KOMMISSIONENS BESLUTNING af 15. juli 1994 om dyresundhedsmaessige betingelser og udstedelse af sundhedscertifikat for indfoersel af tyresaed fra tredjelande (94/577/EF)

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europaeiske Faellesskab,

under hevisning til Raadets direktiv 88/407/EOEF af 14. juni 1988 om fastsaettelse af de veterinaerpolitimaessige krav i forbindelse med handelen inden for Faellesskabet med tyresaed og indfoersel heraf (1), senest aendret ved direktiv 93/60/EOEF (2), saerlig artikel 10 og 11, og

ud fra foelgende betragtninger:

Listen over tredjelande, hvorfra medlemsstaterne tillader indfoersel af tyresaed, i det foelgende benaevnt »tredjelandslisten«, blev fastsat ved Kommissionens beslutning 90/14/EOEF (3), aendret ved beslutning 91/276/EOEF (4);

sygdomssituationen i Israel resulterede i, at der blev indfoert forbud mod indfoersler fra dette land ved Kommissionens beslutning 91/277/EOEF (5);

ved Kommissionens beslutning 91/479/EOEF (6), 91/549/EOEF (7), 92/123/EOEF (8), 92/124/EOEF (9), 92/125/EOEF (10), 92/126/EOEF (11), 92/127/EOEF (12), 92/128/EOEF (13), 92/386/EOEF (14), 92/387/EOEF (15) og 92/445/EOEF (16) blev der fastsat dyresundhedsmaessige betingelser og bestemmelser om udstedelse af sundhedscertifikat for indfoersel af tyresaed fra henholdsvis USA, Canada, Polen, Finland, New Zealand, OEstrig, Schweiz, Sverige, Ungarn, Norge og Tjekkoslovakiet;

direktiv 93/60/EOEF, som skal vaere gennemfoert i medlemsstaterne inden den 1. juli 1994, aendrer direktiv 88/407/EOEF, hvilket goer det noedvendigt at aendre tredjelandsbeslutninger; for at forenkle og klargoere EU-forskrifterne inden for dette omraade boer beslutninger samles i én enkelt beslutning, og de beslutninger, der er gaeldende for hvert enkelt land, ophaeves;

i betragtning af bestemmelserne i aftalen om Det Europaeiske OEkonomiske Samarbejdsomraade er det ikke noedvendigt at opretholde sundhedscertifikatet ved indfoersel af tyresaed fra Finland, Norge, Sverige og OEstrig;

ifoelge udtalelse fra Den Videnskabelige Veterinaerkomité er en yderligere proeve for epizootisk haemorragisk sygdom paakraevet;

det er kun i Canada, at forudgaaende rutineproever for denne sygdrom kan udfoeres med seks maaneders mellemrum; der boer derfor fastlaegges en overgangsperiode for anvendelsen af denne beslutning med hensyn til Canada for at give de canadiske veterinaermyndigheder tilstraekkelig tid til at indfoere den nye proeve i deres rutineprogram;

da der i den senere tid er opnaaet bedre kendskab til bluetongues epidemi, kan der nu ogsaa gives tilladelse til indfoersel af tyresaed fra Australien;

den dyresundhedsmaessige situation i de paa tredjelandslisten opfoerte lande synes at vaere god og kontrolleret af velstrukturerede og velorganiserede veterinaermyndigheder hvad angaar sygdomme, der kan overfoeres via saed;

tredjelandenes veterinaermyndigheder har forpligtet sig til inden for 24 timer via telex eller telefax at underrette Kommissionen og medlemsstaterne om bekraeftelse af enhver forekomst af en af de paa OIE's liste A opfoerte sygdomme eller om enhver aendring i vaccinationspolitikken i forbindelse med disse sygdomme og - inden for en rimelig frist - om forekomst af de paa OIE's liste B opfoerte sygdomme og om enhver paataenkt aendring af importreglerne for husdyr eller saed eller embryoner fra husdyr;

veterinaermyndighederne i de paa tredjelandslisten opfoerte lande har forpligtet sig til at foere officielt tilsyn med udstedelsen af de i denne beslutning omhandlede certifikater samt til at sikre, at alle relevante certifikater, fravigelser og resultater af laboratorieundersoegelser, som udstedelsen af certifikater maatte vaere baseret paa, forbliver officielt registreret i mindst tolv maaneder efter afsendelsen af den saed, de vedroerer;

veterinaermyndighederne i de paa tredjelandslisten opfoerte lande har forpligtet sig til officielt at godkende tyrestationer til udfoersel af saed til Faellesskabet som fastsat i artikel 9 i direktiv 88/407/EOEF;

de dyresundhedsmaessige betingelser og udstedelsen af sundhedscertifikat maa tillpasses den dyresundhedsmaessige situation i det paagaeldende tredjeland;

de i denne beslutning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Staaende Veterinaerkomité -

VEDTAGET FOELGENDE BESLUTNING:

Artikel 1

Medlemsstaterne tillader indfoersel af tyresaed, der opfylder betingelserne i certifikaterne i bilag A, B, C og D, foerste del, dog kun fra de tredjelande, der er anfoert i henholdsvis bilag A, B, C og D, anden del.

Medlemsstaterne tillader dog indfoersel fra Canada af tyresaed, der er opsamlet og behandlet i henhold til beslutning 91/549/EOEF, indtil den 31. december 1994.

Artikel 2

Beslutning 91/479/EOEF, 92/123/EOEF, 92/124/EOEF, 92/125/EOEF, 92/126/EOEF, 92/127/EOEF, 92/128/EOEF, 92/386/EOEF, 92/387/EOEF og 92/445/EOEF ophaeves.

Kommissionens beslutning 91/549/EOEF ophaeves fra den 1. januar 1995.

Artikel 3

Bestemmelserne i artikel 1, stk. 1, vedroerende Canada anvendes fra den 1. januar 1995.

Artikel 4

Denne beslutning er rettet til medlemsstaterne.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 15. juli 1994.

Paa Kommissionens vegne

René STEICHEN

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. L 194 af 22. 7. 1988, s. 10.

(2) EFT nr. L 186 af 28. 7. 1993, s. 28.

(3) EFT nr. L 8 af 11. 1. 1990, s. 71.

(4) EFT nr. L 135 af 30. 5. 1991, s. 58.

(5) EFT nr. L 135 af 30. 5. 1991, s. 60.

(6) EFT nr. L 258 af 16. 9. 1991, s. 1.

(7) EFT nr. L 298 af 29. 10. 1991, s. 6.

(8) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 1.

(9) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 10.

(10) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 19.

(11) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 28.

(12) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 37.

(13) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 46.

(14) EFT nr. L 204 af 21. 7. 1992, s. 13.

(15) EFT nr. L 204 af 21. 7. 1992, s. 22.

(16) EFT nr. L 247 af 27. 8. 1992, s. 1.

BILAG A

FOERSTE DEL ANDEN DEL Liste over lande, som har tilladelse til at anvende det sundhedscertifikat, der er vist i bilag A, foerste del DEN TJEKKISKE REPUBLIK

UNGARN

NEW ZEALAND

POLEN

RUMAENIEN

SCHWEIZ

DEN SLOVAKISKE REPUBLIK

BILAG B

FOERSTE DEL ANDEN DEL Liste over lande, som har tilladelse til at anvende det sundhedscertifikat, der er vist i bilag B, foerste del USA

BILAG C

FOERSTE DEL ANDEN DEL Liste over lande, som har tilladelse til at anvende det sundhedscertifikat, der er vist i bilag C, foerste del CANADA Bortset fra regionen Okanagan Valley i British Columbia, der defineres som et omraade, der afgraenses af en linje trukket fra et punkt paa graensen mellem Canada og USA 120° 15& prime; laengde, 49° bredde mod nord til et punkt 119° 35& prime; laengde, 50° 30& prime; bredde mod nordoest til et punkt 119° laengde, 50° 45& prime; bredde mod syd til et punkt paa graensen mellem Canada og USA 118° 15& prime; laengde, 49° bredde.

BILAG D

FOERSTE DEL ANDEN DEL Liste over tredjelande, som har tilladelse til at anvende det sundhedscertifikat, der er vist i bilag D, foerste del AUSTRALIEN

BILAG E

Protokol for en blokerende eller kompetitiv enzym-kaede-immunitet-maaling med anvendelse af et gruppespecifikt monoklonalt antistof til paavisning af antistoffer mod bluetongue-virus DEN KOMPETITIVE ELISA TIL PAAVISNING AF BLUETONGUE MED ANVENDELSE AF MONOKLONALT ANTISTOF 3-17-A3 Proeven kan paavise antistoffer mod alle kendte serotyper af bluetongue-virus (BTV).

Proeveprincippet er, at reaktionen mellem BTV-antigen og et gruppespecifikt monoklonalt antistof (3-17-A3) afbrydes ved tilsaetning af fortyndinger af proeveserum. Tilstedevaerende antistoffer mod BTV i proeveserummet blokerer reaktionsevnen hos det monoklonale antistof (Mas) og resulterer i en formindskelse af den forventede farveudvikling ved tilsaetning af enzymsubstrat.

MATERIALER OG REAGENSER

1. Fladbundede mikrotiterplader.

2. Antigen: tilberedes som beskrevet nedenfor.

3. Blokerende buffer: 5 % (w/v) »Marvel« toerret maelkepulver, 0,1 % (v/v) Tween-20 (leveres som polyoxyethylensorbitanmonolauratsirup) i phosphatbufferet saltoploesning (PBS).

4. Monoklonalt antistof: 3-17-A3 (leveres som hybridom cellekultur supernatant), opbevaret ved 20 °C eller frysetoerret, fortyndet i forholdet 1: 50 med blokerende buffer inden brug, rettet mod det gruppespecifikke polypeptid p7.

5. Konjugat: kanin-antimuseglobulin (adsorberet og elueret), konjugeret med peberrodsperoxidase og opbevaret i moerke ved 4°C.

6. Substrat og kromogen: 0,2 g ortofenylendiamin (OPD) oploest i en buffer bestaaende af 2,553 g citronsyre og 4,574 g dinatriumhydrogenortofosfat tilsat destilleret vand op til 500 ml, opdelt i 25 ml alikvoter og opbevaret i moerke ved 20°C med tilsaetning af 12 ml/ml hydrogenperoxid (30 % w/v) umiddelbart inden brug.

OMGAAS MED FORSIGTIGHED - BRUG GUMMIHANDSKER - MISTANKE OM MUTAGEN.

7. 1 Molar svovlsyre: 26,6 ml syre blandet i 473,4 ml destilleret vand.

HUSK - BLAND ALTID SYRE I VAND, ALDRIG VAND I SYRE

8. Orbitalryster.

9. Elisa-pladelaeser (proeven kan aflaeses visuelt).

PROEVEPROTOKOL

Blindproevekontrol

Raekke 1 A-H er en blindproevekontrol bestaaende af BTV-antigen og konjugat. Den kan anvendes som blindproeve for Elisa-laeseren.

Mas-kontrol

Raekke 2 A-H er den monoklonale antistofkontrol og bestaar af BTV-antigen, monoklonalt antistof og konjugat. Den udgoer en negativ kontrol. Middelvaerdien af absorbansaflaesningerne af denne kontrolraekke repraesenterer 0 % haemning.

Positiv kontrol

Raekke 3 A-H er den positive kontrol. Den bestaar af BTV-antigen, BTV-positive antiserumfortyndinger, monoklonalt antistof og konjugat. Den tjener som indikator for, at proeven fungerer ordentligt, og der boer opnaas samstemmende haemningsniveauer fra proeve til proeve.

Proevesera

I ovenstaaende proeveformat kan der afproeves 18 sera fortyndet i forholdet 1: 2, 1: 4, 1: 8 og 1: 16. Dette vil vise noget om antistoftiteret i proeveserummet. Fortyndingsraekken kan gaa laengere, saaledes at titrene for serumfortynding naar slutpunktet. Som et alternativ kan sera, naar det gaelder serologiske undersoegelser i stor skala, proeves i en enkelt fortynding (1: 4) eller to fortyndinger (1: 2 og 1: 4) som en hurtig screeningtest.

PROCEDURE

1. BTV-antigen fortyndes til praetitreret fortynding i PBS, der sonikeres et oejeblik for at sprede akkumuleret virus (hvis der ikke findes nogen sonikator, pipetteres der kraftigt), og der tilfoeres 50 ml til alle huller i Elisa-pladen. Der bankes paa pladens sider for at sprede antigenet.

2. Der inkuberes ved 37° C i 60 minutter i en orbitalryster. Pladerne vaskes tre gange ved overskylning og toemning af hullerne med usterilt PBS, og de trykkes af med klatpapir.

3. Der tilsaettes 50 ml blokerende buffer pr. hul. Proevesera og positivt serum haeldes i de relevante huller, og der fortyndes hen over pladen ved hjaelp af en multikanalpipette. Sera maa ikke tilsaettes blankproeve-kontrollen eller Mas-kontrollen.

4. Straks efter tilsaetningen af proeveseraene fortyndes Mas i blokerende buffer (for at praetitrere fortyndingen), og der haeldes 50 ml i alle pladens huller, undtagen naar det gaelder blindproevekontrollen.

5. Der inkluderes ved 37° C i 60 minutter i en sonikator. Der vaskes tre gange med PBS og trykkes af med klatpapir.

6. Kanin-antimusekoncentrat fortyndes til 1: 5 000 i blokerende buffer, og der haeldes 50 ml i alle pladens huller.

7. Der inkuberes ved 37° C i 60 minutter i en sonikator. Der vaskes tre gange med PBS og trykkes af med klatpapir.

8. OPD optoes, og umiddelbart inden brug tilsaettes hver 25 ml POD 12 ml 30 % hydrogenperoxid. 50 ml haeldes i alle pladens huller. Man lader farven udvikle sig i ca. ti minutter og standser reaktionen med 1 M svovlsyre (50 ml pr. hul). Farven skal udvikle sig i Mas-kontrolhullerne og i de huller, der ikke indeholder sera med antistof mod BTV.

9. Hullerne undersoeges og registreres enten visuelt eller ved hjaelp af en spektrofotometrisk laeser.

ANALYSE AF RESULTATER

Middel-OD-aflaesningen beregnes ud fra Mas-kontrollerne. Dette repraesenterer haemningsvaerdien paa 0 %. Absorbansaflaesninger af proeveseraene udtrykkes i procent haemningsvaerdier ved hjaelp af foelgende formel:

Procent haemningsvaerdi = 100 OD ved tilstedevaerelse af proeveserum

OD ved fravaer af proeveserum × 100

Haemningsvaerdier paa over 40 % ved en serumfortynding paa 1: 4 betragtes som positive. Visuel aflaesning er mulig, da 40 % haemning er den laveste vaerdi, der let kan ses med det blotte oeje.

TILBEREDNING AF BTV ELISA-ANTIGEN 1. 10 roux sammenflydende BHK-21 celler vaskes tre gange med serumfrit Eagle's medium, og der inficeres med bluetongue-virus serotype 1 i serumfrit Eagle's medium.

2. Der inkuberes ved 37° C og undersoeges daglig for cytopatisk effekt (cpe).

3. Naar der kan konstateres cpe i 80 til 90 % af cellelaget i hver roux, indsamles viruset ved, at eventuelle celler, der stadig sidder paa glasset, rystes af.

4. Der centrifugeres ved 2 000 til 3 000 rpm for at sammenpresse cellerne.

5. Supernatanten fjernes, og cellerne genopslaemmes i ca. 30 ml PBS, som indeholder 1 % »Sarkosyl« og 2 ml fenolmetylsulfonylfluorid (lysisbuffer). Dette kan bevirke, at cellerne danner en gel, og der kan tilsaettes mere lysisbuffer for at reducere denne effekt.

NB: Fenylmetylsulfonylfluorid er skadeligt - behandles med stoerste forsigtighed.

6. Cellerne spraenges i 60 sekunder ved hjaelp af en ultralydsonde med en amplitude paa 30 micron.

7. Der centrifugeres ved 10 000 rpm i ti minutter.

8. Supernatanten opbevares ved + 4° C, og den resterende cellemasse genopslaemmes i 10 til 20 ml lysisbuffer.

9. Der sonikeres og foretages en klaring, idet supernatanten opbevares paa hvert stadium, i alt tre gange.

10. Supernatanterne samles og centrifugeres ved 24 000 rpm i 120 minutter ved + 4° C paa en 5 ml pude bestaaende af 40 % saccharose (w/v i PBS) ved hjaelp af 30 ml Beckman centrifugeglas og en SW 28 rotor.

11. Supernatanten fjernes, glassene toemmes helt, og massen genopslaemmes i PBS ved hjaelp af sonikering. Antigenet opbevares i alikvoter ved 70° C.

TITRERING AF BTV ELISA-ANTIGEN Bluetongue Elisa-antigen titreres ved hjaelp af den indirekte Elisa. Tofoldfortyndinger af antigen titreres over for en konstant fortynding (1: 50) af monoklonalt antistof 3-17-A3). Protokollen er som foelger:

PROCEDURE

1. BTV antigen fortyndes i PBS over mikrotiterpladen i en todobbelt fortyndingsraekke (50 ml/hul) ved hjaelp af en multikanalpipette.

2. Der inkuberes en time ved 37° C i en orbitalryster.

3. Pladerne vaskes tre gange med PBS.

4. Der tilsaettes hvert hul i mikrotiterpladen 50 ml monoklonalt antistof 3-17-A3 (fortyndet 1: 50).

5. Der inkuberes en time ved 37° C i en orbitalryster.

6. Pladerne vaskes tre gange med PBS.

7. Der tilsaettes hvert hul i mikrotiterpladen 50 ml kanin-antimuseglobulin konjugeret med peberrodsperoxidase fortyndet til en praetitreret optimal koncentration.

8. Der inkuberes en time ved 37° C i en sonikator.

9. Der tilsaettes substrat og kromogen som tidligere beskrevet. Reaktionen standses efter ti minutter ved tilsaetning af 1 Molar svovlsyre (50 ml/hul).

I den kompetitive proeve skal det monoklonale antistof vaere i overskud, og der vaelges derfor en fortynding af antigen, som ligger paa titreringskurven (ikke paa den flade del), hvilket giver ca. 0,8 OD efter ti minutter.

Protokol for en agar-gel-immunodiffusionsproeve til paavisning af antistoffer mod epizootisk haemoragisk sygdom Agar-gel-immunodiffusionsproeven foretages efter foelgende protokol:

MATERIALER OG REAGENSER

1. Antigen

Antigen, der bundfaeldes, tilberedes i et cellekultursystem, der taaler den hurtige formering af den/de paagaeldende serotype(r) epizootisk haemoragisk sygdomsvirus. BHK eller Vero-celler anbefales. Antigen forekommer i supernatantvaesken, naar virusets vaekst er ophoert, men kraever en koncentration paa 50 til 100 gange for at vaere effektivt. Dette kan opnaas ved hjaelp af enhver standardprocedure for proteinkoncentrering. Virus i antigenet kan inaktiveres ved tilsaetning af 0,3 % (v/v) beta-propiolakton.

2. Kendt positivt kontrolserum

Ved hjaelp af det internationale referenceserum og antigen fremstilles et nationalt standardserum, der standardiseres i det optimale forhold som for det internationale referenceserum, frysetoerres og anvendes som det kendte kontrolserum i hver enkelt proeve.

3. Proeveserum

PROCEDURE

1. 1 % agarose tilberedt i borat eller natriumbarbitolbuffer, pH 8,5 til 9,0 haeldes i en petriskaal op til mindst 3,0 mm.

2. Der skaeres et proevemoenster paa syv fugtfri huller paa hvert 5,0 mm diameter i agaren. Moenstret bestaar af et centerhul og seks huller, der er anbragt rundt om det i en cirkel med en radius paa 3 mm.

1

6 2

X

5 3

4

3. Centerhullet fyldes med standardantigenet. De ydre huller 2, 4 og 6 fyldes med kendt positivt serum og hul 1, 3 og 5 fyldes med proevesera.

4. Systemet inkuberes i indtil 72 timer ved stuetemperatur i et lukket fugtigt kammer.

FORTOLKNING

Et proeveserum er positivt, hvis det danner en specifik bundfaeldninglinje med antigenet og danner en ubrudt identitetslinje med kontrolserummet. Et proeveserum er negativt, hvis det ikke danner en specifik linje med antigenet og det ikke krummer kontrolserummets linje. Petriskaale boer undersoeges mod en moerk baggrund ved indirekte belysning.