Komisijas lēmums

(1994. gada 15. jūlijs)

par dzīvnieku veselības nosacījumiem un veterināro sertifikāciju liellopu spermas importam no trešām valstīm

(94/577/EK)

EIROPAS KOPIENU KOMISIJA,

ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu,

ņemot vērā Padomes 1988. gada 14. jūnija Direktīvu 88/407/EEK, ar ko nosaka dzīvnieku veselības prasības, kas piemērojama Kopienā iekšējā tirdzniecībā ar sasaldētu mājas liellopu spermu un tās ievedumiem [1], kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Direktīvu 93/60/EEK [2], un jo īpaši tās 10. un 11. pantu,

tā kā to trešo valstu saraksts, kurām dalībvalstis ir atļāvušas mājas liellopu spermas importēšanu (turpmāk saukts "trešo valstu saraksts"), tika noteikts Komisijas Lēmumā 90/14/EEK [3], kas grozīts ar Lēmumu 91/276EEK [4];

tā kā slimības Izraēlā izraisīja ievešanas aizliegumu no šīs valsts, pieņemot Komisijas Lēmumu 91/277/EEK [5];

tā kā Komisijas Lēmumi 91/479/EEK [6], 91/549/EEK [7], 92/123/EEK [8], 92/124/EEK [9], 92/125/EEK [10], 92/126/EEK [11], 92/127/EEK [12], 92/128/EEK [13], 92/386/EEK [14], 92/387/EEK [15] un 92/445/EEK [16] nosaka dzīvnieku veselības prasības un veterināro sertifikāciju liellopu spermas ievešanai attiecīgi no Amerikas Savienotajām Valstīm, Kanādas, Polijas, Somijas, Jaunzēlandes, Austrijas, Šveices, Zviedrijas, Ungārijas, Norvēģijas un Čehoslovākijas;

tā kā Direktīva 93/60/EEK, kura jāievieš dalībvalstīs vēlākais līdz 1994. gada 1. jūlijam, groza Direktīvu 88/407/EEK, tādējādi nosakot nepieciešamību pēc augšminētās trešās valsts pieņemto lēmumu grozīšanas; tā kā lai vienkāršotu un precizētu Kopienas likumdošanu šajā jomā, augšminētie lēmumi ir jāsagrupē kopā un jāatceļ tie, kuri ir spēkā katrai atsevišķai valstij;

tā kā, ievērojot Eiropas Ekonomikas zonas līguma noteikumus, ir jāsaglabā dzīvnieku veselības sertifikāts liellopu spermas ievešanai no Austrijas, Somijas, Norvēģijas un Zviedrijas;

tā kā saskaņā ar Zinātniskās veterinārās komitejas atzinumu ir jāveic papildu izmeklēšana epizootiskās hemorāģiskās slimības noteikšanai;

tā kā regulārus šīs slimības pirmssavākšanas testus veic reizi sešos mēnešos vienīgi attiecībā uz Kanādu; tā kā tādēļ attiecībā uz Kanādu ir jānosaka pārejas periods šī lēmuma ieviešanai, lai Kanādas veterinārajām iestādēm dotu pietiekami daudz laika jauna testa ieviešanai savā kārtējā programmā;

tā kā, ievērojot pēdējā laikā vērojamos sasniegumus izpratnē par zilās mēles slimības epidemioloģiju, tagad drīkst atļaut liellopu spermas ievešanu no Austrālijas;

tā kā tiek konstatēts, ka valstīs, kuras minētas trešo valstu sarakstā, dzīvnieku veselība ir laba un attiecībā uz slimību nodošanu caur spermu to kontrolē labi izveidoti un organizēti veterinārie dienesti;

tā kā trešo valstu atbildīgās veterinārās iestādes ir apņēmušās 24 stundu laikā pa teleksu vai faksu paziņot Komisijai un dalībvalstīm par jebkuras tādas slimības rašanos, kas ietverta Starptautiskā Epizootiju Biroja (SEB) A sarakstā vai par jebkurām vakcinācijas politikas izmaiņām attiecībā uz tām, vai attiecīgajā periodā, kurā rodas OIE B sarakstā minētās slimības, paziņot par jebkurām piedāvātajām izmaiņām importa noteikumos attiecībā uz mājlopiem vai to spermu vai embrijiem;

tā kā trešo valstu sarakstā minēto valstu atbildīgās veterinārās iestādes ir apņēmušās oficiāli pārraudzīt sertifikātu izsniegšanu, kas izriet no šī lēmuma, un nodrošināt, lai visi attiecīgie sertifikāti, atkāpes un laboratoriskie pētījumi, balstoties uz kuriem ir jāveic sertifikācija, paliktu oficiālajā lietā vismaz 12 mēnešus pēc tās spermas nosūtīšanas, uz kuru tie attiecas;

tā kā trešo valstu sarakstā minēto valstu atbildīgās veterinārās iestādes ir apņēmušās oficiāli apstiprināt spermas savākšanas centrus liellopu spermas eksportam uz Eiropas Ekonomikas kopienu, kāparedzēts Direktīvas 88/407/EEK 9. pantā;

tā kā dzīvnieku veselības nosacījumi un veterinārā sertifikācija jāpieņem atbilstoši dzīvnieku veselības situācijai, kāda valda attiecīgajā trešā valstī;

tā kā šajā lēmumā paredzētie pasākumi atbilst Pastāvīgās veterinārijas komitejas atzinumam,

IR PIEŅĒMUSI ŠO LĒMUMU.

1. pants

Dalībvalstis atļauj ievest tādu liellopu spermu, kura atbilst noteikumiem, kuri izklāstīti A, B, C un D pielikuma 1. daļā minētajos sertifikātos, un tikai no tām trešām valstīm, kuras attiecīgi minētas A, B, C un D pielikuma 2. daļā.

Taču no Kanādas dalībvalstis atļauj ievest tādu liellopu spermu, kura saskaņā ar Lēmumu 91/549/EEK ir savākta un apstrādāta līdz 1994. gada 31. decembrim.

2. pants

Tiek atcelti Lēmumi 91/479/EEK, 92/123/EEK, 92/124/EEK, 92/125/EEK, 92/126/EEK, 92/127/EEK, 92/128/EEK, 92/386/EEK, 92/387/EEK un 92/445/EEK.

Lēmums 91/549/EEK tiek atcelts no 1995. gada 1. janvāra.

3. pants

1. panta pirmajā daļā minētos noteikumus attiecībā uz Kanādu piemēro no 1995. gada 1. janvāra.

4. pants

Šis lēmums ir adresēts dalībvalstīm.

Briselē, 1994. gada 15. jūlijā

Komisijas vārdā —

Komisijas loceklis

René Steichen

[1] OV L 194, 22.7.1988., 10. lpp.

[2] OV L 186, 28.7.1993., 28. lpp.

[3] OV L 8, 11.8.1990., 71. lpp.

[4] OV L 135, 30.5.1991., 58. lpp.

[5] OV L 135, 30.5.1991., 60. lpp.

[6] OV L 258, 16.9.1991., 1. lpp.

[7] OV L 298, 29.10.1991., 6. lpp.

[8] OV L 48, 22.2.1992., 1. lpp.

[9] OV L 48, 22.2.1992., 10. lpp.

[10] OV L 48, 22.2.1992., 19. lpp.

[11] OV L 48, 22.2.1992., 28. lpp.

[12] OV L 48, 22.2.1992., 37. lpp.

[13] OV L 48, 22.2.1992., 46. lpp.

[14] OV L 204, 21.7.1992., 13. lpp.

[15] OV L 204, 21.7.1992., 22. lpp.

[16] OV L 247, 27.8.1992., 1. lpp.

--------------------------------------------------

A PIELIKUMS

1. DAĻA

DZĪVNIEKU VESELĪBAS SERTIFIKĀTS

liellopu spermas importēšanai

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

2. DAĻA

To valstu saraksts, kurām ir atļauts izmantot A pielikuma 1. daļā norādītā dzīvnieku veselības sertifikāta paraugu

ČEHIJAS REPUBLIKA

UNGĀRIJA

JAUNZĒLANDE

POLIJA

RUMĀNIJA

ŠVEICE

SLOVĀKIJA

--------------------------------------------------

B PIELIKUMS

1. DAĻA

DZĪVNIEKU VESELĪBAS SERTIFIKĀTS

liellopu spermas importēšanai no Amerikas Savienotajām Valstīm

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

2. DAĻA

To valstu saraksts, kurām ir atļauts izmantot B pielikuma 1. daļā norādītā dzīvnieku veselības sertifikāta paraugu

AMERIKAS SAVIENOTĀS VALSTIS

--------------------------------------------------

C PIELIKUMS

1. DAĻA

DZĪVNIEKU VESELĪBAS SERTIFIKĀTS

liellopu spermas ievešanai

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

2. DAĻA

To valstu saraksts, kurām ir atļauts izmantot C pielikuma 1. daļā norādītā dzīvnieku veselības sertifikāta paraugu

KANĀDA: izņemot Britu Kolumbijas Okanaganas ielejas reģionu, kurš noteikts kā teritorija, ko ietver līnija, kas novilkta no Kanādas/Amerikas Savienoto Valstu robežas punkta 120o 15′ garumā, 49o platumā uz ziemeļiem līdz punktam 119o 35′ garumā, 50o 30′ platumā uz ziemeļaustrumiem līdz punktam 119o garumā, 50o 45′ platumā uz dienvidiem līdz Kanādas/Amerikas Savienoto Valstu robežas punktam 118o 15′ garumā un 49o platumā.

--------------------------------------------------

D PIELIKUMS

1. DAĻA

DZĪVNIEKU VESELĪBAS SERTIFIKĀTS

liellopu spermas importēšanai

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

2. DAĻA

To valstu saraksts, kurām ir atļauts izmantot D pielikuma 1. daļā norādītā dzīvnieku veselības sertifikāta paraugu

AUSTRĀLIJA

--------------------------------------------------

E PIELIKUMS

Protokols salīdzinošā ELISA (enzīmsaistītā imunosorbences novērtējuma) testa veikšanai, izmantojot šai grupai raksturīgo monoklonālo antivielu zilās mēles slimības vīrusa antivielu noteikšanai

SALĪDZINOŠAIS ELISA TESTS ZILĀS MĒLES SLIMĪBAS NOTEIKŠANAI, IZMANTOJOT MONOKLONĀLO ANTIVIELU 3–17-A3

Ar šo testu iespējams noteikt antivielas visiem zināmajiem zilās mēles slimības vīrusa (ZMV) serotipiem.

Testa pamatā ir starp ZMV antigēnu un šai grupai raksturīgo monoklonālo antivielu (3–17-A3) notiekošās reakcijas pārtraukums, pievienojot testa seruma atšķaidījumus. Testa serumā esošās ZMV antivielas bloķē monoklonālās antivielas (MAV) reaktivitāti un tā rezultātā samazina gaidīto krāsas attīstību, pievienojot enzīma substrātu.

MATERIĀLI UN REAĢENTI

1. Gluda pamata mikrotitrēšanas plates.

2. Antigēns: sagatavots, kā norādīts zemāk.

3. Bloķējošais buferšķīdums: 5 % (w/v) "Marvel" sausais piens, 0,1 % (v/v) Tween-20 (piegādāts kā polioksietilēna sorbīta monolaurāta sīrups) buferētajā fosfāta sālsšķīdumā (BFS).

4. Monoklonālā antiviela: 3-17-A3 (piegādāta kā hibridomas audu kultūras supernatant), uzglabāta - 20 oC temperatūrā vai sausi sasaldēta, pirms lietošanas 1/50 atšķaidīta ar bloķējošu buferšķīdumu, virzīta pret šai grupai raksturīgo polipeptīdu p7.

5. Konjugāts: truša pretpeļu globulīns (absorbēts un elutēts) konjugēts ar mārrutku peroksidāzi un uzglabāts tumsā 4 oC temperatūrā.

6. Substrāts un hromogēns: 0,2 gm ortofenilēna diamīna (OFD), atšķaidīts ar buferšķīdumu, kas sastāv no 2,533 gm citronskābes un 4,574 gm binātrija ūdeņraža ortofosfāta, kas papildināts ar destilētu ūdeni līdz 500 ml, sadalīts pa 25 ml katrā un uzglabāts tumsā - 20 oC temperatūrā, ar 12 μl/25ml ūdeņraža peroksīda (30 % w/v), ko pievieno tieši pirms lietošanas.

UZMANĪGI RĪKOTIES AR OFD — VALKĀT GUMIJAS CIMDUS — AIZDOMAS PAR MUTAGĒNU.

7.1. Molārā sērskābe: 26,6 ml skābes, kurai pievienoti 473,4 ml destilēta ūdens.

VIENMĒR ATCERIETIES — SKĀBI PIEVIENOT ŪDENIM, BET NEKAD — ŪDENI SKĀBEI.

8. Orbitālais šeikers.

9. ELISA plāksnes nolasītājs (testa rezultātu var nolasīt vizuāli).

TESTA FORMĀTS

+++++ TIFF +++++

TESTA PROTOKOLS

Tukšā kontrole

1. rinda A — H ir tukšā kontrole, kas sastāv no ZMV antigēna un konjugāta. To var izmantot ELISA nolasītāja rādījumu nodzēšanai.

MAV kontrole

2. rinda A — H ir monoklonālās antivielas kontrole un sastāv no ZMV antigēna, monoklonālās antivielas un konjugāta. Tas atspoguļo negatīvo kontroli. Šīs kontroles rezultātā iegūto optiskā blīvuma rādījumu vidējais ir 0 % no inhibīcijas vērtības.

Pozitīvā kontrole

3. rinda A — H ir pozitīvā kontrole. Tā sastāv no ZMV antigēna, ZMV pozitīvajiem antiseruma atšķaidījumiem, MAV un konjugāta. Tas iekļauts kā indikators tam, ka tests notiek pareizi, dažādos testos iegūtajiem inhibīcijas līmeņiem būtu jābūt līdzīgiem.

Testa serums

Testa formātā, kas parādīts augstāk, var pārbaudīt 18 serumus, izmantojot dažādus atšķaidījumus: 1/2, 1/4, 1/8 un 1/16. Tas savukārt dos kādu norādi uz testa serumā esošo antivielas titru. Šo atšķaidījuma diapazonu var paplašināt, lai iegūtu seruma atšķaidījuma galīgā punkta titrus. Pretējā gadījumā, attiecībā uz liela mēroga seroloģiskajiem apsekojumiem, serumu ar vienu atšķaidījumu (1/4) vai diviem atšķaidījumiem (1/2 un 1/4) var pārbaudīt kā ātro skrīninga testu.

DARBA SECĪBA

1. BFS atšķaidīt ZMV antigēnu līdz pirmstitrēšanas koncentrācijai, īsu brīdi apstrādāt ar skaņu, lai panāktu agregētā vīrusa izkliedēšanos (ja sonikators nav pieejams, tad to enerģiski izkliedēt ar pipeti) visiem ELISA plāksnes iedobumiem pievienot 50 μl. Antigēna izklīdināšanai piespiest plāksnītes malas.

2. Orbitālajā šeikerī 60 minūtes inkubēt 37 oC temperatūrā. Noskalojot un ar nesterilu BFS iztukšojot iedobumus, plāksnes trīs reizes nomazgāt un ar absorbējošu papīru izžāvēt.

3. Katrā bloķētāja buferšķīduma iedobumā iepilināt 50 μl. Attiecīgajos iedobumos pievienot testa serumu un pozitīvo serumu un atšķaidīt, izmantojot daudzkanālu pipeti. Tukšās kontroles vai MAV kontroles veikšanai serumu nepievienot.

4. Tūdaļ pēc testa seruma pievienošanas bloķētājšķīdumā esošo NiAB atšķaidīt (līdz pirmstitrēšanas atšķaidījumam) un visiem plāksnes iedobumiem pievienot 50 μl, izņemot tukšās kontroles gadījumā.

5. Orbitālajā šeikerī 60 minūtes inkubēt 37 oC temperatūrā. Trīs reizes nomazgāt ar BFS un nožāvēt.

6. Bloķētāja buferšķīdumā 1/5000 atšķaidīt trušu pretpeļu koncentrātu un visiem plāksnes iedobumiem pievienot 50 μl.

7. Orbitālajā šeikerī 60 minūtes inkubēt 37 oC temperatūrā. Trīs reizes nomazgāt ar BFS un nožāvēt.

8. Atkausēt OFD un tieši pirms lietošanas katriem 25 ml OFD pievienot 12 μl 30 % ūdeņraža peroksīda. Visos plāksnes iedobumos iepilināt 50 μl. Apmēram 10 minūtes ļaut krāsai attīstīties un apturēt reakciju ar 1 M sērskābes (50 μl uz katru iedobumu). Krāsai jāattīstās MAV kontroles iedobumos un tajos iedobumos, kuros ir serums, bet nav ZMV antivielu.

9. Vizuāli vai izmantojot spektrofotometrisko nolasītāju, plāksnes pārbaudīt un pierakstīt rādījumus.

REZULTĀTU ANALĪZE

Ar MAV kontroles palīdzību aprēķināt vidējo OD rādījumu. Tas atspoguļo 0 % inhibīcijas vērtības. Optiskā blīvuma rādījumus no testa seruma izsaka kā inhibīcijas vērtības procentos, izmantojot formulu:

Inhibīcijas vētība procentos = 100 –

× 100

Inhibīcijas vērtības, kas pārsniedz 40 % ar seruma atšķaidījumu ¼, ir uzskatāmas par pozitīvām. Vizuālais nolasījums ir iespējams, jo 40 % inhibīcija ir zemākā ar aci atšķiramā vērtība.

ZMV ELISA ANTIGĒNA SAGATAVOŠANA

1. Trīs reizes nomazgāt 10 saplūstošo BHK-21 šūnu rindas (roux) ar bezseruma Eagle's šķīdinātāju un bezseruma Eagle's šķīdinātājā inficēt zilās mēles vīrusa serotipu 1.

2. Inkubēt 37 oC temperatūrā un ik dienas pārbaudīt citopātisko efektu (cpe).

3. Tad, kad cpe ir redzams 80 — 90 % no katras rindas (roux) šūnu lapas, vīrusu noņemt, nokratot pie stikla pielipušās šūnas.

4. Lai šūnas izgulsnētos, centrifūgēt pie 2000 — 3000 rpm.

5. Aizvadīt supernatant, un atkārtoti piekārt šūnas apmēram 30 ml PHS, kas satur 1 % "Sarkosyl" un 2 ml fenolmetilsulfonila fluorīda (līzes buferšķīdums). Tā rezultātā šūnas var veidot gēlu, un šī efekta samazināšanai jāpievieno vairāk līzes buferšķīduma.

PIEZĪME:

fenilmetilsulfonila fluorīds ir kaitīgs — ar to rīkoties īpaši uzmanīgi.

6. Izmantojot ultrasonisko zondi ar amplitūdu 30 mikroni, uz 60 sekundēm pārraut šūnas.

7. 10 minūtes centrifugēt pie 10000 rpm.

8. Supernatant uzglabāt + 4 oC temperatūrā, un atkārtoti iekarināt atlikušo šūnu grupu 10 — 20 ml līzes buferšķīdumā.

9. Kliedēt ar skaņu un precizēt, katrā etapā saglabājot supernatant, kopā to veicot trīs reizes.

10. Supernatant sagrupēt un 120 minūtes 4 oC temperatūrā centrifugēt pie 24000 rpm 5 ml 40 % saharozes šķīdumā (w/v BFS), izmantojot 30 ml Bekmana centrifūgas caurulītes un SW 28 rotoru.

11. Supernatant aizvadīt, rūpīgi iztīrīt caurulītes, un ar sonikācijas palīdzību atkārtoti piekārt BFS esošo peleti. Antigēnu uzglabāt pa daļām – 70 oC temperatūrā.

ZMV ELISA ANTIGĒNA TITRĒŠANA

Zilās mēles ELISA antigēns ir titrēts ar netiešo ELISA testu. Antigēna divkārtīgie atšķaidījumi ir titrēti pret konstantu monoklonālās antivielas (3-17-A3) atšķaidījumu (1/50). Protokols ir šāds.

DARBA SECĪBA

1. Ar daudzkanālu pipeti pa visu mikrotitru plāksni BFS esošo ZMV antigēnu divkārt atšķaidīt (50 μl/uz katru iedobumu).

2. Orbitālajā šeikerā 1 stundu inkubēt 37 oC temperatūrā.

3. Plāksnītes trīs reizes nomazgāt ar BFS.

4. Katrā mikrotitra plāksnītes iedobumā ieliet 50 μl monoklonālās antivielas 3.17-A3 (atšķaidīta 1/50).

5. Orbitālajā šeikerā 1 stundu inkubēt 37 oC temperatūrā.

6. Plāksnītes trīs reizes nomazgāt ar BFS.

7. Katrā mikrotitra plāksnes iedobumā ieliet 50 μl trušu pretpeļu globulīna, kas konjugēts ar mārrutku peroksidāzi un atšķaidīts līdz optimālai pirmstitrēšanas koncentrācijai.

8. Orbitālajā šeikerā 1 stundu inkubēt 37 oC temperatūrā.

9. Pievienot substrātu un hromogēnu, kā aprakstīts iepriekš. Pēc 10 minūtēm apturēt reakciju, pievienojot 1 molu sērskābes (50 μl/uz atveri).

Salīdzinošajā pārbaudē monoklonālajai antivielai ir jābūt pārākumā, tādēļ ir izvēlēta tāda antigēna atšķaidīšana, kas uz titrēšanas līknes (taču ne uz plato reģiona) krītas, kas pēc 10 minūtēm ļauj iegūt apmēram 0,8 OD.

Protokols imūndifūzijas testa veikšanai agara gēlā, lai noteiktu epizootiskās hemorāģiskās slimības antivielas

Imūndifūzijas testu agara gēlā veic saskaņā ar šādu protokolu.

MATERIĀLI UN REAGģENTI

1. Antigēns.

Nogulsnējošu antigēnu sagatavi jebkurā šūnu kultūras sistēmā, kas nodrošina ātru epizootiskās hemorāģiskās slimības vīrusa attiecīgā(-o) serotipa(-u) vairošanos. Iesakām izmantot BKHvai vero šūnas. Vīrusa augšanas beigās antigēns atrodas supernatant fluīdā, bet, lai tas būtu efektīvs, tam vajadzīga piecdesmitkārtīga līdz simtkārtīga koncentrācija. To iespējams panākt, izpildot standarta olbaltumvielu koncentrācijas procedūru, antigēnā esošo vīrusu var aktivizēt, pievienojot 0,3 % (v/v) betapropiolaktona.

2. Zināms pozitīvs kontroles serums.

Izmantojot starptautisko atsauces serumu un antigēnu, tiek iegūts valsts standartserums, kas optimālas daļas iegūšanai salīdzinājumā ar starptautisko atsauces serumu ir standartizēts, sausi saldēts un katrā testā tiek lietots kā zināms kontroles serums.

3. Testa serums.

DARBA SECĪBA

1. 1 % agarozes, kas sagatavota borāta vai nātrija barbitola šķīdumā, pH 8,5 līdz 9,0, ielej petri platēs, nepārsniedzot 3,0 mm augstumu.

2. Agarā tiek izgrieztas septiņas no mitruma brīvas bedrītes, katra 5,0 mm diametrā. Šis paraugs sastāv no vienas centrālās bedrītes un sešām ap to esošajām bedrītēm, kuras izvietotas 3 mm rādiusā ap to.

+++++ TIFF +++++

3. Centrālo bedrīti piepilda ar standarta antigēnu. 2., 4. un 6. perifēro bedrīti aizpilda ar zināmu pozitīvu serumu, 1., 3. un 5. bedrīti aizpilda ar testa serumu.

4. Sistēma 72 stundas istabas temperatūrā noslēgtā mitrā kamerā tiek inkubēta.

INTERPRETĀCIJA

Testa serums ir pozitīvs, ja tas veido īpašu nosēšanās līniju ar antigēnu un pilnīgi identisku līniju ar kontroles serumu. Testa serums ir negatīvs, ja tas neveido īpašu līniju ar antigēnu un neliec kontroles seruma līniju. Jāpārbauda, vai petri platēs nav tumšs dibens un vai netiek lietots netiešais apgaismojums.

--------------------------------------------------