

2.2.1. Katsetatav aine

- olemasolev informatsioon analüüsitava aine kohta (identifitseerimiskood, lisandid, ebapuhtused),

- proovi eeltöötluse täpne kirjeldus, tähelepanekud, probleemid.

2.2.2. Aparatuur

- eluendi mahuti, inertgaas, eluendi degaseerimine, eluendi koostis, ebapuhtused,

- pump, pulsatsioonisummuti, injektsioonisüsteem,

- lahutuskolonnid (tootja, kõik kolonni näitajad nagu poori suurus, täitematerjali liik jms, kasutatavate kolonnide arv, pikkus ja järjekord),

- kolonni (või nende kombinatsiooni) teoreetiliste taldrikute arv, lahutamise efektiivsus (süsteemi lahutusvõime),

- andmed piikide sümmeetria kohta,

- kolonni temperatuur, temperatuurikontrolli liik,

- detektor (mõõtmise põhimõte, tüüp, küveti ruumala),

- kulumõõtja, kui kasutati (tootja, mõõte põhimõte),

- andmete salvestamise ja töötlemise süsteem (riist- ja tarkvara).

2.2.3. Süsteemi kalibreerimine

- kalibreerimiskõvera koostamiseks kasutatud meetodi täpne kirjeldus,

- andmed selle meetodi kvaliteedinõuete kohta (näiteks korrelatsioonikoefitsient, ruutsumma viga jms),

- andmed kõikide ekstrapoleerimiste, oletuste ja lähenduste kohta, mis tehti eksperimendi ning andmete hindamise ja töötlemise käigus,

- kõik kalibreerimiskõvera koostamiseks tehtud mõõtmised peavad olema dokumenteeritud tabelis, mis sisaldab kalibreerimiskõvera iga punkti kohta alljärgnevat informatsiooni:

- proovi nimetus,

- proovi tootja,

- tootjapoolsed või mõõtmistel saadud standardit iseloomustavad Mp, Mn, Mw ja Mw/Mn väärtused, koos määramismeetodi üksikasjadega,

- süsteruumala ja -kontsentratsioon,

- kalibreerimisel kasutatud Mp väärtus,

- piigi maksimumile vastav mõõdetud elutsiooniruumala või parandatud retensiooniaeg,

- piigi maksimumile arvutatud Mp,

- arvutatud Mp protsentuaalne viga ja kalibreerimistulemus.

2.2.4. Informatsioon madalamolekulaarse polümeeri sisalduse kohta

- analüüsimeetodite kirjeldus ja katsete läbiviimise viis,

- madalmolekulaarsete komponentide protsentuaalne sisaldus (massi järgi) võrreldes kogu prooviga,

- andmed ebapuhtuste, lisandite ja muude mittepolümeersete komponentide kohta massiprotsendina kogu proovist.

2.2.5. Hindamine

- retensiooniaja järgi hindamine: nõutava korratavuse tagamiseks kasutatavad meetodid (parandusmeetod, sisestandard jms),

- informatsioon selle kohta, kas hindamine viidi läbi elutsiooniruumala või retensiooniaja põhjal,

- informatsioon hindamise piiratuse kohta, kui piik ei ole täielikult analüüsitud,

- silumismeetodite kirjeldus, kui neid kasutati,

- proovi ettevalmistamise ja eeltöötluse protseduurid,

- lahustumatute osakeste olemasolu,

- süsteruumala (μl) ja -kontsentratsioon (mg/ml),

- tähelepanekud seikade kohta, mis võivad põhjustada kõrvalekaldumist ideaalsest geelkromatograafia profiilist,

- kõikide katseprotseduurides tehtud muudatuste üksikasjalik kirjeldus,

- veapiiride üksikasjalikud andmed,

- mis tahes muu informatsioon ja tähelepanekud, mis puudutavad tulemuste tõlgendamist.

3. VIITED

(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

--------------------------------------------------

LISA III C

A.20 POLÜMEERIDE LAHUSTUMIS-/EKSTRAHEERUMISKÄITUMINE VEES

1. MEETOD

Kirjeldatav meetod on OECD katsejuhendi nr 120 (1997) parandatud versiooni koopia. Täpsem tehniline lisainformatsioon on toodud kirjandusviites (1).

1.1. Sissejuhatus

Osade polümeeride nagu emulsioonipolümeerid korral on vajalik eeltöötlus enne allkirjeldatud meetodi kasutamist. Meetod ei ole kasutatav vedelate polümeeride ja katsetingimustel veega reageerivate polümeeride jaoks.

Kui meetod ei ole otstarbekohane või võimalik, siis võib polümeeri lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist uurida muude meetodite abil. Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendused.

1.2. Võrdlusained

Puuduvad.

1.3. Katsemeetodi põhimõte

Polümeeride lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist vesilahuses uuritakse muudatustega kolvimeetodil (vt A.6 vees lahustuvus, kolvimeetod), mida on alljärgnevalt kirjeldatud.

1.4. Kvaliteedinõuded

Puuduvad.

1.5. Katsemeetodi kirjeldus

1.5.1. Seadmed

Meetodi jaoks on vajalikud järgmised seadmed:

- purustamisseade, näiteks jahvatusmasin, kindla suurusega osakeste valmistamiseks,

- seade loksutamiseks, temperatuurikontrolli võimalusega,

- membraanfiltratsiooni süsteem,

- asjakohased analüütilised seadmed,

- standardsed sõelad.

1.5.2. Proovi ettevalmistus

Esindusliku proovi peab esmalt vähendama osakeste suuruseni 0,125 kuni 0,25 mm kasutades vastavaid sõelu. Proovi stabiilsuse tagamiseks või jahvatamisel võib vajalik olla jahutamine. Kummilaadseid materjale saab purustada vedela lämmastiku temperatuuril (1).

Kui soovitud osakeste suurusega fraktsioon ei ole saavutatav, peab vähendama osakeste suurust nii palju kui võimalik ja saadud tulemused protokollima. Protokollis peab täpselt ära näitama, mil viisil säilitati purustatud proovi enne katset.

1.5.3. Protseduur

Katsetatava aine kolm proovi (á 10 g) kaalutakse vastavalt kolme klaaskorgiga varustatud nõusse ja igaühte lisatakse 1000 ml vett. Kui polümeeri koguses 10 g ei ole võimalik käsitleda, siis peab kasutama suurimat kogust, mille käsitlemine on veel võimalik, ja muutma vastavalt sellele ka vee kogust.

Nõud suletakse tihedalt ja seejärel loksutatakse temperatuuril 20 °C. Kasutada tuleks konstantsel temperatuuril töötavat loksutit või segajat. Peale 24 tunni möödumist tsentrifuugitakse või filtritakse iga nõu sisu ja selges veefaasis määratakse polümeeri kontsentratsioon sobiva analüüsimeetodiga. Kui veefaasi jaoks puudub sobiv analüüsimeetod, siis võib summaarset lahustuvust/ekstraktiivsust hinnata filtril oleva jäägi või tsentrifuugimise sademe kuivkaalu põhjal.

Tavaliselt on vajalik ebapuhtuste ja lisandite ning madala molekulmassiga komponentide kvantitatiivne eristamine. Gravimeetrilise analüüsi korral on tähtis sooritada ka pimekatse ilma testaineta, et hinnata katseprotseduurist tingitud jääkide kogust.

Polümeeride lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist vesilahuses temperatuuril 37 °C ning pH 2 ja pH 9 juures võib määrata samal viisil, nagu kirjeldati katse läbiviimist temperatuuril 20 °C. Vastava pH väärtuse saavutamiseks võib lisada kas sobivaid puhvreid, happeid või aluseid, nagu vesinikkloriidhape, etaanhape, analüütilise puhtusega naatrium- või kaaliumhüdroksiid või ammoniaak.

Sõltuvalt analüüsimeetodist peaks tegema ühe või kaks katset. Kui polümeeri vesilahuse otsese analüüsi jaoks on olemas piisavalt spetsiifilised meetodid, siis piisab ühest eelnevalt kirjeldatud katsest. Kui sellised meetodid ei ole kättesaadavad ja polümeeri lahustumis- või ekstraheerumiskäitumise määramine piirdub vaid kaudse analüüsiga, kus määratakse veefaasi kogu orgaanilise süsiniku sisaldus (TOC), peab läbi viima lisakatse. Lisakatse hõlmab samuti kolme paralleelkatset, milles kasutatakse 10 korda väiksemat polümeerikogust ja sama veekogust, mida kasutati esimeses katses.

1.5.4. Analüüs

1.5.4.1. Ühe proovi suurusega läbiviidud katse

Polümeeri komponentide otseseks analüüsiks veefaasis võib olla sobivaid meetodeid. Alternatiivina saab kasutada lahustunud või ekstraheerunud polümeeri komponentide kaudset analüüsi, millega määratakse lahustuvate komponentide üldine sisaldus ning tehakse parandusi polümeerile mittespetsiifiliste komponentide osas.

Kõikide polümeeri komponentide analüüs veefaasis on võimalik:

kas piisavalt tundliku meetodiga, nagu näiteks

- kogu orgaanilise süsiniku määramine (TOC), kasutades persulfaadi või dikromaadiga lagundamist, tekkiva süsinikdioksiidi koguse määramiseks kasutatakse infrapunaspektroskoopiat või keemilisi analüüsimeetodeid,

- aatomabsorptsioonspektromeetria (AAS) või induktiivsidestunud plasma (ICP) emissioonspektromeetria, kui polümeer sisaldab räni või metalle,

- UV-absorptsioon või spektrofluoromeetria arüülpolümeeride jaoks,

- vedelikkromatograafia — mass-spektromeetria (LC-MS) madala molekulmassiga proovide jaoks,

või aurutades vee ekstrakti kuivjäägini ja saadud jääki analüüsitakse spektroskoopiliselt (IR, UV, jms) või AAS/ICP abil.

Kui veefaasi analüüs ei ole teostatav, siis peaks vesiekstrakti ekstraheerima vees segunematu orgaanilise lahustiga nagu näiteks klorosüsivesinikud. Lahusti aurutatakse ja saadud jäägis analüüsitakse ülalnimetatud polümeeri sisaldust. Selles jäägis sisalduvad ebapuhtusena või lisanditena identifitseeritud komponendid lahutatakse tulemusest, et määrata polümeeri lahustumis- või ekstraheerumisastet.

Kui proov sisaldab suhteliselt palju sellist materjali, siis võib jääki analüüsida vedelikkromatograafia (HPLC) või gaaskromatograafia (GC) abil, et eraldada ebapuhtused monomeeridest ja monomeeridest pärinevatest komponentidest nii, et saab määrata monomeeride tegeliku koguse.

Osadel juhtudel on piisav orgaanilise lahusti aurutamine kuivjäägini ja saadud jäägi kaalumine.

1.5.4.2. Kahe erineva proovi suurusega läbiviidud katse

Kõikides vesiekstraktides analüüsitakse kogu orgaanilist süsinikku (TOC).

Proovi lahustumatut või ekstraheerumatut osa analüüsitakse gravimeetriliselt. Kui peale iga nõu sisu tsentrifuugimist või filtrimist on nõu seintel polümeeri jääke, siis peab nõud loputama filtraadiga kuni nõu seintel ei ole jääke näha. Seejärel filtritakse või tsentrifuugitakse filtraati uuesti. Filtril või tsentrifuugiklaasis olevat jääki kuivatatakse temperatuuril 40 °C vaakumis ning kaalutakse. Kuivatamist jätkatakse kuni konstantse kaalu saavutamiseni.

2. ANDMED

2.1. Ühe proovi suurusega läbiviidud katse

Kõigi kolme kolvikatse tulemused ja keskmised väärtused peab esitama ja tulemused tuleb väljendada massiühikutes lahuse ruumala kohta (tüüpiliselt mg/l) või massiühikutes polümeeri proovi massi kohta (tüüpiliselt mg/g). Lisaks tuleb esitada ka proovi massikadu (arvutatakse soluudi massi jagamisel esialgse proovi massiga). Katsete puhul tuleks arvutada ka suhteline standardhälve (RSD). Kogu proovi (polümeer + olulised lisandid jms) ja ainult polümeeri (peale selliste lisandite mõju lahutamist) kohta peab esitama eraldi tulemused.

2.2. Kahe erineva proovi suurusega läbiviidud katse

Kahest kolme paralleelkatsega eksperimendist saadud TOC väärtused ja iga eksperimendi keskmine tuleb esitada massiühikuna lahuse ruumala kohta (tavaliselt mgC/l) ja massiühikuna proovi massi kohta (tavaliselt mgC/g).

Kõrge ja madala proovi/vee suhtega katsetulemuste vahelise erinevuse puudumine viitab sellele, et kõik ekstraheeruvad komponendid on ekstraheerunud. Sellistel juhtudel ei ole tavaliselt otsene analüüs vajalik.

Jääkide massid peab esitama ja tulemused tuleb väljendada protsendina proovi esialgsest massist. Iga katse jaoks peab arvutama keskmise. Erinevused 100 % ja leitud protsendi vahel esitavad lahustuva ja ekstraheeruva materjali protsendilist sisaldust esialgses proovis.

3. ARUANDLUS

3.1. Katseprotokoll

Katsetulemused peavad sisaldama järgmist informatsiooni:

3.1.1. Katsetatav aine

- olemasolev informatsioon analüüsitava ühendi kohta (identifitseerimiskood, lisandid, ebapuhtused, madala molekulmassiga komponentide sisaldus).

3.1.2. Katse tingimused

- kasutatud protseduuride kirjeldus ja katse tingimused,

- analüütiliste ja määramismeetodite kirjeldus.

3.1.3. Tulemused

- lahustuvuse/ekstraktiivsuse tulemused (mg/l); erinevates lahustes läbiviidud ekstraktsioonikatsete üksikud ja keskmised väärtused, lagunenud polümeeri sisaldus, ebapuhtused, lisandid jms,

- polümeeri lahustuvuse/ekstraktiivsuse tulemused (mg/g),

- kui mõõdeti, siis vee ekstraktide TOC tulemused, soluudi mass ja arvutatud protsendid,

- iga proovi pH väärtus,

- pimekatsete tulemused,

- kus vajalik, peab viitama katsetatava ühendi keemilisele ebastabiilsusele nii katse kui ka analüütilise protsessi käigus,

- kõik informatsioon, mis omab tähtsust tulemuste tõlgendamisel.

4. VIITED

(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

--------------------------------------------------

LISA III D

C.13 BIOKONTSENTRATSIOON: KALADEGA LÄBIVOOLUKATSE

1. MEETOD

Käesolev biokontsentratsiooni meetod on OECD katsejuhendi nr 305 (1996) koopia.

1.1. Sissejuhatus

Käesolev meetod kirjeldab ainete biokontsentratsiooni potentsiaali hindamist kalades läbivoolava vee tingimustes. Kuigi kindlalt tuleb eelistada läbivoolutingimustega katseid, on katsetes lubatav kasutada ka poolseisva vee tingimusi eeldusel, et valideerimisnõuded on täidetud.

Meetodi kirjeldus on piisavalt üksikasjalik katse läbiviimiseks, samas võimaldades küllaldast vabadust katse kohandamiseks vastavalt konkreetsetele laboritingimustele ja uuritavate ainete omadustele. Meetod sobib kõige paremini stabiilsete orgaaniliste ainete hindamiseks, mille log Pow väärtus on 1,5 kuni 6,0 (1), kuid seda saab kasutada ka superlipofiilsete ainete jaoks, mille log Pow > 6,0. Biokontsentratsiooni teguri (BCF) eelhinnang, mida tähistatakse ka kui KB, on selliste superlipofiilsete ainete jaoks eeldatavasti kõrgem kui laborikatsetest saadud püsioleku biokontsentratsiooni tegur (BCFSS). Biokontsentratsiooni teguri eelhinnanguid orgaaniliste kemikaalide jaoks, mille log Pow väärtused on kuni 9,0, saadakse Bintein et al. (2) võrranditest. Biokontsentratsiooni potentsiaali iseloomustavad parameetrid on seondumise kiiruskonstant (k1), puhastumise kiiruskonstant (k2) ja BCFSS.

Radiomärgistatud katseained lihtsustavad vee- ja kalaproovide analüüsimist ning neid võib kasutada otsustamisel, kas on vaja teha laguproduktide identifitseerimist ja kvantitatiivset analüüsi. Kogu radioaktiivse jäägi mõõtmisel (näiteks põletamisel või kudede lahustamisel) saadud BCF põhineb lähteainel, mis tahes säilinud metaboliitidel ja samuti assimileerunud süsinikul. Seetõttu ei ole kogu radioaktiivse jäägi mõõtmisel põhinev BCF otseselt võrreldav BCF-iga, mis on saadud ainult lähteaine analüüsil teatud keemiliste meetoditega.

Radiomärgistamisega uuringutes võib lähteainel põhineva BCF määramisel kasutada puhastamismenetlust ja vajadusel iseloomustada peamiseid metaboliite. Lisaks on võimalik kombineerida kalade metabolismi uuringut biokontsentratsiooni uuringuga, analüüsides ja identifitseerides kudedes jääke.

1.2. Mõisted ja ühikud

Biokontsentratsioon/bioakumulatsioon on uuritava aine kontsentratsiooni kasv organismis või selle pinnal (teatud kudedes) võrreldes uuritava aine kontsentratsiooniga ümbritsevas keskkonnas.

Biokontsentratsiooni tegur (BCF või KB) akumulatsioonikatse seondumisfaasi mis tahes ajahetkel on uuritava aine kontsentratsioon kalades (kala pinnal) või teatud kudedes (Cf, ühik μg/g (ppm)) jagatuna uuritava aine kontsentratsiooniga ümbritsevas keskkonnas (Cw, ühik μg/ml (ppm)).

Püsioleku biokontsentratsiooni tegur (BCFSS või KB) ei muutu märkimisväärselt pikemaajalise ajavahemiku vältel, kui uuritava aine kontsentratsioon ümbritsevas keskkonnas on selle ajavahemiku vältel konstantne.

Platoo või püsiolek saavutatakse kalades sisalduva uuritava aine kontsentratsiooni (Cf) ja aja funktsiooni esitaval kõveral siis, kui see saab paralleelseks ajateljega ja vähemalt kahepäevaste intervallidega võetud proovide kolm järjestikust Cf analüüsi tulemust on üksteise suhtes ±20 % ja kolme proovivõtmisperioodi vahel ei ole märkimisväärseid erinevusi. Ühendatud (puulitud) proovide analüüsimisel on nõutavad vähemalt neli järjestikust analüüsi. Aeglaselt seonduvate ainete jaoks on sobivamaks intervalliks seitse päeva.

Kineetilistest kiiruskonstantidest (k1/k2) otse arvutatud biokontsentratsiooni tegurit nimetatakse kineetiliseks biokontsentratsiooni teguriks BCFk.

Jaotuskoefitsient oktanool/vesi (Pow) on aine lahustuvuse suhe n-oktanoolis ja vees tasakaalutingimustel (meetod A.8), seda tähistakse ka Kow. Pow logaritmi kasutatakse kemikaali biokontsentratsiooni potentsiaali tähistamiseks veeorganismides.

Ekspositsiooni- või seondumisfaas on aeg, mille jooksul kala puutub kokku uuritava ainega.

Seondumise kiiruskonstant (k1) on numbriline väärtus, mis iseloomustab uuritava aine kontsentratsiooni kasvu kiirust kalas või kala pinnal (või teatud kudedes), kui kala puutub kokku selle ainega (k1 ühik on päev–1).

Ekspositsioonijärgne või puhastumise (kao) faas on aeg, mis järgneb kala viimisele uuritavat ainet sisaldavast keskkonnast ilma selle aineta keskkonda, mille kestel uuritakse selle aine puhastumist (või summaarset kadu) kalast (või teatud kudedest).

Puhastumise (kao) kiiruskonstant (k2) on numbriline väärtus, mis iseloomustab uuritava aine kontsentratsiooni vähenemise kiirust kalas (või teatud kudedes) peale kala viimist uuritavat ainet sisaldavast keskkonnast seda ainet mittesisaldavasse keskkonda (k2 ühik on päev–1).

1.3. Katsemeetodi põhimõte

Katse koosneb kahest faasist: ekspositsiooni (seondumise) faas ja ekspositsioonijärgne (puhastumise) faas. Seondumisfaasi ajal viiakse sama liiki kalade erinevad rühmad kokku uuritava aine vähemalt kahe kontsentratsiooniga. Seejärel viiakse kalad puhastumisfaasi jaoks uuritava aine vabasse keskkonda. Puhastumisfaas on alati vajalik, välja arvatud juhul, kui aine seondumine seondumisfaasis oli tähtsusetu (näiteks BCF < 10). Uuritava aine kontsentratsiooni kalas või kala pinnal (või teatud kudedes) jälgitakse katse mõlema faasi kestel. Lisaks kahele katses kasutatud kontsentratsioonile hoitakse kontrollrühma kalu samastes tingimustes ilma uuritava aineta, et võrrelda biokontsentratsiooni katse vältel täheldatud võimalikke ebasoodsaid mõjusid vastava kontrollrühmaga ja teha kindlaks uuritava aine foonilist (mõju mitte avaldavat) kontsentratsiooni.

Seondumisfaas kestab 28 päeva või vähem, kui on võimalik tõestada, et tasakaal püstitus varem. Seondumisfaasi pikkust ja püsioleku saavutamiseks kuluvat aega saab hinnata lisas 3 toodud võrrandi abil. Puhastumisperiood algab kala üleviimisega puhtasse nõusse, milles on sama keskkond, kuid mis ei sisalda uuritavat ainet. Võimalusel arvutatakse biokontsentratsiooni tegur nii kalas (Cf) ja vees (Cw) sisalduva uuritava aine kontsentratsiooni suhtena näivas püsiolekus (BCFSS) kui ka kineetilise biokontsentratsiooni tegurina (BCFk) seondumise kiiruskonstandi (k1) ja puhastumise kiiruskonstandi (k2) suhtest eeldades, et protsessid on esimest järku kineetikaga. Kui ilmselgelt ei ole tegemist esimest järku kineetikaga, siis peab kasutama keerulisemaid mudeleid (lisa 5).

Kui püsiolekut ei saavutata 28 päeva jooksul, siis peab seondumisfaasi pikendama kuni püsioleku saavutamiseni või 60 päeva pikkuseni, sõltuvalt kumb neist esimesena saavutatakse, misjärel alustatakse puhastumisfaasi.

Seondumise kiiruskonstant, puhastumise (kao) kiiruskonstant (või konstandid keerulisemate mudelite korral), biokontsentratsiooni tegur ja kus võimalik, iga nimetatud parameetri usalduspiirid arvutatakse mudelist, mis kirjeldab kõige paremini uuritava aine mõõdetud kontsentratsioone kalades ja vees.

BCF esitatakse kalade märgkaalu funktsioonina. Siiski võib erieesmärgil kasutada teatud kudesid või organeid (näiteks lihased, maks), kui kala on piisavalt suur või kui kala võib jagada söödavaks (filee) ja mittesöödavaks (sisikond) osaks. Kuna paljude orgaaniliste ainete potentsiaalse biokontsentratsiooni ja lipofiilsuse vahel on selge seos, siis on ka uuritava kala rasvasisalduse ja nende ainete vaadeldava biokontsentratsiooni vahel vastav seos. Seetõttu peaks kõrge lipofiilsusega ainete (näiteks log Pow > 3) biokontsentratsiooni väljendama lisaks kogukaalule ka rasvasisalduse suhtes, et vähendada katsetulemuste varieeruvust.

Võimalusel peaks rasvasisaldust määrama samast bioloogilisest materjalist, millest määrati uuritava aine kontsentratsioon.

1.4. Uuritava aine andmed

Enne biokontsentratsiooni katse teostamist peab uuritava aine kohta teadma järgmisi andmeid:

a) lahustuvus vees;

b) jaotuskoefitsient oktanool/vesi Pow (tähistatakse ka kui Kow ja määratakse HPLC meetodiga vastavalt punktile A.8);

c) hüdrolüüs;

d) fototransformatsioon vees, määratakse päikesekiirguse või simuleeritud päikesekiirguse abil biokontsentratsiooni katse kiiritustingimustel (3);

e) pindpinevus (ainete jaoks, mille log Pow väärtust ei saa määrata);

f) aururõhk;

g) kohene biolagunduvus (vajadusel),

Muu nõutav informatsioon on uuritava aine toksilisus katses kasutatava kalaliigi suhtes, eelistatult asümptootiline LC50 (st ajast sõltumatu). Teadaoleva mõõtetäpsusega, kordustäpsusega ja tundlikkusega sobilik meetod uuritava aine kvantitatiivse sisalduse määramiseks katselahustes ja bioloogilises materjalis peab olema kättesaadav koos üksikasjaliku kirjeldusega proovi ettevalmistamise ja säilitamise kohta. Samuti peab teadma testainete analüütilist määramispiiri vees ja kala kudedes. 14C-märgistatud uuritava aine kasutamisel on vaja teada ka lisanditest tingitud radioaktiivsuse protsenti.

1.5. Katse kehtivus

Katse kehtivuseks peavad olema täidetud alljärgnevad tingimused:

- temperatuuride erinevus alla ±2 °C,

- lahustunud hapniku sisaldus ei tohi langeda alla 60 % küllastuskontsentratsioonist,

- seondumisfaasis hoitakse uuritava aine kontsentratsiooni kambris ±20 % piires mõõdetud väärtuste keskmisest,

- suremus või muud ebasoodsad mõjud ja haigused kontroll- ja katserühma kaladel on katse lõpus alla 10 %; kui katse kestab mitmeid nädalaid või kuid, siis surm või muud ebasoodsad mõjud peavad mõlemas kalade rühmas olema vähem kui 5 % kuu kohta ja mitte ületama kokku 30 %.

1.6. Võrdlusained

Vajadusel on katsemenetluse kontrollimiseks hea kasutada teadaoleva biokontsentratsiooni potentsiaaliga võrdlusaineid. Siiski ei saa veel soovitada konkreetseid aineid.

1.7. Katsemeetodi kirjeldus

1.7.1. Seadmed

Katseseadme kõikide osade korral peab vältima materjalide kasutamist, mis võivad lahustuda, sorbeeruda või leostuda ning millel on kaladele ebasoodne mõju. Kasutada võib keemiliselt inertsetest materjalidest valmistatud standardseid nelinurkseid või silindrilisi mahuteid, mille mahutavus on kooskõlas voolukiirusega. Vältima peaks pehmest plastmassist torude kasutamist. Eelistatult kasutatakse teflonist (R), roostevabast terasest ja/või klaasist torustikku. Kogemustest on teada, et vaja võib minna kõrge absorptsioonikoefitsiendiga aineid, nagu sünteetilised püretroidid, silaniseeritud klaas. Sellistel juhtudel peab seadmed peale kasutamist ära viskama.

1.7.2. Vesi

Tavaliselt kasutatakse katses looduslikku vett, mida peaks saama saastumata ja ühtlase kvaliteediga allikast. Lahjendusvesi peab olema sellise kvaliteediga, mis tagab valitud kalaliikide ellujäämise aklimatsiooni- ja katseperioodide vältel, ilma et tekiks mis tahes ebanormaalse välimuse või käitumise ilminguid. Ideaaljuhul peaks saama näidata, et uuritavad liigid jäävad ellu, kasvavad ja paljunevad lahjendusvees (näiteks laborikultuur või elutsükli toksilisuse test). Kasutatavas vees peaks eelnevalt määrama vähemalt pH, üldkareduse, tahke jäägi, kogu orgaanilise süsiniku, eelistatult ka ammooniumi, nitriti sisalduse ja mereliikide korral ka soolsuse. Kalade optimaalseks kasvuks vajaminevad parameetrid on hästi teada, kuid lisas 1 on toodud mitmete parameetrite soovituslikud maksimumkontsentratsioonid mageda ja soolase vee katsetele.

Katseperioodi kestel peaks vesi olema konstantse kvaliteediga. Vee pH väärtus peaks olema vahemikus 6,0 kuni 8,5, kuid konkreetse katse ajal ei tohiks muutus olla suurem kui ±0,5 pH ühikut. Selleks, et lahjendusvesi ei mõjutaks liialt katsetulemusi (näiteks moodustades uuritava ainega kompleksühendeid) või kalade seisundit, peab teatud ajavahemike järel analüüsima veeproove. Seal kus lahjendusvesi on teadaolevalt suhteliselt püsiva kvaliteediga peaks raskemetallide (näiteks Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), peamiste anioonide ja katioonide (näiteks Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pestitsiidide (näiteks kõik fosfororgaanilised ja kõik kloororgaanilised pestitsiidid), üldise orgaanilise süsiniku ja suspendeerunud tahkete ainete sisaldust määrama näiteks iga kolme kuu järel. Kui vee kvaliteet on püsiv vähemalt ühe aasta vältel, siis võib erinevaid parameetreid analüüsida harvemini ja proovi võtmise ajavahemikke suurendada (näiteks iga kuue kuu järel).

Lahjendusvee loodusliku hõljuvaine (tahkete osakeste) sisaldus ja üldine orgaaniline süsinik (TOC) peaks olema võimalikult madalad, et vältida uuritava aine adsorptsiooni orgaanilisele hõljuvainele, mis võib vähendada selle biosaadavust (4). Tahkete osakeste maksimaalne vastuvõetav sisaldus on 5 mg/l (kuivaine, mis ei läbi 0,45 μm filtrit) ja üldise orgaanilise süsiniku sisaldus 2 mg/l (vt lisa 1). Vajadusel peaks vett enne kasutamist filtrima. Kalade (väljaheidete) ja toidujääkide panus orgaanilise süsiniku sisaldusele peaks olema võimalikult madal. Kogu katse kestel ei tohiks orgaanilise süsiniku sisaldus katseanumas ületada uuritavast ainest ja solubiseerijast (kui seda kasutatakse) pärineva orgaanilise süsiniku kontsentratsiooni mitte rohkem kui 10 mg/l (±20 %) võrra.

1.7.3. Katselahused

Uuritava aine põhilahus valmistatakse sobiva kontsentratsiooniga. Põhilahus valmistatakse eelistatult uuritava aine segamisel või loksutamisel lahjendusvees. Lahustite või dispergeerijate (solubiliseerijate) kasutamine ei ole soovitatav, siiski võib see olla mõningatel juhtudel vajalik piisavalt kontsentreeritud põhilahuse valmistamisel. Sobivad lahustid on etanool, metanool, etüleenglükool monometüüleeter, etüleenglükool dimetüüleeter, dimetüülformamiid ja trietüleenglükool. Sobivad dispergaatorid on Cremophor RH40, Tween 80, metüültselluloos 0,01 % ja HCO-40. Kergesti biolagunevate ühendite kasutamisega tuleb olla ettevaatlik, kuna need võivad läbivoolu katsetes põhjustada probleeme bakterite kasvuga. Uuritav aine võib olla radiomärgistatud ja ta peaks olema kõrgeima puhtusastmega (näiteks eelistatult > 98 %).

Läbivoolu katsete jaoks on nõutav süsteem (näiteks mõõtepump, proportsionaalne lahjendaja, küllastamissüsteem), mis jaotab ja lahjendab pidevalt uuritava aine põhilahust katsekambritesse. Katsekambris peaks vesi eelistatult vahetuma vähemalt viis kambri mahtu ööpäevas. Eelistatud on läbivoolurežiim, kuid kus see pole võimalik (näiteks mõjutab see katseorganisme kahjulikult), võib kasutada poolseisva veega katset eeldusel, et valideerimisnõuded on täidetud. Põhilahuse ja lahjendusvee voolukiiruseid peab kontrollima 48 tundi enne katset ja seejärel vähemalt iga päev katse vältel. Voolukiiruse kontroll peab hõlmama igat katsekambrit ja sellega tagatakse, et voolukiirus ei varieeru rohkem kui 20 % ühe katsekambri piires või katsekambrite vahel.

1.7.4. Liikide valik

Liikide valikukriteeriumiteks on kättesaadavus, sobiv suurus ja võimalus kalu laboritingimustes rahuldavalt pidada. Muud kalaliikide valikukriteeriumid hõlmavad harrastuslikku, kaubanduslikku ja ökoloogilist väärtust, aga ka samaväärset tundlikkust, varasemat edukat kasutamist jms.

Soovitatavad katseloomade liigid on toodud lisas 2. Kasutada võib ka muid liike, kuid see võib eeldada katsemenetluse kohandamist sobivate katsetingimuste loomiseks. Sellisel juhul tuleb esitada liikide ja katsemeetodi valiku põhjendused.

1.7.5. Kalade pidamine

Kalavarude populatsioon peab aklimatiseeruma vähemalt kaks nädalat katse temperatuuril oleva veega ja saama piisavalt sööta, mis on sama tüüpi katses kasutatava söödaga.

Peale 48tunnist sisseelamisperioodi märgitakse kalade suremus ja rakendatakse järgmisi kriteeriume:

- suremus on suurem kui 10 % populatsioonist seitsme päeva jooksul: terve partii loetakse sobimatuks,

- suremus on 5 % kuni 10 % populatsioonist seitsme päeva jooksul: kalu jälgitakse veel seitse päeva,

- suremus on vähem kui 5 % populatsioonist seitsme päeva jooksul: kalad loetakse sobivaks, kuid kui järgmise seitsme päeva jooksul ületab suremus 5 %, siis loetakse terve partii sobimatuks.

Eelnevalt peab veenduma, et katsetes kasutatavatel kaladel ei ole märgatavaid haigusi ja väärarenguid. Kõik haigestunud kalad tuleb jätta kõrvale. Kalu ei tohi ravida kaks nädalat enne katset või katse ajal.

1.8. Katse tegemine

1.8.1. Eelkatse

Eelkatse läbiviimine on vajalik selleks, et optimiseerida lõpliku katse tingimusi, nagu näiteks uuritava aine kontsentratsioonid, seondumis- ja puhastumisfaaside kestus.

1.8.2. Ekspositsioonitingimused

1.8.2.1. Seondumisfaasi kestus

Seondumisfaasi kestust saab ennustada praktilisele kogemusele tuginedes (näiteks eelnevast uuringust või sarnase kemikaali akumulatsiooni andmetest) või teatud empiiriliste seoste põhjal, milles kasutatakse uuritava aine lahustuvust vees või jaotuskoefitsienti oktanool/vesi (vt lisa 3).

Seondumisfaas kestab 28 päeva või kuni tasakaalu püstitumiseni. Kui püsiolekut ei saavutata 28 päeva jooksul, siis peab seondumisfaasi pikendama ja sooritama lisamõõtmisi, kuni püsioleku saavutamiseni või 60 päeva, sõltuvalt kumb neist esimesena saavutatakse.

1.8.2.2. Puhastumisfaasi kestus

Ajavahemik, mis võrdub poolega seondumisfaasi kestusest, on tavaliselt piisav aine sobivaks vähenemiseks (näiteks 95 %) kehakaalu kohta (vt lisa 3, hinnangute selgitused). Kui 95 % kao saavutamiseks vajaminev ajavahemik on ebapraktiliselt pikk, ületades näiteks kaks korda seondumisfaasi normaalset kestust (st üle 56 päeva), siis võib kasutada lühemat perioodi (st kuni testaine kontsentratsioon on alla 10 % püsioleku kontsentratsioonist). Ainete korral, mille seondumine ja puhastumine on palju keerulisema skeemiga, kui esimest järku kineetikaga ühekambriline kaladega mudel, on aine kadumise kiiruskonstantide määramiseks vajalik pikem puhastumisfaas. Nimetatud perioodi pikkus võib olla piiratud ajavahemikuga, mille kestel uuritava aine kontsentratsioon kalas jääb veel ülespoole analüütilisest määramispiirist.

1.8.2.3. Kalade arv

Kalade arv uuritava kontsentratsiooni kohta valitakse nii, et minimaalselt neli kala on proovi kohta iga proovivõtu korra jaoks. Suurema statistilise usaldusväärsuse tagamiseks on vaja proovi kohta suuremat kalade arvu.

Täiskasvanud kalade kasutamisel tuleb üles märkida katses kasutatud kalade sugu. Kui katses kasutatakse mõlemast soost kalu, siis peab enne ekspositsiooni algust dokumentaalselt näitama, et sugudevahelised rasvasisaldused ei erine märkimisväärselt; kusjuures vajalik võib olla kõikide isaste ja emaste kalade puulimine.

Iga üksiku katse jaoks peab valima sarnase kaaluga kalu, nii et kõige väiksemad kalad moodustaksid vähemalt kaks kolmandikku kõige suuremate kalade kaalust. Kõik kalad peaksid olema ühevanused ja pärinema ühest allikast. Kuna kalade kaal ja vanus mõjutavad mõnikord märkimisväärselt BCF väärtust (1), siis peab sellised üksikasjad täpselt kirja panema. Soovitatavalt võetakse enne katse algust kalavarudest väiksem valim, et hinnata kalade keskmist kaalu.

1.8.2.4. Sisselaskmine

Katse alguses kalade lisamisest põhjustatud Cw vähenemise minimiseerimiseks ja lahustunud hapniku kontsentratsiooni alanemise vältimiseks kasutatakse suurt vee ja kalade suhet. Sisselaskmiskiirus peab sobima katses kasutatavatele liikidele. Kõikidel juhtudel soovitatakse normaalselt sisselaskmiskiirust 0,1 kuni 1,0 g kala (märgkaal) liitri vee kohta päevas. Kui uuritava aine nõutavat kontsentratsiooni saab hoida ±20 % piirides ja lahustunud hapniku kontsentratsioon ei lange alla 60 % küllastumiskontsentratsioonist, siis võib kasutada ka suuremaid kiiruseid.

Sobivate sisselaskmisrežiimide valikul arvestatakse liigi normaalset looduslikku elukohta. Näiteks veekogu põhjas elavad kalad vajavad suuremat akvaariumi põhja pindala sama vee mahu korral võrreldes avamere liikidega.

1.8.2.5. Toitmine

Aklimatsiooni ja katseperioodi vältel toidetakse kalu sobiva toiduga, mille rasva- ja valgusisaldus on teada ning mille kogus on piisav, et hoida neid tervetena ja säilitada kehakaalu. Kalu söödetakse iga päev kogu aklimatsiooniperioodi ja katse vältel sellises koguses, mis on umbkaudu 1—2 % kehakaalust; see hoiab katse ajal enamuse kalaliikide rasvasisalduse suhteliselt püsival tasemel. Toidu kogust peab ümber arvutama näiteks korra nädalas, et säilitada ühtlast kehakaalu ja rasvasisaldust. Selle arvutuse jaoks võib kalade kaalu igas katsekambris hinnata viimati võetud kalaproovi kaalu põhjal. Kambrisse jäävaid kalu ei tohi kaaluda.

Söömata toit ja väljaheited imetakse sifooniga katsekambrist välja iga päev koheselt peale toitmist (30 minutit kuni tund). Katse ajal hoitakse kambreid nii puhtana kui võimalik, et orgaanilise aine kontsentratsioon oleks võimalikult madal, kuna orgaanilise süsiniku sisaldus võib piirata uuritava aine biosaadavust (1).

Kuna paljud toidusegud valmistatakse kalalihast, siis peab neis eelnevalt analüüsima uuritava aine sisaldust. Lisaks on soovitatav analüüsida toidus pestitsiide ja raskemetalle.

1.8.2.6. Valgus ja temperatuur

Valgustusperiood on tavaliselt 12 kuni 16 tundi ja temperatuur (±2 °C) peaks olema sobilik katses kasutatavatele liikidele (vt lisa 2). Valgustuse tüüp ja omadused peavad olema teada. Ettevaatlik peab olema uuritava aine võimaliku fototransformatsiooni suhtes katses kasutatavatel valgustustingimustel. Vältimaks kalade kokkupuudet mittelooduspärase valguskiirgusega, peab kasutama sobivat valgustusallikat. Osadel juhtudel võib kasutada filtrit, mis neelab ultraviolettkiirgust lainepikkusega alla 290 nm.

1.8.2.7. Uuritavad kontsentratsioonid

Kalu eksponeeritakse läbivoolu tingimustel vähemalt kahele uuritava aine kontsentratsioonile vees. Tavaliselt valitakse uuritava aine kõrge (või kõrgeim) kontsentratsioon, mis oleks umbes 1 % selle akuutsest asümptootilisest LC50 väärtusest ja see peaks olema vähemalt 10 korda kõrgem kui selle aine määramispiir vees kasutatava analüütilise meetodiga.

Kõrgeima katses kasutatava kontsentratsiooni määramiseks võib akuutse 96 tunni LC50 väärtuse jagada sobiva akuutse ja kroonilise väärtuse suhtega (sobivad suhted võivad mõnede kemikaalide jaoks olla 3 kuni 100). Võimalusel tuleb kontsentratsioonid valida nii, et nad erineksid ülaltoodust 10 korda. Kui see ei ole võimalik 1 % LC50 kriteeriumi ja analüütilise määramispiiri tõttu, siis peab kasutama väiksemat kordajat kui 10 või kaaluma 14C-märgistatud uuritava aine kasutamist. Kasutatav kontsentratsioon ei tohi olla suurem kui uuritava aine lahustuvus.

Solubiliseerija kasutamisel ei tohi selle kontsentratsioon olla suurem kui 0,1 ml/l ja see peab olema ühesugune kõigis katseanumates. Solubiliseerija ja testaine osakaalu üldise orgaanilise süsiniku sisaldusest katses kasutatavas vees peab teadma. Siiski tuleb võimalusel vältida selliste ainete kasutamist.

1.8.2.8. Kontrollkatsed

Lisaks katseseeriatele tuleb teostada üks lahjendusvee kontrollkatse või üks kontrollkatse solubiliseerijaga eeldusel, et kasutatav ühend ei mõjuta kalu. Kui ühendi mõju pole kindel, siis peab tegema mõlemad kontrollkatsed.

1.8.3. Veekvaliteedi mõõtmise sagedus

Katse ajal peaks kõikides kambrites mõõtma lahustunud hapniku, TOC, pH ja temperatuuri väärtusi. Vajadusel peaks mõõtma lisaks üldkaredust ja soolsust kontrollkatsetes ja ühes kõrge (või kõrgeima) kontsentratsiooniga kambris. Minimaalselt peaks lahustunud hapnikku ja soolsust mõõtma kolm korda — seondumisperioodi alguses, keskel ja lõpus ning puhastumisperioodi ajal korra nädalas. TOC peaks mõõtma katse alguses (24 tundi ja 48 tundi enne seondumisfaasi algust), enne kalade lisamist ja korra nädalas nii seondumis- kui ka puhastumisfaaside ajal. Temperatuuri peaks mõõtma iga päev, pH-d iga perioodi alguses ja lõpus ning karedust üks kord iga katse ajal. Eelistatult peaks temperatuuri jälgima pidevalt vähemalt ühes katseanumas.

1.8.4. Kalade ja vee proovide võtmine ning analüüs

1.8.4.1. Kalade ja vee proovivõtmise ajakava

Katsekambritest võetakse veeproove uuritava aine kontsentratsiooni määramiseks enne kalade sisselaskmist ning seondumis- ja puhastumisfaaside ajal. Minimaalselt võetakse veeproove samal ajal kalaproovidega ning enne toitmist. Seondumisfaasi ajal määratakse uuritava aine kontsentratsiooni selleks, et kontrollida vastavust valideerimisnõuetele.

Kalaproove võetakse vähemalt viiel korral seondumisfaasi ajal ja vähemalt neljal korral puhastumisfaasi ajal. Kuna osadel juhtudel on keeruline arvutada rahuldava täpsusega BCF väärtuse hinnangut sellise arvu proovide põhjal, eriti kui tegemist ei ole esimest järku puhastumiskineetikaga, siis on soovitatav sagedasem proovivõtmine mõlema perioodi ajal (vt lisa 4). Lisaproove säilitatakse ja analüüsitakse vaid siis, kui esimese ringi analüüsitulemused ei ole piisavad BCF arvutamiseks soovitud täpsusega.

Vastuvõetava proovivõtu ajakava näide on toodud lisas 4. Muid ajakavasid saab hõlpsasti arvutada kasutades Pow oletatavaid väärtusi, et arvutada 95 % seondumiseks vajaminevat ekspositsiooniaega.

Proovivõtmist jätkatakse seondumisfaasi ajal kuni püsioleku saavutamiseni või 28 päeva möödumiseni, vastavalt kumb on lühem ajavahemik. Kui püsiolekut ei saavutata 28 päeva jooksul, siis peab seondumisfaasi pikendama kuni püsioleku saavutamiseni või 60 päeva möödumiseni, sõltuvalt kumb neist esimesena saavutatakse. Enne puhastumisfaasi viiakse kalad puhastesse mahutitesse.

1.8.4.2. Proovivõtt ja proovi ettevalmistus

Analüüsimiseks imetakse veeproov sifooniga läbi inertse torustiku katsekambri keskosast. Kuna filtrimine või tsentrifuugimine ei lahuta alati uuritava aine mitte-biosaadavat fraktsiooni biosaadavast osast (eriti superlipofiilsed kemikaalid, näiteks mille log Pow > 5) (1) (5), siis alati ei tohi neid meetodeid kasutada.

Selle asemel peab kasutama meetmeid mahutite hoidmiseks võimalikult puhtana ja orgaanilise süsiniku sisaldust peaks jälgima nii seondumis- kui ka puhastumisfaaside ajal.

Iga proovivõtuga eemaldatakse katsekambritest sobiv arv kalu (tavaliselt minimaalselt neli). Proovivõtu käigus püütud kalu loputatakse kiiresti veega, kuivatatakse, tapetakse koheselt kõige sobivamal ja humaansemal viisil ning seejärel kaalutakse.

Eelistatult analüüsitakse kalu ja vett koheselt peale proovivõtmist, et vältida lagunemist või muid kadusid, ja katse jätkudes arvutatakse umbkaudsed seondumis- ja puhastumiskiirused. Kohene analüüs hoiab ära ka viivituse platoo saavutamise kindlaksmääramisel.

Kui kohene analüüs ei ole võimalik, siis säilitatakse proove sobival meetodil. Enne uuringu algust tehakse kindlaks sobiv meetod uuritava aine säilitamiseks, näiteks sügavkülmutamine, 4 °C juures hoidmine, säilitamise kestus, ekstraktsioon jms.

1.8.4.3. Analüüsimeetodi kvaliteet

Kuna kogu protseduuri täpsuse määrab peamiselt ära uuritava aine määramiseks kasutatava analüüsimeetodi mõõtetäpsus, kordustäpsus ja tundlikkus, siis peab eksperimentaalselt kontrollima, kas keemilise analüüsi täpsus ja korratavus ning uuritava aine eraldamine veest ja kaladest rahuldab selle meetodi tingimusi. Lisaks peab kontrollima, et lahjendusvees ei oleks uuritavat ainet määramispiiri ületavas koguses.

Vajadusel parandatakse katsest saadud Cw ja Cf väärtusi kontrollkatsetest saadud saagise ja foonilise kontsentratsiooni väärtustega. Kala ja vee proove käsitletakse nii, et saastumine ja kaod (näiteks adsorptsioon proovivõtuseadmesse) oleks võimalikult väikesed.

1.8.4.4. Kalaproovide analüüs

Kui katses kasutatakse radiomärgistatud aineid, siis on võimalik analüüsida kogu radioaktiivsust (st lähteainete ja metaboliitide) või puhastada proovi nii, et lähteainet saaks eraldi analüüsida. Peamisi metaboliite võib määrata püsiolekus või seondumisfaasi lõpus, sõltuvalt kumb neist saabub varem. Kui BCF on üldiste radiomärgistatud jääkide osas ≥ 1000 %, siis võib olla mõistlik (osade kemikaalide kategooriate nagu pestitsiidid jaoks tungivalt soovitatav) nende laguproduktide identifitseerimine ja kvantitatiivne analüüs, mis moodustavad püsiolekus ≥ 10 % kogu jääkidest kala kudedes. Laguproduktide, mis moodustavad ≥ 10 % kõikidest radiomärgistatud jääkidest kala kudedes, identifitseerimisel ja kvantitatiivsel analüüsil on soovitatav identifitseerida ja määrata nende kogus ka katsevees.

Igas kaalutud kalas peab määrama uuritava aine kontsentratsiooni. Kui see ei ole võimalik, siis võib iga proovivõtmise proovid liita (puulida), kuid selline liitmine piirab andmetega tehtavaid statistilisi arvutusi. Kui teatud statistilisi arvutusi ja suurt andmehulka peetakse tähtsaks, siis peab katses kasutama piisaval arvul kalu, et rahuldada soovitud liitmisprotseduuri ja andmehulga nõudeid (6) (7).

BCF esitatakse kogu märgkaalu funktsioonina ja kõrge lipofiilsusega ainete jaoks rasvasisalduse funktsioonina. Kalade rasvasisaldus määratakse võimalusel iga proovivõtu käigus. Rasvasisalduse määramiseks kasutatakse sobivaid meetodeid (lisa 3 viited 8 ja 2). Standardmeetodina võib soovitada kloroformi/metanooli ekstraktsioonitehnikat (9). Kuna erinevad meetodid ei anna samaseid tulemusi (10), siis on tähtis viidata kasutatavale meetodile. Võimalusel peaks rasvasisaldust analüüsima samas ekstraktis, mida kasutatakse uuritava aine analüüsiks, kuna lipiidid eemaldatakse sageli ekstraktist enne kromatograafilist analüüsi. Kala rasvasisaldus (mg/kg, märgkaal) ei tohiks katse lõpus erineda katse alguse väärtusest mitte rohkem kui ±25 %. Kudede tahke jäägi sisalduse peab samuti ära märkima, et rasva kontsentratsiooni märgkaalus oleks võimalik ümber arvutada kala kuivkaalu kohta.

2. ANDMED

2.1. Tulemuste töötlemine

Uuritava aine seondumiskõver saadakse seondumisfaasi kontsentratsiooni kalas või kala pinnal (või kindlaksmääratud kudedes) ja aja funktsioonina aritmeetilises skaalas. Kui kõver saavutab platoo ehk muutub ligikaudu asümptootiliseks ajateljega, siis arvutatakse püsioleku BCFSS järgmisest valemist:

püsioleku C

wkeskmine

Kui püsiolekut ei saavutata, siis on võimalik ohtlikkuse hindamiseks arvutada BCFSS piisava täpsusega "püsiolekust", mis on 80 % tasakaaluolekust (1,6/k2) või 95 % tasakaaluolekust (3,0/k2).

Lisaks saab määrata biokontsentratsiooni teguri (BCFk) kahe esimest järku kineetiliste konstantide k1/k2 suhtena. Puhastumise kiiruskonstant (k2) määratakse tavaliselt puhastumiskõveralt (st testaine kontsentratsiooni vähenemine kalades aja jooksul). Seondumise kiiruskonstant (k1) arvutatakse k2 ja Cf väärtuse järgi, mis leitakse seondumiskõveralt (vt lisa 5). Eelistatud meetod BCFk ja kiiruskonstantide k1 ja k2 määramiseks on mittelineaarne parameetrite hindamine arvutusprogrammiga (11). k1 ja k2 arvutamiseks võib kasutada ka graafilisi meetodeid. Kui puhastumiskõver ei ole ilmselgelt esimest järku, siis peab kasutama keerulisemaid mudeleid (vt lisa 3 viiteid) ja biostatistika spetsialistide abi.

2.2. Tulemuste tõlgendamine

Tulemuste tõlgendamisel peab olema ettevaatlik, kui uuritava lahuse mõõdetud kontsentratsioonitasemed on analüüsimeetodi määramispiiri ligidal.

Selgelt määratletud seondumis- ja puhastumiskõverad viitavad hea kvaliteediga biokontsentratsiooni andmetele. Seondumis- ja puhastumiskonstantide varieerumine kahe uuritava kontsentratsiooni vahel ei tohiks ületada 20 %. Täheldatud märkimisväärsed erinevused kahe kontsentratsiooni seondumis- ja puhastumiskiiruste vahel peab üles märkima ja andma võimalikud seletused. Üldiselt läheneb BCF usalduspiir hästi kavandatud uuringutes ±20 %.

3. ARUANDLUS

Katsetulemused peavad sisaldama järgmist informatsiooni:

3.1. Uuritav aine

- füüsikaline olek ja vajadusel füüsikalis-keemilised omadused,

- keemilised identifitseerimisandmed (sealhulgas vajadusel orgaanilise süsiniku sisaldus),

- radiomärgistatud ühendite puhul märgistatud aatomite täpne asukoht ja lisanditega seotud radioaktiivsuse protsent.

3.2. Katses kasutatavad liigid

- teaduslik nimetus, liin, allikas, olemasolul eeltöötlused, aklimatiseerumine, suuruste vahemik jms.

3.3. Katse tingimused

- kasutatav katsemenetlus (läbivoolava või poolseisva veega),

- kasutatava valgustuse tüüp ja omadused ning valgustuse kestus(ed),

- katse ülesehitus (näiteks katsekambrite arv ja suurus, vee vahetumise kiirus, paralleelkatsete arv, kalade arv paralleelkatsetes, uuritud kontsentratsioonide arv, seondumis- ja puhastumisfaaside pikkus, vee ja kala proovide võtmise sagedus),

- põhilahuste valmistamismeetod ja uuendamise sagedus (solubiliseerija kasutamisel peab tooma selle kontsentratsiooni ja mõju orgaanilise süsiniku sisaldusele katsevees),

- nominaalsed uuritud kontsentratsioonid, mõõdetud väärtuste keskmised ja nende standardhälbed katsenõudes ning nende saamismeetod,

- lahjendusvee allikas, eeltöötluse kirjeldus, tõendid selle kohta, et kalad suudavad selles vees elada, ja vee omadused: pH, karedus, temperatuur, lahustunud hapniku kontsentratsioon, kloori jääksisaldus (kui mõõdeti), üldine orgaaniline süsinik, hõljuvained, katsekeskkonna soolsus (kui on asjakohane) ja muud sooritatud mõõtmised,

- vee kvaliteet katseanumates, pH, karedus, TOC, temperatuur ja lahustunud hapniku kontsentratsioon,

- üksikasjalik informatsioon kalade toitmise kohta (toidu tüüp, allikas, koostis (kui võimalik, siis vähemalt rasva- ja valgusisaldus), toidu kogus ja toitmise sagedus),

- andmed kala ja vee proovide töötlemise kohta, sealhulgas valmistamise üksikasjad, säilitamine, ekstraktsioon ning testaine ja rasvasisalduse (kui mõõdeti) analüütilised protseduurid (ja täpsus).

3.4. Tulemused

- eeluuringute tulemused (kui teostati),

- kontrollkatse ja iga katsekambri kalade suremus ning mis tahes täheldatud ebanormaalne käitumine,

- kalade rasvasisaldus (kui määratakse katses),

- kõverad (sealhulgas mõõdetud andmed), mis näitavad uuritava aine seondumist ja puhastumist kalades, aeg püsioleku saavutamiseks,

- Cf ja Cw väärtused (kui asjakohane, siis ka standardhälve ja määramispiirkond) kõikide proovivõtmisaegade jaoks (Cf ühik on μg/g märgkaal (ppm) terve keha või teatud kudede jaoks, nagu rasvad, ja Cw ühik on μg/ml (ppm)), lisaks peab esitama kontrollkatsete Cw väärtused (samuti peab esitama fooni määramise katse andmed),

- püsioleku biokontsentratsiooni tegur (BCFSS) ja/või kineetiline biokontsentratsiooni tegur (BCFk) ja sobivuse korral seondumise ja puhastumise (kao) kiiruskonstantide 95 % usalduspiirid (kõiki väljendatakse terve kala suhtes ja kui mõõdeti, siis looma või teatud kudede kogu rasvasisaldus), võimalusel usalduspiirid ja standardhälve ning uuritava aine iga kontsentratsiooni jaoks kasutatud arvutusmeetod ja andmetöötlus,

- radiomärgistatud ühendite kasutamisel võib vajadusel esitada andmed mis tahes määratud metaboliitide akumuleerumise kohta,

- kõik ebatavaline katse kohta, mis tahes kõrvalekaldumine protseduuridest ja muu asjakohane informatsioon.

Tulemusi stiilis "ei määratud määramispiiri läheduses" peab vältima eelkatse meetodi arendamise ja eksperimentaalse ülesehitusega, kuna selliseid tulemusi ei saa kasutada kiiruskonstandi arvutamisel.

4. VIITED

(1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117–156.

(2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29–390.

(3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.

(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.

(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.

(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.

(7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Evironmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.

(8) Compaan H. (1980) in "The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation", Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands.

(9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099–1105.

(10) Randall R. C., Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L. and Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431–1436.

(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method- Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm.

(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.

--------------------------------------------------

31998L0073