KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) Nr. 86/94 af 19. januar 1994 om fastlaeggelse af en referencemetode til bestemmelse af sitosterol og stigmasterol i smoer

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europaeiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets forordning (EOEF) nr. 804/68 af 27. juni 1968 om den faelles markedsordning for maelk og mejeriprodukter (1), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 2071/92 (2), saerlig artikel 6, stk. 7, og

ud fra foelgende betragtninger:

Smoer kan tilsaettes roebestoffer, og dette skal kontrolleres i henhold til artikel 3 og 6 i Kommissionens forordning (EOEF) nr. 570/88 (3), senest aendret ved forordning (EF) nr. 3049/93 (4);

bestemmelserne om tilsaetning af roebestoffer af smoer maa overholdes noeje med henblik paa at forhindre autoriseret anvendelse af smoer, hvortil der er ydet stoette;

tilsaetning af roebestoffer spiller en vigtig rolle i denne ordning, og der maa derfor paa EF-plan udarbejdes referencemetoder til paavisning af alle roebestoffer, der anvendes som led i denne ordning;

dermed vil der kunne sikres lige behandling af alle, der anvender denne ordning, og undgaas ulige konkurrencevilkaar, som forskelle i medlemsstaternes analysemetoder for oejeblikket kan resultere i;

der er fastsat en referencemetode til bestemmelse af stigmasterol og sitosterol i butteroil ved Kommissionens forordning (EOEF) nr. 3942/92 (5); denne metode kan anvendes i lidt aendret form til bestemmelse af sterolroebestoffer i smoer;

de i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Forvaltningskomitéen for Maelk og Mejeriprodukter -

UDSTEDT FOELGENDE FORORDNING:

Artikel 1

Referenceanalysemetoden i bilaget anvendes, naar indholdet af stigmasterol eller v-sitosterol i smoer skal bestemmes i henhold til artikel 6 i forordning (EOEF) nr. 570/88.

Tilsaetning af roebestoffer til smoer er korrekt, hvis resultaterne er i overensstemmelse med bestemmelserne i punkt 8 i bilaget til denne forordning.

Artikel 2

Denne forordning traeder i kraft paa tredjedagen efter offentliggoerelsen i De Europaeiske Faellesskabers Tidende.

Den anvendes fra den 1. april 1994.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gaelder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 19. januar 1994.

Paa Kommissionens vegne

René STEICHEN

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. L 148 af 28. 6. 1968, s. 13.

(2) EFT nr. L 215 af 30. 7. 1992, s. 64.

(3) EFT nr. L 55 af 1. 3. 1988, s. 31.

(4) EFT nr. L 273 af 5. 11. 1993, s. 7.

(5) EFT nr. L 399 af 31. 12. 1992, s. 29.

BILAG

BESTEMMELSE AF SITOSTEROL OG STIGMASTEROL I SMOER VED GASKROMATOGRAFI I KAPILLARKOLONNE 1. ANVENDELSESOMRAADE

Metoden bestaar i en procedure til kvantitativ bestemmelse af sitosterol og stigmasterol i smoer. Ved sitosterol forstaas summen af v-sitosterol og 22-dihydro-v-sitosterol, eftersom andre sisteroler anses for at vaere uden betydning. Dette gaelder for proever, som er udtaget i henhold til forordning (EOEF) nr. 570/88.

2. PRINCIP

Smoerret forsaebes med kaliumhydroxid i en ethanoloploesning og uforsaebelige bestanddele ekstraheres med diethylether.

Sterolerne omdannes til trimethylsilylethere og analyseres ved gaskromatografi i en kapillarkolonne med betulin som intern standard.

3. APPARATUR

3.1. En 150 ml kolbe til forsaebning med tilbagesvaler med glasslib.

3.2. 500 ml skilletragte.

3.3. 250 ml kolber.

3.4. Trykudligningstragte, 250 ml eller tilsvarende, til opsamling af fordampet diethylether.

3.5. Glaskolonne, 350 mm × 20 mm, med sintret glasskive.

3.6. Vandbad eller varmekappe.

3.7. Proeveglas, 2 ml.

3.8. Gaskromatograf (med splitningssystem), som egner sig til brug med kapillarkolonne, bestaaende af:

3.8.1. en kolonneovn, som kan opretholde den oenskede temperatur inden for ± 1 °C

3.8.2. injektionsblok med temperaturindstilling

3.8.3. flammeioniseringsdetektor og konverter/forstaerker

3.8.4. skriver med integrator, som kan anvendes sammen med konverteren/forstaerkeren (3.8.3).

3.9. Kapillarkolonne i kvartsglas, coated med BP1 eller tilsvarende i en ensartet lagtykkelse paa 0,25 mm; kolonnen skal kunne adskille trimethylsilylderivater af lanosterol og sitosterol - en BP1-kolonne paa 12 m med 0,2 mm indre diameter er velegnet.

3.10. Mikrosproejte paa 1 mm med haerdet naal.

4. REAGENSER

Alle reagenser skal vaere analytisk rene. Vand skal vaere destilleret eller af mindst tilsvarende renhedsgrad.

4.1. Ethanol, mindst 95 %.

4.2. Kaliumhydroxid, 60 %: 600 g kaliumhydroxid (minimum 85 %) oploeses i vand og fortyndes til 1 liter med vand.

4.3. Betulin, mindst 99 %.

4.3.1. Intern standardoploesning. Betulin i diethylether (4.4)

4.3.1.1. Betulinoploesningen til bestemmelse af sitosterol skal vaere af en koncentration paa 1,0 mg/ml;

4.3.1.2. Betulinoploesningen til bestemmelse af stigmasterol skal vaere af en koncentration paa 0,4 mg/ml.

4.4. Analytisk ren diethylether (fri for peroxider og rester).

4.5. Natriumsulfat, vandfrit, granuleret og toerret ved 102 °C i to timer.

4.6. Silyleringsreagens, f. eks. TRI-SIL (kan faas fra Pierce Chemical Co, katalognummer 49001) eller tilsvarende. (ADVARSEL: TRI-SIL er braendbart, aetsende, giftigt og muligvis kraeftfremkaldende. Laboratoriepersonalet skal have kendskab til sikkerhedsbestemmelserne for TRI-SIL og handle derefter).

4.7. Lanosterol.

4.8. Sitosterol af en kendt renhedsgrad paa ikke under 90 % (P).

Note 1: Renhedsgraden af standardmaterialer, som anvendes til kalibrering, fastsaettes efter standardiseringsprincippet. Det forudsaettes, at samtlige steroler, som findes i proeven, kommer til udtryk paa kromatogrammet, at toppenes samlede areal repraesenterer 100 % af sterolindholdet og at sterolerne fremkalder samme detektorrespons. Systemets linearitet skal kontrolleres for de aktuelle koncentrationsomraader.

4.8.1. Sitosterolstandardoploesning - der fremstilles en oploesning af sitosterol (4.8) i diethylether (4.4), indeholdende ca. 0,5 mg/ml) (med en noejagtighed paa 0,001 mg/ml) (W1).

4.9. Stigmasterol af en kendt renhedsgrad paa ikke under 90 % (P).

4.9.1. Stigmasterolstandardoploesning - der fremstilles en oploesning af stigmasterol (4.9) i diethylether (4.4), indeholdende ca. 0,2 mg/ml (med en noejagtighed paa 0,001 mg/ml (W1).

4.10. Oploesning til kontrol af adskillelsesevne. Der fremstilles en oploesning af 0,05 mg lanosterol (4.7) og 0,5 mg sitosterol (4.8) pr. ml diethylether (4.4).

5. FREMGANGSMAADE

5.1. Fremstilling af standardoploesning til kromatografi. Tilsaetning af intern standardoploesning (4.3.1) til den paagaeldende sterolstandardoploesning skal ske samtidig med tilsaetning til den forsaebede proeve (se 5.2.2).

5.1.1. Standardkromatografioploesning for sitosterol; der overfoeres 1 ml sitosterolstandardoploesning (4.8.1) til hvert af to proeveglas (3.7), og diethyletheren afdampes med nitrogen. Der tilsaettes 1 ml intern standardoploesning (4.3.1.1), og diethyletheren afdampes med nitrogen.

5.1.2. Standardkromatografioploesning for stigmasterol; der overfoeres 1 ml stigmasterolstandardoploesning (4.9.1) til hvert af to proeveglas (3.7), og diethyletheren afdampes med nitrogen. Der tilsaettes 1 ml intern standardoploesning (4.3.1.2), og diethyletheren afdampes med nitrogen.

5.2. Tilberedning af uforsaebelige bestanddele.

5.2.1. Smoerproeven smeltes ved opvarmning til hoejst 35° C. Den blandes omhyggeligt ved omroering. Der afvejes 1 g smoer (W2), med 1 mg noejagtighed, i en 150 ml kolbe (3.1). Der tilsaettes 50 ml ethanol (4.1) og 10 ml kaliumhydroxidoploesning (4.2). Tilbagesvaleren paasaettes, og kolben opvarmes til ca. 75° C i 30 minutter. Svaleren tages af, og kolben afkoeles til rumtemperatur.

5.2.2. Kolben tilsaettes 1,0 ml intern standardoploesning. Hvis indholdet af sitosterol skal bestemmes, anvendes oploesningen i (4.3.1.1), hvis det drejer sig om stigmasterol, anvendes oploesningen i (4.3.1.2). Efter omhyggelig blanding overfoeres indholdet kvantitativt til en 500 ml skilletragt (3.2), og kolben skylles med 50 ml vand og 250 ml diethylether (4.4). Skilletragten rystes kraftigt i to minutter, hvorefter man lader faserne adskilles. Det nedre vandige lag tappes af, og etherlaget vaskes ved at ryste kolben med fire hold vand à 100 ml.

Note 2: For at undgaa emulsionsdannelse er det meget vigtigt at vaere forsigtig ved de foerste to vaskninger (kolben vendes ti gange). Ved tredje vask rystes kraftigt i 30 sekunder. En eventuel emulsion kan brydes ved at tilsaette 5 til 10 ml ethanol. Hvis der tilsaettes ethanol, skal der foretages yderligere to grundige vaskninger med vand.

5.2.3. Det klare, saebefrie etherlag ledes igennem en glaskolonne (3.5), som indeholder 30 g vandfri natriumsulfat (4.5). Etheren opsamles i en 250 ml kolbe (3.3). Der tilsaettes en kogesten, og etheren afdampes til naesten toerhed i vandbad eller varmekappe, mens overskydende oploesningsmiddel omhyggeligt opsamles.

Note 3: Hvis proeveekstrakter inddampes til fuldstaendig toerhed ved for hoej temperatur, kan der ske tab af sterol.

5.3. Fremstilling af trimethylsilylethere.

5.3.1. Den resterende etheroploesning i kolben haeldes i et 2 ml proeveglas (3.7) med 2 ml diethylether, og etheren afdampes med nitrogen. Kolben skylles med yderligere to hold diethylether à 2 ml. Indholdet haeldes hver gang over i proeveglasset, og etheren afdampes med nitrogen.

5.3.2. Proeven silyleres ved tilsaetning af 1 ml TRI-SIL (4.6). Proeveglasset lukkes og rystes grundigt for at oploese proeven. Hvis proeven stadig ikke er fuldstaendigt oploest, opvarmes den til 65-70 °C. Proeven henstaar i mindst fem minutter, inden den indsproejtes i gaskromatografen. Referenceoploesningerne silyleres paa samme maade som proeverne. Oploesningen til kontrol af adskillelsesevnen (4.10) silyleres paa samme maade.

Note 4: Silylering skal foretages i vandfrit miljoe. Ved ufuldstaendig silylering ses en top taet ved betulintoppen.

Ethanol, kan give interferens ved silylering. Dette kan skyldes utilstraekkelig vaskning under ekstraktionen. Hvis dette problem forekommer, kan der foretages en femte vaskning med kraftig rystning 30 sekunder under ekstraktionen.

5.4. Gaskromatografisk analyse.

5.4.1. Kromatografibetingelser.

Gaskromatografen indstilles som angivet i betjeningsvejledningen.

De vejledende kromatografibetingelser er som foelger:

- kolonnetemperatur 265 °C

- injektorblokkens temperatur 280 °C

- detektorens temperatur 300 °C

- baeregassens gennemstroemningshastighed 0,6 ml/minut

- hydrogentryk 84 kPa

- lufttryk 155 kPa

- splitningssystemet indstilles til mellem 10: 1 og 50: 1 og optimeres i henhold til betjeningsvejledningen, hvorefter detektorresponsens linearitet kontrolleres inden for det aktuelle koncentrationsomraade.

Note 5: Det er af saerlig vigtighed, at injektionsblokkens belaegning rengoeres regelmaessigt.

- indsproejtet maengde: 1 ml trimethylsilyletheroploesning.

Systemet skal vaere i ligevaegt og grundlinjen stabil, inden analysen paabegyndes.

Disse betingelser kan fraviges, hvis saerlige forhold ved kolonnen og gaskromatografen goer det noedvendigt for at opnaa kromatogrammer, som opfylder foelgende krav:

- sitosteroltoppen skal vaere tydeligt adskilt fra lanosteroltoppen. I figur 1 ses, hvordan et kromatogram af en silyleret oploesning til kontrol af adskillelsesevnen (4.10) typisk skal se ud

- den relative retentionstid for foelgende steroler skal vaere ca:

Cholesterol 1,0

Stigmasterol 1,3

Sitosterol 1,5

Betulin 2,5

- retentionstiden for betulin skal vaere ca. 24 minutter.

5.4.2. Analyseprocedure

Der indsproejtes 1 ml silyleret standardoploesning (stigmasterol eller sitosterol), og integratorens kalibreringsparametre indstilles.

Herefter indsproejtes yderligere 1 ml silyleret standardoploesning for at bestemme responsfaktorerne for betulin.

Der indsproejtes 1 ml silyleret proeveoploesning, og toppene aflaeses. Hver kromatografisk serie skal indledes og afsluttes med indsproejtning af standardoploesninger. Som hovedregel kan der indsproejtes seks proever i hver serie.

Note 6: Integration af stigmasteroltoppen skal ogsaa omfatte en evt. hale som afgraenset af punkt 1, 2 og 3 i figur 2b.

Integration af sitosteroltoppen skal ogsaa omfatte toppen for 22-dihydro-v-sitosterol (stigmastanol), som eluerer umiddelbart efter sitosterol se figur 3b, naar den samlede maengde sitosterol bestemmes.

6. BEREGNING AF RESULTATER

6.1. Arealet af steroltoppe og betulintoppe i begge referencekromatogrammer omkring en serie bestemmes, og R1 beregnes saaledes:

7. METODENS PRAECISION

7.1. Repeterbarhed.

7.1.1. Stigmasterol.

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme proevemateriale foretaget umiddelbart efter hinanden af den samme person med det samme udstyr maa ikke overstige 19,3 mg/kg.

7.1.2. Sitosterol.

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme proevemateriale foretaget umiddelbart efter hinanden af den samme person med det samme udstyr maa ikke overstige 23,0 mg/kg.

7.2. Reproducerbarhed.

7.2.1. Stigmasterol.

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme proevemateriale, foretaget i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, maa ikke overstige 31,9 mg/kg.

7.2.2. Sitosterol.

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme proevemateriale, foretaget i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, maa ikke vaere stoerre end 8,7 % af gennemsnittet af resultaterne.

7.3. Kilde for bestemmelserne om praecision.

Bestemmelserne om praecision er fastlagt paa grundlag af et eksperiment, som i 1992 blev foretaget med otte laboratorier og seks proever (blindbestemmelse med tre dobbeltproever) for stigmasterol; seks proever (blindbestemmelse med tre dobbeltproever) for sitosterol.

8. TOLERANCER

8.1. Der udtages tre proever fra det produkt, som er tilsat roebestof, for at sikre, at resultaterne er repraesentative.

8.2. Stigmasterol.

8.2.1. Der iblandes 150 g mindst 95 % ren stigmasterol pr. ton smoer, dvs. 142,5 mg/kg; eller 170 g mindst 85 % ren stigmasterol pr. ton smoer, dvs. 144,5 mg/kg.

8.2.2. Med et konventionelt konfidensinterval paa 95 % (CrD95) maa gennemsnittet af de tre resultater ikke vaere lavere end

- 126,0 mg/kg ved iblanding af 95 % ren stigmasterol,

- 128,0 mg/kg ved iblanding af 85 % ren stigmasterol.

8.2.3. Udover kriterierne ovenfor anvendes det laveste resultat, som opnaas ved analyse af produktet, til at kontrollere, om roebestoffet er jaevnt fordelt. Dette goeres ved at sammenholde det med foelgende graensevaerdier:

- 116,4 mg/kg (95 % af den mindste tilladelige iblanding ved 95 % ren stigmasterol med konventionelt konfidensinterval (ISO CrD95))

- 118,3 mg/kg (95 % af den mindste tilladelige iblanding ved 85 % ren stigmasterol med konventionelt konfidensinterval (ISO CrD95))

- 95,1 mg/kg (80 % af den mindste tilladelige iblanding ved 95 % ren stigmasterol med konventionelt konfidensinterval (ISO CrD95))

- 96,7 mg/kg (80 % af den mindste tilladelige iblanding ved 85 % ren stigmasterol med konventionelt konfidensinterval (ISO CrD95)).

Den laveste roebestofkoncentration i proeven sammenholdes med en interpolering mellem enten 116,4 mg/kg og 95,1 mg/kg eller 118,3 mg/kg og 96,7 mg/kg.

8.3. Sitosterol.

8.3.1. Der iblandes 600 g mindst 90 % ren sitosterol pr. ton smoer, dvs. 540 mg/kg.

8.3.2. Med et konventionelt konfidensinterval paa 95 % maa gennemsnittet af de tre resultater ikke vaere lavere end 514,4 mg/kg.

8.3.3. Udover kriteriet ovenfor anvendes det laveste resultat, som opnaas ved analyse af produktet, til at kontrollere, om roebestoffet er jaevnt fordelt. Dette goeres ved sammenligning med foelgende graensevaerdier:

- 485,1 mg/kg (95 % af den mindste tilladelige iblanding ved 90 % ren sitosterol med konventionelt konfidensinterval (ISO CrD95))

- 404,1 mg/kg (80 % af den mindste tilladelige iblanding ved 90 % ren sitosterol med konventionelt konfidensinterval (ISO CrD95)).

Den laveste roebestofkoncentration i proeven sammenholdes med en interpolering mellem 485,1 mg/kg og 404,1 mg/kg.