KOMISSION DIREKTIIVI 98/73/EY,

annettu 18 päivänä syyskuuta 1998,

vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY mukauttamisesta tekniikan kehitykseen kahdennenkymmenennenneljännen kerran (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,

ottaa huomioon vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkitsemistä koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä 27 päivänä kesäkuuta 1967 annetun neuvoston direktiivin 67/584/ETY (1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 97/69/EY (2), ja erityisesti sen 28 artiklan,

sekä katsoo, että

direktiivin 67/548/ETY liite I sisältää vaarallisten aineiden luettelon sekä kunkin aineen luokitusta ja merkintöjä koskevat vaatimukset; kyseisen liitteen vaarallisten aineiden luettelo on muutettava ja täydennettävä tieteellisen ja teknisen nykytietämyksen perusteella,

direktiivin 67/548/ETY liitteessä V säädetään menetelmistä aineiden ja valmisteiden fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien, toksisuuden ja ekotoksisuuden määrittämiseksi; kyseinen liite on mukautettava tekniikan kehitykseen, ja

tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat vaarallisten aineiden ja valmisteiden kaupan teknisten esteiden poistamiseksi annettujen direktiivien mukauttamista tekniseen kehitykseen käsittelevän komitean lausunnon mukaiset,

ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:

1 artikla

Muutetaan direktiivi 67/548/ETY seuraavasti:

1. Muutetaan liite I seuraavasti:

a) Korvataan direktiivin 67/548/ETY liitteen I kohdat tämän direktiivin liitteen I vastaavilla kohdilla.

b) Lisätään tämän direktiivin liitteen II kohdat direktiivin 67/548/ETY liitteeseen I.

2. Muutetaan liite V seuraavasti:

a) Lisätään tämän direktiivin liitteiden III A, III B ja III C tekstit direktiivin 67/548/ETY liitteessä V olevaan A osaan.

b) Lisätään tämän direktiivin liitteen III D teksti direktiivin 67/548/ETY liitteessä V olevaan C osaan.

2 artikla

Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaan viimeistään 31 päivänä lokakuuta 1999. Niiden on ilmoitettava tästä komissiolle välittömästi.

Kyseisissä jäsenvaltioiden antamissa säädöksissä on viitattava tähän direktiiviin tai niitä virallisesti julkaistaessa niihin on liitettävä tällainen viittaus. Jäsenvaltioiden on päätettävä siitä, miten tällaiset viittaukset tehdään.

3 artikla

Tämä direktiivi tulee voimaan kahdentenakymmenentenä päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä.

4 artikla

Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.

Tehty Brysselissä 18 päivänä syyskuuta 1998.

Komission puolesta

Ritt BJERREGAARD

Komission jäsen

(1) EYVL 196, 16.8.1967, s. 1

(2) EYVL L 343, 13.12.1997, s. 19

ANEXO I - BILAG I - ANHANG I - ÐÁÑÁÑÔÇÌÁ I - ANNEX I - ANNEXE I - ALLEGATO I - BIJLAGE I - ANEXO I - LIITE I - BILAGA I

>VIITTAUS KAAVIOON>

ANEXO II - BILAG II - ANHANG II - ÐÁÑÁÑÔÇÌÁ II - ANNEX II - ANNEXE II - ALLEGATO II - BIJLAGE II - ANEXO II - LIITE II - BILAGA II

>VIITTAUS KAAVIOON>

LIITE III A

A.18. POLYMEERIEN LUKUKESKIMÄÄRÄINEN MOLEKYYLIPAINO JA MOLEKYYLIPAINOJAKAUMA

1. MENETELMÄ

Tämä geelipermeaatiokromatografiamenetelmä (GPC) on toisinto OECD:n testausohjeesta N:o 118 (1996). Menetelmän periaatteet ja teknisiä lisätietoja on viitteessä 1.

1.1. Johdanto

Koska polymeerien ominaisuudet ovat hyvin vaihtelevia, on mahdotonta antaa yhtä ainoaa menetelmää ja täsmällisiä erotus- ja arviointiohjeita, jotka sopisivat kaikkiin polymeerien erotuksessa mahdollisesti esiintyviin tapauksiin. Erityisesti monimutkaisia polymeeriseoksia voi olla mahdoton erottaa geelipermeaatiomenetelmällä. Jos GPC:tä ei voi käyttää, voidaan molekyylipaino määrittää muilla tavoilla (katso liite). Tällaisissa tapauksissa on käytetystä menetelmästä annettava yksityiskohtaiset tiedot ja perustelut on esitettävä.

Jäljempänä esitettävä menetelmä perustuu DIN-standardiin 55672 (1). Yksityiskohtaiset ohjeet kokeiden suorittamiseksi ja tulosten arvioimiseksi annetaan kyseisessä DIN-standardissa. Jos koe-olosuhteita täytyy muuttaa, on muutokset perusteltava. Muita standardeja saa käyttää, jos niistä annetaan täydelliset viitteet. Tässä menetelmässä käytetään kalibrointiin polystyreeninäytteitä, johon sisältyvien polymeerien koot tunnetaan, ja menetelmää voi joutua muuttamaan, jotta sitä voitaisiin käyttää tietyille polymeereille, esim. vesiliukoisille ja pitkäketjuisille haaraantuville polymeereille.

1.2. Määritelmät ja yksiköt

Lukukeskimääräinen molekyylipaino Mn ja painokeskimääräinen molekyylipaino Mw määritetään seuraavilla yhtälöillä:

Mn = >NUM>Ói = lnHi

>DEN>Ói = ln

>NUM>Hi/

>DEN>Mi

Mw = >NUM>Ói = lnHixMi

>DEN>Ói = lnHi

joissa

Hi on detektorisignaalin korkeus perustasosta retentiotilavuudelle Vi,

Mi on retentiotilavuutta Vi vastaava polymeerifraktion molekyylipaino ja

n on mittauspisteiden lukumäärä.

Molekyylipainojakauman leveys, joka kuvastaa seoksen dispersiivisyyttä, saadaan suhteesta Mw/Mn.

1.3. Vertailuaineet

Koska GPC on suhteellinen menetelmä, on tehtävä kalibrointi. Tähän käytetään tavallisesti kokojakaumaltaan kapeita lineaarisia polystyreenistandardeja, joiden keskimääräiset molekyylipainot Mn ja Mw sekä molekyylipainojakauma tunnetaan. Kalibrointikäyrää voidaan käyttää tuntemattoman näytteen molekyylipainon määritykseen vain, jos näytteen ja standardin erotusolosuhteet on valittu samalla tavalla.

Molekyylipainon ja eluutiotilavuuden suhde on validi ainoastaan tietyn kokeen tietyissä koeolosuhteissa. Tärkeitä tekijöitä ovat ennen kaikkea lämpötila, liuotin (tai liuotinseos), kromatografiajärjestely sekä erotuspylväs tai pylväsjärjestelmä.

Tällä tavoin määritetyt näytteen molekyylipainot ovat suhteellisia arvoja ja niistä käytetään nimitystä "polystyreeniekvivalenttimolekyylipaino". Tämä tarkoittaa sitä, että riippuen näytteen ja standardien rakenne-eroista ja kemiallisista eroista molekyylipainot voivat poiketa absoluuttisista arvoista enemmän tai vähemmän. Jos käytetään muita standardeja, esim. polyetyleeniglykolia, polyetyleenioksidia, polymetyylimetakrylaattia tai polyakryylihappoa, on syy ilmoitettava.

1.4. Testimenetelmän periaate

Sekä näytteen molekyylipainojakauma että keskimääräiset molekyylipainot Mn ja Mw voidaan määrittää GPC:llä. GPC on erityinen nestekromatografian laji, jossa näytteen erottaminen perustuu seoksen yksittäisten aineiden hydrodynaamisiin tilavuuksiin (2).

Erottuminen tapahtuu, kun näyte kulkee huokoisella aineella, tyypillisesti orgaanisella geelillä täytetyn pylvään läpi. Pienet molekyylit tunkeutuvat huokosiin, kun taas suuret molekyylit jäävät huokosten ulkopuolelle. Isojen molekyylien kulkema tie on siten lyhyempi, ja ne tulevat ensimmäisenä ulos pylväästä. Keskikokoiset molekyylit tunkeutuvat joihinkin huokosiin ja eluoituvat myöhemmin. Pienimmät molekyylit, joiden keskimääräinen hydrodynaaminen säde on pienempi kuin geelin huokoset, voivat tunkeutua kaikkiin huokosiin. Ne eluoituvat viimeisinä.

Ihanteellisessa tilanteessa erottumiseen vaikuttaa ainoastaan molekyylilajin koko, mutta käytännössä on vaikea välttää ainakin jonkin verran adsorptiosta aiheutuvaa haittaa. Epätasaisesti pakattu pylväs ja kuolleet tilavuudet voivat pahentaa tilannetta (2).

Detektorina käytetään esim. taitekerroin- tai UV-detektoria, ja tuloksena saadaan yksinkertainen jakaumakäyrä. Jotta käyrästä voidaan lukea oikeita molekyylipainoja, on pylväs kalibroitava molekyylipainoltaan tunnetuilla polymeereillä, joilla on mieluiten suunnilleen samanlainen rakenne, esim. erilaiset polystyreenistandardit. Tuloksena on tyypillisesti Gaussin käyrä, joka on joskus vääristynyt siten, että pienen molekyylipainon puolella on "häntä"; pystysuoralla akselilla on eluoitujen molekyylilajien määrät painomitoissa ja vaaka-akselilla molekyylipainon logaritmi.

1.5. Laatukriteerit

Eluutiotilavuuden toistettavuuden (keskihajonnan keskivirhe: RSD) olisi oltava parempi kuin 0,3 %. Määrityksen vaadittu toistettavuus on varmistettava sisäistä standardia käyttämällä, jos kromatogrammin arviointi on aikariippuvainen eikä täytä edellä mainittuja kriteerejä (1). Polydispersiivisyys riippuu standardien molekyylipainoista. Polystyreenistandardien osalta tyypillisiä arvoja ovat:

>TAULUKON PAIKKA>

1.6. Testimenetelmän kuvaus

1.6.1. Polystyreenistandardiliuosten valmistus

Polystyreenistandardit liuotetaan sekoittamalla huolellisesti haluttuun eluointiliuokseen. Valmistajan ohjeet on otettava huomioon liuosten valmistuksessa.

Valittujen standardien pitoisuudet riippuvat eri tekijöistä, esim. injektiotilavuudesta, liuoksen viskositeetistä ja detektorin herkkyydestä. Suurin injektiotilavuus on sovitettava pylvään pituuden mukaan, ettei pylvästä kuormiteta liikaa. Tyypilliset injektiotilavuudet käytettäessä GPC:tä analyyttisiin erotuksiin pylväässä, jonka koko on 30 cm × 7,8 mm, ovat tavallisesti 40-100 ìl. Suuremmat tilavuudet ovat mahdollisia, mutta eivät saisi olla enemmän kuin 250 ìl. Injektiotilavuuden ja aineen pitoisuuden paras suhde on määritettävä ennen pylvään varsinaista kalibrointia.

1.6.2. Näyteliuoksen valmistus

Periaatteessa samat vaatimukset koskevat näyteliuosten valmistamista. Näyte liuotetaan sopivaan liuottimeen (esim. tetrahydrofuraaniin (THF)) ravistamalla huolellisesti. Sitä ei saa missään tapauksessa liuottaa ultraäänihauteessa. Tarpeen vaatiessa näyte puhdistetaan suodattamalla kalvolla, jonka huokoskoko on 0,2-2 ìm.

Jos näytteessä on liukenemattomia hiukkasia, on tämä kirjattava loppuraporttiin, koska se saattaa johtua suurikokoisista molekyyleistä. Liukenemattomien hiukkasten painoprosenttiosuus on määritettävä jollakin sopivalla menetelmällä. Liuokset on käytettävä vuorokauden sisällä.

1.6.3. Laitteisto

- liuotinsäiliö

- kaasunpoistolaite (tarvittaessa)

- pumppu

- pulssinvaimennin (tarvittaessa)

- injektiojärjestelmä

- kromatografiapylväät

- ilmaisin (detektori)

- virtausmittari (tarvittaessa)

- tulosten tallennus/prosessointilaite

- jäteastia

On varmistettava, että GPC-laitteisto ei reagoi käytettävien liuottimien kanssa (esim. THF:n kanssa on käytettävä teräskapillaareja).

1.6.4. Injektiojärjestelmä ja liuottimen annostelujärjestelmä

Määrätty näytetilavuus syötetään pylvääseen joko automaattisella näytteensyöttölaitteella tai käsin tarkasti määriteltyyn vyöhykkeeseen. Jos ruiskun mäntää vedetään tai työnnetään liian nopeasti, se voi aiheuttaa muutoksia havaitussa molekyylipainojakaumassa. Liuotinta pumppaavien pumppujen olisi oltava mahdollisimman tasaisia ja niissä saisi mieluiten olla pulssinvaimennin. Virtausnopeuden pitäisi olla noin 1 ml/min.

1.6.5. Pylväs

Näytteestä riippuen polymeerin ominaisuudet määritetään käyttäen joko yhtä pylvästä tai useita peräkkäin kytkettyjä pylväitä. Kaupallisesti on saatavilla lukuisia pylväsmateriaaleja, joiden ominaisuudet on määritelty (esim. huokoskoko, ekskluusiorajat). Erotusgeelin ja pylvään pituuden valinta riippuu sekä näytteen ominaisuuksista (hydrodynaamiset tilavuudet, molekyylipainojakauma) että erotuksen erityisvaatimuksista kuten liuottimesta, lämpötilasta ja virtausnopeudesta (1) (2) (3).

1.6.6. Teoreettiset levyt

Käytettävästä pylväästä tai pylväsyhdistelmästä on tiedettävä teoreettisten levyjen lukumäärä. Tätä varten syötetään pituudeltaan tunnettuun pylvääsen - jos THF on eluutioliuotin - etyylibentseeniliuosta tai muuta sopivaa ei-polaarista liuotinta. Teoreettisten levyjen lukumäärä saadaan seuraavasta yhtälöstä:

N = 5,54 (

>NUM>Ve

>DEN>W½

)2 tai N = 16 (

>NUM>Ve

>DEN>W

)2

jossa

N on teoreettisten levyjen lukumäärä

Ve on eluutiotilavuus piikin maksimin kohdalla

W on piikin leveys perusviivalla

W½ on piikin leveys piikin korkeuden puolivälissä.

1.6.7. Erotusteho

Teoreettisten levyjen lukumäärän lisäksi, joka on vyöhykkeen leveyden määräävä suure, myös erotusteholla on osansa. Erotustehon määrää kalibraatiokäyrän jyrkkyys. Pylvään erotusteho saadaan seuraavasta yhtälöstä:

>NUM>Ve,M - Ve,(10M

>DEN>pylvään leikkauksen pinta-ala

≥ 6.0 [

>NUM>cm3

>DEN>cm2

]

jossa

Ve,M on sellaisen polystyreenin, jonka molekyylipaino on Mx, eluutiotilavuus

Ve,(10M on molekyylipainoltaan kymmenen kertaa suuremman polystyreenin eluutiotilavuus.

Järjestelmän erotuskyky määritellään yleensä seuraavasti:

R1,2 = 2 × >NUM>Ve1 - Ve2

>DEN>W1 + W2

× >NUM>1

>DEN>log10(M2/M1)

jossa

Ve1, Ve2 ovat kahden polystyreenistandardin eluutiotilavuudet piikin maksimissa

W1, W2 ovat piikin leveydet perusviivalla

M1, M2 ovat molekyylipainot piikin maksimissa (niiden ero pitäisi olla vähintään 10-kertainen).

Pylvään R-arvon olisi oltava suurempi kuin 1,7 (4).

1.6.8. Liuottimet

Kaikkien liuottimien on oltava korkeaa puhtauslaatua (THF:n puhtaus 99,5 %). Liuotinastian (tarvittaessa inertissä kaasussa) on oltava riittävän iso pylvään kalibroimiseen ja useiden näytteiden määrittämiseen. Liuottimesta on poistettava kaasut ennen kuin sitä pumpataan pylvääseen.

1.6.9. Lämpötilansäätö

Tärkeiden laitteiston sisäisten osien (injektiosilmukka, pylväät, detektori ja letkut/putket) lämpötilan olisi oltava vakaa ja valitulle liuottimelle sopiva.

1.6.10. Detektori

Detektorin tarkoitus on mitata pylväästä tulevan näytteen pitoisuus. Jotta piikit eivät leviäisi tarpeettomasti, on detektorin mittauskyvetin tilavuuden oltava mahdollisimman pieni. Se ei saisi olla suurempi kuin 10 ìl paitsi valon sirontaa tai viskositeettia mittaavilla detektoreilla. Detektorina käytetään tavallisesti differentiaalirefraktometriä. Muitakin detektoreja, esim. UV/VIS-, IR- ja viskositeettidetektoreja voidaan käyttää, mikäli näytteen tai eluutioliuottimen erityiset ominaisuudet edellyttävät sitä.

2. MÄÄRITYSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN

2.1. Määritystulokset

Yksityiskohtaisten arviointiperusteiden samoin kuin määritystulosten keräämisen ja käsittelyn osalta on noudatettava DIN-standardin (1) määrityksiä.

Kustakin näytteestä tehdään kaksi erillistä koetta, jotka on analysoitava erikseen.

Mn, Mw, Mw/Mn ja Mp on ilmoitettava jokaisesta mittauksesta. On ilmoitettava selvästi, että mitatut arvot ovat suhteellisia arvoja, jotka ovat suhteessa käytettyjen standardien molekyylipainoihin.

Kun retentiotilavuudet tai retentioajat (mahdollisesti korjattuina sisäisten standardien suhteen) on määritetty, esitetään log Mp -arvot (Mp on kalibrointistandardin piikin korkein kohta) jonkin edellä mainitun suureen funktiona. Kutakin molekyylipainon kymmentä potenssia kohti tarvitaan vähintään kaksi kalibrointipistettä ja koko käyrällä on oltava vähintään viisi mittauspistettä, joiden pitäisi kattaa näytteen arvioitu molekyylipainoalue. Kalibrointikäyrän loppupiste pienen molekyylipainon päässä määritetään n-heksyylibentseenin tai jonkin muun sopivan ei-polaarisen liuottimen avulla Mn ja Mw määritetään tavallisesti tietokoneella osastossa 1.2. esitettyjen kaavojen perusteella. Jos käytetään manuaalista digitointia, voidaan ohjeeksi katsoa menetelmää ASTM D 3536-91 (3).

Jakaumakäyrä on esitettävä taulukon tai kuvan muodossa (differentiaalinen taajuus tai summaprosenttiosuudet log M:n funktiona). Graafisessa esityksessä yksi molekyylipainon kymmenen potenssi pitäisi olla tavallisesti noin 4 cm leveä ja piikin maksimin pitäisi olla noin 8 cm korkea. Koko jakaumakäyrän osalta y-akselin korkeuden 0 ja 100 %:n välillä olisi oltava noin 10 cm.

2.2. Testiraportti

Testiraportissa on esitettävä seuraavat asiat:

2.2.1. Testattava aine

- saatavissa olevat tiedot testattavasta aineesta (tunnistetiedot, lisäaineet, epäpuhtaudet);

- näytteen käsittelyn kuvaus, mahdolliset huomiot ja ongelmat.

2.2.2. Laitteisto

- eluenttisäiliö, inertti kaasu, kaasun poisto eluentista, eluentin koostumus, epäpuhtaudet

- pumppu, pulssinvaimennin, injektiojärjestelmä

- erotuspylväät (valmistaja, kaikki tiedot pylväiden ominaisuuksista kuten huokoskoko, erotusmateriaalin tyyppi jne., käytettävien pylväiden lukumäärä, pituus ja järjestys)

- pylvään (tai pylväsyhdistelmän) teoreettisten levyjen lukumäärä, erotusteho (järjestelmän erotuskyky)

- piikkien symmetriaa koskevat tiedot

- pylvään lämpötila, lämpötilan säätötapa

- detektori (mittausperiaate, tyyppi, kyvetin tilavuus)

- mahdollinen virtausmittari (valmistaja, mittausperiaate)

- mittaustulosten tallennus- ja käsittelyjärjestelmä (laitteet ja ohjelmat).

2.2.3. Järjestelmän kalibrointi

- kalibrointikäyrän määrittämiseksi käytetyn menetelmän tarkka kuvaus

- tiedot menetelmän laatukriteereistä (esim. korrelaatiokerroin, jäännösneliösumma jne.)

- tiedot kaikista kokeen aikana sekä tulosten arvioinnissa ja käsittelyssä suoritetuista ekstrapolaatioista, oletuksista, ja aproksimaatioista

- kaikki kalibrointikäyrän määrittämiseksi käytetyt mittaukset on esitettävä taulukossa, jossa esitetään myös seuraavat tiedot kustakin kalibrointipisteestä:

- näytteen nimi

- aineen valmistaja

- valmistajan ilmoittamat tai mittauksista johdetut standardien Mp, Mn, Mw ja Mw/Mn ominaisarvot sekä tarkat tiedot niiden määritysmenetelmästä

- injektiotilavuus ja injektoitavan liuoksen pitoisuus

- kalibrointiin käytetty Mp - arvo

- eluutiotilavuus tai piikin maksimissa mitattu korjattu retentioaika

- piikin maksimissa laskettu Mp

- laskemalla saadun Mp:n ja kalibrointiarvon prosenttivirhe.

2.2.4. Arviointi

- aikaperusteinen arviointi: toistettavuuden varmistamiseen käytetyt menetelmät (korjausmenetelmä, sisäinen standardi jne.)

- suoritetaanko arviointi eluutiotilavuuden vai retentioajan perusteella

- tiedot arvion rajoituksista, jos piikkiä ei analysoida täydellisesti

- mahdollisten tasoitusmenetelmien kuvaus

- näytteen valmistus ja esikäsittely

- mahdolliset liukenemattomat hiukkaset

- injektiotilavuus (ìl) ja injektoitavan näytteen pitoisuus (mg/ml)

- huomiot seikoista, joista aiheutuu poikkeamista ihanteellisesta GPC-käyttäytymisestä

- tarkka kuvaus kaikista testausmenetelmien muutoksista

- virherajoja koskevat yksityiskohtaiset tiedot

- kaikki tulosten tulkintaan vaikuttavat tiedot ja huomiot.

3. KIRJALLISUUSVIITTEET

(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Liite

Esimerkkejä muista menetelmistä polymeerien lukukeskimääräisen molekyylipainon (Mn) määrittämiseksi

Geelipermeaatiokromatografia (GPC) on paras menetelmä Mn:n määrittämiseksi, erityisesti, jos on käytettävissä sarja standardeja, joiden rakenne vastaa polymeerin rakennetta. Jos kuitenkin GPC:n käytössä on käytännön hankaluuksia tai on odotettavissa, että aine ei täytä säädettyä Mn-kriteeriä (joka on varmistettava), voidaan käyttää muita menetelmiä, kuten

1. Kolligatiivisten ominaisuuksien käyttö

1.1. Ebullioskopia/kryoskopia: Tässä mitataan kiehumispisteen ylenemä (ebullioskopia) tai jäätymispisteen alenema (kryoskopia), kun liuokseen lisätään tutkittavaa polymeeriä. Menetelmä perustuu siihen, että liuenneen polymeerin vaikutus nesteen kiehumis/jäätymispisteeseen riippuu polymeerin molekyylipainosta (1) (2).

Soveltamisala: Mn

LIITE III B

A.19. PIENIMOLEKYYLISTEN AINEIDEN PITOISUUS POLYMEERISSÄ

1. MENETELMÄ

Tämä geelipermeaatiokromatografiamenetelmä on toisinto OECD:n testausohjeesta N:o 119 (1996). Perusperiaatteet ja teknisiä lisätietoja saa kirjallisuusviitteistä.

1.1. Johdanto

Koska polymeerien ominaisuudet vaihtelevat suuresti, on mahdotonta kuvata yhtä ainoaa menetelmää, jossa selitettäisiin täsmällisesti kaikki polymeerien erotuksessa mahdollisesti esiintyvät erityiset seikat kattavat erotus- ja analysointiedellytykset. Erityisesti kompleksiset polymeerijärjestelmät eivät useinkaan sovi geelipermeaatiokromatografiaan. Kun GPC:tä ei voida käyttää, molekyylipaino voidaan määrittää muilla menetelmillä (katso Liite). Tällöin on esitettävä käytettyä menetelmää koskevat yksityiskohdat ja perustelut.

Seuraavassa kuvattava menetelmä perustuu DIN-standardiin 55672 (1). Tässä standardissa esitetään yksityiskohtaisesti, miten kokeet suoritetaan ja tulokset arvioidaan. Jos koeolosuhteita täytyy muuttaa, on muutokset perusteltava. Muita standardeja voi käyttää, jos niistä annetaan täydelliset viitteet. Tässä kuvattavassa menetelmässä käytetään tunnetun polydispersiivisyyden omaavia polystyreeninäytteitä kalibrointiin, ja menetelmää on mahdollisesti muutettava tiettyjä polymeerejä varten, esim. vesiliukoisia ja pitkäketjuisia haaraisia polymeerejä varten.

1.2. Määritelmät ja yksiköt

Matalaksi molekyylipainoksi määritellään pienempi kuin 1 000 (daltonia).

Mn (lukukeskimääräinen molekyylipaino) ja Mw (painokeskimääräinen molekyylipaino) määritellään seuraavilla yhtälöillä:

Mn = >NUM>Ói = lnHi

>DEN>Ói = ln

>NUM>Hi/

>DEN>Mi

Mw = >NUM>Ói = lnHixMi

>DEN>Ói = lnHi

joissa

Hi on detektorisignaalin korkeus perustasosta retentiotilavuudelle Vi,

Mi on polymeerifraktion molekyylipaino retentiotilavuudessa Vi, ja

n on mittauspisteiden lukumäärä.

Molekyylipainojakauman leveys, joka on suhteessa järjestelmän dispersiivisyyteen, saadaan suhteesta Mw/Mn.

1.3. Vertailuaineet

Koska GPC on suhteellinen menetelmä, on tehtävä kalibrointi. Tähän käytetään tavallisesti kokojakaumaltaan kapeita lineaarisia polystyreenistandardeja, joiden keskimääräiset molekyylipainot Mn ja Mw sekä molekyylipainojakauma tunnetaan. Kalibrointikäyrää voidaan käyttää tuntemattoman näytteen molekyylipainon määritykseen vain, jos näytteen ja standardin erotusolosuhteet on valittu samalla tavalla.

Molekyylipainon ja eluutiotilavuuden suhde on validi ainoastaan tietyn kokeen tietyissä koeolosuhteissa. Tärkeitä tekijöitä ovat ennen kaikkea lämpötila, liuotin (tai liuotinseos), kromatografiajärjestely sekä erotuspylväs tai pylväsjärjestelmä.

Tällä tavoin määritetyt näytteen molekyylipainot ovat suhteellisia arvoja ja niistä käytetään nimitystä "polystyreeniekvivalenttimolekyylipaino". Tämä tarkoittaa sitä, että riippuen näytteen ja standardien rakenne-eroista ja kemiallisista eroista molekyylipainot voivat poiketa absoluuttisista arvoista enemmän tai vähemmän. Jos käytetään muita standardeja, esim. polyetyleeniglykolia, polyetyleenioksidia, polymetyylimetakrylaattia tai polyakryylihappoa, on syy ilmoitettava.

1.4. Testimenetelmän periaate

Sekä näytteen molekyylipainojakauma että keskimääräiset molekyylipainot Mn ja Mw voidaan määrittää GPC:llä. GPC on erityinen nestekromatografian laji, jossa näytteen erottaminen perustuu seoksen yksittäisten aineiden hydrodynaamisiin tilavuuksiin (2).

Erottuminen tapahtuu, kun näyte kulkee huokoisella aineella, tyypillisesti orgaanisella geelillä täytetyn pylvään läpi. Pienet molekyylit tunkeutuvat huokosiin, kun taas suuret molekyylit jäävät huokosten ulkopuolelle. Isojen molekyylien kulkema tie on siten lyhyempi, ja ne tulevat ensimmäisenä ulos pylväästä. Keskikokoiset molekyylit tunkeutuvat joihinkin huokosiin ja eluoituvat myöhemmin. Pienimmät molekyylit, joiden keskimääräinen hydrodynaaminen säde on pienempi kuin geelin huokoset, voivat tunkeutua kaikkiin huokosiin. Ne eluoituvat viimeisinä.

Ihanteellisessa tilanteessa erottumiseen vaikuttaa ainoastaan molekyylilajin koko, mutta käytännössä on vaikea välttää ainakin jonkin verran adsorptiosta aiheutuvaa haittaa. Epätasaisesti pakattu pylväs ja kuolleet tilavuudet voivat pahentaa tilannetta (2).

Detektorina käytetään esim. taitekerroin- tai UV-detektoria, ja tuloksena saadaan yksinkertainen jakaumakäyrä. Jotta käyrästä voidaan lukea oikeita molekyylipainoja, on pylväs kalibroitava molekyylipainoltaan tunnetuilla polymeereillä, joilla on mieluiten suunnilleen samanlainen rakenne, esim. erilaiset polystyreenistandardit. Tuloksena on tyypillisesti Gaussin käyrä, joka on joskus vääristynyt siten, että pienen molekyylipainon puolella on "häntä"; pystysuoralla akselilla on eluoitujen molekyylilajien määrät painomitoissa ja vaaka-akselilla molekyylipainon logaritmi.

1.5. Laatukriteerit

Eluutiotilavuuden toistettavuuden (keskihajonnan keskivirhe: RSD) olisi oltava parempi kuin 0,3 %. Määrityksen vaadittu toistettavuus on varmistettava sisäistä standardia käyttämällä, jos kromatogrammin arviointi on aikariippuvainen eikä täytä edellä mainittuja kriteerejä (1). Polydispersiivisyys riippuu standardien molekyylipainoista. Polystyreenistandardien osalta tyypillisiä arvoja ovat:

M>TAULUKON PAIKKA>

1.6. Testimenetelmän kuvaus

1.6.1. Polystyreenistandardiliuosten valmistus

Polystyreenistandardit liuotetaan sekoittamalla huolellisesti haluttuun eluointiliuokseen. Valmistajan ohjeet on otettava huomioon liuosten valmistuksessa.

Valittujen standardien pitoisuudet riippuvat eri tekijöistä, esim. injektiotilavuudesta, liuoksen viskositeetistä ja detektorin herkkyydestä. Suurin injektiotilavuus on sovitettava pylvään pituuden mukaan, ettei pylvästä kuormiteta liikaa. Tyypilliset injektiotilavuudet käytettäessä GPC:tä analyyttisiin erotuksiin pylväässä, jonka koko on 30 cm × 7,8 mm, ovat tavallisesti 40-100 ìl. Suuremmat tilavuudet ovat mahdollisia, mutta eivät saisi olla enemmän kuin 250 ìl. Injektiotilavuuden ja aineen pitoisuuden paras suhde on määritettävä ennen pylvään varsinaista kalibrointia.

1.6.2. Näyteliuoksen valmistus

Periaatteessa samat vaatimukset koskevat näyteliuosten valmistamista. Näyte liuotetaan sopivaan liuottimeen (esim. tetrahydrofuraaniin (THF) ravistamalla huolellisesti. Sitä ei saa missään tapauksessa liuottaa ultraäänihauteessa. Tarpeen vaatiessa näyte puhdistetaan suodattamalla kalvolla, jonka huokoskoko on 0,2-2 ìm.

Jos näytteessä on liukenemattomia hiukkasia, on tämä kirjattava loppuraporttiin, koska se saattaa johtua suurikokoisista molekyyleistä. Liukenemattomien hiukkasten painoprosenttiosuus on määritettävä jollakin sopivalla menetelmällä. Liuokset on käytettävä vuorokauden sisällä.

1.6.3. Epäpuhtauksista ja lisäaineista johtuvat korjaukset

Molekyylipainoltaan alle 1 000 olevien molekyylien suhteen on yleensä tehtävä korjaus, joka aiheutuu ei-polymeerisistä komponenteista (esim. epäpuhtaudet ja/tai lisäaineet), ellei pitoisuus jo ole pienempi kuin 1 %. Tämä tehdään analysoimalla suoraan polymeeriliuos tai GPC-eluaatti.

Jos eluaatti on pylväästä tultuaan liian laimea analysoitavaksi edelleen, se on konsentroitava. Voi olla tarpeen haihduttaa se kuiviin ja liuottaa uudelleen. Konsentroiminen on tehtävä siten, ettei eluaatissa tapahdu muutoksia. Eluaatin käsittely GPC-vaiheen jälkeen riippuu kvantitatiiviseen määritykseen käytettävästä analyyttisestä menetelmästä.

1.6.4. Laitteisto

GPC-laitteistoon kuuluu seuraavat osat:

- liuotinsäiliö

- kaasunpoistolaite (tarvittaessa)

- pumppu

- pulssinvaimennin (tarvittaessa)

- injektiojärjestelmä

- kromatografiapylväät

- ilmaisin (detektori)

- virtausmittari (tarvittaessa)

- tulosten tallennus/prosessointilaite

- jäteastia.

On varmistettava, että GPC-laitteisto ei reagoi käytettävien liuottimien kanssa (esim. THF:n kanssa on käytettävä teräskapillaareja).

1.6.5. Injektiojärjestelmä ja liuottimen annostelujärjestelmä

Määrätty näytetilavuus syötetään pylvääseen joko automaattisella näytteensyöttölaitteella tai käsin tarkasti määriteltyyn vyöhykkeeseen. Jos ruiskun mäntää vedetään tai työnnetään liian nopeasti, se voi aiheuttaa muutoksia havaitussa molekyylipainojakaumassa. Liuotinta pumppaavien pumppujen olisi oltava mahdollisimman tasaisia ja niissä saisi mieluiten olla pulssinvaimennin. Virtausnopeuden pitäisi olla noin 1 ml/min.

1.6.6. Pylväs

Näytteestä riippuen polymeerin ominaisuudet määritetään käyttäen joko yhtä pylvästä tai useita peräkkäin kytkettyjä pylväitä. Kaupallisesti on saatavilla lukuisia pylväsmateriaaleja, joiden ominaisuudet on määritelty (esim. huokoskoko, ekskluusiorajat). Erotusgeelin ja pylvään pituuden valinta riippuu sekä näytteen ominaisuuksista (hydrodynaamiset tilavuudet, molekyylipainojakauma) että erotuksen erityisvaatimuksista kuten liuottimesta, lämpötilasta ja virtausnopeudesta (1) (2) (3).

1.6.7. Teoreettiset levyt

Käytettävästä pylväästä tai pylväsyhdistelmästä on tiedettävä teoreettisten levyjen lukumäärä. Tätä varten syötetään pituudeltaan tunnettuun pylvääseen - jos THF on eluutioliuotin - etyylibentseeniliuosta tai muuta sopivaa ei-polaarista liuotinta. Teoreettisten levyjen lukumäärä saadaan seuraavasta yhtälöstä:

N = 5,54 (

>NUM>Ve

>DEN>W½

)2 tai N = 16 (

>NUM>Ve

>DEN>W

)2

jossa

N on teoreettisten levyjen lukumäärä

Ve on eluutiotilavuus piikin maksimin kohdalla

W on piikin leveys perusviivalla

W½ on piikin leveys piikin korkeuden puolivälissä.

1.6.8. Erotusteho

Teoreettisten levyjen lukumäärän lisäksi, joka on vyöhykkeen leveyden määräävä suure, myös erotusteholla on osansa. Erotustehon määrää kalibraatiokäyrän jyrkkyys. Pylvään erotusteho saadaan seuraavasta yhtälöstä:

>NUM>Ve,M - Ve,(10M

>DEN>pylvään läpileikkauksen pinta-ala

≥ 6,0 [

>NUM>cm3

>DEN>cm2

]

jossa

Ve, M on sellaisen polystyreenin, jonka molekyylipaino on Mx, eluutiotilavuus

Ve,(10M on molekyylipainoltaan kymmenen kertaa suuremman polystyreenin eluutiotilavuus.

Järjestelmän erotuskyky määritellään yleensä seuraavasti:

R1,2 = 2 × >NUM>Ve1 - Ve2

>DEN>W1 + W2

× >NUM>1

>DEN>log10(M2/M1)

jossa

Ve1, Ve2 ovat kahden polystyreenistandardin eluutiotilavuudet piikin maksimissa

W1, W2 ovat piikin leveydet perusviivalla

M1, M2 ovat molekyylipainot piikin maksimissa (niiden ero pitäisi olla vähintään 10-kertainen)

Pylvään R-arvon olisi oltava suurempi kuin 1,7 (4).

1.6.9. Liuottimet

Kaikkien liuottimien on oltava korkeaa puhtauslaatua (THF:n puhtaus 99,5 %). Liuotinastian (tarvittaessa inertissä kaasussa) on oltava riittävän iso pylvään kalibroimiseen ja useiden näytteiden määrittämiseen. Liuottimesta on poistettava kaasut ennen kuin sitä pumpataan pylvääseen.

1.6.10. Lämpötilansäätö

Tärkeiden laitteiston sisäisten osien (injektiosilmukka, pylväät, detektori ja letkut/putket) lämpötilan olisi oltava vakaa ja valitulle liuottimelle sopiva.

1.6.11. Detektori

Detektorin tarkoitus on mitata pylväästä tulevan näytteen pitoisuus. Jotta piikit eivät leviäisi tarpeettomasti, on detektorin mittauskyvetin tilavuuden oltava mahdollisimman pieni. Se ei saisi olla suurempi kuin 10 ìl paitsi valon sirontaa tai viskositeettia mittaavilla detektoreilla. Detektorina käytetään tavallisesti differentiaalirefraktometriä. Muitakin detektoreja, esim. UV/VIS-, IR- ja viskositeettidetektoreja voidaan käyttää, mikäli näytteen tai eluutioliuottimen erityiset ominaisuudet edellyttävät sitä.

2. MÄÄRITYSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN

2.1. Määritystulokset

Yksityiskohtaisten arviointiperusteiden samoin kuin määritystulosten keräämisen ja käsittelyn osalta on noudatettava DIN-standardin (1) määräyksiä.

Kustakin näytteestä tehdään kaksi erillistä koetta, jotka on analysoitava erikseen.

Mn, Mw, Mw/ Mn ja Mp on ilmoitettava jokaisesta mittauksesta. On ilmoitettava selvästi, että mitatut arvot ovat suhteellisia arvoja, jotka ovat suhteessa käytettyjen standardien molekyylipainoihin.

Kun retentiotilavuudet tai retentioajat (mahdollisesti korjattuina sisäisten standardien suhteen) on määritetty, esitetään log Mp-arvot (Mp on kalibrointistandardin piikin korkein kohta) jonkin edellä mainitun suureen funktiona. Kutakin molekyylipainon kymmenen potenssia kohti tarvitaan vähintään kaksi kalibrointipistettä ja koko käyrällä on oltava vähintään viisi mittauspistettä, joiden pitäisi kattaa näytteen arvioitu molekyylipainoalue. Kalibrointikäyrän loppupiste pienen molekyylipainon päässä määritetään n-heksyylibentseenin tai jonkin muun sopivan ei-polaarisen liuottimen avulla. Mn ja Mw määritetään tavallisesti tietokoneella osastossa 1.2 esitettyjen kaavojen perusteella. Jos käytetään manuaalista digitointia, voidaan ohjeeksi katsoa menetelmää ASTM D 3536-91 (3).

Jakaumakäyrä on esitettävä taulukon tai kuvan muodossa (differentiaalinen taajuus tai summaprosenttiosuudet log M:n funktiona). Graafisessa esityksessä yksi molekyylipainon kymmenen potenssi pitäisi olla tavallisesti noin 4 cm leveä ja piikin maksimin pitäisi olla noin 8 cm korkea. Koko jakaumakäyrän osalta y-akselin korkeuden 0 ja 100 %:n välillä olisi oltava noin 10 cm.

2.2. Testiraportti

Testiraportissa on esitettävä seuraavat asiat:

2.2.1. Testattava aine

- saatavissa olevat tiedot testattavasta aineesta (tunnistetiedot, lisäaineet, epäpuhtaudet)

- näytteen käsittelyn kuvaus, mahdolliset huomiot ja ongelmat.

2.2.2. Laitteisto

- eluenttisäiliö, inertti kaasu, kaasun poisto eluentista, eluentin koostumus, epäpuhtaudet

- pumppu, pulssinvaimennin, injektiojärjestelmä

- erotuspylväät (valmistaja, kaikki tiedot pylväiden ominaisuuksista kuten huokoskoko, erotusmateriaalin tyyppi jne, käytettävien pylväiden lukumäärä, pituus ja järjestys)

- pylvään (tai pylväsyhdistelmän) teoreettisten levyjen lukumäärä, erotusteho (järjestelmän erotuskyky)

- piikkien symmetriaa koskevat tiedot

- pylvään lämpötila, lämpötilan säätötapa

- detektori (mittausperiaate, tyyppi, kyvetin tilavuus)

- mahdollinen virtausmittari (valmistaja, mittausperiaate)

- mittaustulosten tallennus- ja käsittelyjärjestelmä (laitteet ja ohjelmat).

2.2.3. Järjestelmän kalibrointi

- kalibrointikäyrän määrittämiseksi käytetyn menetelmän tarkka kuvaus

- tiedot menetelmän laatukriteereistä (esim. korrelaatiokerroin, jäännösneliösumma jne.)

- tiedot kaikista kokeen aikana sekä tulosten arvioinnissa ja käsittelyssä suoritetuista ekstrapolaatioista, oletuksista ja aproksimaatioista

- kaikki kalibrointikäyrän määrittämiseksi käytetyt mittaukset on esitettävä taulukossa, jossa esitetään myös seuraavat tiedot kustakin kalibrointipisteestä:

- näytteen nimi

- aineen valmistaja

- valmistajan ilmoittamat tai mittauksista johdetut standardien Mp Mn, Mw ja Mw/Mn ominaisarvot sekä tarkat tiedot niiden määritysmenetelmästä

- injektiotilavuus ja injektoitavan liuoksen pitoisuus

- kalibrointiin käytetty Mp-arvo

- eluutiotilavuus tai piikin maksimissa mitattu korjattu retentioaika

- piikin maksimissa laskettu Mp

- laskemalla saadun Mp:n ja kalibrointiarvon prosenttivaihe.

2.2.4. Tiedot pienimolekyylipainoisen polymeerin pitoisuudesta

- käytettyjen analyysimenetelmien kuvaus ja kokeiden suoritustapa

- tiedot pienimolekyylipainoisen aineen pitoisuusprosentista (w/w) suhteessa koko näytteeseen

- tiedot epäpuhtauksista, lisäaineista ja muista ei-polymeerisistä aineista painoprosentteina koko näytteestä.

2.2.5. Arviointi

- aikaperusteinen arviointi: toistettavuuden varmistamiseen käytetyt menetelmät (korjausmenetelmä, sisäinen standardi jne.)

- suoritetaanko arviointi eluutiotilavuuden vai retentioajan perusteella

- tiedot arvion rajoituksista, jos piikkiä ei analysoida täydellisesti

- mahdollisten tasoitusmenetelmien kuvaus

- näytteen valmistus ja esikäsittely

- mahdolliset liukenemattomat hiukkaset

- injektiotilavuus (ìl) ja injektoitavan näytteen pitoisuus (mg/ml)

- huomiot seikoista, joista aiheutuu poikkeamista ihanteellisesta GPC-käyttäytymisestä

- tarkka kuvaus kaikista testausmenetelmien muutoksista

- virherajoja koskevat yksityiskohtaiset tiedot

- kaikki tulosten tulkintaan vaikuttavat tiedot ja huomiot.

3. KIRJALLISUUSVIITTEET

(1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J.Wiley and Sons.

(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Liite

Ohjeet pienimolekyylipainoisten aineiden pitoisuuden korjaamiseksi, jos näytteessä on liukenematonta polymeeriä

Jos näytteessä on liukenematonta polymeeriä, aiheuttaa se massakatoa GPC-analyysissä. Liukenematon polymeeri tarttuu pylvääseen tai näytesuodattimeen, kun taas näytteen liukoinen osa menee pylvään läpi. Jos polymeerin taitekerroindifferentiaali (inkrementti) (dn/dc) voidaan arvioida tai mitata, voidaan arvioida pylvääseen hävinnyt näytemassa. Tällöin tehdään korjaus ulkoisella kalibroinnilla käyttäen standardiaineita, joiden konsentraatio ja dn/dc tunnetaan, refraktometrin vasteen kalibroimiseksi. Seuraavassa esimerkissä käytetään poly(metyylimetakrylaatti) (pMMA) -stardardia.

Akryylipolymeerianalyysin ulkoisessa kalibroinnissa analysoidaan tetrahydrofuraanissa oleva, tietyn konsentraatin omaava pMMA-standardi GPC:llä, ja tuloksien avulla määritetään refraktometrivakio seuraavalla yhtälöllä:

K = >NUM>R/ >DEN>(C × V × >NUM>dn/

>DEN>dc

)

,

jossa

K on refraktometrivakio (mikrovolttiasekunti/ml),

R on pMMA-standardin vaste (mikrovolttiasekunti),

C on pMMA-standardin konsentraatio (mg/ml),

V on injektiovolyymi (ml) ja

dn/dc on tetrahydrofuraanissa olevan pMMA-standardin taitekerroindifferentiaali (ml/mg).

Seuraavat tiedot ovat tyypillisiä pMMA-standardille:

R = 2 937 891

C = 1,07 mg/ml

V = 0,1 ml

dn/dc = 9 × 10-5 ml/mg.

Tulokseksi saatua K-arvoa (3,05 × 1011) käytetään sitten teoreettisen detektorivasteen laskemiseksi, kun oletetaan, että injisoitu polymeeri eluoituu detektorista 100-prosenttisesti.

LIITE III C

A.20. VESILIUOKSESSA OLEVIEN POLYMEERIEN LIUKENEMIS/UUTTUMISOMINAISUUDET

1. MENETELMÄ

Seuraava menetelmä on toisinto OECD:n ohjeen N:o 120 (1997) muutetusta versiosta. Teknisiä lisätietoja on viitteessä (1).

1.1. Johdanto

Tietyille polymeereille, kuten emulsiopolymeerit, on tehtävä esikäsittelyjä ennen kuin seuraavassa selostettua menetelmää voi käyttää. Menetelmä ei sovellu nestemäisiin polymeereihin eikä veden kanssa testausolosuhteissa reagoiviin polymeereihin.

Jos menetelmä ei ole kohtuullisesti tai lainkaan mahdollinen, liukenemis/uuttumisominaisuuksia voi tutkia muilla menetelmillä. Tällöin on esitettävä käytetyn menetelmän yksityiskohdat ja perustelut.

1.2. Vertailuaineet

Ei vertailuaineita.

1.3. Testausmenetelmän periaate

Vesiliuoksessa olevien polymeerien liukenemis/uuttumisominaisuudet määritetään pullomenetelmällä (katso A.6. Vesiliukoisuus, pullomenetelmä) seuraavin muutoksin.

1.4. Laatukriteerit

Ei laatukriteerejä.

1.5. Testausmenetelmän kuvaus

1.5.1. Laitteisto

Menetelmässä tarvitaan seuraavat laitteet:

- murskauslaite, esim. jauhin, tietyn koon omaavien hiukkasten valmistamiseksi

- ravistelulaite, jossa on lämpötilansäätö

- kalvosuodatusjärjestelmä

- sopiva analyysilaitteisto

- standardisoidut seulat.

1.5.2. Näytteen valmistus

Edustava näyte on ensin saatettava hiukkaskokoon 0,125-0,25 mm sopivilla seuloilla. Näytteen stabiilisuuden varmistamiseksi tai jauhamisen aikana voidaan tarvita jäähdytystä. Kumimaisia aineita voi murskata nestetyppilämpötilassa (1).

Jos vaadittua hiukkaskokoa ei voida saavuttaa, olisi pyrittävä saamaan hiukkaskoko mahdollisimman pieneksi, ja ilmoitettava tulos. Raportissa on selostettava, miten murskattua näytettä säilytettiin ennen testausta.

1.5.3. Menetelmä

Kolme 10 gramman näytettä testattavaa ainetta punnitaan kolmeen pulloon, joissa on lasitulpat, ja 1 000 ml vettä lisätään kuhunkin pulloon. Jos on hankala käsitellä 10:tä grammaa polymeeriä, käytetään suurempaa määrää ja lisätyn veden tilavuutta muutetaan vastaavasti.

Pullot suljetaan tiiviisti ja niitä ravistetaan 20 °C:ssa. Olisi käytettävä ravistelu- tai sekoituslaitetta, jonka lämpötila pysyy käytettäessä vakiona. Kunkin pullon sisältö sentrifugoidaan tai suodatetaan 24 tunnin kuluttua ja polymeerin pitoisuus kirkkaassa vesifaasissa määritetään sopivalla määritysmenetelmällä. Jos vesifaasille ei ole olemassa sopivaa määritysmenetelmää, kokonaisliukoisuus/uuttuvuus voidaan arvioida suodatusjäännöksen tai sentrifugoidun sakan kuivapainosta.

Tavallisesti on tehtävä kvantitatiivinen ero epäpuhtauksien ja lisäaineiden ja toisaalta pienimolekyylipainoisten aineiden välillä. Gravimetrisiä määrityksiä tehtäessä on tärkeää tehdä myös nollakoe ilman testattavaa ainetta, jotta voidaan määrittää koemenetelmästä johtuvat jäämät.

Polymeerien liukenemis/uuttumisominaisuuksia vedessä 37 °C:ssa pH:ssa 2 ja 9 voidaan määrittää samalla tavalla kuin 20 °C:n kokeessa. pH-arvot voidaan säätää lisäämällä joko sopivia puskureita tai sopivia happoja tai emäksiä kuten suolahappoa, etikkahappoa, pro analyysi -laatuista natrium- tai kaliumhydroksidia tai NH3:a.

Määritysmenetelmästä riippuen on tehtävä yksi tai kaksi testiä. Jos on olemassa riittävän spesifinen menetelmä polymeerikomponentin määrittämiseksi suoraan vesiliuoksesta, pitäisi yhden edellä kuvatun kaltaisen testin riittää. Jos tällaista menetelmää ei kuitenkaan ole käytettävissä ja jos polymeerin liukenemis/uuttumisominaisuuksien määritys rajoittuu epäsuoraan analyysiin eli ainoastaan orgaanisen hiilen kokonaismäärän (TOC) määrittämiseen vesiuutteesta, pitäisi tehdä lisätesti. Tämä lisätesti pitäisi myös tehdä kolmoismäärityksenä käyttäen kymmenen kertaa pienempiä polymeerinäytteitä ja samaa määrää vettä kuin ensimmäisessä testissä.

1.5.4. Määritys

1.5.4.1. Testi, jossa on yksi näytekoko

Menetelmiä vesifaasissa olevan polymeerikomponentin suoraa määrittämistä varten voi olla olemassa. Vaihtoehtoisesti voidaan harkita myös liuenneiden/uuttuneiden polymeerikomponenttien epäsuoraa analyysiä, jolloin määritetään liukoisten osien kokonaispitoisuus ja korjataan ei-polymeerispesifisten komponenttien suhteen.

Kokonaispolymeeri voidaan määrittää vesiliuoksesta:

joko riittävän herkällä menetelmällä, esim.

- TOC käyttämällä persulfaatti- tai dikromaattidigestiota, jolloin muodostuva CO2 määritetään IR:llä tai kemiallisesti;

- atomiabsorptiospektrometrialla (AAS) tai ICP (inductively coupled plasma)-emissiomenetelmällä, jos polymeeri sisältää piitä tai metallia;

- UV-absorptio- tai spektrofluorometrialla, jos on kyseessä aryylipolymeeri;

- LC-MS:llä, jos on kyseessä pienimolekyylipainoiset näytteet;

tai haihduttamalla vesiuute tyhjiössä kuiviin ja tekemällä jäännöksestä spektroskooppinen (IR, UV jne.) tai AAS/ICP-analyysi.

Jos vesifaasia ei voida sellaisenaan analysoida, pitäisi vesiuute uuttaa veteen sekoittuvalla orgaanisella liuottimella, esim. klooratulla hiilivedyllä. Liuotin haihdutetaan ja jäännöksestä määritetään ilmoitetun polymeerin pitoisuus kuten edellä on selostettu. Jos tässä jäännöksessä tunnistetaan epäpuhtauksia tai lisäaineita, on niiden osuus vähennettävä itse polymeerin liukenemis/uuttumisasteen määrittämiseksi.

Jos näytteessä on suhteellisen paljon tällaisia aineita, voi olla tarpeen tehdä jäännökselle esim. HPLC- tai GC-analyysi epäpuhtauksien erottamiseksi monomeeristä ja monomeeristä peräisin olevasta aineesta, jotta monomeerin todellinen pitoisuus voidaan määrittää.

Joskus voi riittää, että orgaaninen liuotin haihdutetaan kuiviin ja kuiva jäännös punnitaan.

1.5.4.2. Testi, jossa on kaksi eri näytekokoa

Kaikista vesiuutteista määritetään TOC.

Näytteen liukenemattomalle osalle (joka ei uuttunut) tehdään gravimetrinen analyysi. Jos kunkin pullon sisällön sentrifugoinnin tai suodattamisen jälkeen polymeerijäännöksiä on tarttunut pullon seinämiin, pitäisi pullo huuhtoa suodoksella, kunnes siinä ei enää näy mitään jäännöstä. Sen jälkeen suodos sentrifugoidaan tai suodatetaan uudelleen. Suodattimeen tai sentrifuugiputkeen jäänyt jäännös kuivataan 40 °C:ssa tyhjiössä ja punnitaan. Kuivaamista jatketaan, kunnes saavutetaan vakiopaino.

2. MÄÄRITYSTULOKSET

2.1. Testi, jossa on yksi näytekoko

Ilmoitetaan erilliset tulokset kutakin kolmea pulloa kohti ja keskiarvot ilmaistuna massayksiköllä liuostilavuutta kohti (tyypillisesti mg/l) tai massayksiköllä polymeerinäytteen massaa kohti (tyypillisesti mg/g). Lisäksi pitäisi ilmoittaa näytteen painohävikki (liuenneen aineen paino jaettuna alkuperäisen näytteen painolla) Suhteelliset keskihajonnat (RSD) pitäisi laskea. Tulokset pitää antaa koko ainemäärää kohti (polymeeri + olennaiset lisäaineet jne.) ja pelkkää polymeeriä kohti (ts. sen jälkeen, kun on vähennetty tällaisten lisäaineiden vaikutus).

2.2. Testi, jossa on kaksi näytekokoa

Ilmoitetaan erilliset TOC-arvot kahden kolmenkertaisilla näytteillä tehdyn kokeen vesiliuosuutteille ja kunkin kokeen keskiarvo ilmaistuna massayksiköllä liuostilavuutta kohti (tyypillisesti mgC/l) sekä massayksikköinä alkuperäisen näytteen painoa kohti (tyypillisesti mgC/g).

Jos tuloksissa ei ole eroa, kun näytteen suhde vesimäärään on suuri tai pieni, tämä voi merkitä sitä, että kaikki uuttuvat komponentit ovat todella uuttuneet. Tällöin ei suora määritys ole yleensä tarpeen.

Kunkin jäännöksen painot olisi ilmoitettava erikseen ja ilmaistava prosentteina näytteiden alkuperäispainoista. Keskiarvot lasketaan koetta kohti. Erotus sadan prosentin ja havaittujen prosenttimäärien välillä on alkuperäisen näytteen liukoisen ja uuttuvan aineksen prosenttimäärä.

3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN

3.1. Testiraportti

Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:

3.1.1. Testattava aine:

- saatavissa olevat tiedot testattavasta aineesta (tunnistetiedot, lisäaineet, epäpuhtaudet, pienimolekyylipainoisen aineen pitoisuus)

3.1.2. Koeolosuhteet

- kuvaus käytetyistä menetelmistä ja koeolosuhteista;

- kuvaus analyyttisistä ja detektiomenetelmistä.

3.1.3. Tulokset:

- liukoisuus/uuttuvuustulokset mg/l; yksittäiset arvot ja keskiarvot uuttumiskokeista eri liuoksissa, eritellen polymeeripitoisuus ja epäpuhtaudet, lisäaineet ym.,

- liukoisuus/uuttuvuustulokset mg/g polymeeriä,

- vesiliuosuutteiden TOC-arvot, liuenneen aineen paino ja lasketut prosenttiosuudet, jos ne on mitattu,

- kunkin näytteen pH,

- tiedot nollanäytteistä,

- tarvittaessa kirjallisuudesta saatavat tiedot testattavan aineen kemiallisesta epästabiilisuudesta sekä testausprosessin aikana että analyysin aikana,

- muut tiedot, jotka ovat tärkeitä tulosten tulkitsemisen kannalta.

4. KIRJALLISUUSVIITTEET

(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

LIITE III D

C.13 BIOKERTYVYYS: TESTI KALOILLA LÄPIVIRTAUSOLOSUHTEISSA

1. MENETELMÄ

Tämä biokertyvyysmenetelmä on toisinto OECD:n testausohjeesta N:o 305 (1996).

1.1. Johdanto

Tällä menetelmällä karakterisoidaan kemiallisten aineiden biokertymispotentiaalia kaloihin läpivirtausolosuhteissa. Vaikka läpivirtausolosuhteissa suoritettu testaus on paras, puolistaattiset olosuhteet ovat hyväksyttäviä, jos validiteetti on varmistettu.

Menetelmässä annetaan riittävän tarkat ohjeet testin suorittamiseksi samalla kun on mahdollista mukauttaa koejärjestelyä laboratorioiden erityisolosuhteisiin ja testattavien aineiden erilaisiin ominaisuuksiin. Luotettavimmin voidaan testata stabiileja orgaanisia aineita, joiden log Pow-arvot ovat 1,5-6,0 (1), mutta myös erityisen lipofiilisiä aineita (logPow > 6.0). Alustava arvio tällaisten erityisen lipofiilisten aineiden biokertyvyystekijälle (bioconcentration factor, BCF), josta käytetään joskus merkintää KB, on todennäköisesti korkeampi kuin laboratoriokokeista saatava biokertyvyystekijä tasapainotilassa (BCFSS). Orgaanisille aineille, joiden log Pow-arvot saattavat olla jopa 9,0, voidaan saada biokertyvyystekijän alustavia arvioita Binteinin et al (2) yhtälön avulla. Biokertyvyyspotentiaalia luonnehtivia muuttujia ovat mm. kertymävakio (k1), poistumavakio (k2) ja BCFSS.

Radioaktiivisilla isotoopeilla leimatut aineet saattavat helpottaa vesi- ja kalanäytteiden analysointia, ja niitä voi käyttää sen arvioimiseksi, onko hajoamistuotteet tunnistettava ja kvantifioitava. Jos mitataan radioaktiivisten jäämien kokonaismäärä (esim. polttamalla tai kudosta liuottamalla), BCF perustuu perusyhdisteeseen, mahdollisesti jäljellä oleviin aineenvaihduntatuotteisiin sekä assimiloituneeseen hiileen. Radioaktiivisten jäämien kokonaismäärään perustuva BCF ei siis ole välttämättä suoraan verrattavissa BCF:ään, joka on johdettu pelkästään perusyhdisteen spesifisestä kemiallisesta analyysistä.

Jos käytetään radioaktiivisia leimoja, voidaan tehdä puhdistustoimenpiteitä perusyhdisteeseen perustuvan BCF:n määrittämiseksi, ja tärkeimmät aineenvaihduntatuotteet voidaan karakterisoida, jos se katsotaan tarpeelliseksi. On myös mahdollista yhdistää kalan aineenvaihduntatutkimus ja biokertyvyystutkimus, jossa kudoksissa esiintyvät jäämät analysoidaan ja tunnistetaan.

1.2. Määritelmät ja yksiköt

Biokertyvyys (biokonsentraatio) on organismissa tai sen pinnalla (sen tietyssä kudoksessa) olevan testattavan aineen pitoisuuden lisääntyminen verrattuna testattavan aineen pitoisuuteen väliaineessa.

Biokertyvyystekijä (bioconcentration factor BCF tai KB) minä tahansa tämän kertyvyystestin kertymävaiheen ajankohtana on testattavan aineen pitoisuus kalassa (kalan pinnalla) tai tietyssä kalan kudoksessa [Cf, ìg/g (ppm)] jaettuna kyseisen aineen pitoisuudella väliaineessa [Cw, ìg/ml (ppm)].

Biokertyvyystekijä tasapainotilassa (steady state) (BCFSS tai KB) ei muutu merkittävästi pitkän ajanjakson aikana, kun testattavan aineen pitoisuus väliaineessa on vakio tänä aikana.

Tasapainotila saavutetaan kalassa esiintyvän testattavan aineen määrää (Cf) ajan funktiona esittävässä käyrässä silloin, kun käyrä on aika-akselin suuntainen, kolme peräkkäistä vähintään kahden vuorokauden välein otetuista näytteistä tehtyä Cf-määritystä ovat samat ± 20 prosenttia eikä näiden kolmen näytteenottoajanjakson välillä ole merkittäviä eroja. Yhdistettyjä näytteitä määritettäessä vaaditaan vähintään neljä peräkkäistä määritystä. Kun testataan aineita, joiden kertyminen kudoksiin tapahtuu hitaasti, välit voivat olla pikemminkin seitsemän vuorokautta.

Biokertyvyystekijöitä, jotka lasketaan suoraan kineettisistä nopeusvakioista (k1/k2) sanotaan kineettisiksi kertyvyystekijöiksi BCFk.

Oktanoli-vesi-jakautumiskerroin (Pow) on kemiallisen aineen n-oktanoliliukoisuuden ja vesiliukoisuuden suhde tasapainotilassa (menetelmä A.8), josta käytetään myös merkintää Kow. Pow:n logaritmia käytetään merkitsemään kemiallisen aineen biokertyvyyttä vesieliöissä.

Altistumis- eli kertymisvaihe on aika, jona kalat altistetaan testattavalle kemikaalille.

Kertymävakio (K1) on numeerinen arvo, joka määrittelee testattavan aineen pitoisuuden lisääntymisen nopeuden kalassa tai kalan pinnalla (tai sen tietyssä kudoksessa), kun kalat altistetaan kyseiselle kemikaalille (k1:n laatu on päivää-1).

Poistumavaihe (altistuksen jälkeinen vaihe) on se ajanjakso (sen jälkeen kun testattavat kalat on siirretty testattavaa ainetta sisältävästä väliaineesta sellaiseen väliaineeseen, jossa ei ole kyseistä ainetta), jonka aikana kyseisen aineen (netto)poistumaa testattavista kaloista (tai niiden tietyistä kudoksista) tutkitaan.

Poistumavakio (k2) on numeerinen arvo, joka kuvaa testattavan aineen pitoisuuden alenemisen nopeutta kalassa (tai sen tietyssä kudoksessa), kun kalat on siirretty testattavaa ainetta sisältävästä väliaineesta sellaiseen väliaineeseen, jossa ei ole kyseistä ainetta (k2:n laatu on päivää-1).

1.3. Testimenetelmän periaate

Testissä on kaksi vaihetta: kertymävaihe (altistusvaihe) ja poistumavaihe (altistuksen jälkeinen vaihe). Kertymävaiheessa yhtä lajia olevat erilliset kalaryhmät altistetaan vähintään kahdelle testattavan aineen pitoisuudelle. Kalat siirretään tämän jälkeen poistumavaihetta varten sellaiseen väliaineeseen, jossa ei ole testattavaa ainetta. Kokeessa on aina oltava poistumavaihe, ellei aineen kertyminen kertymisvaiheen aikana ole ollut mitättömän pieni (esim. BCF alle 10). Testattavan aineen pitoisuutta kalassa tai kalan pinnalla (tai sen tietyssä kudoksessa) seurataan testin molempien vaiheiden aikana. Kahden testipitoisuuden lisäksi pidetään kalojen vertailuryhmää samoissa olosuhteissa (lukuun ottamatta testattavan aineen läsnäoloa), jotta biokertyvyyskokeessa mahdollisesti havaittavia haitallisia vaikutuksia voidaan verrata vertailukelpoiseen vertailuryhmään ja jotta saadaan testattavan aineen taustapitoisuudet.

Kertymisvaihe on 28 vuorokautta, jollei osoiteta, että tasapainotila on saavutettu aikaisemmin. Kertymisvaiheen kestoa ja tasapainotilan saavuttamiseen tarvittavaa aikaa voidaan ennustaa liitteessä 3 olevan yhtälön avulla. Poistumavaihe aloitetaan siirtämällä kalat puhtaaseen kammioon samaan väliaineeseen, jossa ei ole testattavaa ainetta. Biokertyvyystekijä lasketaan mahdollisuuksien mukaan sekä kalassa olevan pitoisuuden Cf ja vedessä olevan pitoisuuden Cw suhteena (BCFSS), kun tasapainotila näyttää olevan saavutettu, että kineettisenä biokertyvyystekijänä (BCFK) kertymävakion k1 ja poistumavakion k2 suhteena, kun oletetaan, että reaktio noudattaa ensimmäisen asteen kinetiikkaa. Jos on ilmeistä, että reaktio ei noudata ensimmäisen asteen kinetiikkaa, olisi käytettävä monimutkaisempia malleja (liite 5).

Jos tasapainotilaa ei ole saavutettu 28 vuorokaudessa, kertymävaihetta on pidennettävä, kunnes tasapainotila saavutetaan, tai 60 vuorokauteen, sen mukaan, kumpi on ensin; minkä jälkeen aloitetaan poistumavaihe.

Kertymävakio, poistumavakio (tai vakiot, jos käytetään monimutkaisempia malleja), biokertyvyystekijä ja mahdollisuuksien mukaan näiden muuttujien luottamusvälit lasketaan mallista, joka parhaiten kuvaa testattavan aineen mitattuja pitoisuuksia kaloissa ja vedessä.

BCF ilmaistaan kalan kokonaismärkäpainoa kohti. Erityissyistä voi kuitenkin käyttää tiettyjä kudoksia tai elimiä (esim. lihas, maksa), jos kala on riittävän suurikokoinen tai jos se voidaan jakaa syötävään (filee) ja syömäkelvottomaan (sisälmykset) osaan. Koska monien orgaanisten aineiden biokertyvyyspotentiaalin ja lipofiilisyyden välillä on selvä suhde, on myös testattavan kalan rasvapitoisuuden ja kyseisten aineiden havaitun biokertyvyyden välillä vastaava suhde. Jotta tästä johtuvaa testitulosten vaihtelua hyvin lipofiilisten aineiden (log Pow > 3) osalta voidaan pienentää, biokertyvyys olisi ilmaistava sekä rasvapitoisuutta että kokonaiselopainoa kohti.

Rasvapitoisuus olisi mahdollisuuksien mukaan määritettävä samasta biologisesta aineksesta, jota käytetään testattavan aineen pitoisuuden määrittämiseksi.

1.4. Testattavaa ainetta koskevat tiedot

Ennen biokertyvyystestin suorittamista pitäisi testattavasta aineesta olla käytettävissä seuraavat tiedot:

a) aineen vesiliukoisuus

b) oktanoli-vesi-jakautumiskerroin Pow (josta käytetään myös merkintää Kow, ja joka määritetään HPLC-menetelmällä, liite A.8)

c) hydrolyysi

d) valomuuntuminen vedessä määritettynä oikeassa tai jäljitellyssä auringonvalossa ja samoissa säteilyolosuhteissa kuin ne, joissa biokertyvyyskoe tehdään (3)

e) pintajännitys (aineet, joiden log Pow:ta ei voida määrittää)

f) höyrynpaine

g) nopea biologinen hajoavuus (tapauksen mukaan).

Muita tarvittavia tietoja ovat toksisuus testissä käytettävälle kalalajille, mieluiten asymptoottinen (ajasta riippumaton) LC50. Koeliuoksissa ja biologisessa aineksessa olevan testattavan aineen kvantifioimiseksi täytyy olla käytettävissä sopiva määritysmenetelmä, jonka tarkkuus, täsmällisyys ja herkkyys tunnetaan, ja samoin on oltava olemassa näytteen valmistusta ja säilyttämistä koskevat yksityiskohtaiset tiedot. Testattavan aineen määritysraja sekä vedessä että kalan kudoksissa pitäisi myös olla tiedossa. Käytettäessä 14C-merkittyä testattavaa ainetta on tunnettava epäpuhtauksiin liittyvän radioaktiivisuuden prosenttiosuus.

1.5. Testin luotettavuus (validiteetti)

Testi on luotettava (validi), jos

- lämpötilavaihtelu on vähemmän kuin ± 2 °C,

- liuenneen hapen pitoisuus ei laske alemmaksi kuin 60 % kyllästymisarvosta,

- testattavan aineen pitoisuus testauskammiossa pidetään 20 prosentin rajoissa kertymävaiheessa mitattujen arvojen keskiarvosta,

- kuolleisuus tai muut haitalliset vaikutukset tai sairaudet sekä vertailu- että koekaloissa on alle 10 % testin lopussa; jos koe kestää useita viikkoja tai kuukausia, kuolleisuuden tai muiden haitallisten vaikutuksien olisi oltava molemmissa ryhmissä alle 5 % kuukautta kohti, eikä se saisi kaikkiaan olla enemmän kuin 30 %.

1.6. Vertailuaineet

Tunnetun biokertyvyyskyvyn omaavien vertailuyhdisteiden käyttö olisi hyödyllistä koejärjestelyjen tarkistamiseksi tarvittaessa. Vielä ei kuitenkaan voida suositella mitään tiettyjä aineita.

1.7. Testimenetelmän kuvaus

1.7.1. Laitteisto

Missään laitteiston osissa ei saisi käyttää materiaaleja, jotka voivat liueta, sorboitua tai uuttua ja vaikuttaa kaloihin haitallisesti. Tavallisia laatikon- tai lieriönmuotoisia säiliöitä, jotka on tehty kemiallisesti inertistä aineesta ja jotka ovat kooltaan sopivia syöttönopeus huomioon ottaen, voidaan käyttää. Pehmeää muoviletkua pitäisi käyttää mahdollisimman vähän. Mieluummin käytetään teflonista (R), ruostumattomasta teräksestä ja/tai lasista valmistettua putkea/letkua. Kokemus on osoittanut, että aineille, joilla on korkea adsorptiokerroin, kuten synteettiset pyretroidit, voi olla tarpeen käyttää silanoitua lasia. Tällöin välineet on heitettävä pois käytön jälkeen.

1.7.2. Vesi

Testissä käytetään yleensä luonnon vettä, jonka on oltava pilaantumatonta ja laadultaan tasaista. Laimennusveden on oltava laadultaan sellaista, että kokeeseen valitut kalat elävät siinä totuttautumisvaiheen ja testin aikana ilman, että niiden ulkonäössä tai käyttäytymisessä havaitaan mitään epänormaalia muutosta. Olisi ihanteellista pystyä osoittamaan, että koelaji elää, kasvaa ja lisääntyy laimennusvedessä (esim. laboratoriokasvatuksessa tai koko sukupolvenkierron käsittävässä toksisuustestissä). Vedestä on tunnettava ainakin pH, kovuus, kiinteiden aineiden kokonaispitoisuus, orgaanisissa yhdisteissä olevan hiilen kokonaismäärä ja mieluiten myös ammonium-ioni- ja nitriittipitoisuus sekä emäksisyys ja merieliöiden osalta suolapitoisuus. Kalojen hyvinvoinnille tärkeät tekijät tunnetaan hyvin, mutta liitteessä 1 annetaan suositeltavat enimmäispitoisuudet useille makean ja meriveden testivesien muuttujille.

Veden laadun on oltava tasainen testin ajan. pH-arvo voi olla 6,0-8,5, mutta vaihtelun on pysyttävä tietyn testin ajan 0,5 pH-yksikön sisällä. Sen varmistamiseksi, ettei laimennusvesi vaikuta liikaa testituloksiin (esimerkiksi kompleksoimalla testattavaa ainetta) tai vaikuta haitallisesti kalakannan vointiin, näytteitä olisi otettava säännöllisin väliajoin määrityksiä varten. Raskasmetallit (esim. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), tärkeimmät anionit ja kationit (esim. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), torjunta-aineet (esim. orgaanista fosforia ja orgaanista klooria sisältävien torjunta-aineiden kokonaispitoisuudet), orgaanisen hiilen kokonaispitoisuus ja suspendoituneet kiinteät aineet olisi määritettävä esimerkiksi kolmen kuukauden välein, jos laimennusveden laatu tiedetään suhteellisen vakioksi. Jos veden laadun on osoitettu pysyvän vakiona ainakin vuoden ajan, määrityksiä voidaan tehdä harvemmin (esim. kuuden kuukauden välein).

Luonnosta peräisin olevien hiukkasten samoin kuin orgaanisen hiilen kokonaismäärän (TOC) laimennusvedessä olisi oltava mahdollisimman alhainen, jotta testiaine ei absorboituisi orgaanisen aineen pintaan, mikä vähentäisi sen biologista hyötyosuutta (4). Suurin hyväksyttävä arvo on 5 mg/l hiukkasille (kuiva-aine, joka ei läpäise 0,45 ìm:n suodatinta) ja 2 mg/l orgaanisen hiilen kokonaismäärälle (katso liite 1). Vesi on tarvittaessa suodatettava ennen käyttöä. Testattavista kaloista (ulosteet) ja ruoanjätteistä peräisin olevan orgaanisen hiilen määrän pitäisi olla mahdollisimman alhainen. Koko testin aikana orgaanisen hiilen pitoisuus testausastiassa ei saa ylittää testattavasta aineesta ja mahdollisesti käytetystä liuotusaineesta peräisin olevaa pitoisuutta yli 10 milligrammalla litraa kohti (± 20 %).

1.7.3. Testiliuokset

Testattavasta aineesta tehdään kantaliuos, jonka pitoisuus on sopiva. Kantaliuos valmistetaan mieluiten joko sekoittamalla tai sekoittamalla voimakkaasti testattava aine laimennusveteen. Liuottimien tai liuotusaineiden (dispergoivien aineiden) käyttöä ei suositella. Niitä voi kuitenkin joskus käyttää, jotta saadaan tehdyksi väkevä kantaliuos. Sallittuja liuottimia ovat etanoli, metanoli, etyleeniglykolimonometyylieetteri, etyleeniglykolidimetyylieetteri, dimetyyliformamidi ja trietyleeniglykoli. Sallittuja liuotusaineita ovat Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % metyyliselluloosa ja HCO-40. Helposti biohajoavia aineita käytettäessä on oltava varovainen, koska ne voivat aiheuttaa ongelmia bakteerikasvuston takia läpivirtaustesteissä. Testattava aine voi olla leimattu radioaktiivisella aineella ja sen pitäisi olla mahdollisimman puhdasta kemiallisesti (mielellään esimerkiksi yli 98-prosenttista).

Läpivirtaustestissä on käytettävä testattavan aineen kantaliuosta jatkuvasti annostelevaa ja laimentavaa järjestelmää (esim. annostelupumppua, laimenninta, kyllästävää järjestelmää) testipitoisuuksien annostelemiseksi testikammioihin. Testikammioiden veden pitäisi vaihtua mielellään ainakin viisi kertaa vuorokaudessa. Läpivirtausmalli on paras, mutta jos sitä ei voida käyttää (jos se esimerkiksi haittaa testattavia eliöitä), voidaan käyttää puolistaattista järjestelmää, mikäli validiteettikriteerit täyttyvät. Kantaliuosten ja laimennusveden virtausnopeudet on tarkistettava sekä 48 h ennen testiä että vähintään kerran päivässä testin aikana. Tässä tarkistuksessa mitataan myös läpivirtausnopeus kaikissa testikammioissa ja varmistetaan, ettei se vaihtele yli 20 %:a yhdessä kammiossa tai kammioiden välillä.

1.7.4. Lajin valinta

Tärkeitä perusteita lajin valinnassa ovat se, että lajia on helposti saatavilla, sitä voi saada sopivan kokoisina yksilöinä ja sitä voidaan helposti ylläpitää laboratoriossa. Muita perusteita kalalajin valitsemiselle voivat olla virkistyskäyttö, kaupallinen tai ekologinen merkitys sekä samanlainen herkkyys, onnistunut käyttö aikaisemmin ym.

Suositeltavat lajit luetellaan liitteessä 2. Muita lajeja voidaan käyttää, mutta testausmenetelmää voi joutua muuttamaan siten, että saadaan sopivat koeolosuhteet. Tällaisessa tapauksessa olisi selostettava syyt lajin valitsemiseen ja koemenetelmä.

1.7.5. Kalojen olosuhteet testauskammioissa

Kalojen kantapopulaatiota totutetaan vähintään kahden viikon ajan testauslämpötilassa ja kaloja ruokitaan riittävästi ja samantyyppisellä rehulla kuin se, jota annetaan testin aikana.

Kuolleiden kalojen määrä kirjataan 48 tunnin alkutotuttelun jälkeen, jonka jälkeen noudatetaan seuraavia periaatteita:

- jos kuolleita kaloja on yli 10 % populaatiosta seitsemän vuorokauden aikana, koko erä hylätään,

- jos kuolleita kaloja on 5-10 % populaatiosta seitsemän vuorokauden aikana, kaloja totutetaan vielä seitsemän vuorokautta,

- jos kuolleita kaloja on alle 5 % populaatiosta seitsemän vuorokauden aikana, erä hyväksytään, mutta jos kuolleita on yli 5 % seuraavien seitsemän vuorokauden aikana, koko erä hylätään.

On tarkastettava, ettei testeissä käytettävissä kaloissa ole havaittavia tauteja tai poikkeavuuksia. Sairaat kalat on heitettävä pois. Kaloja ei saisi hoitaa sairauden takia kahden viikon aikana ennen testiä tai testin aikana.

1.8. Testin suorittaminen

1.8.1. Esitesti

Voi olla hyvä tehdä esitesti lopullisen kokeen olosuhteiden optimoimiseksi, esim. testattavan aineen pitoisuuden (pitoisuuksien) valitseminen, kertymä- ja poistumavaiheen kesto.

1.8.2. Altistumisolosuhteet

1.8.2.1. Kertymävaiheen kesto

Kertymävaiheen kestoa voi arvioida käytännön kokemuksen perusteella (esim. aiemmasta kemikaalin kertyvyystutkimuksesta) tai tietyistä kokemusperäisistä suhteista käyttämällä joko testattavan aineen vesiliukoisuutta tai oktanoli-vesi-jakaantumiskerrointa koskevia tietoja (ks. liite 3).

Kertymävaiheen on kestettävä 28 vuorokautta, ellei voida osoittaa, että tasapainotila on saavutettu aikaisemmin. Jos tasapainotilaa ei ole saavutettu 28 vuorokauden kuluessa, kertymävaihetta jatketaan ja mittauksia tehdään, kunnes tasapainotila saavutetaan tai 60 vuorokautta on kulunut, sen mukaan, kumpi tapahtuu aiemmin.

1.8.2.2. Poistumavaiheen kesto

Puolet kertymävaiheesta riittää tavallisesti asianmukaiseen (esim. 95 %) vähenemiseen kalaan kertyneessä aineessa (katso liite 3, arvioinnin selostus). Jos 95 prosentin vähenemiseen pääseminen kestää erittäin kauan, esimerkiksi yli kaksi kertaa kertymävaiheen normaali kesto (ts. yli 56 vuorokautta), voidaan hyväksyä lyhyempi aika (ts. kunnes testattavan aineen pitoisuus on alle 10 % tasapainotilasta). Jos aineen kertymä- ja poistumakinetiikka on monimutkaisempi kuin yhden osaston mallissa, jota voidaan kuvata ensimmäisen asteen kinetiikalla, on poistumavaiheen oltava pitempi poistumavakion määrittämiseksi. Tämä aika voidaan kuitenkin määrätä esim. sen perusteella, kuinka kauan testattavan aineen pitoisuus kalassa pysyy määritysrajan yläpuolella.

1.8.2.3. Testikalojen määrä

Kalojen lukumäärän jokaista testipitoisuutta kohti on oltava sellainen, että on saatavilla vähintään neljä kalaa näytettä kohti. Jos tarvitaan suurempaa tilastotehoa, tarvitaan enemmän kaloja näytettä kohti.

Jos käytetään täysikasvuisia kaloja, ilmoitetaan, ovatko ne koiraita, naaraita vai molempia. Jos käytetään molempia sukupuolia, on osoitettava ennen totuttautumisvaihetta, että erot rasva-ainepitoisuudessa sukupuolien välillä ovat merkityksettömät. Määritystä varten voi olla tarpeen yhdistää kaikki koiraat ja kaikki naaraat.

Jokaiseen testiin on valittava samanpainoisia kaloja, jolloin pienimpien on painettava vähintään kaksi kolmasosaa suurimmista. Kaikkien pitäisi olla samaa vuosiluokkaa ja peräisin samasta lähteestä. Koska paino ja ikä näyttävät vaikuttavan joskus merkittävästi BCF-arvoihin (1), on ne kirjattava tarkasti. Suositellaan, että osa näytekaloista punnitaan ennen testiä keskipainon arvioimiseksi.

1.8.2.4. Kalojen lastaaminen testikammioon

Vesimäärän on oltava suuri suhteessa kalojen määrään, jotta Cw laskee mahdollisimman vähän, kun kalat lisätään kammioon testin alussa, ja myös siksi, ettei liuenneen hapen pitoisuus laske. On tärkeää, ettei kaloja lisätä kammioon liian nopeasti. Joka tapauksessa lastausnopeudeksi suositellaan normaalisti 0,1-1,0 g kalaa (märkäpainona) litraa vettä kohti vuorokaudessa. Lastaus voidaan tehdä nopeammin, jos osoitetaan, että testattavan aineen pitoisuus voidaan pitää nimellisarvossa ±20 prosenttia eikä liuenneen hapen pitoisuus laske alemmaksi kuin 60 prosenttia kyllästyneisyysarvosta.

Valittaessa sopiva lastaustapa on otettava huomioon kalalajin luonnollinen elinympäristö. Esimerkiksi pohjakalat voivat vaatia samaa vesitilavuutta kohti suuremman pohjapinta-alan kuin pelagiset kalalajit.

1.8.2.5. Ruokkiminen

Totuttamisvaiheessa ja testin aikana kalojen ravinnossa noudatetaan ruokavaliota, jonka rasvapitoisuus ja valkuaisaineiden kokonaispitoisuus tunnetaan. Rehua annetaan riittävästi niin, että kalat pysyvät terveinä ja niiden paino ei laske. Rehua annetaan päivittäin totuttamisvaiheessa ja testin aikana noin 1-2 % kalan painosta vuorokaudessa. Tällöin useimpien kalalajien rasvapitoisuus pysyy suhteellisen vakiona testin aikana. Rehun määrä olisi laskettava uudelleen esimerkiksi kerran viikossa, jotta kalan paino ja rasvapitoisuus pysyisivät samana. Tässä laskutoimituksessa kussakin kammiossa olevien kalojen paino voidaan arvioida viimeksi kyseisestä kammiosta näytteeksi otetun kalan painosta. Kammiossa olevia kaloja ei punnita.

Syömättä jäänyt rehu ja ulosteet poistetaan testikammioista päivittäin vähän ruokinnan jälkeen (30 minuuttia - 1 tunti). Kammiot pidetään mahdollisimman puhtaina koko testin ajan, jotta orgaanisen aineksen pitoisuus pysyy mahdollisimman alhaisena, koska orgaaninen hiili saattaa vaikuttaa haitallisesti testattavan aineen biologiseen hyötyosuuteen (1).

Koska monet rehut on valmistettu kalajauhoista, on määritettävä, onko rehussa testattavaa ainetta. On suotavaa määrittää myös, onko rehussa torjunta-aineita ja raskasmetalleja.

1.8.2.6. Valo ja lämpötila

Valoisa aika on tavallisesti 12-16 tuntia. Lämpötilan pitäisi olla kalalajille sopiva eikä se saisi vaihdella enempää kuin ± 2°C. Valaistuksen tyyppi ja ominaisuudet on tunnettava. Testattavan aineen mahdollinen muuntuminen tutkimuksen säteilyolosuhteissa on otettava huomioon. Valaistusolosuhteiden olisi oltava asianmukaiset, ja on vältettävä kalojen altistumista epäluonnolliselle valolle. Joskus voi olla tarpeen suodattaa pois alle 290 nm:n UV-säteily.

1.8.2.7. Testipitoisuudet

Kalat altistetaan läpivirtausolosuhteissa vähintään kahdelle testattavan aineen pitoisuudelle vedessä. Tavallisesti valitaan korkeampi (tai korkein) testattavan aineen pitoisuus siten, että se on noin 1 % aineen akuutista asymptoottisesta LC50-arvosta ja vähintään 10 kertaa korkeampi kuin sen havaitsemisraja vedessä käytettävällä määritysmenetelmällä.

Korkein testipitoisuus voidaan myös määrittää jakamalla akuutti 96 tunnin LC50-arvo asianmukaisella akuutti/krooninen-suhteella (asianmukaiset suhteet joillekin kemikaaleille voivat olla noin 3-100). Jos se on mahdollista, valitaan toinen pitoisuus (toiset pitoisuudet) siten, että sen ero edelliseen pitoisuuteen on kymmenkertainen. Jos tämä ei ole mahdollista, kun otetaan huomioon kriteeri "1 % LC50-arvosta" ja määritysraja, voidaan käyttää pienempää tekijää kuin 10 tai harkita 14C-leimatun aineen käyttöä. Mikään testipitoisuus ei saa olla suurempi kuin testattavan aineen liukoisuus.

Jos käytetään liuotusainetta, sen pitoisuus ei saisi olla suurempi kuin 0,1 ml/l, pitoisuuden on oltava sama kaikissa testiastioissa. Sen osuus orgaanisen hiilen kokonaismäärästä, samoin kuin testattavan aineen osuus, on tunnettava. Näitä aineita on kuitenkin pyrittävä välttämään mahdollisimman täydellisesti.

1.8.2.8. Kontrollit

Testisarjan lisäksi on tehtävä yksi kontrolli laimennusvedellä tai - jos liuotusainetta on käytetty - yksi kontrolli, jossa on liuotusainetta, jos on osoitettu, ettei liuotusaine vaikuta kaloihin. Ellei tätä ole osoitettu, on tehtävä molemmat kontrollit.

1.8.3. Veden laatua koskevien mittausten taajuus

Testin aikana on mitattava liuennut happi, TOC (orgaanisen hiilen kokonaismäärä), pH ja lämpötila kaikista astioista. Veden kokonaiskovuus ja suola, mikäli se on aiheellista, mitataan kontrolleista ja yhdestä astiasta, jossa on korkeampi (korkein) pitoisuus. Vähintään on mitattava kolme kertaa liuennut happi ja suola, mikäli aiheellista (alussa, kertymävaiheen keski- ja loppuvaiheessa) ja kerran viikossa poistumavaiheen aikana. TOC on mitattava testin alussa (24 ja 48 tuntia ennen kertymävaiheen alkua), ennen kalojen lisäämistä astiaan ja vähintään kerran viikossa sekä kertymä- että poistumisvaiheen aikana. Lämpötila on mitattava joka päivä, pH kunkin vaiheen alussa ja lopussa ja kovuus kerran testin aikana. Lämpötilaa olisi mieluiten mitattava jatkuvasti vähintään yhdessä astiassa.

1.8.4. Näytteenotto ja mittaukset kaloista ja vedestä

1.8.4.1. Näytteenoton aikataulu

Testattavan aineen pitoisuuden määrittämiseen käytetyistä testauskammioista otetaan vesinäyte ennen kalojen lisäystä sekä kertymä- ja poistumisvaiheen aikana. Vedestä on otettava näytteet vähintään samoina aikoina kuin kaloista ja ennen ruokkimista. Kertymävaiheen aikana määritetään testattavan aineen pitoisuudet sen tarkistamiseksi, täyttyvätkö validiteettikriteerit.

Kaloista otetaan näyte ainakin viidesti kertymävaiheen aikana ja neljästi poistumavaiheen aikana. Koska voi olla joskus vaikea laskea kohtuullisen tarkkaa arviota BCF-arvosta tämän näytemäärän perusteella (erityisesti, jos näyttää siltä, että poistuma noudattaa muuta kuin yksinkertaista ensimmäisen asteen kinetiikkaa), voi olla suositeltavaa ottaa näytteitä tiheämmin molemmissa vaiheissa (katso liite 4). Ylimääräiset näytteet säilytetään ja analysoidaan vain, jos ensimmäisen analyysikierroksen tulokset osoittautuvat riittämättömiksi BCF:n laskemiseksi halutulla tarkkuudella.

Hyväksyttävästä näytteenottoaikataulusta on esimerkki liitteessä 4. Muunlaisia aikatauluja voi laskea helposti käyttäen muita oletettuja Pow-arvoja 95 prosentin kertymään tarvittavan altistusajan laskemiseksi.

Näytteenottoa jatketaan kertymävaiheen aikana, kunnes saavutetaan tasapainotila tai 28 vuorokauden ajan, kumpi tapahtuu aikaisemmin. Jos tasapainotilaa ei ole saavutettu 28 vuorokauden kuluessa, näytteenottoa jatketaan, kunnes tasapainotila saavutetaan tai 60 vuorokauden ajan, sen mukaan, kumpi tapahtuu aikaisemmin. Ennen poistumisvaiheen aloittamista kalat siirretään puhtaisiin kammioihin.

1.8.4.2. Näytteenotto ja näytteiden valmistus

Vesinäytteet otetaan esimerkiksi lapolla inertin putken/letkun kautta kammion keskivaiheilla olevasta kohdasta. Koska sen enempää suodatuksella kuin sentrifugoinnillakaan ei aina ilmeisesti voida erottaa toisistaan niitä testattavan aineen osia, joita kala ei biohyödynnä ja joita se biohyödyntää (erityisesti superlipofiilisten kemikaalien, ts. kemikaalien, joiden log Pow > 5, osalta) (1) (5), näytteille ei tarvitse välttämättä tehdä näitä toimenpiteitä.

Sen sijaan on huolehdittava siitä, että kammiot pidetään mahdollisimman puhtaina, ja orgaanisen hiilen kokonaismäärää on seurattava sekä kertymä- että poistumavaiheessa.

Sopiva määrä kaloja (normaalisti vähintään neljä) otetaan testikammioista kutakin näytettä varten. Näytteeksi otetut kalat huuhdellaan nopeasti vedellä, kuivataan (pyyhkeellä), tapetaan välittömästi sopivimmalla ja inhimillisimmällä tavalla ja punnitaan.

On suositeltavaa tehdä määritykset kaloista ja vedestä heti näytteenoton jälkeen, jotta ei tapahtuisi hajoamista tai muuta ainehävikkiä ja jotta voidaan laskea likimääräiset kertymä- ja poistumanopeudet testin edetessä. Kun näytteet määritetään heti, voidaan myös nähdä nopeasti, milloin tasapainotila on saavutettu.

Jos näytteitä ei voi määrittää heti, ne säilytetään sopivalla tavalla. Ennen testin aloittamista on hankittava tietoja kyseisen testattavan aineen oikeasta säilytystavasta, esimerkiksi pakastamisesta, säilyttämisestä 4 °C:ssa, säilytysajasta, uuttamisesta jne.

1.8.4.3. Määritysmenetelmän laatu

Koska koko menetelmä riippuu olennaisesti testattavan aineen määritykseen käytettävän menetelmän tarkkuudesta, täsmällisyydestä ja herkkyydestä, on todettava kokeellisesti, että kyseisessä menetelmässä kemiallisen määrityksen täsmällisyys ja toistettavuus samoin kuin testattavan aineen saalis sekä vedestä että kaloista ovat tyydyttäviä. On myös tarkastettava, ettei testattavaa ainetta ole laimennukseen käytetyssä vedessä mitattavia määriä.

Tarvittaessa testissä saadut Cw- ja Cf-arvot korjataan kontrollien saaliin ja tausta-arvojen suhteen. Kala- ja vesinäytteitä käsitellään koko ajan siten, että kontaminoituminen ja hävikki (joka voi johtua esimerkiksi adsorboitumisesta näytteenottolaitteistoon) ovat mahdollisimman pienet.

1.8.4.4. Kalanäytteistä tehtävät määritykset

Jos testissä käytetään radioaktiivisia merkkiaineita, on mahdollista määrittää kokonaisradioaktiivisuus (ts. perusyhdiste ja siitä syntyneet aineenvaihduntatuotteet) tai näytteet voidaan puhdistaa siten, että perusyhdiste voidaan määrittää erikseen. Myös tärkeimmät aineenvaihduntatuotteet voidaan karakterisoida tasapainotilassa tai kertymävaiheen lopussa, sen mukaan, kumpi tapahtuu aikaisemmin. Jos BCF on ≥ 1 000 % ilmaistuna radioaktiivisten jäämien kokonaismääränä, voi olla suositeltavaa - ja tiettyihin luokkiin kuuluvien kemikaalien kuten torjunta-aineiden ollessa kyseessä erittäin suositeltavaa - tunnistaa ja määrittää kvantitatiivisesti hajoamistuotteet, joiden määrä on ≥ 10 % kalan kudoksissa tasapainotilassa olevista jäämistä. Jos kaloista tunnistetaan ja määritetään kvantitatiivisesti ≥ 10 %:n luokkaa olevia hajoamistuotemääriä, niin on suositeltavaa tunnistaa ja määrittää kvantitatiivisesti hajoamistuotteet myös testivedestä.

Testattavan aineen pitoisuus olisi tavallisesti määritettävä kustakin yksittäisestä punnitusta kalasta. Jos tämä ei ole mahdollista, voidaan samaan aikaan otetut näytekalat yhdistää, mutta yhdistäminen rajoittaa tilastomenetelmiä, joita voidaan käyttää tulosten käsittelyyn. Jos on tärkeää, että käytetään tiettyä ja tietyn tehoista tilastollista menetelmää, pitäisi testissä olla riittävä määrä kaloja, jotta haluttu kalojen yhdistäminen ja tilastollinen teho voidaan ottaa huomioon (6) (7).

BCF pitäisi ilmaista sekä kokonaismärkäpainoa kohti että erittäin lipofiilisten aineiden osalta myös rasvapitoisuutta kohti. Kalojen rasvapitoisuus määritetään jokaisen näytteenoton yhteydessä, jos mahdollista. Sopivia menetelmiä on käytettävä rasvapitoisuuden määrittämiseksi (liitteessä 3 olevat viitteet 8 ja 2). Kloroformi-metanoliuuttoa voi suositella standardimenetelmänä (9). Eri menetelmillä ei saada samoja arvoja (10), joten on tärkeää kuvailla käytetty menetelmä. Aina kun se on mahdollista, rasvat olisi määritettävä samasta uutteesta, josta testattava aine määritetään, koska rasvat täytyy usein poistaa uutteesta ennen kuin sitä voi käyttää kromatografiseen määritykseen. Kalan rasvapitoisuus (mg/kg märkäpainoa kohti) kokeen lopussa ei saisi poiketa rasvapitoisuudesta kokeen alussa enempää kuin ± 25 %. Kudoksen kiinteän aineen prosenttiosuus pitää myös ilmoittaa, jotta rasvapitoisuus voidaan muuntaa märkäarvosta kuiva-arvoksi.

2. MÄÄRITYSTULOKSET

2.1. Tulosten käsittely

Testattavan aineen kertymäkäyrä saadaan esittämällä kalassa tai kalan pinnalla (tai määritellyissä kudoksissa) kertymävaiheen aikana olevan aineen pitoisuus ajan funktiona aritmeettisella asteikolla. Jos käyrä osoittaa tasapainotilaa (ts. käyrä on suunnilleen asymptoottinen aika-akselin kanssa), tasapainotilaa vastaava BCFSS lasketaan kaavasta

>NUM>Cf as steady-state (mean)

>DEN>Cw as steady-state (mean)

as steady-state (mean) = tasapainossa (keskiarvo)

Jos tasapainotilaa ei saavuteta, voi olla mahdollista laskea vaarallisuuden arviointiin riittävän tarkka BCFSS 80 (1.6/k2) prosentin tai 95 prosentin (3,0/k2) "tasapainon" perusteella.

Myös konsentraatiotekijä (BCFk) määritetään kahden ensimmäisen asteen kineettisen vakion suhteena (k1/k2). Poistumisvakio (k2) määritetään tavallisesti poistumakäyrästä (ts. käyrästä, joka kuvaa testattavan aineen pitoisuuden vähenemistä kalassa ajan funktiona). Kertymävakio (k1) lasketaan sitten, kun tunnetaan k2 ja jokin kertymäkäyrästä saatu Cf:n arvo, (katso myös liite 5). Paras menetelmä BCFk:n ja nopeusvakioiden k1 ja k2 laskemiseksi on estimoida tietokoneella epälineaariset parametrit (11). Muuten voidaan käyttää graafisia menetelmiä k1 ja k2:n määrittämiseksi. Jos poistumakäyrä ei selvästikään noudata ensimmäisen asteen kinetiikkaa, pitäisi käyttää monimutkaisempia malleja (katso liitteessä 3 olevat viitteet) ja pyytää neuvoa biostatistiikan asiantuntijoilta.

2.2. Tulosten tulkinta

Tulosten tulkinnassa on oltava varovainen, jos testiliuoksista mitatut tulokset ovat lähellä määritysmenetelmän havaitsemisrajaa.

Selvät kertymä- ja poistumakäyrät osoittavat hyviä biokonsentraatiotuloksia. Vaihtelun kertymä/poistumavakioissa kahden testipitoisuuden välillä pitäisi olla alle 20 %. Jos havaitaan merkittäviä eroja kertymä-/poistumanopeuksien välillä käytettyjen kahden testipitoisuuden välillä, ne on kirjattava ja selitettävä, jos voidaan. BCF:ien luotettavuusväli hyvin suunnitelluissa kokeissa on yleensä lähellä ± 20:tä prosenttia.

3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN

Testiraportissa on ilmoitettava seuraavat tiedot:

3.1. Testattava aine

- fysikaalinen olomuoto ja fysikokemialliset ominaisuudet, jos niillä on merkitystä;

- kemialliset tunnistetiedot (mukaan lukien orgaanisen hiilen pitoisuus tarvittaessa);

- jos aine on radioaktiivisesti leimattu, leimatun atomin (leimattujen atomien) tarkka sijainti ja epäpuhtauksiin liittyvän radioaktiivisuuden määrä.

3.2. Testattava laji

- tieteellinen nimi, kanta, lähde, mahdollinen esikäsittely, totuttamistiedot, ikä, koko jne.

3.3. Testiolosuhteet

- käytetty testimenettely, esim. läpivirtaus- tai puolistaattinen;

- käytetty valaistustyyppi ja valon ominaisuudet sekä valoperiodi(t);

- testimenetelmän kuvaus, esim. testikammioiden lukumäärä ja koko, veden vaihtumisnopeus, rinnakkaisnäytteiden määrä, kalojen lukumäärä rinnakkaisnäytteessä, testipitoisuuksien lukumäärä, kertymä- ja poistumavaiheiden kesto, kala- ja vesinäytteiden näytteenottotaajuus;

- kantaliuosten valmistus ja niiden uusimistaajuus (liuotusaine ja sen pitoisuus sekä sen osuus testivedessä olevan orgaanisen hiilen kokonaismäärästä on ilmoitettava, jos liuotusainetta käytetään);

- nimelliset testipitoisuudet, testikammioissa mitattujen arvojen keskiarvot ja niiden keskihajonnat ja menetelmä, jolla ne on laskettu;

- laimennusveden alkuperä, mahdolliset esikäsittelyt, osoitukset kalojen kyvystä elää tässä vedessä sekä vettä koskevat tiedot: pH, kovuus, lämpötila, liuenneen hapen pitoisuus, jäännöskloorin tasot (jos ne on mitattu), orgaanisen hiilen kokonaispitoisuus, suspensiossa olevat kiinteät aineet, testiväliaineen suolapitoisuus (jos aiheellista) ja muut mahdolliset mittaukset;

- testikammioissa olevan veden laatu, pH, kovuus, TOC, lämpötila ja liuenneen hapen pitoisuus;

- yksityiskohtaiset tiedot ruokkimisesta (esim. rehutyyppi, sen alkuperä, koostumus - vähintään rasva- ja valkuaisainepitoisuus mahdollisuuksien mukaan, annetut määrät ja syöttötaajuus);

- kala- ja vesinäytteiden käsittelyä koskevat tiedot, mukaan lukien testattavan aineen valmistusta, säilyttämistä, uuttamista ja määritysmenetelmiä (ja niiden täsmällisyyttä) sekä rasvapitoisuutta koskevat tiedot (jos on mitattu).

3.4. Tulokset:

- mahdollisista esikokeista saadut tulokset;

- vertailukalojen ja kussakin altistuskammiossa olevien kalojen kuolleisuus sekä mahdollinen tavallisuudesta poikkeava käyttäytyminen;

- kalojen rasvapitoisuus (jos se on määritetty testin yhteydessä);

- testattavan kemikaalin kertymää ja poistumaa kuvaavat käyrät (mukaan lukien kaikki mittaustulokset) ja tasapainotilan saavuttamiseen tarvittu aika;

- Cf ja Cw (sekä keskihajonta ja vaihteluväli, jos aiheellista) kaikkien näytteenottoaikojen osalta (Cf ilmaistuna mikrogrammoina grammaa märkäpainoa kohti tai ppm:inä koko kalaa tai sen tiettyjä kudoksia, esim. rasvakudosta kohti, ja Cw mikrogrammoina millilitraa kohti eli ppm:inä); Cw-arvot verrokkisarjalle (tausta) on myös ilmoitettava;

- tasapainotilassa mitattu biokonsentraatiotekijä (BCFSS) ja/tai kineettinen konsentraatiotekijä (BCFk) sekä mahdolliset 95 prosentin luotettavuusvälit kertymä- ja poistumavakioille (kaikki ilmaistuna eläimen tai sen tiettyjen kudosten kokonaispainoa tai kokonaisrasvapitoisuutta kohti, jos ne on mitattu), luotettavuusvälit ja keskihajonta, jos ovat saatavina, sekä tuloksiin sovellettu tietokoneanalyysi kullekin käytetylle testipitoisuudelle;

- jos on käytetty radioaktiivisesti leimattuja aineita, voidaan tarvittaessa esittää mahdollisten havaittujen aineenvaihduntatuotteiden kertymistä koskevat tiedot;

- mahdolliset epätavalliset tapahtumat testin aikana, poikkeamat näistä menettelyistä ja muut mahdolliset asiaan liittyvät tiedot.

On vältettävä ilmoittamasta "ei havaittu havaitsemisrajalla". Menetelmää ja koejärjestelyä on kehitettävä ennen testiä, koska edellä mainitunlaisia tuloksia ei voi käyttää nopeusvakioiden laskemiseen.

4. KIRJALLISUUSVIITTEET

(1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp 117-156.

(2) Bintein S., Devillers, J. and Karcher W. (1993). Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, 29-390.

(3) OECD, Paris (1996). Direct Phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.

(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: Comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.

(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Doc. for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.

(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane Rockville, MD 20852, July 1975.

(7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Recidues in Human and Environmental Samples, Thompson J.F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.

(8) Compaan H. (1980) in "The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation", Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, The Hague, The Netherlands.

(9) Gardner et al. (1995). Limn. & Oceanogr. 30, 1099-1105.

(10) Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431-1436.

(11) CEC. Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method-Ring Test Programme, 1984-1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm.

(12) ASTME E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.

Liite 1

>TAULUKON PAIKKA>

Liite 2

>TAULUKON PAIKKA>

Erilaisia suisto- ja merikalalajeja on käytetty eri maissa, esimerkiksi:

>TAULUKON PAIKKA>

Kalojen saatavuus

Edellä olevassa taulukossa lueteltuja makean veden kaloja on helppo kasvattaa ja/tai niitä on helposti saatavissa läpi vuoden, kun taas meri- tai suistokalalajeja on lähinnä saatavissa vastaavissa maissa. Niitä voidaan kasvattaa joko kalanviljelylaitoksissa tai laboratorioissa taudeilta ja loisilta valvotuissa olosuhteissa niin, että saadaan terveitä koe-eläimiä, joiden alku/sukuperä tunnetaan. Näitä kaloja on saatavissa monissa osissa maailmaa.

Liite 3

Kertymä- ja poistumavaiheen keston arvioiminen

1. Kertymävaiheen keston arvioiminen

Ennen testin suorittamista voidaan saada arvio k2:sta ja siten jokin prosenttimäärä tasapainotilan saavuttamiseksi tarvittavasta ajasta, kun tunnetaan empiirisiä suhteita k2:n ja n-oktanoli-vesi -jakautumiskertoimen (Pow) tai k2:n ja vesiliukoisuuden (s) välillä.

Arvio k2:sta (vuorokautta-1) saadaan esimerkiksi seuraavasta empiirisestä suhteesta:

log10k2 = -0,414 log10(Pow) + 1.47 (r2 = 0,95) (yhtälö 1)

Muita suhteita on viitteessä (2).

Jos jakautumiskerrointa (Pow) ei tunneta, voidaan tehdä arvio (3), jos tunnetaan aineen vesiliukoisuus (s):

log10(Pow) = 0,862 log10(s) + 0,710 (r2 = 0,994) (yhtälö 2),

jossa s = liukoisuus (moolia/l): (n = 36).

Nämä suhteet koskevat vain kemiallisia aineita, joiden log Pow-arvot ovat 2-6,5 (4).

Aika, joka tarvitaan jonkin prosenttiasteisen tasapainotilan saavuttamiseksi, voidaan saada k2-arviota soveltamalla yleisestä kertymä- ja poistumavaihetta kuvaavasta yhtälöstä (ensimmäisen asteen kinetiikka):

>NUM>dCf

>DEN>dt

= k1.Cw - k2.Cf

tai jos Cw on vakio:

Cf = >NUM>k1

>DEN>k2

.Cw (1 - e-k) (yhtälö 3).

Kun lähestytään tasapainotilaa (t . ∞), yhtälö 3 voidaan muuttaa (5) (6) seuraavasti:

Cf = >NUM>k1

>DEN>k2

.Cw tai Cf/Cw = k1/k2 = BCF

Tällöin k1/k2.Cw lähenee pitoisuutta kalassa "tasapainotilassa" (Cf,s).

Yhtälö 3 voidaan kirjoittaa seuraavasti:

Cf = Cf,s (1 - e-k) tai >NUM>Cf

>DEN>Cfs

= 1 - e-k (yhtälö 4).

Soveltamalla yhtälöä 4 voidaan arvioida jonkin prosenttiasteen tasapainotilan saavuttamiseksi tarvittava aika, kun k2 on arvioitu ensin yhtälöstä 1 tai 2.

Tilastollisesti paras kertymävaiheen kesto tilastollisesti hyväksyttävien tulosten saamiseksi (BCFk) on aika, joka tarvitaan, jotta kalassa olevan testattavan aineen pitoisuuden logaritmia lineaarisen ajan funktiona kuvaava käyrä tulee keskikohtaansa, eli 1,6/k2 tai 80 % tasapainotilasta, mutta ei enempää kuin 3,0 k2/ tai 95 % tasapainotilasta (7).

Aika, joka tarvitaan 80-prosenttisen tasapainotilan saavuttamiseen on (yhtälö 4):

0,80 = 1 - e-k tai t80 = >NUM>1,6

>DEN>k2

(yhtälö 5).

Samaten 95 % tasapainotilasta on:

t95 = >NUM>3,0

>DEN>k2

(yhtälö 6).

Esimerkiksi kertymävaiheen (uptake phase, up) kesto testattavalle aineelle, jonka log Pow = 4, olisi (käyttäen yhtälöitä 1, 5, 6):

log10k2 = -0,414 7(4) + 1,47 k2 = 0,652 vrk-1

up (80 %) = 1,6/0,652; ts. 2,45 vrk (59 tuntia)

tai up (95 %) = 3,0/0,652; ts. 4,60 vrk (110 tuntia).

Samaten testattavalle aineelle, jonka s = 10-5 mol/l (log(s) = -5,0), kertymävaiheen kesto olisi (käyttäen yhtälöitä 1, 2, 5, 6):

log10 (Pow) = -0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02

log10k2 = -0,414 (5,02) + 1,47

k2 = 0,246 vrk-1

up (80 %) = 1,6/0,246; ts. 6,5 vrk (156 tuntia)

taiup (95 %) = 3,0/0,246; ts. 12,2 vrk (293 tuntia).

Vaihtoehtoisesti yhtälöä

teq = 6,54 × 10-3 Pow + 55,31 (tuntia)

voidaan käyttää tosiasiallisen tasapainotilan saavuttamiseksi tarvittavan ajan laskemiseen (4).

2. Poistumavaiheen keston arvioiminen

Ennakkoarvio ajasta, joka tarvitaan eläimeen kertyneen aineen pitoisuuden jonkin prosenttimäärän poistumiseen, voidaan myös saada kertymä- ja poistumavaihetta (ensimmäisen asteen kinetiikka) kuvaavasta yleisestä yhtälöstä (1) (8).

Oletetaan, että Cw on poistumavaiheessa nolla. Yhtälö saa seuraavan muodon:

>NUM>dCf

>DEN>dt

= -k2Cf tai Cf = Cf,o .e-kjossa Cf,o on pitoisuus poistumavaiheen alussa. Siten saavutetaan 50 prosentin poistuma ajankohtana (t50):

>NUM>Cf

>DEN>Cf,o

= >NUM>1

>DEN>2

= e-k tai t50 = >NUM>0,693

>DEN>k2

Samaten 95 prosentin poistuma saavutetaan ajankohtana:

t95 = >NUM>3,0

>DEN>k2

Jos 80 %:n kertymää käytetään ensimmäisessä vaiheessa (1,6/k2) ja 95 prosentin poistumaa poistumavaiheessa (3,0/k2), niin poistumavaihe on suunnilleen kaksi kertaa niin pitkä kuin kertymävaihe.

On kuitenkin tärkeää huomata, että nämä arviot perustuvat siihen, että kertymä- ja poistumavaihe noudattavat ensimmäisen asteen kinetiikkaa. Jos näin ei selvästikään ole, on käytettävä monimutkaisempia malleja (esim. viite (1)).

Kirjallisuusviitteet (liite 3)

(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982), Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp 309-320.

(2) Kristensen P. (1991), Bioconcentration in fish: comparison of BCF's derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.

(3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982), Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp 4-10.

(4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988), Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp 701-707.

(5) Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975), Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp 785-792.

(6) Ernst W. (1985), Accumulation in aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4 pp 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N.Y.

(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff M.W. (1977), Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kenetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp 614-622.

(8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980), Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp 3-19.

Liite 4

>TAULUKON PAIKKA>

Liite 5

Mallin valitseminen

Biokertymistulosten on yleensä oletettu noudattavan "kohtuullisesti" yksinkertaista kahden osaston ja kahden muuttujan mallia. Sen osoittaa suora kuvaaja, joka vastaa kalassa poistumavaiheessa havaittuja pitoisuuksia, kun ne esitetään puolilogaritmipaperilla. (Jos näistä pitoisuuksista ei muodostu suoraa kuvaajaa, olisi käytettävä monimutkaisempia malleja, katso esim. Spacie ja Hamelink, liitteen 3 viite 1).

Graafinen menetelmä poistumavakion k2 määrittämiseksi

Kussakin kalanäytteessä mitattu testattavan aineen pitoisuus esitetään näytteenottoajankohdan funktiona puolilogaritmipaperilla. Tämän kuvaajan kulmakerroin on k2.

k2 = >NUM>ln (Cf1 / Cf2)

>DEN>t2 - t1

>VIITTAUS FILMIIN>

On huomattava, että poikkeamat suorasta viivasta voivat viitata monimutkaisempaan poistumaan kuin ensimmäisen asteen kinetiikkaa noudattavaan poistumaan. Graafista menetelmää voidaan käyttää sellaisten poistumatyyppien selvittämiseen, jotka poikkeavat ensimmäisen asteen kinetiikasta.

Graafinen menetelmä kertymävakion k1 määrittämiseksi

Kun tunnetaan k2, lasketaan k1 seuraavasti:

k1 = >NUM>Cfk2

>DEN>Cw x (1 - e-k)

(yhtälö 1).

Cf:n arvo luetaan mittaustuloksista saadun tasaisen käyrän keskikohdasta, kun pitoisuuden logaritmi on esitetty ajan funktiona (aritmeettisella asteikolla).

Kertymä- ja poistumavakioiden laskeminen tietokoneella

Biokertyvyystekijä sekä k1- ja k2-nopeusvakiot lasketaan mieluiten tietokoneella käyttäen epälineaarisia parametrien arviointimenetelmiä. Tällaisilla ohjelmilla saadaan arvot k1:lle ja k2:lle, jos on sarja peräkkäisiä aika-konsentraatiotuloksia ja malli:

Cf = Cw .

>NUM>k1

>DEN>k2

x (1 - e-k) 0 NUM>k1

>DEN>k2

x (e-k - e-k) t