Konsolidovaný TEXT: 32009L0156 — SK

2009L0156 — SK — 18.10.2016 — 002.001

Tento text slúži výlučne ako dokumentačný nástroj a nemá žiadny právny účinok. Inštitúcie Únie nenesú nijakú zodpovednosť za jeho obsah. Autentické verzie príslušných aktov vrátane ich preambúl sú tie, ktoré boli uverejnené v Úradnom vestníku Európskej únie a ktoré sú dostupné na portáli EUR-Lex. Tieto úradné znenia sú priamo dostupné prostredníctvom odkazov v tomto dokumente

►B	SMERNICA RADY 2009/156/ES z 30. novembra 2009 o zdravotnom stave zvierat v súvislosti s presunom a dovozom zvierat čeľade koňovité z tretích krajín (kodifikované znenie) (Text s významom pre EHP) (Ú. v. ES L 192 23.7.2010, s. 1)

Zmenené a doplnené:

		Úradný vestník
		Č.	Strana	Dátum
►M1	SMERNICA RADY 2013/20/EÚ z 13. mája 2013,	L 158	234	10.6.2013
►M2	VYKONÁVACIE ROZHODNUTIE KOMISIE (EÚ) 2016/1840 Text s významom pre EHP zo 14. októbra 2016,	L 280	33	18.10.2016

▼B

SMERNICA RADY 2009/156/ES

z 30. novembra 2009

o zdravotnom stave zvierat v súvislosti s presunom a dovozom zvierat čeľade koňovité z tretích krajín

(kodifikované znenie)

(Text s významom pre EHP)

KAPITOLA I

VŠEOBECNÉ USTANOVENIA

Článok 1

Táto smernica stanovuje predpisy o zdravotnom stave živých zvierat čeľade koňovité pri ich presune medzi členskými štátmi a dovoze z tretích krajín.

Článok 2

Na účely tejto smernice sa uplatňujú tieto definície:

a) „podnik“ je poľnohospodárske zariadenie (hospodárstvo), stajňa alebo vo všeobecnosti každá budova alebo zariadenie, v ktorom sú zvieratá čeľade koňovité obvykle držané alebo chované na akýkoľvek účel;

b) „zvieratá čeľade koňovité“ sú divé alebo domáce zvieratá čeľade koňovité (vrátane zebier) alebo druh asinine (somáre), prípadne mláďatá po skrížení týchto druhov;

c) „registrované zviera čeľade koňovité“ je každé zviera čeľade koňovité, zaregistrované ako stanovuje smernica Rady 90/427/EHS z 26. júna 1990 o zootechnických a genealogických podmienkach platiacich pre obchod s equidae v rámci Spoločenstva ( 1 ), označené pomocou identifikačného dokumentu vydaného:

i) chovateľom alebo iným príslušným orgánom v krajine, z ktorej zviera pochádza a kde sa vedie plemenná kniha alebo register pre tento chov zvierat;

ii) prípadne medzinárodnou asociáciou alebo organizáciou, ktorá registruje kone na súťaže alebo dostihy;

d) „zvieratá čeľade koňovité na porážku“ sú zvieratá čeľade koňovité, ktoré sú určené buď priamo, alebo prostredníctvom schváleného zhromažďovacieho strediska uvedeného v článku 7 na prevoz do bitúnku na porážku;

e) „zvieratá čeľade koňovité chovné a úžitkové“ sú zvieratá iné než tie, ktoré sa spomenuli v písmenách c) a d);

f) „členský štát alebo tretia krajina bez výskytu afrického moru koní“ je každá členská krajina alebo tretia krajina, na území ktorej sa počas dvoch predchádzajúcich rokov nezaznamenal klinický, sérologický (u neočkovaných zvierat čeľade koňovité) alebo epidemiologický výskyt afrického moru koní a v ktorej sa počas predchádzajúcich 12 mesiacov neuskutočnilo očkovanie proti tejto chorobe;

g) „povinne oznamované choroby“ sú choroby uvedené v prílohe I;

h) „úradný veterinár“ je veterinár vymenovaný príslušným ústredným orgánom členského štátu alebo tretej krajiny;

i) „dočasné osvedčenie“ je status registrovaného zvieraťa čeľade koňovité, ktoré pochádza z tretej krajiny a ktoré má osvedčenie na území Spoločenstva na dobu kratšiu než 90 dní, ktorá je uvedená v článku 21 ods. 2 podľa zdravotnej situácie v krajine pôvodu.

KAPITOLA II

PRAVIDLÁ PRESUNU ZVIERAT ČEĽADE KOŇOVITÉ RÁMCI ČLENSKÝCH ŠTÁTOV A MEDZI NIMI

Článok 3

Členské štáty môžu oprávniť presun registrovaných zvierat čeľade koňovité na ich území alebo ich poslať do iného členského štátu, len ak sú splnené podmienky uvedené v článkoch 4 a 5.

Príslušné orgány v cieľových členských štátoch však môžu zaručiť všeobecné alebo limitované výnimky pre presun zvierat čeľade koňovité, ktoré:

— sa použijú pre rekreačnú a športovú jazdu pozdĺž ciest, ktoré sú v blízkosti hraníc so Spoločenstvom,

— sa použijú na kultúrnych a podobných udalostiach alebo aktivitách organizovaných miestnymi orgánmi situovanými v blízkosti vnútorných hraníc so Spoločenstvom,

— sú určené výlučne na dočasné pasenie alebo prácu v blízkosti vnútorných hraníc Spoločenstva.

Členské štáty, ktoré využívajú takéto povolenie majú informovať Komisiu o obsahu zaručovanej výnimky.

Článok 4

1. Pri kontrole nesmú zvieratá čeľade koňovité vykazovať klinické príznaky choroby. Kontrola sa musí uskutočniť do 48 hodín pred naložením zvierat do dopravného prostriedku. V prípade registrovaných zvierat čeľade koňovité sa však môže takáto kontrola vyžadovať podľa článku 6 len pri obchode vo vnútri Spoločenstva.

2. Bez toho, aby boli dotknuté požiadavky uvedené v odseku 5 týkajúce sa povinného oznamovania chorôb, musí úradný veterinár v čase inšpekcie zistiť na základe vyhlásení vlastníka alebo chovateľa, či zvieratá boli v kontakte 15 dní pred kontrolou so zvieratami, ktoré majú alebo môžu mať nákazlivú chorobu.

3. Nesmie ísť o zvieratá určené na porážku v rámci vyhubenia infekčnej alebo nákazlivej choroby podľa štátneho programu.

4. Zvieratá čeľade koňovité sa musia identifikovať týmto spôsobom:

a) v prípade registrovaných zvierat čeľade koňovité pomocou identifikačného dokumentu, ako stanovuje smernica 90/427/EHS, ktorý osvedčuje, že sa splnili odseky 5 a 6 tohto článku a článok 5 tejto smernice.

Úradný veterinár musí pozastaviť účinnosť identifikačného dokumentu počas obdobia zákazu, ako je uvedené v odseku 5 tohto článku alebo v článku 5 tejto smernice. Identifikačný dokument sa musí po porážke registrovaného koňa vrátiť orgánu, ktorý ho vydal. Postup realizácie tohto písmena sa prijme v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2;

b) u zvierat na chov a úžitkových metódou, ktorú zaviedla v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2.

5. K požiadavkám uvedeným v článku 5 treba dodať, že zviera čeľade koňovité nesmie pochádzať z hospodárstva, pre ktoré sa vydal jeden z týchto zákazov:

a) ak sú všetky druhy zvierat podozrivé z choroby lokalizované na hospodárstve a neboli odvezené na porážku, obdobie zákazu pre hospodárstvo musí byť najmenej:

i) šesť mesiacov v prípade zvierat čeľade koňovité podozrivých zo žrebčej nákazy, počínajúc dátumom posledného skutočného alebo možného kontaktu s chorým zvieraťom. V prípade žrebcov zákaz platí, kým sa zviera nevykastruje;

ii) šesť mesiacov v prípade malleusu alebo encefalomyelitídy u zvierat čeľade koňovité počnúc dňom, v ktorý bolo zviera s touto chorobou zabité;

iii) v prípade infekčnej anémie až do dátumu, keď sa infikované zviera zabilo, ostatné zvieratá mali negatívnu reakciu na dva Cogginsove testy uskutočnené s odstupom troch mesiacov;

iv) šesť mesiacov od posledného zaznamenaného prípadu v prípade vezikulárnej stomatitídy;

v) jeden mesiac od posledného zaznamenaného prípadu besnoty;

vi) 15 dní od posledného zaznamenaného prípadu antraxu;

b) ak sa všetky zvieratá daného druhu, podozrivé na chorobu, lokalizované na hospodárstve odviezli na porážku a objekty sa vydezinfikovali, obdobie zákazu má byť 30 dní počnúc dňom, keď sa zvieratá zlikvidovali a objekty vydezinfikovali, okrem antraxu, keď je obdobie zákazu 15 dní.

Príslušné orgány môžu čiastočne zrušiť tento zákaz v prípade jazdiarní a dostihových dráh a môžu upovedomiť Komisiu o dôvode pre takéto zrušenie.

►M1

Keď členský štát navrhne alebo navrhol voliteľný alebo povinný kontrolný program pre sledovanie choroby, na ktoré sú zvieratá čeľade koňovité podozrivé, môže predložiť Komisii program do šiestich mesiacov od 4. júla 1990 pre Belgicko, Dánsko, Nemecko, Írsko, Grécko, Španielsko, Francúzsko, Taliansko, Luxembursko, Holandsko, Portugalsko a Spojené kráľovstvo, od 1. januára 1995 pre Rakúsko, Fínsko a Švédsko, od 1. mája 2004 pre Českú republiku, Estónsko, Cyprus, Lotyšsko, Litvu, Maďarsko, Maltu, Poľsko, Slovinsko a Slovensko, od 1. januára 2007 pre Bulharsko a Rumunsko a od 1. júla 2013 pre Chorvátsko, ktorý by sa týkal najmä:

◄

a) rozšírenia choroby na jeho území;

b) dôvodov, pre ktoré treba brať do úvahy v programe význam choroby, ako aj náklady s tým spojené;

c) zemepisnej oblasti, v ktorej sa program zavedie;

d) kategórií používaných pre zariadenie, noriem, ktoré sa majú dodržať pre každý druh zvieraťa a postupov, ktoré sa majú použiť na testovanie;

e) postupov na monitorovanie programu;

f) krokov, ktoré sa majú uskutočniť, ak z nejakého dôvodu stratí hospodárstvo svoj status;

g) krokov, ktoré sa majú uskutočniť, ak sú výsledky testov podľa opatrení v programe pozitívne;

h) nediskriminačného obchodu na území členského štátu považovaný vzhľadom na obchod vo vnútri Spoločenstva.

Komisia vyhodnotí programy predložené členskými štátmi. Ak sú vhodné, schváli ich podľa v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2. Všetky ďalšie záruky, všeobecné alebo špecifické, ktoré si môže vyžadovať obchod vo vnútri Spoločenstva, sa môžu definovať podľa toho istého postupu. Takéto záruky nesmú presahovať tie, ktoré vyžadujú členské štáty na svojom vlastnom území.

Programy predložené členskými štátmi sa môžu doplniť alebo sa k nim môžu pridať dodatky v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 3. Dodatky alebo doplnky k programom, ktoré sa už schválili alebo k tým, ktoré sa definovali podľa druhého pododseku, sa môžu schváliť tým istým postupom.

Článok 5

1. Členský štát, v ktorom sa vyskytol africký mor koní, môže expedovať zvieratá čeľade koňovité z tej časti svojho územia, ktorá sa považuje za infikovanú v zmysle odseku 2 tohto článku, iba za podmienok stanovených v odseku 5.

2. Určitá časť územia členského štátu sa považuje za infikovanú africkým morom koní, ak:

a) klinické, sérologické (u nevakcinovaných zvierat) a/alebo epidemiologické dôkazy odhalili prítomnosť afrického moru koní v predchádzajúcich dvoch rokoch alebo

b) vakcinácia proti africkému moru koní bola v priebehu posledných 12 mesiacov vykonaná.

Časť územia považovaná za infikovanú africkým morom koní prinajmenšom zahŕňa:

a) ochranné pásmo s polomerom najmenej 100 km okolo každého centra infekcie;

b) pásmo pozorovania siahajúce najmenej 50 km za ochranné pásmo, v ktorom nebola v posledných 12 mesiacoch vykonaná žiadna vakcinácia.

3. Pravidlá kontroly a opatrenia na boj s africkým morom koní týkajúce sa území a pásiem uvedených v odseku 2 a príslušné výnimky sú špecifikované v smernici Rady 92/35/EHS z 29. apríla 1992, ktorou sa stanovujú pravidlá kontroly a opatrenia na boj s africkým morom koní ( 2 ).

4. Všetky vakcinované zvieratá čeľade koňovité nachádzajúce sa v ochrannom pásme musia byť registrované a označené v súlade s článkom 6 ods. 1 písmene d) smernice 92/35/EHS.

Identifikačný doklad a/alebo zdravotný certifikát sú opatrené jasným odkazom na takúto vakcináciu.

5. Členský štát môže expedovať z územia uvedeného v odseku 2 druhom pododseku iba zvieratá čeľade koňovité, ktoré spĺňajú tieto požiadavky:

a) musia sa expedovať iba počas určitých období roka so zreteľom na aktivitu vektorového hmyzu, ktoré sa majú určiť v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 3;

b) nesmú vykazovať žiadne klinické príznaky afrického moru koní v deň prehliadky uvedenej v článku 4 ods. 1;

c) museli byť podrobené na africký mor koní, tak ako je to opísané v prílohe IV, a to dvakrát, pričom medzi týmito dvoma testami uplynul interval 21 až 30 dní a druhý test musel byť vykonaný počas 10 dní pred expedovaním buď:

i) s negatívnymi výsledkami, ak neboli vakcinované proti africkému moru koní, alebo

ii) bez toho, aby bol zaznamenaný nárast počtu protilátok a bez toho, aby boli vakcinované počas predchadzajúcich dvoch mesiacov, ak boli vakcinované proti africkému moru koní.

V súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2 a na základe stanoviska Európskeho úradu pre bezpečnosť potravín sa môžu uznať aj iné metódy monitorovania;

d) museli byť držané v karanténnej stanici počas obdobia najmenej 40 dní pred expedovaním;

e) museli byť chránené pred vektorovým hmyzom počas obdobia karantény a počas prepravy z karanténnej stanice na miesto odoslania.

Článok 6

Členské štáty, ktoré používajú iný kontrolný systém so zárukami rovnocennými tým, ktoré sú uvedené v článku 4 ods. 5, čo sa týka presunu zvierat čeľade koňovité na ich území, si môžu navzájom poskytnúť odchýlku z opatrení uvedených v druhej vete článku 4 ods. 1 a v článku 8 ods. 1 písm. b).

Upovedomia o tom Komisiu.

Článok 7

1. Zvieratá čeľade koňovité sa musia dopravovať čo najskôr z pôvodného hospodárstva (podniku), a to buď priamo alebo cez na schválené zhromažďovacie stredisko v bitúnku, ako je definované v článku 2 ods. 2 písm. o) smernice Rady 64/432/EHS z 26. júna 1964 o zdravotných problémoch zvierat ovplyvňujúcich obchod s hovädzím dobytkom a ošípanými vo vnútri Spoločenstva ( 3 ) v dopravných vozidlách alebo kontajneroch, ktoré sa pravidelne čistia a dezinfikujú dezinfekčným činidlom v intervaloch, ktoré určia vyvážajúce členské štáty. Vozidlá majú byť navrhnuté tak, aby sa výkaly zvierat čeľade koňovité, odpad alebo krmivo z nich nevytrácali počas transportu. Bez toho, aby bolo dotknuté nariadenie (ES) č. 1/2005, doprava musí byť efektívna, a to tým spôsobom, aby sa zdravotný stav zvierat čeľade koňovité mohol účinne ochraňovať.

2. Cieľový členský štát môže všeobecne alebo len obmedzene stanoviť výnimky z niektorých požiadaviek uvedených v článku 4 ods. 5 pre akékoľvek zviera s osobitným označením, ktoré je určené na porážku za predpokladu, že zdravotný certifikát v súlade s prílohou III umožňuje takúto výnimku.

Ak sa takáto výnimka stanoví, pre zviera čeľade koňovité určené na porážku sa musí transport uskutočniť priamo do určeného bitúnku a porážka sa musí vykonať do piatich dní od príchodu zvieraťa na bitúnok.

3. Úradný veterinár musí zaznamenať identifikačné číslo alebo číslo identifikačného dokumentu zvieraťa určeného na porážku, postúpiť tieto údaje príslušnému orgánu na mieste vývozu a na požiadanie vyhotoviť osvedčenie o tom, že zviera bolo zabité.

Článok 8

1. Členské štáty zabezpečia, aby:

a) registrované zviera čeľade koňovité opúšťalo hospodárstvo spolu s identifikačným dokumentom, ako je uvedené v článku 4 ods. 4 písm. a), ak je určené pre obchod vnútri Spoločenstva, s osvedčením o zdravotnom stave, ako je uvedené v prílohe II;

b) zvieratá čeľade koňovité chovné, úžitkové a určené na porážku mali počas prepravy pripojený sprievodný zdravotný certifikát, ako sa uvádza v prílohe III.

2. Zdravotný certifikát alebo v prípade registrovaného zvieraťa čeľade koňovité osvedčenie o zdravotnom stave musí byť bez ohľadu na článok 6 vystavené do 48 hodín pred ich naložením alebo najneskôr posledný pracovný deň predtým a vyhotovené prinajmenej v jednom úradnom jazyku odosielajúceho a cieľového členského štátu. Platnosť zdravotného certifikátu alebo osvedčenia o zdravotnom stave je 10 dní. Zdravotný certifikát alebo osvedčenie o zdravotnom stave musí pozostávať z jedného listu.

3. Pre pohyb medzi členskými štátmi sa môže na zvieratá čeľade koňovité iné ako tie, ktoré sú registrované, vzťahovať radšej jeden zdravotný certifikát pre zásielku, ako jednotlivé zdravotné certifikáty, ako je uvedené v odseku 1 písm. b).

Článok 9

Pravidlá určené smernicou 90/425/EHS platia najmä pri kontrolách v mieste pôvodu, organizácii kontrol a následných kontrol, ktoré majú vykonávať štáty určenia, a poistných opatreniach, ktoré sa majú plniť.

Článok 10

Veterinárni odborníci z Komisie môžu v rozsahu, ktorý je potrebný na zabezpečenie jednotného použitia tejto smernice a v spolupráci s príslušnými štátnymi orgánmi, uskutočniť kontroly na mieste. Komisia informuje členské štáty o výsledku takýchto kontrol.

Členské štáty, na území ktorých sa uskutočnila kontrola, majú odborníkom poskytnúť všetku pomoc potrebnú na uskutočnenie ich úloh.

Všeobecné dohody o použití tohto článku sa majú prijať v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2.

KAPITOLA III

PRAVIDLÁ PRE DOVOZ ZVIERAT ČEĽADE KOŇOVITÉ Z TRETÍCH KRAJÍN

Článok 11

Zvieratá čeľade koňovité dovážané do Spoločenstva musia spĺňať podmienky uvedené v článkoch 12 až 16.

Článok 12

1. Dovoz zvierat čeľade koňovité do Spoločenstva sa povolí len z tretích krajín, ktoré sú zaradené do zoznamu, ktoré sa majú vypracovať alebo zmeniť a doplniť v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2.

S ohľadom na zdravotnú situáciu a záruky, ktoré poskytla tretia krajina ohľadom zvierat čeľade koňovité, sa môže rozhodnúť v zmysle postupu uvedeného v článku 21 ods. 2, že schválenie podľa prvého pododseku tohto odseku sa bude uplatňovať na celé územie tretej krajiny alebo len na časť jej územia.

Na tento účel sa na základe príslušných medzinárodných štandardov zohľadní, ako tretia krajina schválila a uplatňuje tieto štandardy, najmä princíp regionalizácie na svojom vlastnom území a hygienické požiadavky na dovoz z tretích krajín a zo Spoločenstva.

2. Pokiaľ sa vypracuje zoznam uvedený v odseku 1 alebo sa zmení a doplní, najmä s ohľadom na:

a) zdravotnú situáciu zvierat čeľade koňovité, okrem domácich a divých zvierat v tejto tretej krajine, najmä s ohľadom na exotické choroby zvierat a akékoľvek aspekty všeobecného zdravia a situácie v životnom prostredí v tretej krajine, ktorá môže spôsobiť riziko pre zdravie a ohroziť životné prostredie Spoločenstva;

b) legislatívu tretej krajiny vo vzťahu k zdraviu a blahu zvierat;

c) organizáciu príslušného veterinárneho orgánu a jeho servisných služieb, právomocí týchto služieb, dohľad, ktorému sú podrobené a prostriedky, ktoré majú k dispozícii, vrátane zamestnancov a laboratórnej kapacity na účinné presadzovanie vnútroštátnej legislatívy;

d) záruky, ktoré príslušný veterinárny orgán tretej krajiny môže poskytnúť, so zreteľom na zhodu alebo rovnocennosť s príslušnými podmienkami na ochranu zdravia zvierat v Spoločenstve;

e) či je tretia krajina členom Svetovej organizácie pre zdravie zvierat (OIE) a pravidelne a včas dodáva informácie ohľadom výskytu infekčných alebo nákazlivých chorôb zvierat čeľade koňovité na svojom území, najmä tých chorôb, ktoré sú uvedené v prílohe I;

f) záruky, ktoré poskytla tretia krajina, že bude priamo informovať Komisiu a členské štáty:

i) do 24 hodín potvrdí výskyt akejkoľvek choroby zvierat čeľade koňovité uvedenej v prílohe I a akúkoľvek zmenu v politike vakcinácie ohľadom príslušných chorôb;

ii) v prijateľnom období uskutoční navrhnuté zmeny vo vnútroštátnej legislatíve ohľadom sanitárnych pravidiel týkajúcich sa zvierat čeľade koňovité, najmä s ohľadnom na dovoz zvierat čeľade koňovité;

iii) v pravidelných intervaloch bude informovať o stave zdravia zvierat čeľade koňovité na svojom území;

g) akúkoľvek skúsenosť s predchádzajúcim dovozom koní z tretej krajiny a výsledky akejkoľvek vykonanej kontroly dovozu;

h) výsledky vykonaných inšpekcií a/alebo auditov Spoločenstva v tretej krajine, najmä výsledky hodnotenia príslušných orgánov, alebo ak to vyžaduje Komisia, správu príslušných orgánov tretej krajiny o nimi vykonaných prehliadkach;

i) platné predpisy príslušnej tretej krajiny na zabránenie a kontrolu infekčných alebo nákazlivých chorôb zvierat v tretej krajine a ich vykonávanie vrátane predpisov pre dovoz zvierat čeľade koňovité z iných tretích krajín.

3. Komisia pripraví aktuálne znenie vypracovaného zoznamu alebo ho zmení a doplní v zmysle odseku 1 a sprístupní ho verejnosti.

Tieto zoznamy sa môžu kombinovať s inými zoznamami vypracovanými na účely ochrany zdravia ľudí a zvierat a môžu obsahovať aj vzory zdravotných certifikátov.

4. Osobitné podmienky dovozu pre každú tretiu krajinu alebo skupinu tretích krajín, ktoré zodpovedajú zdravotnej situácii u zvierat čeľade koňovité v príslušnej tretej krajine alebo krajinách sa ustanovujú v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2.

5. Podrobné predpisy na uplatňovanie odsekov 1 až 4 a podmienky včítane tretích krajín alebo častí tretích krajín uvedených v zozname podľa odseku 1 sa môžu prijať v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2.

Článok 13

1. Zvieratá čeľade koňovité pochádzajúce z tretích krajín nesmú mať:

a) africký mor koní;

b) venezuelskú encefalomyelitídu koní (VEE) počas dvoch rokov;

c) žrebčiu nákazu a malleus v období šiestich mesiacov.

2. V súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2 možno rozhodnúť:

a) že opatrenia uvedené v odseku 1 tohto článku platia len pre časť územia tretej krajiny.

V prípade, že požiadavky na africký mor koní platia regionálne, musia sa prinajmenšom dodržať opatrenia uvedené v článku 5 ods. 2 a 5;

b) vyžadovať ďalšie záruky pri chorobách, ktoré považuje Spoločenstvo za cudzokrajné.

Článok 14

Zvieratá čeľade koňovité dovážané do cieľového členského štátu musia zostať bez prerušenia deň pred naložením na dopravné prostriedky na území tretej krajiny a v prípade regionalizácie územia, ako je definované v článku 13 ods. 2 písm. a), po dobu stanovenú rozhodnutím podľa článku 15.

Musia pochádzať z hospodárstva, ktoré je pod veterinárnou kontrolou.

Článok 15

Dovoz zvierat čeľade koňovité z územia tretej krajiny alebo jej časti, ako je definované podľa článku 13 ods. 2 písm. a) na zozname vyhotovenom podľa článku 12 ods. 1, sa má schváliť len vtedy, ak zvieratá čeľade koňovité mimo požiadaviek stanovených v článku 13:

a) vyhovujú prijatým požiadavkám na zdravotný stav zvierat s odvolaním na druhy, kategórie zvierat v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2 pre dovoz týchto zvierat čeľade koňovité z takejto krajiny.

Stanovenie týchto zdravotných požiadaviek pre zvieratá je možné na základe noriem uvedených v článkoch 4 a 5 a

b) v prípade tretej krajiny, kde sa vyskytuje vezikulárna stomatitída alebo virálna artritída prinajmenej šesť mesiacov, musia zvieratá čeľade koňovité spĺňať tieto požiadavky:

i) musia pochádzať z hospodárstva, kde sa nevyskytuje vezikulárna stomatitída prinajmenej šesť mesiacov a musia mať negatívny serologický test pred vývozom;

ii) v prípade virálnej artritídy musia samce týchto zvierat čeľade koňovité napriek článku 19 písm. b) mať negatívny serologický test alebo test vírovej izolácie, alebo akýkoľvek iný test uznaný v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2, ktorý by zaručil neprítomnosť vírusu.

V súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2 a podľa stanoviska Európskeho úradu pre bezpečnosť potravín sa môžu definovať kategórie samcov zvierat čeľade koňovité, na ktorých sa táto požiadavka vzťahuje.

Článok 16

1. Zvieratá čeľade koňovité sa musia identifikovať podľa článku 4 ods. 4 a k zásielke sa musí priložiť zdravotný certifikát vystavené úradným veterinárom vyvážajúcej tretej krajiny. Tento zdravotný certifikát musí:

a) byť vydaný v deň naloženia zvierat do vývozného dopravného prostriedku do cieľového členského štátu alebo v prípade registrovaných koní v posledný pracovný deň pred ich naložením;

b) byť vystavený prinajmenej v jednom úradnom jazyku cieľového členského štátu a v jednom jazyku tých členských štátov, v ktorom sa uskutočnila dovozná kontrola;

c) k zvieratám musí byť priložený jeho originál;

d) byť osvedčením o tom, že zvieratá vyhovujú požiadavkám tejto smernice v súvislosti s dovozom z tretích krajín;

e) pozostávať z jedného listu;

f) byť vyhotovený pre jedného príjemcu zásielky alebo v prípade zvierat určených na porážku pre danú zásielku za predpokladu, že zvieratá sú správne označené a identifikované.

Členské štáty informujú Komisiu v prípade, že využijú túto možnosť.

2. Zdravotný certifikát sa musí vystaviť na formulári podľa priloženého vzoru, ktorý je vyhotovený v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2.

Článok 17

1. Ihneď po príchode do cieľového členského štátu sa zvieratá čeľade koňovité určené na porážku odvezú na bitúnok, a to priamo alebo po prechode cez zhromažďovacie stredisko uvedené v článku 7 a podľa požiadaviek na zdravotný stav zvieraťa sa porážka uskutoční v časovom období špecifikovanom v rozhodnutí, ktoré sa prijalo v zhode s článkom 15.

2. Na základe osobitných podmienok, ktoré možno prijať v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2, môže príslušný orgán cieľového členského štátu na základe zdravotného stavu zvieraťa navrhnúť bitúnok, do ktorého sa má takéto zviera čeľade koňovité odviezť.

Článok 18

Kontrola sa má uskutočňovať na mieste pomocou veterinárnych odborníkov členských štátov a Komisie na overenie, či sa používajú v praxi opatrenia uvedené v tejto smernici a predovšetkým tie, ktoré sú uvedené v článku 12 ods. 2.

Ak kontroly uskutočnené na základe podmienok uvedených v tomto článku objasnia závažne fakty proti schválenému hospodárstvu, Komisia má ihneď informovať členské štáty a prijať rozhodnutie, ktorým sa takéto schválenie stiahne. Konečné rozhodnutie sa potom uskutoční v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 3.

Odborníci z členských štátov, ktorí sú oprávnení na uskutočňovanie takýchto kontrol, sa vymenovávajú Komisiou, ktorá pracuje na návrh členských štátov.

Tieto kontroly sa majú uskutočniť v zastúpení Spoločenstva, ktoré bude znášať aj s týmto súvisiace náklady.

Častosť a podrobnosti o týchto kontrolách sa stanovia v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2.

Článok 19

V súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 2:

a) sa môže rozhodnúť o tom, že dovoz z tretej krajiny alebo časti tretej krajiny sa má obmedziť na zvláštne druhy alebo kategórie zvierat čeľade koňovité;

b) sa môže rozhodnúť napriek článku 15 o zavedení osobitnej podmienky pre dočasný vstup registrovaných zvierat čeľade koňovité alebo zvierat čeľade koňovité, ktoré sú určené na osobitné účely na územie Spoločenstva alebo ich opakovaný vstup na územie Spoločenstva po tom, ako sa dočasne vyviezli;

c) sa má stanoviť podmienky na premenu dočasného vstupu na trvalý vstup;

d) sa môže určiť referenčné laboratórium Spoločenstva pre jednu alebo viac chorôb zvierat čeľade koňovité uvedených v prílohe I a ustanoviť funkcie, úlohy a postupy ohľadom spolupráce s laboratóriami zodpovednými za diagnostikovanie infekčných chorôb zvierat čeľade koňovité v členských štátoch.

KAPITOLA IV

KONEČNÉ OPATRENIA

Článok 20

Prílohy I až IV sa zmenia a doplnia v súlade s postupom uvedeným v článku 21 ods. 3.

Článok 21

1. Komisii pomáha Stály výbor pre potravinový reťazec a zdravie zvierat zriadený podľa článku 58 nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 178/2002 z 28. januára 2002, ktorým sa ustanovujú všeobecné zásady a požiadavky potravinového práva, zriaďuje Európsky úrad pre bezpečnosť potravín a stanovujú postupy v záležitostiach bezpečnosti potravín ( 4 ).

2. Ak sa odkazuje na tento odsek, uplatňujú sa články 5 a 7 rozhodnutia 1999/468/ES.

Lehota ustanovená v článku 5 ods. 6 rozhodnutia 1999/468/ES je tri mesiace.

3. Ak sa odkazuje na tento odsek, uplatňujú sa články 5 a 7 rozhodnutia 1999/468/ES.

Lehota ustanovená v článku 5 ods. 6 rozhodnutia 1999/468/ES je 15 dní.

Článok 22

Smernica 90/426/EHS, zmenená a doplnená aktami uvedenými v časti A prílohy V, sa zrušuje bez vplyvu na povinnosti členských štátov týkajúce sa lehôt na transpozíciu tých smerníc do vnútroštátneho práva, ktoré sú uvedené v časti B prílohy V.

Odkazy na zrušenú smernicu sa považujú za odkazy na túto smernicu a znejú v súlade s tabuľkou zhody uvedenou v prílohe VI.

Článok 23

Táto smernica nadobúda účinnosť dvadsiatym dňom po jej uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.

Článok 24

Táto smernica je určená členským štátom.

PRÍLOHA I

POVINNE OZNAMOVANÉ CHOROBY

Nasledujúce choroby sa povinne oznamujú:

— žrebčia nákaza,

— Malleus,

— konská encefalomyelitída (všetky druhy vrátane VEE),

— nákazlivá anémia,

— besnota,

— antrax,

— africký mor koní,

— vezikulárna stomatitída.

PRÍLOHA II

VZOR

OSVEDČENIE O ZDRAVOTNOM STAVE ( 5 )

Pas č. …

Ja, podpísaný, potvrdzujem ( 6 ), že vyššie uvedené zviera spĺňa tieto požiadavky:

a) bolo vyšetrené dnes a nevykazuje žiadne príznaky choroby;

b) nie je určené na zabitie v súlade s národným programom eradikácie nákazlivých alebo infekčných chorôb;

— nepochádza z územia alebo z časti územia členského štátu, ktorý/á podlieha obmedzeniam z dôvodov výskytu afrického moru koní, alebo

— pochádza z územia alebo časti územia členského štátu, ktorý podlieha zákazu z veterinárnych dôvodov, a bolo podrobené s uspokojivým výsledkom testom uvedeným v článku 5 ods. 5 smernice 2009/156/ES v karanténnej stanici … medzi … a … ( 7 ),

— nebolo vakcinovaný proti africkému moru koní alebo

— bolo vakcinované proti africkému moru koní dňa … (7) ( 8 );

d) nepochádza z chovu, ktorý podliehal zákazu z veterinárnych dôvodov, a ani neprišlo do styku so zvieratami čeľade koňovité z chovu, ktorý podliehal zákazu z veterinárnych dôvodov:

— počas šiestich mesiacov v prípade zvierat čeľade koňovité, u ktorých je podozrenie na žrebčiu nákazu, počnúc dátumom posledného skutočného alebo možného kontaktu s chorým zvieraťom. V prípade žrebca sa zákaz uplatňuje dovtedy, kým zviera nebude vykastrované,

— počas šiestich mesiacov v prípade sopľavky alebo encefalomyelitídy koní počnúc dňom, keď boli zvieratá čeľade koňovité trpiace danou chorobou zabité,

— v prípade infekčnej anémie až do dátumu, keď boli infikované zvieratá zabité, zvyšné zvieratá vykázali reakciu na dva Cogginsove testy vykonané s časovým odstupom troch mesiacov,

— počas šiestich mesiacov od posledného prípadu v prípade vezikulárnej stomatitídy,

— počas jedného mesiaca od posledného prípadu v prípade besnoty,

— počas 15 dní od posledného prípadu v prípade sneti slezinovej,

— ak všetky zvieratá druhov vnímavých na chorobu umiestnené v chove boli zabité a priestory dezinfikované počas 30 dní počnúc dňom, keď boli zvieratá zničené a priestory vydenzifikované, s výnimkou prípadu sneti slezinovej, keď zákaz trvá 15 dní;

e) podľa mojich najlepších vedomostí neprišlo do kontaktu so zvieraťom čeľade koňovité trpiacim infekčnou alebo nákazlivou chorobou v priebehu 15 dní pred týmto vyhlásením;

f) v čase konania kontroly, bolo v súlade s ustanoveniami nariadenia (ES) č. 1/2005 ( 9 ), spôsobilé na prepravu po plánovanej ceste.

Dátum	Miesto	Pečiatka a podpis úradného veterinárneho lekára (1)

(1) Meno paličkovým veľkým písmom a funkcia.

PRÍLOHA III

VZOR

ZDRAVOTNÉ OSVEDČENIE

Pre obchod medzi členskými štátmi

ZVIERATÁ ČEĽADE KOŇOVITÉ

▼M2

PRÍLOHA IV

AFRICKÝ MOR KONÍ

DIAGNOSTIKA

ČASŤ A

Sérologické testy

Sérologickou metódou opísanou ďalej je enzýmové imunosorbentové stanovenie (ELISA) na základe kapitoly 2.5.1. oddielu B bodu 2 Príručky diagnostických testov a vakcín pre suchozemské zvieratá, vydanie 2016, ktorú schválilo Svetové združenie zástupcov Svetovej organizácie pre zdravie zvierat (OIE) v máji 2012.

Vírusový proteín VP7 je imunodominantný hlavný antigén vírusu afrického moru koní (AHSV) a zachováva sa v rámci deviatich sérotypov AHSV. Ukázalo sa, že rekombinantné proteíny AHSV-VP7 sú stabilné a neškodné a sú vhodné na použitie ako antigény v postupoch ELISA na stanovenie protilátok AHSV s vysokým stupňom citlivosti a špecifickosti (Laviada et al., 1992b ( 10 ); Maree a Paweska, 2005). Nepriama ELISA a blokujúca ELISA predstavujú dva testy na určenie AHS-VP7 v rámci testov ELISA, ktoré sú vhodné na sérologickú diagnostiku afrického moru koní (AHS).

1. Nepriama ELISA na zistenie protilátok proti vírusu afrického moru koní (AHSV)

Konjugát použitý pri tejto metóde je chrenová peroxidáza konjugovaná s anti-konským gama-globulínom reagujúcim so sérom koní, mulíc a somárov. V metóde, ktorú opísali Maree & Paweska (2005) ( 11 ), sa používa proteín G ako konjugát, ktorý takisto reaguje so sérom zebry.

Antigén môže poskytnúť Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), Španielsko, a to do 4 až 6 mesiacov od žiadosti.

1.1. Postup skúšky

1.1.1. Fáza tuhosti

1.1.1.1. Pokryte platničky ELISA rekombinantom AHSV-4 VP7 rozpusteným v karbonátovom/bikarbonátovom tlmivom roztoku, pH 9,6. Platničky inkubujte cez noc pri teplote 4 °C.

1.1.1.2. Platničky opláchnite päťkrát destilovanou vodou obsahujúcou 0,01 % (v/v) Tween 20 (čistiaci roztok). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.

1.1.1.3. Platničky blokujte fosfátovým slaným tlmivým roztokom (PBS) pH 7,2 + 5 % (w/v) odstredeného mlieka (sušené odstredené mlieko NestléTM), 200 μl/jamku 1 hodinu pri teplote 37 °C.

1.1.1.4. Odstráňte blokujúci roztok a jemne pritlačte platničky na savý materiál.

1.1.2. Skúšobné vzorky

1.1.2.1. Testované vzorky séra, pozitívne a negatívne kontrolné séra sa rozpustia 1:25 v PBS + 5 % (w/v) odstredeného mlieka + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl/jamku. Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.

Pri titrácii urobte dvojnásobné riedenie 1: 25 (100 μl/jamku), jedno sérum na jeden stĺpec platničky, a to isté vykonajte s pozitívnou a negatívnou kontrolou. Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.

1.1.2.2. Platničky opláchnite päťkrát destilovanou vodou obsahujúcou 0,01 % (v/v) Tween 20 (čistiaci roztok). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.

1.1.3. Konjugácia

1.1.3.1. Dajte 100 μl/jamku chrenovej peroxidázy (HRP) konjugovanej s anti-konským gama-globulínom rozpusteným v PBS + 5 % mlieku + 0,05 % Tween 20, pH 7,2. Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.

1.1.3.2. Platničky opláchnite päťkrát destilovanou vodou obsahujúcou 0,01 % (v/v) Tween 20 (čistiaci roztok). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.

1.1.4. Chromogén/substrát

1.1.4.1. Pridajte 200 μl/jamku chromogénového/substrátového roztoku (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetyl aminobenzaldehyd) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metyl-2-benzo-tiazolin hydrazon hydrochlorid) + 5 μl H2O2).

Vyvolávanie farby sa zastaví pridaním 50 μl 3N H2SO4 po približne 5 až 10 minútach (predtým, ako sa začne sfarbovať negatívna kontrola).

Tiež je možné použiť aj iné chromogény ako ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-etylbenzotiazolin-6- kyselina sulfónová], TMB (tetrametyl benzidín) alebo OPD (orto-fenyldiamín).

1.1.4.2. Odčítajte pri 600 nm (alebo 620 nm).

1.2. Interpretácia výsledkov

1.2.1. Vypočítajte medznú hodnotu pripočítaním 0,06 k hodnote negatívnej kontroly (0,06 je štandardná odchýlka odvodená zo skupiny 30 negatívnych sér).

1.2.2. Skúšobné vzorky, pri ktorých sa uvádzajú absorpčné hodnoty nižšie než je medzná hodnota, sa považujú za negatívne.

1.2.3. Skúšobné vzorky, pri ktorých sa uvádzajú absorpčné hodnoty vyššie než je medzná hodnota + 0,15, sa považujú za pozitívne.

1.2.4. Skúšobné vzorky, pri ktorých sa uvádzajú prostredné absorpčné hodnoty, sú nerozhodné a na potvrdenie výsledku je potrebné použiť inú metódu.

2. Blokujúca ELISA na zistenie protilátok proti vírusu afrického moru koní (AHSV)

Kompetitívna blokujúca ELISA je určená na zisťovanie špecifických protilátok AHSV v sérach akýchkoľvek zvierat čeľade koňovité, t. j. koní, somárov, zebier a ich krížencov, ktorou sa zabraňuje problému špecifickosti, ku ktorej občasne dochádza pri použití testu nepriama ELISA.

Princípom skúšky je blokovanie reakcie medzi rekombinantným proteínom VP7 absorbovaným do platničky ELISA a konjugovanou špecifickou monoklonálnou protilátkou AHS-VP7. Protilátka v skúšobnom sére zablokuje reakciu medzi antigénom a monoklonálnou protilátkou, čo vyústi do zníženia zafarbenia. Keďže monoklonálna protilátka je tiež namierená proti VP7, daná skúška poskytne vysokú hladinu citlivosti a osobitosti.

Kompetitívna blokujúca ELISA je komerčne dostupná.

2.1. Postup skúšky

2.1.1. Fáza tuhosti

2.1.1.1. Pokryte platničky ELISA rekombinantým AHSV-4 VP7 (50 – 100 ng) rozpusteným v karbonátovom/bikarbonátovom tlmivom roztoku, pH 9,6. Inkubujte cez noc pri teplote 4 °C.

2.1.1.2. Platničky trikrát premyte vo fosfátovom soľnom tlmivom roztoku (PBS) 0,1 × obsahujúcom 0,135 M NaCl a 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.

2.1.2. Skúšobné vzorky a kontroly

2.1.2.1. Testované vzorky séra a pozitívne a negatívne kontrolné séra sa rozpustia v pomere 1:5 v rozpúšťadle obsahujúcom 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 a 0,1 % Kathon, 100 μl/jamku. Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.

Pri titrácii urobte dvojnásobné riedenie testovaného séra od 1:10 do 1:280 v 8 jamkách (100 μl/jamku), jedno sérum na jeden stĺpec platničky, a to isté vykonajte s pozitívnou a negatívnou kontrolou. Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.

2.1.2.2. Platničky päťkrát premyte vo fosfátovom soľnom tlmivom roztoku (PBS) 0,1× obsahujúcom 0,135 M NaCl a 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.

2.1.3. Konjugácia

2.1.3.1. Dajte 100 μl/jamku monoklonálnej protilátky anti-VP7 konjugovanej chrenovou peroxidázou. Táto monoklonálna protilátka bola vopred rozpustená v pomere 1:5 000 až 1:15 000 v roztoku 1:1 StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics; odkaz: SZ03) v destilovanej vode. Inkubujte 30 minút pri teplote 37 °C.

2.1.3.2. Platničky päťkrát premyte vo fosfátovom soľnom tlmivom roztoku (PBS) 0,1 × obsahujúcom 0,135 M NaCl a 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.

2.1.4. Chromogén/substrát

Pridajte 100 μl/jamku roztoku chromogén/substrátu (1 ml ABTS (kyselina 2,2′-azino-bis-[3-etylbenzotiazolín-6-sulfónová]) 5 mg/ml + 9 ml substrátového tlmivého roztoku (0,1 M fosfátovo-citrátový tlmivý roztok s pH 4 obsahujúci 0,03 % H2O2) a inkubujte 10 minút pri izbovej teplote. Vývoj farby sa zastaví pridaním 100 μl/jamku 2 % (w/v) SDS (dodecylsulfát sodný).

2.1.5. Odčítanie

Odčítajte pri 405 nm v snímači ELISA.

2.2. Interpretácia výsledkov

2.2.1. Stanovte blokujúce percento (BP) každej vzorky pomocou nasledujúceho vzorca, kde „Abs“ znamená protilátky:

2.2.2. Vzorky vykazujúce hodnotu BP vyššiu ako 50 % by sa mali považovať za pozitívne pre protilátky AHSV.

2.2.3. Vzorky vykazujúce hodnotu BP nižšiu ako 45 % by sa mali považovať za negatívne pre protilátky AHSV.

2.2.4. Vzorky vykazujúce hodnotu BP medzi 45 % a 50 % by sa mali považovať za nerozhodné a musia sa nanovo otestovať. Ak bude výsledok opäť nerozhodný, zvieratá by sa mali nanovo otestovať na vzorkách odobratých nie skôr ako dva týždne po odobratí vzorky, ktorá sa považovala za nerozhodnú.

ČASŤ B

Identifikácia agensa

Polymerázová reťazová reakcia spojená s reverznou transkripciou v reálnom čase

Pri testoch na identifikáciu agensa na základe metód nukleových kyselín sa musia zistiť referenčné kmene z deviatich vírusových sérotypov AHSV.

Metóda opísaná v bode 2.1. je založená na kapitole 2.5.1. oddiele B bode 1.2. Príručky diagnostických testov a vakcín pre suchozemské zvieratá, vydanie 2016, ktorú schválilo Svetové združenie zástupcov Svetovej organizácie pre zdravie zvierat (OIE) v máji 2012.

Akákoľvek metóda detekcie polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou použitá na testovanie vzoriek, buď krvi, alebo sleziny, musí byť v kontexte smernice 2009/156/ES rovnocenná alebo musí presiahnuť citlivosť metodík opísaných v bode 2.

Inaktivovaný vírus sérotypov 1 až 9 referenčných kmeňov možno získať z referenčného laboratória Európskej únie alebo referenčného laboratória OIE pre africký mor koní, Algete, Španielsko.

1. Extrakcia vírusovej RNA

Na zaistenie správnej reakcie je potrebné zo vzorky extrahovať RNA AHSV vysokej kvality. Extrakciu nukleových kyselín z klinických vzoriek možno vykonať rôznymi internými a komerčne dostupnými metódami.

V rámci komerčných súprav sa na izoláciu RNA používajú rôzne prístupy. Väčšina z nich je založená na týchto postupoch:

— fenol-chloroformová extrakcia nukleových kyselín,

— adsorpcia nukleových kyselín na filtračný systém,

— adsorpcia nukleových kyselín na systém magnetických lôžok.

Príklad internej extrakcie RNA je uvedený nižšie:

1.1. 1 g vzorky tkaniva sa homogenizuje v 1 ml denaturovaného roztoku (4 M tiokyanatan guanidínu, 25 mM citranu sodného, 0,1 M 2-merkaptoetanolu, 0,5 % sarkosyl).

1.2. Do supernatantu sa po centrifugácii pridá 1 μg RNA z kvasiniek, 0,1 ml 2 M citranu sodného s pH 4, 1 ml fenolu a 0,2 ml chloroformu/zmesi izoamylalkoholu (49:1).

1.3. Suspenzia sa silno pretrasie a schladí na ľade na 15 minút.

1.4. Po centrifugácii je RNA prítomná vo vodnej fáze extrahovaná fenolom, vyzrážaná etanolom a resuspendovaná v sterilnej vode.

2. Postup pri polymerázovej reťazovej reakcii spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase

2.1. Polymerázová reťazová reakcia spojená s reverznou transkripciou v reálnom čase špecifická pre skupinu podľa Agüero et al., 2008 ( 12 )

Polymerázová reťazová reakcia spojená s reverznou transkripciou v reálnom čase špecifická pre skupinu je zameraná na VP7 AHSV a možno ňou zistiť všetky v súčasnosti známe cirkulujúce sérotypy a kmene AHSV. Túto metódu použili s veľmi dobrými výsledkami zúčastňujúce sa národné referenčné laboratóriá členských štátov Európskej únie v skúškach spôsobilosti, ktoré každoročne organizuje referenčné laboratórium Európskej únie na obdobie rokov 2009 – 2015. Tento protokol okrem toho získal spomedzi ďalších protokolov veľmi vysoké skóre v medzinárodnom kruhovom teste organizovanom v roku 2015 v rámci siete referenčných laboratórií OIE.

Sekvencie primerov a sond na zistenie prítomnosti vírusov druhov AHSV:

priamy primer

5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′

reverzný primer

5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′

TaqMan MGB sonda

5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′

2.1.1. Koncentrácia vzorky primeru sa rozpustí na pracovnú koncentráciu 8 μM („pracovná vzorka primeru 8 μM“) a sonda sa rozpustí na pracovnú koncentráciu 50 μM („pracovná vzorka sondy 50 μM“). Je potrebné navrhnúť usporiadanie testovacej platničky, ktorá sa vloží do softvéru v stroji na polymerázovú reťazovú reakciu v reálnom čase. Použitím daného usporiadania ako vodidla sa 2,5 μl každej pracovnej vzorky primeru 8 μM pridá do každej jamky, ktorá bude obsahovať vzorky RNA, pozitívne a/alebo negatívne kontroly (konečná koncentrácia primeru bude 1 μM v 20 μl zmesi RT-PCR). Platnička je uložená na ľade.

2.1.2. S priamym a reverzným primerom sa zmieša 2 μl izolovanej RNA (skúšobné vzorky a pozitívna kontrola) alebo 2 μl vody bez obsahu RNázy v negatívne reagujúcich kontrolách. Táto zmes sa denaturuje ohrevom na 95 °C počas 5 minút, po čom nasleduje rýchle ochladenie na ľade počas aspoň 5 minút.

2.1.3. Podľa pokynov výrobcu sa pre niekoľko vzoriek, ktoré sa budú testovať, pripraví príslušný objem zmesi „master mix“ v jednom kroku na polymerázovú reťazovú reakciu spojenú s reverznou transkripciou v reálnom čase. 0,1μl pracovnej vzorky sondy 50 μM sa pridá do každej jamky s obsahom vzoriek RNA (konečná koncentrácia sondy bude 0,25 μM v každej jamke s obsahom vzoriek RNA),13 μl zmesi „master mix“ v jednom kroku na polymerázovú reťazovú reakciu spojenú s reverznou transkripciou v reálnom čase sa rozdelí do každej jamky na platničke polymerázovej reťazovej reakcie, ktorá obsahuje denaturované primery a RNA.

2.1.4. Platnička sa umiestni do termocykléru v reálnom čase naprogramovaného na reverznú transkripciu a zistenie amplifikácie/fluorescencie cDNA. Podmienky amplifikácie pozostávajú z kroku prvej reverznej transkripcie pri teplote 48 °C počas 25 minút, po čom nasleduje 10 minút pri teplote 95 °C („hot start“) a 40 cyklov po 15 sekúnd pri teplote 95 °C, 35 sekúnd pri teplote 55 °C a 30 sekúnd pri teplote 72 °C (alebo 40 cyklov pri teplote 97 °C po 2 sekundy a pri teplote 55 °C po 30 sekúnd, ak sa použijú reagenty a termocyklér umožňujúci rýchle reakcie). Údaje o fluorescencii sa získajú pri konečnom kroku pri teplote 55 °C.

2.1.5. Ak sa získajú atypické amplifikačné krivky, skúška sa nepovažuje za platnú a treba ju zopakovať.

Vzorky sa považujú za pozitívne v prípade, ak hodnota Ct (číslo cyklu, pri ktorom fluorescencia vytvorená pri reakcii prekročí prahovú hodnotu fluorescencie) bude nižšia než stanovená prahová hodnota Ct (35) v rámci 40 cyklov polymerázovej reťazovej reakcie (Ct ≤ 35) alebo jej rovná.

Vzorky sa považujú za nerozhodné v prípade, ak hodnota Ct bude vyššia ako stanovená prahová hodnota Ct (35) v rámci 40 cyklov polymerázovej reťazovej reakcie (Ct ≥ 35).

Vzorky sa považujú za negatívne v prípade, ak sa získa horizontálna amplifikačná krivka, ktorá neprekročí líniu prahovej hodnoty v rámci 40 cyklov polymerázovej reťazovej reakcie.

2.2. Polymerázová reťazová reakcia spojená s reverznou transkripciou v reálnom čase špecifická pre skupinu podľa Guthrie et al., 2013 ( 13 )

Polymerázová reťazová reakcia spojená s reverznou transkripciou v reálnom čase pomocou sond FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) na zistenie nukleovej kyseliny AHSV.

Opísaná skúška polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou AHSV bola navrhnutá pomocou sekvencií zo širokého množstva v súčasnosti cirkulujúcich voľne sa vyskytujúcich kmeňov AHSV (Quan et al., 2010 ( 14 )). Zároveň zahŕňa originálnu syntetickú externú kontrolnú skúšku na overenie správneho fungovania komponentov skúšky.

Súpravy na polymerázovú reťazovú reakciu v reálnom čase v jednom kroku sú komerčne dostupné. Ďalej sú uvedené niektoré základné kroky podľa opisu Guthrie et al. (2013), ktoré možno upraviť v závislosti od miestnych/prípadových požiadaviek, použitých súprav a dostupného vybavenia.

Sekvencie primerov a sond na zistenie prítomnosti vírusov druhov AHSV:

priamy primer

5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′

reverzný primer

5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′

TaqMan MGB sonda

5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′

2.2.1. Pracovné roztoky zmesi primeru a sondy sú vytvorené v koncentrácii 25 × v 5 μΜ pre priame primery a 3 μΜ pre sondu. Je potrebné navrhnúť usporiadanie testovacej platničky, ktorá sa vloží do softvéru v stroji na polymerázovú reťazovú reakciu v reálnom čase. Použitím daného usporiadania sa do príslušných jamiek platničky pridá 5 μl vzoriek RNA vrátane testovacích vzoriek a pozitívnych a negatívnych kontrol.

2.2.2. RNA sa denaturuje ohrevom na 95 °C počas 5 minút, po čom nasleduje rýchle ochladenie na ľade počas aspoň 3 minút.

2.2.3. Podľa pokynov výrobcu sa pre niekoľko vzoriek, ktoré sa budú testovať, pripraví príslušný objem zmesi „master mix“ v jednom kroku na polymerázovú reťazovú reakciu spojenú s reverznou transkripciou v reálnom čase. 1 μl 25 × pracovného roztoku zmesi primeru-sondy (z bodu 2.2.1 vyššie) sa zahrnie do zmesi „master mix“ s cieľom dosiahnuť konečnú koncentráciu každej jamky 200 nM pre každý primer a 120 nM pre sondu. 20 μl zmesi „master mix“ sa rozdelí do každej jamky na platničke polymerázovej reťazovej reakcie, ktorá obsahuje denaturovanú RNA.

2.2.4. Platnička sa umiestni do termocykléru v reálnom čase naprogramovaného na reverznú transkripciu a zistenie amplifikácie/fluorescencie cDNA podľa odporúčania výrobcov. Podmienky amplifikácie pozostávajú napríklad z kroku prvej reverznej transkripcie pri teplote 48 °C počas 10 minút, po čom nasleduje 10 minút pri teplote 95 °C a 40 cyklov po 15 sekúnd pri teplote 95 °C a 45 sekúnd pri teplote 60 °C.

2.2.5. Vzorky sa považujú za pozitívne v prípade, ak normalizovaná fluorescencia pre skúšku AHSV polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou prekročí prahovú hodnotu 0,1 pri 36 cykloch polymerázovej reťazovej reakcie vo všetkých replikátoch vzorky.

Vzorky sa považujú za nerozhodné v prípade, ak normalizovaná fluorescencia pre skúšku AHSV polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou prekročí prahovú hodnotu 0,1 pri 36 až 40 cykloch polymerázovej reťazovej reakcie v ktoromkoľvek replikáte vzorky.

Vzorky sa považujú za negatívne v prípade, ak normalizovaná fluorescencia pre skúšku AHSV polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou neprekročila prahovú hodnotu 0,1 pri 40 cykloch polymerázovej reťazovej reakcie vo všetkých replikátoch vzorky a v prípade, ak normalizovaná fluorescencia v prípade chránenej syntetickej externej kontrolnej skúšky prekročila prahovú hodnotu 0,1 pri 33 cykloch polymerázovej reťazovej reakcie.

▼B

PRÍLOHA V

ČASŤ A

Zrušená smernica so zoznamom neskorších zmien a doplnení

(v zmysle článku 22)

Smernica Rady 90/426/EHS (Ú. v. ES L 224, 18.8.1990, s. 42).
Smernica Rady 90/425/EHS (Ú. v. ES L 224, 18.8.1990, s. 29).	Iba článok 15 ods. 3.
Smernica Rady 91/496/EHS (Ú. v. ES L 268, 24.9.1991, s. 56).	Iba pokiaľ ide o odkazy na smernicu 90/426/EHS v článku 26 ods. 2.
Rozhodnutie Komisie 92/130/EHS (Ú. v. ES L 47, 22.2.1992, s. 26).
Smernica Rady 92/36/EHS (Ú. v. ES L 157, 10.6.1992, s. 28).	Iba článok 1.
Akt o pristúpení z roku 1994, bod V.E.I.A.3 prílohy I (Ú. v. ES C 241, 29.8.1994, s. 132).
Rozhodnutie Komisie 2001/298/ES (Ú. v. ES L 102, 12.4.2001, s. 63).	Iba pokiaľ ide o odkazy na smernicu 90/426/EHS v článku 1 ods. 1 a bod 2 prílohy I.
Rozhodnutie Komisie 2002/160/ES (Ú. v. ES L 53, 23.2.2002, s. 37).
Nariadenie Rady (ES) č. 806/2003 (Ú. v. EÚ L 122, 16.5.2003, s. 1).	Iba bod 10 prílohy III.
Akt o pristúpení z roku 2003, bod 6.B.I.16 prílohy II (Ú. v. EÚ L 236, 23.9.2003, s. 381).
Smernica Rady 2004/68/ES (Ú. v. EÚ L 139, 30.4.2004, s. 321).	Iba článok 15.
Smernica Rady 2006/104/ES (Ú. v. EÚ L 363, 20.12.2006, s. 352).	Iba bod I.2 prílohy.
Smernica Rady 2008/73/ES (Ú. v. EÚ L 219, 14.8.2008, s. 40).	Iba článok 7.

ČASŤ B

Zoznam lehôt na transpozíciu do vnútroštátneho práva

(v zmysle článku 22)

Smernica	Lehota na transpozíciu
90/426/EHS	1. január 1992
90/425/EHS	1. júl 1992
91/496/EHS	1. júl 1992
92/36/EHS	31. december 1992
2004/68/ES	19. november 2005
2006/104/ES	1. január 2007
2008/73/ES	1. január 2010

PRÍLOHA VI

Tabuľka zhody

Smernica 90/426/EHS	Táto smernica
článok 1	článok 1
článok 2 písm. a) a b)	článok 2 písm. a) a b)
článok 2 písm. c)	článok 2 písm. c) body i) a ii)
článok 2 písm. d) až i)	článok 2 písm. d) až i)
článok 3	článok 3
článok 4 ods. 1, 2 a 3	článok 4 ods. 1, 2 a 3
článok 4 ods. 4 body i) a ii)	článok 4 ods. 4 písm. a) a b)
článok 4 ods. 5 písm. a) prvá až šiesta zarážka	článok 4 ods. 5 písm. a) body i) až vi)
článok 4 ods. 5 písm. b)	článok 4 ods. 5 písm. b)
článok 4 ods. 6 prvý pododsek prvá až ôsma zarážka	článok 4 ods. 6 prvý pododsek písm. a) až h)
článok 4 ods. 6 druhý a tretí pododsek	článok 4 ods. 6 druhý a tretí pododsek
článok 5 ods. 1	článok 5 ods. 1
článok 5 ods. 2 písm. a)	článok 5 ods. 2 prvý pododsek písm. a) a b)
článok 5 ods. 2 písm. b)	článok 5 ods. 2 druhý pododsek písm. a) a b)
článok 5 ods. 2 písm. c)	článok 5 ods. 3
článok 5 ods. 2 písm. d)	článok 5 ods. 4
článok 5 ods. 3 písm. a) a b)	článok 5 odsek 5 písm. a) a b)
článok 5 ods. 3 písm. c) prvá a druhá zarážka	článok 5 odsek 5 písm. c) prvý pododsek body i) a ii)
článok 5 ods. 3 písm. c) druhá zarážka posledná veta	článok 5 odsek 5 písm. c) druhý pododsek
článok 5 ods. 3 písm. d) a e)	článok 5 odsek 5 písm. d) a e)
článok 6	článok 6
článok 7	článok 7
článok 8 ods. 1 prvý pododsek prvá a druhá zarážka	článok 8 ods. 1 písm. a) a b)
článok 8 ods. 1 druhý pododsek	článok 8 ods. 2
článok 8 ods. 2	článok 8 ods. 3
článok 9	článok 9
článok 10	článok 10
článok 11 ods. 1	článok 11
článok 11 ods. 2	—
článok 12	článok 12
článok 13	článok 13
článok 14	článok 14
článok 15	článok 15
článok 16 ods. 1 písm. a) až f)	článok 16 ods. 1 písm. a) až f)
článok 16 ods. 1 posledná veta	—
článok 16 ods. 2	článok 16 ods. 2
článok 17	článok 18
článok 18	článok 17
článok 19 body i) až iv)	článok 19 písm. a) až d)
článok 22	—
článok 23	článok 20
článok 24 ods. 1 a 2	článok 21 ods. 1 a 2
článok 24 ods. 3	—
článok 25 ods. 1 a 2	článok 21 ods. 1 a 3
článok 26	—
článok 27	—
—	článok 22
—	článok 23
článok 28	článok 24
príloha A	príloha I
príloha B	príloha II
príloha C	príloha III
príloha D	príloha IV
—	príloha V
—	príloha VI

( 1 ) Ú. v. ES L 224, 18.8.1990, s. 55.

( 2 ) Ú. v. ES L 157, 10.6.1992, s. 19.

( 3 ) Ú. v. ES 121, 29.7.1964, s. 1977/64.

( 4 ) Ú. v. ES L 31, 1.2.2002, s. 1.

( 5 ) Toto osvedčenie sa nevyžadujú v prípade, že existuje dvojstranná dohoda v súlade s článkom 6 smernice 2009/156/ES.

( 6 ) Platí 10 dní.

( 7 ) Nehodiace sa prečiarknite.

( 8 ) Dátum vakcinácie musí byť zapísaný v pase.

( 9 ) Toto prehlásenie nezbavuje prepravcov od povinností v súlade s platnými ustanoveniami Spoločenstva, najmä čo sa týka spôsobilosti zvierat na prepravu.

( 10 ) Laviada M.D., Roy P. a Sanchez-Vizcaino J.M (1992b). Adaptácia a hodnotenie testu nepriama ELISA a testu imunoblot na zistenie protilátok proti africkému moru koní. V: Katarálna horúčka oviec, africký mor koní a súvisiace orbivírusy: Zápis z druhého medzinárodného sympózia. Walton T.E. & Osburn B.l., Eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646 – 650.

( 11 ) Maree S. a Paweska J.T. (2005). Príprava rekombinantného antigénu VP7 vírusu afrického moru koní jednoduchou metódou a validáciou testom nepriama ELISA na základe antigénu VP7 na zistenie prítomnosti protilátok IgG v sére koní špecifických pre skupinu. J. Virol. Metódy, 125 (1), 55 – 65.

( 12 ) Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. a Jimenez-Clavero A. (2008). Skúška fluórogenovej polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase na detekciu vírusu afrického moru koní. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325 – 328.

( 13 ) Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostická presnosť dvojitej skúšky kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase na detekciu vírusu afrického moru koní. Žurnál virologických metód. 2013; 189(1):30-5.

( 14 ) Quan, M., Lourens, C.W., MacLachlan, N.J., Gardner, I.A., Guthrie, A.J., 2010. Rozvoj a optimalizácia dvojitej skúšky kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie s reverznou transkripciou v reálnom čase zameranej na gény VP7 a NS2 vírusu afrického moru koní. J. Virol. Metódy 167, 45 – 52.