Komisijos sprendimas

1994 m. liepos 15 d.

dėl gyvūnų sveikatos reikalavimų ir veterinarinio sertifikavimo importuojant galvijų spermą iš trečiųjų šalių

(94/577/EB)

EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA,

atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį,

atsižvelgdama į 1988 m. birželio 14 d. Tarybos direktyvą 88/407/EEB, nustatančią gyvūnų sveikatos reikalavimus, taikomus Bendrijos vidaus prekybai užšaldyta galvijų sperma ir jos importui [1], su paskutiniais pakeitimais, padarytais Direktyva 93/60/EEB [2], ypač į jos 10 ir 11 straipsnius,

kadangi Komisijos sprendimu 90/14/EEB [3] su paskutiniais pakeitimais, padarytais Sprendimu 91/276/EEB [4], buvo sudarytas trečiųjų šalių, iš kurių valstybės narės leidžia importuoti galvijų spermą, sąrašas (toliau — trečiųjų šalių sąrašas);

kadangi Komisijos sprendimu 91/277/EEB [5] dėl sveikatos padėties Izraelyje buvo uždraustas importas iš šios šalies;

kadangi Komisijos sprendimais 91/479/EEB [6], 91/549/EEB [7], 92/123/EEB [8], 92/124/EEB [9], 92/125/EEB [10], 92/126/EEB [11], 92/127/EEB [12], 92/128/EEB [13], 92/386/EEB [14], 92/387/EEB [15] ir 92/445/EEB [16] nustatyti gyvūnų sveikatos reikalavimai ir veterinarinio sertifikavimo reikalavimai importuojant galvijų spermą iš Jungtinių Amerikos Valstijų, Kanados, Lenkijos, Suomijos, Naujosios Zelandijos, Austrijos, Šveicarijos, Švedijos, Vengrijos, Norvegijos ir Čekoslovakijos;

kadangi Direktyva 93/60/EEB, kuri valstybėse narėse turi būti įgyvendinta ne vėliau kaip iki 1994 m. liepos 1 d., iš dalies pakeičia Direktyvą 88/407/EEB, turi būti pakeisti ir sprendimai dėl pirmiau išvardytų trečiųjų šalių; kadangi, siekiant Bendrijos teisės aktus, reglamentuojančius šią sritį, padaryti aiškesnius ir paprastesnius, reikia sujungti pirmiau išvardytus sprendimus ir atšaukti šiuo metu atskiroms šalims galiojančius sprendimus;

kadangi, atsižvelgiant į Europos ekonominės erdvės susitarimo nuostatas, veterinarijos sertifikatų nereikia importuojant galvijų spermą iš Austrijos, Suomijos, Norvegijos ir Švedijos;

kadangi, remiantis Veterinarijos mokslinio komiteto nuomone, būtinas papildomas tyrimas epizootinei hemoraginei ligai nustatyti;

kadangi tik Kanadoje kas šeši mėnesiai prieš surenkant spermą atliekamas įprastas šios ligos tyrimas; kadangi todėl šiam sprendimui taikyti Kanadai reikia nustatyti pereinamąjį laikotarpį, kad Kanados veterinarijos institucijos turėtų pakankamai laiko į savo įprastą programą įtraukti naująjį tyrimą;

kadangi Australijoje vis geriau suvokiama mėlynojo liežuvio ligos epidemiologija, jau galima leisti importuoti galvijų spermą iš šios šalies;

kadangi atrodo, kad trečiųjų šalių sąraše išvardytose šalyse gyvūnų sveikatos padėtis, susijusi su per spermą plintančiomis ligomis, yra gera ir ją prižiūri gerai suformuotos ir organizuotos veterinarijos tarnybos;

kadangi trečiųjų šalių atsakingos veterinarijos institucijos yra įsipareigojusios Komisijai ir valstybėms narėms teleksu arba telefaksu per 24 valandas pranešti apie visus patvirtintus ligų, nurodytų Tarptautinio epizootijų biuro (TEB) A sąraše, atvejus arba apie skiepijimo nuo bet kurios iš jų tvarkos pakeitimus, arba — per nustatytą laikotarpį — apie patvirtintus ligų, nurodytų TEB B sąraše, atvejus, ir apie siūlomus naminių gyvūnų, jų spermos ar embriono importo taisyklių pakeitimus;

kadangi trečiųjų šalių sąraše išvardytų šalių atsakingos veterinarijos institucijos įsipareigojo oficialiai prižiūrėti, kaip išduodami šiame sprendime nurodyti sertifikatai, ir užtikrinti, kad visi reikiami sertifikatai, atsisakymai juos išduoti ir laboratorinių tyrimų rezultatai, kuriais galėjo būti pagrįstas sertifikavimas, būtų oficialiai saugomi 12 mėnesių po to, kai bus išsiųsta juose nurodyta sperma;

kadangi, kaip reikalaujama Direktyvos 88/407/EEB 9 straipsnyje, trečiųjų šalių sąraše išvardytų šalių atsakingos veterinarijos institucijos įsipareigojo oficialiai patvirtinti spermos surinkimo centrus, iš kurių leidžiama galvijų spermą eksportuoti į Europos ekonominę bendriją;

kadangi gyvūnų sveikatos reikalavimai ir veterinarinis sertifikavimas turi būti pritaikyti prie trečiosios šalies veterinarijos padėties;

kadangi šiame sprendime numatytos priemonės yra pateiktos atsižvelgiant į Veterinarijos nuolatinio komiteto nuomonę,

PRIĖMĖ ŠĮ SPRENDIMĄ:

1 straipsnis

Valstybės narės leidžia importuoti galvijų spermą tik iš tų trečiųjų šalių, kurios išvardytos A, B, C ir D priedų 2 dalyje ir atitinka A, B, C ir D priedų 1 dalyje nurodytus reikalavimus.

Tačiau, valstybės narės leidžia iki 1994 m. gruodžio 31 d. iš Kanados importuoti galvijų spermą, surinktą ir paruoštą remiantis Sprendimu 91/549/EEB.

2 straipsnis

Sprendimai 91/479/EEB, 92/123/EEB, 92/124/EEB, 92/125/EEB, 92/126/EEB, 92/127/EEB, 92/128/EEB, 92/386/EEB, 92/387/EEB ir 92/445/EEB panaikinami.

Sprendimas 91/549/EEB panaikinamas nuo 1995 m. sausio 1 d.

3 straipsnis

1 straipsnio pirmos pastraipos nuostatos Kanadai pradedamos taikyti nuo 1995 m. sausio 1 d.

4 straipsnis

Šis sprendimas skirtas valstybėms narėms.

Priimta Briuselyje, 1994 m. liepos 15 d.

Komisijos vardu

René Steichen

Komisijos narys

[1] OL L 194, 1988 7 22, p. 10.

[2] OL L 186, 1993 7 28, p. 28.

[3] OL L 8, 1990 1 11, p. 71.

[4] OL L 135, 1991 5 30, p. 58.

[5] OL L 135, 1991 5 30, p. 60.

[6] OL L 258, 1991 9 16, p. 1.

[7] OL L 298, 1991 10 29, p. 6.

[8] OL L 48, 1992 2 22, p. 1.

[9] OL L 48, 1992 2 22, p. 10.

[10] OL L 48, 1992 2 22, p. 19.

[11] OL L 48, 1992 2 22, p. 28.

[12] OL L 48, 1992 2 22, p. 37.

[13] OL L 48, 1992 2 22, p. 46.

[14] OL L 204, 1992 7 21, p. 13.

[15] OL L 204, 1992 7 21, p. 22.

[16] OL L 247, 1992 8 27, p. 1.

--------------------------------------------------

A PRIEDAS

1 DALIS

VETERINARIJOS SERTIFIKATAS

skirtas galvijų spermos importui

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

2 DALIS

Šalių, kurioms leidžiama naudoti A priedo 1 dalyje nustatytą veterinarijos sertifikato formą, sąrašas

ČEKIJOS RESPUBLIKA

VENGRIJA

NAUJOJI ZELANDIJA

LENKIJA

RUMUNIJA

ŠVEICARIJA

SLOVAKIJOS RESPUBLIKA

--------------------------------------------------

B PRIEDAS

1 DALIS

VETERINARIJOS SERTIFIKATAS

skirtas galvijų spermos importui iš Jungtinių Amerikos Valstijų

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

2 DALIS

Šalis, kuriai leidžiama naudoti B priedo 1 dalyje nustatytą veterinarijos sertifikato formą

JUNGTINĖS AMERIKOS VALSTIJOS

--------------------------------------------------

C PRIEDAS

1 DALIS

VETERINARIJOS SERTIFIKATAS

skirtas galvijų spermos importui

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

2 DALIS

Šalis, kuriai leidžiama naudoti C priedo 1 dalyje nustatytą veterinarijos sertifikato formą

KANADA, išskyrus Britų Kolumbijos Okanagan Valley regioną, kuris nuo Kanados ir Jungtinių Amerikos Valstijų sienos, esančios 120o 15″ ilgumos, 49o platumos, driekiasi į šiaurę link 119o 35″ ilgumos, 50o 30″ platumos į šiaurės rytus link 119o ilgumos, 50o 45″ platumos, ir į pietus link Kanados (Jungtinių Amerikos Valstijų) sienos, esančios 118o 15″ ilgumos ir 49o platumos.

--------------------------------------------------

D PRIEDAS

1 DALIS

VETERINARIJOS SERTIFIKATAS

skirtas galvijų spermos importui

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

2 DALIS

Šalis, kuriai leidžiama naudoti D priedo 1 dalyje nustatytą veterinarijos sertifikato formą

AUSTRALIJA

--------------------------------------------------

E PRIEDAS

ELISA tyrimo ("su fermentais susijusio imunosorbentinio metodo"), atliekamo mėlynojo liežuvio ligos viruso antikūnams nustatyti, naudojant specifinių monokloninių antikūnų grupę, protokolas

ELISA TYRIMAS MĖLYNOJO LIEŽUVIO LIGAI NUSTATYTI NAUDOJANT MONOKLONINĮ ANTIKŪNĄ 3-17-A3

Šiuo tyrimu galima nustatyti visus žinomus mėlynojo liežuvio ligos viruso (BTV) serotipus.

Tyrimas atliekamas BTV antigeną ir specifinį monokloninį antikūną (3-17-A3) skiedžiant serumo tirpalu. Serume esantys BTV antikūnai stabdo monokloninio antikūno (MAB) reakciją ir susilpnina spalvos intensyvumą, kuris išgaunamas šias medžiagas atskiedus fermentų substratu.

MEDŽIAGOS IR REAGENTAI

1. Plokščiadugnės mikrotitrų plokštelės.

2. Antigenas: paruoštas toliau nurodytu būdu.

3. Blokuojantis buferinis tirpalas: 5 % (w/v) "Marvel" pieno miltelių, 0,1 % (v/v) "Tween-20" (tiekiamas kaip polioksietileno sorbitono monolauratinis sirupas) fosfato buferinės druskos (PBS).

4. Monokloninis antikūnas: 3–17-A3 (tiekiamas kaip hibridinis audinio kultūros supernatantas), saugomas – 20 oC temperatūroje arba užšaldytas, prieš naudojant atskiestas blokuojančiu buferiniu tirpalu santykiu 1:50, nukreiptas prieš specifinį polipeptidą p7.

5. Junginys: triušių priešpelinis globulinas (absorbuotas ir išplautas) sujungtas su krienų peroksidaze, saugomas tamsoje 4 oC temperatūroje.

6. Substratas ir chromogenas: 0,2 g ortopenileno diamino (OPD), ištirpinto buferiniame tirpale, kurį sudaro 2,553 g citrinos rūgšties ir 4,574 g dinatrio vandenlio ortofosfatas, bendras šio tirpalo, atskiesto distiliuotu vandeniu, tūris yra ne didesnis nei 500 ml, išpilstytas į 25 ml talpos indus ir saugomas tamsoje – 20 °C temperatūroje, prieš pat naudojimą atskiedus 12μl/25 ml vandenilio peroksido (30 % w/v).

ATSARGIAI ELGTIS SU OPD, ĮTARIAMAS ESANT MUTAGENU, DĖVĖTI GUMINES PIRŠINES.

7. 1 molinė dalis sieros rūgšties: į 473,4 ml distiliuoto vandens įpilti 26,6 ml rūgšties.

DĖMESIO: NIEKADA VANDENS NEPILKITE Į RŪGŠTĮ, O TIK RŪGŠTĮ Į VANDENĮ.

8. Žiedinis plaktuvas.

9. ELISA plokštelės ekranas (ekrane matomi tyrimo rezultatai).

TYRIMO FORMATAS

+++++ TIFF +++++

TYRIMO PROTOKOLAS

Paprastoji kontrolĖ

1 eilutės A–H stulpeliai apima paprastąją kontrolę, atliekamą naudojant BTV antigeną ir junginį. Ji gali būti atliekama nepaisant ELISA ekrano rodmenų.

MAB kontrolė

2 eilutės A–H stulpeliai apima monokloninio antikūno kontrolę, atliekamą naudojant BTV antigeną, monokloninį antikūną ir junginį. Ja siekiama nustatyti neigiamą reakciją į tyrimą. Šioje kontrolinėje eilutėje pateiktų optinio tankio rodmenų vidurkis sudaro 0 % slopinimo vertės.

Teigiama kontrolė

3 eilutės A–H stulpeliai apima teigiamą kontrolę, kuri atliekama naudojant BTV antigeną, BTV pozityvaus antiserumo tirpalus, MAB ir junginį. Ji įtraukta kaip rodiklis, kad tyrimas yra veiksmingas ir kad kiekvieno tyrimo metu turėtų būti pasiektas panašus slopinimo lygis.

Tyrimui naudojamas serumas

Remiantis pirmiau nurodytu šio tyrimo formatu, 18 serumų rūšių galima ištirti, kai tirpalo santykis yra 1:2, 1:4, 1:8 ir 1:16. Taip galima nustatyti tyrimui naudojamo serumo antikūno titrą. Tirpalo santykis gali būti padidintas siekiant nustatyti serumo tirpimo kraštutinius titrus. Be to, atliekant didelės apimties serologinius tyrimus, serumą galima ištirti, kai tirpalo santykis yra 1:4 arba 1:2 ir 1:4. Taip tyrimo rezultatas bus gautas greitai.

TYRIMO ATLIKIMO TVARKA

1. Ištirpinkite BTV antigeną titravimui skirtame fosfatinio buferio druskų tirpalo (PBS) koncentrate, specialaus garso bangų aparatu trumpai apdorokite tirpalą, kad virusas išsisklaidytų (jei šio aparato neturite, staigiais judesiais keletą kartų tirpalą įtraukite į pipetę ir grąžinkite jį į indą), ir įlašinkite po 50 μl šio tirpalo į kiekvieną ELISA plokštelės duobutę. Plekšnokite plokštelės kraštus, kad antigenas išsisklaidytų.

2. 60 minučių įdėkite plokšteles į iki 37 oC įkaitintą žiedinį plaktuvą. Tris kartus išplaukite plokšteles jas apsemdami, plokštelės duobutes išplaukite nesteriliu PBS ir padėkite išdžiūti ant sugeriamo popieriaus.

3. Į kiekvieną plokštelės duobutę įlašinkite 50 μl blokuojančio buferinio tirpalo. Į reikiamas duobutes įlašinkite tyrimui naudojamo serumo ir pozityvaus serumo ir, naudodamiesi daugiakanale pipete, ištirpinkite juos ant plokštelės. Atlikdami paprastąją kontrolę arba MAB tyrimą, serumo nelašinkite.

4. Įlašinę tyrimui naudojamo serumo, iš karto ištirpinkite MAB blokuojančiame buferiniame tirpale (prieš titravimą skirto tirpalo santykio) ir po 50 μl šio tirpalo įlašinkite į visas plokštelės duobutes, išskyrus paprastosios kontrolės duobutę.

5. 60 minučių įdėkite plokšteles į iki 37 oC įkaitintą žiedinį plaktuvą. Tris kartus išplaukite plokšteles PBS ir nusausinkite sugeriamuoju popieriumi.

6. Triušių priešpelinį koncentratą atskieskite blokuojančiu buferiniu tirpalu santykiu 1:5000 ir įlašinkite 50 μl šio tirpalo į visas plokštelės duobutes.

7. 60 minučių įdėkite plokšteles į iki 37 oC įkaitintą plaktuvą. Tris kartus išplaukite plokšteles PBS ir nusausinkite sugeriamuoju popieriumi.

8. Ištirpinkite OPD ir prieš pat naudojimą į kiekvieną 25 ml OPD indelį įlašinkite 12 μl 30 % vandenilio peroksido. Į kiekvieną plokštelės duobutę įlašinkite po 50 μl šio tirpalo. Apie 10 minučių palaukite, kol išryškės spalva, reakciją užbaikite įlašindami 1 molinę dalį sieros rūgšties (po 50 μl į kiekvieną duobutę). Nusidažys MAB kontrolinės duobutės ir tos duobutės, kuriose esantis serumas NETURI BTV antikūnų.

9. Apžiūrėkite plokšteles plika akimi arba ištirkite jas naudodami spektrofotometrinį aparatą ir užrašykite jų rodmenis.

REZULTATŲ ANALIZĖ

Nustatę MAB kontrolinio tyrimo rodmenis, apskaičiuokite OD vidurkį. Jis sudaro 0 % slopinimo vertės. Serologinio tyrimo optinio tankio rodmenys išreiškiami slopinimo vertės procentais naudojantis šia formule:

Slopinimo vertės procentinė išraiška = 100 –

× 100

Didesnė nei 40 % slopinimo vertė, kai serumas skiedžiamas santykiu 1:4, yra laikoma teigiama reakcija. Visualinis nustatymas gali būti atliekamas nenaudojant jokių specialių aparatų, nes žemiausia slopinimo vertė, kurią gali įžiūrėti žmogaus akis, yra 40 %.

BTV ELISA ANTIGENO PARUOŠIMAS

1. 10 susisiekiančių BHK-21 ląstelių atplaišų tris kartus išplaukite serumo neturinčia priemone "Eagle" ir serumo neturinčioje priemonėje "Eagle" užkrėskite jas 1 serotipo mėlynojo liežuvio ligos virusu.

2. Laikykite jas 37 oC temperatūroje ir kasdien stebėkite ląstelių pokyčio efektą (cpe).

3. Kai cpe akivaizdus, 80–90 % kiekvienos atplaišos ląstelių, surinkite virusą, supurtydami indą taip, kad nuo stiklinių sienelių atliptų prilipusios ląstelės.

4. Ląsteles išsukite 2000—3000 apsisukimų per minutę.

5. Išimkite paviršinį darinį, o ląsteles vėl patalpinkite į apytiksliai 30 ml PHS tirpalą, kurį sudaro 1 % "Sarkosyl" ir 2 ml fenolmetilsulfonilo fluorido (ląsteles nuo irimo saugantį buferinį tirpalą). Iš ląstelių gali susidaryti želė, todėl, siekiant sušvelninti šią reakciją, gali būti įpilta daugiau ląsteles nuo irimo saugančio buferinio tirpalo.

PASTABA:

fenolmetilsulfonilo fluoridas — pavojingas, todėl su juo elkitės ypač atsargiai.

6. Suardykite ląsteles, 60 sekundžių naudodami ultragarso zondą, kurio amplitudė 30 mikronų.

7. 10 minučių išsukite 10000 apsisukimų per minutę.

8. Paviršinį darinį saugokite + 4 o C temperatūroje, o likusias ląsteles vėl įmerkite į 10–20 ml ląsteles nuo irimo saugantį buferinį tirpalą.

9. Paviršinį darinį tris kartus apdorokite garsu ir išvalykite, kiekvieną kartą po šios procedūros saugodami jį pirmiau nurodytu būdu.

10. Supilkite visus paviršinius darinius kartu ir 120 minučių išsukite juos 24000 apsisukimų per minutę + 4 o C temperatūroje kartu su 5 ml 40 % sacharozės (w/v PBS), naudodami 30 ml "Beckmann" centrifugos vamzdžius ir rotorių "SW 28".

11. Išimkite paviršinį darinį, gerai išdžiovinkite vamzdžius, o likusią dalį užmerkite į PBS ir apdorokite garsu. Antigeną saugokite alikvotinėmis dalimis — 70 oC temperatūroje.

BTV ELISA ANTIGENO TITRAVIMAS

Mėlynojo liežuvio ligos ELISA antigenas titruojamas netiesioginiu ELISA tyrimu. Dvigubi antigeno tirpalai titruojami nuolatiniu monokloninio antikūno 3-17-A3 tirpalu (1:50). Turi būti laikomasi šio protokolo:

TYRIMO ATLIKIMO TVARKA

1. Ant mikrotitro plokštelės PBS tirpale ištirpinkite BTV antigeną naudodami dvigubą antigeną (50 μl į kiekvieną duobutę) ir daugiakanalę pipetę.

2. 1 valandai įdėkite plokšteles į iki 37 oC įkaitintą žiedinį plaktuvą.

3. Tris kartus išplaukite plokšteles naudodami PBS.

4. Į kiekvieną mikrotitro plokštelės duobutę įlašinkite po 50 μl monokloninio antikūno 3-17-A3 (ištirpinto santykiu 1:50).

5. 1 valandai įdėkite plokšteles į iki 37 oC įkaitintą žiedinį plaktuvą.

6. Tris kartus išplaukite plokšteles naudodami PBS.

7. Į kiekvieną mikrotitro plokštelės duobutę įlašinkite po 50 μl triušių priešpelinio globulino, sujungto su krienų peroksidaze, ištirpinto iki optimalios titravimui skirtos koncentracijos.

8. 1 valandai įdėkite plokšteles į iki 37 oC įkaitintą žiedinį plaktuvą.

9. Įpilkite pirmiau nurodyto substrato ir chromogeno. Reakciją užbaikite po 10 minučių įlašindami 1 molinę dalį sieros rūgšties (po 50 μ į kiekvieną duobutę).

Atliekant ELISA analizę, monokloninio antigeno turi būti per daug, todėl pasirenkamas toks antigeno tirpimas, kuris atitinka titravimo kreivę ir po 10 minučių sudaro 0,8 OD.

Agaro gelio imunodifuzinio tyrimo, kuriuo nustatomi epizootinės hemoraginės ligos antikūnai, protokolas

Agaro gelio imunodifuzinis tyrimas atliekamas laikantis šio protokolo:

MEDŽIAGOS IR REAGENTAI

1. Antigenas

Nusodinantis antigenas paruošiamas bet kokioje ląstelinės kultūros sistemoje, kuri skatina greitą reikiamo (-ų) epizootinės hemoraginės ligos viruso serotipo (-ų) dauginimąsi. Rekomenduojama naudoti BKH arba vero ląsteles. Viruso augimo pabaigoje antigeno esama paviršiniame skystyje, tačiau tam, kad jis efektyviai pasireikštų, reikia 50–100 kartų didesnio koncentrato. Šį rezultatą galima pasiekti atliekant įprastą baltymo koncentracijos procedūrą; virusą antigene galima inaktyvuoti, įpilant 0,3 % (v/v) beta propiolaktono.

2. Žinomas pozityvus kontrolinis serumas

Naudojant tarptautiniu mastu pripažintą serumą ir antigeną, gaunamas nacionalinis standartinis serumas, kuris standartizuojamas pagal optimalius tarptautinius serumo standartus, užšaldomas, o vėliau, atliekant kiekvieną tyrimą, naudojamas kaip žinomas kontrolinis serumas.

3. Tyrimui naudojamas serumas.

TYRIMO ATLIKIMO TVARKA

1. 1 % agaroso, pagaminto iš borato arba natrio barbitūrato buferinio tirpalo (pH 8,5—9,0), įpilti į Petri lėkštelę, kad šis tirpalas sudarytų ne mažiau nei 3,0 mm lėkštelės gylio.

2. Agare reikia išskobti septynias 5,0 mm skersmens duobutes, kurios turi būti sausos. Duobutės paskirstomos taip: viena duobutė yra centre, o šešios yra 3 mm spinduliu išdėstomos aplink ją.

+++++ TIFF +++++

3. Į vidurinę duobutę įlašinama standartinio antigeno. Į 2, 4, ir 6 duobutes įlašinama žinomo pozityvaus serumo, o į 1, 3 ir 5 duobutes įlašinama tyrimui naudojamo serumo.

4. Sistema 72 valandas laikoma kambario temperatūroje, uždaroje ir drėgnoje patalpoje.

AIŠKINIMAS

Serumo reakcija yra teigiama, jei susidaro specifinis serumo ir antigeno nuosėdų sluoksnis ir susidaro bendras sluoksnis su kontroliniu serumu. Serumo reakcija yra neigiama, jei su antigenu nesusidaro specifinis sluoksnis ir nesusidaro bendras sluoksnis su kontroliniu serumu. Petri lėkštelė apžiūrima tamsiame fone naudojant netiesioginį apšvietimą.

--------------------------------------------------