„PRILOGE

POVZETEK

Priloga I	Značilnosti oljčnega olja
Priloga Ia	Vzorčenje oljčnega olja ali olja iz oljčnih tropin, dostavljenega v izvirnem pakiranju
Priloga Ib	Diagram poteka za preverjanje, ali je vzorec oljčnega olja v skladu z deklarirano kategorijo
Priloga II	Določanje prostih maščobnih kislin, metoda v hladnem
Priloga III	Določanje peroksidnega števila
Priloga IV	Določanje vsebnosti voskov s kapilarno kolonsko plinsko kromatografijo
Priloga VII	Določanje deleža 2-gliceril monopalmitata
Priloga IX	Spektrofotometrično merjenje v UV področju
Priloga X	Določanje metilnih estrov maščobnih kislin s plinsko kromatografijo
Priloga XI	Določanje hlapnih halogeniranih topil v oljčnem olju
Priloga XII	Metoda mednarodnega sveta za oljke za organoleptično ocenjevanje deviškega oljčnega olja
Priloga XV	Vsebnost olja v oljčnih tropinah
Priloga XVI	Določanje jodnega števila
Priloga XVII	Metoda za določanje stigmastadienov v rastlinskih oljih
Priloga XVIII	Določanje razlike med dejansko in teoretično vsebnostjo triacilglicerolov z ekvivalentnim ogljikovim številom (ECN) 42
Priloga XIX	Določanje sestave in vsebnosti sterola ter alkoholnih spojin s kapilarno plinsko kromatografijo
Priloga XX	Metoda za določanje vsebnosti voskov, metilnih estrov maščobnih kislin in etilnih estrov maščobnih kislin s kapilarno plinsko kromatografijo
Priloga XXI	Rezultati preverjanj skladnosti oljčnega olja iz člena 8(2)

„PRILOGA I

ZNAČILNOSTI OLJČNEGA OLJA

Značilnosti kakovosti

Etilni estri maščobnih kislin [mg/kg]		≤ 35	—	—	—	—	—	—	—
Organoleptična ocena	Mediana sadežnosti (Mf)	Mf > 0,0	Mf > 0,0	—	—	—	—	—	—
	Mediana napake (Md) (*)	Md = 0,0	Md ≤ 3,5	Md> 3,5 (1)
Delta-K		≤ 0,01	≤ 0,01	—	≤ 0,16	≤ 0,15	—	≤ 0,20	≤ 0,18
K268 ali K270		≤ 0,22	≤ 0,25	—	≤ 1,25	≤ 1,15	—	≤ 2,00	≤ 1,70
K232		≤ 2,50	≤ 2,60	—	—	—	—	—	—
Peroksidno število (mEq O2/kg)		≤ 20,0	≤ 20,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0
Vsebnost kislin (%) (*)		≤ 0,80	≤ 2,0	> 2,0	≤ 0,30	≤ 1,00	—	≤ 0,30	≤ 1,00
Kategorija		1. Ekstra deviško oljčno olje	2. Deviško oljčno olje	3. Lampantno oljčno olje	4. Rafinirano oljčno olje	5. Oljčno olje, sestavljeno iz rafiniranih oljčnih olj in deviških oljčnih olj	6. Surovo olje iz oljčnih tropin	7. Rafinirano olje iz oljčnih tropin	8. Olje iz oljčnih tropin

Značilnosti čistosti

2-gliceril monopalmitat (%)

≤ 0,9, če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14,00 %

≤ 1,0, če je skupni % palmitinske kisline > 14,00 %

≤ 0,9, če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14,00 %

≤ 1,0, če je skupni % palmitinske kisline > 14,00 %

≤ 0,9, če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14,00 %

≤ 1,1, če je skupni % palmitinske kisline > 14,00 %

≤ 0,9, če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14,00 %

≤ 1,1, če je skupni % palmitinske kisline > 14,00 %

≤ 0,9, če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14,00 %

≤ 1,0, če je skupni % palmitinske kisline > 14,00 %

≤ 1,4

≤ 1,4

≤ 1,2

Razlika: ECN42 (HPLC) in ECN42 (teoretični izračun)

≤ |0,20|

≤ |0,20|

≤ |0,30|

≤ |0,30|

≤ |0,30|

≤ |0,60|

≤ |0,50|

≤ |0,50|

Stigmastadieni (mg/kg) (3)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,50

—

—

—

—

—

Vsota transizomerov linolne in linolenske kisline (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,10

≤ 0,35

≤ 0,35

Vsota transizomerov oleinske kisline (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,40

Sestava maščobnih kislin (2)

Lignocerinska (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

Behenska (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,30

Eikozanojska (%)

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

Arahidonska (%)

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

Linolenska (%)

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

Miristinska (%)

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

Kategorija

1. Ekstra deviško oljčno olje

2. Deviško oljčno olje

3. Lampantno oljčno olje

4. Rafinirano oljčno olje

5. Oljčno olje, sestavljeno iz rafiniranih oljčnih olj in deviških oljčnih olj

6. Surovo olje iz oljčnih tropin

7. Rafinirano olje iz oljčnih tropin

8. Olje iz oljčnih tropin

Voski (mg/kg) (**)		C42 + C44 + C46 ≤ 150	C42 + C44 + C46 ≤ 150	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (6)	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (7)	C40 + C42 + C44 + C46 > 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350
Eritrodiol in uvaol (%) (**)		≤ 4,5	≤ 4,5	≤ 4,5 (6)	4,5	≤ 4,5	> 4,5 (7)	4,5	> 4,5
Steroli skupaj [mg/kg]		≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 2 500	≥ 1 800	≥ 1 600
Sestava sterolov	Delta-7-stigmastenol (4) (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
	Navidezni β-sitosterol (5) (%)	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0
	Stigmasterol (%)	< kamp.	< kamp.	—	< kamp.	< kamp.	—	< kamp.	< kamp.
	Kampesterol (4) (%)	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0
	Brasikasterol (%)	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,2	≤ 0,2	≤ 0,2
	Holesterol (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
Kategorija		1. Ekstra deviško oljčno olje	2. Deviško oljčno olje	3. Lampantno oljčno olje	4. Rafinirano oljčno olje	5. Oljčno olje, sestavljeno iz rafiniranih oljčnih olj in deviških oljčnih olj	6. Surovo olje iz oljčnih tropin	7. Rafinirano olje iz oljčnih tropin	8. Olje iz oljčnih tropin

Opombe:

(a)	Rezultate analiz je treba navesti na enako število decimalnih mest natančno, kot je določeno za posamezno značilnost. Zadnjo števko v številki je treba povečati za ena, če je naslednja števka večja od 4.

(b)	Če samo ena značilnost ni skladna z navedenimi vrednostmi, se lahko olje razvrsti v drugo kategorijo ali se označi kot neskladno za namene te uredbe.

(c)	Za lampantno oljčno olje sta lahko obe značilnosti kakovosti, označeni z zvezdico (*), hkrati različni od mejnih vrednosti, določenih za navedeno kategorijo.

(d)

Značilnosti, označene z dvema zvezdicama (**), pomenijo, da sta za surovo olje iz oljčnih tropin lahko obe ustrezni mejni vrednosti hkrati različni od navedenih vrednosti. Za olje iz oljčnih tropin in rafinirano olje iz oljčnih tropin se lahko ena od ustreznih mejnih vrednosti razlikuje od navedenih vrednosti.

Dodatek

Drevesi odločanja

Drevo odločanja za vsebnost kampesterola v deviških in ekstra deviških oljčnih oljih:

Drugi parametri so skladni z mejnimi vrednostmi, določenimi v tej uredbi.

Drevo odločanja za vsebnost delta-7-stigmastenola v:

—	ekstra deviških in deviških oljčnih oljih

Drugi parametri so skladni z mejnimi vrednostmi, določenimi v tej uredbi.

—	oljih iz oljčnih tropin (surovih in rafiniranih)

Drugi parametri so skladni z mejnimi vrednostmi, določenimi v tej uredbi.

„PRILOGA Ib

DIAGRAM POTEKA ZA PREVERJANJE, ALI JE VZOREC OLJČNEGA OLJA V SKLADU Z DEKLARIRANO KATEGORIJO

Splošna tabela

Tabela 1 – Ekstra deviško oljčno olje (merila kakovosti)

Tabela 2 – Deviško oljčno olje (merila kakovosti)

Tabela 3 – Ekstra deviško oljčno olje in deviško oljčno olje (merila čistosti)

Tabela 4 – Lampantno oljčno olje (merila čistosti)

Tabela 5 – Rafinirano oljčno olje (merila kakovosti)

Tabela 6 – Oljčno olje (sestavljeno iz rafiniranega oljčnega olja in deviških oljčnih olj) (merila kakovosti)

Tabela 7 – Rafinirano oljčno olje in oljčno olje, sestavljeno iz rafiniranega oljčnega olja in deviških oljčnih olj (merila čistosti)

Tabela 8 – Surovo olje iz oljčnih tropin (merila čistosti)

Tabela 9 – Rafinirano olje iz oljčnih tropin – Merila kakovosti

Tabela 10 – Olje iz oljčnih tropin (merila kakovosti)

Tabela 11 – Rafinirano olje iz oljčnih tropin in olje iz oljčnih tropin (merila čistosti)

„PRILOGA XIX

DOLOČANJE SESTAVE IN VSEBNOSTI STEROLA TER ALKOHOLNIH SPOJIN S KAPILARNO PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1.   PODROČJE UPORABE

Metoda opisuje postopek za določanje posamezne in skupne vsebnosti alkoholnih spojin v oljčnem olju in olju iz oljčnih tropin ter v mešanici obeh.

Alkoholne spojine v oljčnem olju in olju iz oljčnih tropin so alifatski alkoholi, steroli in triterpenski dialkoholi.

2.   PRINCIP

Olja z dodanima α-holestanolom in 1-eikozanolom kot internima standardoma se umilijo s kalijevim hidroksidom v etanolni raztopini, neumiljive snovi pa se nato ekstrahirajo z etilnim etrom.

Različne frakcije alkoholnih spojin se ločijo od neumiljivih snovi bodisi s tankoplastno kromatografijo na z lugom obdelani silikagelni plošči (referenčna metoda) bodisi s HPLC s silikagelno kolono. Frakcije, dobljene iz ločitve silikagela, se pretvorijo v trimetilsililne etre in se nato analizirajo s kapilarno kolonsko plinsko kromatografijo.

DEL 1

PRIPRAVA NEUMILJIVIH SNOVI

1.   PODROČJE UPORABE

Ta del opisuje pripravo in ekstrakcijo neumiljivih snovi. Vključuje pripravo in ekstrakcijo neumiljivih snovi iz oljčnega olja in olja iz oljčnih tropin.

2.   PRINCIP

Testni vzorec se umili z vrenjem pod povratnim hladilnikom z raztopino etanolnega kalijevega hidroksida. Neumiljive snovi se ekstrahirajo z dietil etrom.

3.   OPREMA

Običajna laboratorijska oprema in zlasti:

3.1	250-ml bučka z okroglim dnom s povratnim hladilnikom s priključki iz steklenih obrusov.

3.2	500-ml lij ločnik.

3.3	250-ml bučke.

3.4	100- in 500-μl mikrobrizgalki.

3.5	Cilindrični filtrirni lij s porozno frito G3 (poroznosti 15–40 μm), premera približno 2 cm in globine 5 cm, z nastavkom, primernim za filtriranje v vakuumu, in priključkom z zunanjim obrusom.

3.6	50-ml erlenmajerica s priključkom z notranjim obrusom za uporabo s filtrirnim lijem (točka 3.5).

3.7	10-ml epruveta s koničnim dnom in steklenim zamaškom.

3.8	Eksikator, napolnjen s kalcijevim dikloridom.

4.   REAGENTI

4.1	Kalijev hidroksid (minimalne koncentracije 85 %).

4.2	Etanolna raztopina kalijevega hidroksida, približno 2 M. Raztopite 130 g kalijevega hidroksida (4.1) s hlajenjem v 200 ml destilirane vode in potem do enega litra dodajte etanol (4.7). Raztopino hranite v dobro zamašenih temnih steklenicah, in sicer največ dva dni.

4.3	Etilni eter čistoče za analizo.

4.4	Brezvodni natrijev sulfat čistoče za analizo.

4.5	Aceton kromatografske čistoče.

4.6	Etilni eter kromatografske čistoče.

4.7	Etanol čistoče za analizo.

4.8	Etilacetat čistoče za analizo.

4.9	Interni standard α-holestanol več kot 99-odstotne čistoče (čistočo je treba preveriti s plinskokromatografsko analizo).

4.10	Interna standardna raztopina α-holestanola, 0,2-odstotna raztopina (m/V) v etilacetatu (4.8).

4.11	Raztopina 10 g/l fenolftaleina v etanolu (4.7).

4.12	0,1-odstotna (m/v) raztopina 1-eikozanola v etilacetatu (interni standard).

5.   POSTOPEK

S 500-μl mikrobrizgalko (3.4) vnesite v 250-ml bučko (3.1) interno standardno raztopino α-holestanola (4.10) in 1-eikozanol (4.12), in sicer takšno količino holestanola in eikozanola, ki ustreza približno 10 % vsebnosti sterolov in alkoholov v vzorcu. Na primer za 5 g vzorca oljčnega olja dodajte 500 μl raztopine α-holestanola (4.10) in 250 μL raztopine 1-eikozanola (4.12). Za olja iz oljčnih tropin dodajte 1 500 μl tako raztopine α-holestanola (4.10) kot tudi 1-eikozanola (4.12). Odparite do suhega z blagim tokom dušika na parni kopeli. Po ohladitvi bučke vanjo natehtajte 5,00 ± 0,01 g suhega filtriranega vzorca.

Opomba 1:

Olja in masti živalskega ali rastlinskega izvora, ki vsebujejo precejšnje količine holesterola, lahko dajo vrh, ki ima retenzijski čas enak holestanolu. V takem primeru je treba sterolno frakcijo analizirati dvakrat, in sicer z internim standardom in brez njega.

Dodajte 50 ml 2M etanolne raztopine kalijevega hidroksida (4.2) in nekaj plovca, namestite povratni hladilnik in segrejte na rahlo vretje do končanega umiljenja (raztopina postane bistra). S segrevanjem nadaljujte še nadaljnjih 20 minut in potem z vrha hladilnika dodajte 50 ml destilirane vode, snemite hladilnik in ohladite bučko na približno 30 °C.

Kvantitativno prenesite vsebino bučke v 500-ml lij ločnik (3.2), in sicer z večkratnim spiranjem z destilirano vodo (50 ml). Dodajte približno 80 ml etilnega etra (4.6), močno tresite približno 60 sekund ter postopoma sproščajte pritisk, tako da obrnete lij ločnik in odprete petelinček. Pustite mirovati, dokler fazi nista popolnoma ločeni (opomba 2). Nato milnico v celoti prelijte v drug lij ločnik. Iz vodno-alkoholne faze še dvakrat ekstrahirajte, in sicer z uporabo 60 do 70 ml etilnega etra (4.6).

Opomba 2:

Emulzijo je mogoče odstraniti z dodajanjem majhnih količin etanola (4.7).

Združite vse tri etrske ekstrakte v skupnem liju ločniku, ki vsebuje 50 ml vode. Nadaljujte z izpiranjem (50 ml), dokler izpiralna voda ob dodatku kapljice raztopine fenolftaleina ni več rožnato obarvana (4.11). Potem ko je izpiralna voda odstranjena, filtrirajte skozi brezvodni natrijev sulfat (4.4) v predhodno stehtani 250-ml bučki, pri tem pa lij in filter izperite z majhnimi količinami etilnega etra (4.6).

Topilo odparite z destilacijo na rotacijskem izparilniku pri 30 °C v vakuumu. Dodajte 5 ml acetona (4.5) in z blagim tokom dušika v celoti odstranite hlapno topilo. Ostanek sušite v peči 15 minut pri 103 ± 2 °C. Po ohladitvi v eksikatorju ga stehtajte z natančnostjo 0,1 mg.

DEL 2

LOČEVANJE FRAKCIJ ALKOHOLNIH SPOJIN

1.   PODROČJE UPORABE

Neumiljive snovi, pripravljene v delu 1, se frakcionirajo v različne alkoholne spojine, alifatske alkohole, sterole in triterpenske dialkoalkohole (eritrodiole in uvaole).

2.   PRINCIP

Neumiljiva snov se lahko frakcionira in prepozna z osnovno tankoplastno kromatografijo (referenčna metoda), ustrezni pasovi pa se lahko odstrgajo in ekstrahirajo. Kot alternativna metoda ločevanja se lahko uporabi HPLC s silikagelno kolono in UV-detektorjem ter zberejo različne frakcije. Alifatski in triterpenski alkoholi ter steroli in triterpenski dialkoalkoholi se izolirajo skupaj.

3.   OPREMA

Običajna laboratorijska oprema in zlasti:

3.1	Celotna oprema za analizo s tankoplastno kromatografijo s steklenimi ploščami 20 × 20 cm.

3.2	Ultravijolična svetilka z valovno dolžino 366 ali 254 nm.

3.3	100- in 500-μl mikrobrizgalki.

3.4	Cilindrični filtrirni lij s porozno frito G3 (poroznosti 15–40 μm), premera približno 2 cm in globine 5 cm, z nastavkom, primernim za filtriranje v vakuumu, in priključkom z zunanjim obrusom.

3.5	50-ml erlenmajerica s priključkom z notranjim obrusom za uporabo s filtrirnim lijem (točka 3.4).

3.6	10-ml epruveta s koničnim dnom in steklenim zamaškom.

3.7	Eksikator, napolnjen s kalcijevim dikloridom.

3.8	Sistem HPLC, ki ga sestavljajo: 3.8.1 Binarna črpalka. 3.8.2 Ročni ali avtomatski injektor, opremljen z 200-μl injekcijskim zvitkom. 3.8.3 Integrirani razplinjevalnik. 3.8.4 UV-VIS-detektor ali IR-detektor.

3.9	Kolona HPCL (25 cm x 4 mm notranjega premera) s silikagelom 60 (velikost delcev 5 μm).

3.10	Filter za brizgalke, 0,45 μm.

3.11	Erlenmajerica, 25-ml.

4.   REAGENTI

4.1	Kalijev hidroksid (minimalne koncentracije 85 %).

4.2	Etanolna raztopina kalijevega hidroksida, približno 2 M. Raztopite 130 g kalijevega hidroksida (4.1) s hlajenjem v 200 ml destilirane vode in potem do enega litra dodajte etanol (4.9). Raztopino hranite v dobro zamašenih temnih steklenicah, in sicer največ dva dni.

4.3	Etilni eter čistoče za analizo.

4.4	Etanolna raztopina kalijevega hidroksida, približno 0,2 M. Raztopite 13 g kalijevega hidroksida (4.1) v 20 ml destilirane vode in potem do enega litra dodajte etanol (4.9).

4.5	Steklene plošče, 20 x 20, premazane s silikagelom, brez indikatorja fluorescence, debeline 0,25 mm (na voljo v prodaji, pripravljene za uporabo).

4.6	Aceton kromatografske čistoče.

4.7	N-heksan kromatografske čistoče.

4.8	Etilni eter kromatografske čistoče.

4.9	Etanol čistoče za analizo.

4.10	Etilacetat čistoče za analizo.

4.11	Referenčna raztopina za tankoplastno kromatografijo: holesterol, fitosteroli, alkoholi in eritrodiol, 5-odstotna raztopina v etilacetatu (4.10).

4.12	0,2-odstotna raztopina 2,7-diklorofluorosceina v etanolni raztopini. Naredite rahlo bazično z dodatkom nekaj kapelj alkoholne raztopine 2 M kalijevega hidroksida (4.2).

4.13	Mešanica n-heksana (4.7) / etilnega etra (4.8) v razmerju 65:35 (V/V).

4.14	Mobilna faza HPLC, n-heksan (4.7) / etilni eter (4.8) (1:1) (V/V).

5.   REFERENČNA METODA: LOČEVANJE ALKOHOLNIH SPOJIN Z UPORABO Z LUGOM OBDELANE PLOŠČE ZA TANKOPLASTNO KROMATOGRAFIJO

Priprava z lugom obdelanih plošč za tankoplastno kromatografijo. Silikagelne plošče (4.5) za 10 sekund potopite ali približno 4 cm globoko namočite v raztopino 0,2 M kalijevega hidroksida (4.4) in jih potem pustite dve uri, da se sušijo v digestoriju, na koncu pa jih dajte v peč na 100 °C za eno uro.

Vzemite jih iz peči in jih do uporabe hranite v eksikatorju, napolnjenim s kalcijevim kloridom (3.7) (tako obdelane plošče je treba uporabiti v 15 dneh).

Mešanico heksana in etilnega etra (4.13) (opomba 3) vstavite v razvijalno komoro na globino približno 1 cm. Komoro zaprite z ustreznim pokrovom in jo tako pustite najmanj pol ure na hladnem, da se lahko med hlapi in tekočino ustvari ravnotežje. Trakovi filtrirnega papirja, namočeni v eluent, se lahko položijo na notranje površine komore. To skrajša razvijalni čas za približno eno tretjino ter omogoča bolj enakomerno elucijo sestavin.

Opomba 3:

Razvijalno mešanico je treba zamenjati za vsak preskus, zato da se dosežejo popolnoma ponovljivi pogoji elucije. Kot alternativa se lahko uporabi mešanica n-heksana in etilnega etra v razmerju 50:50 (V/V).

Pripravite približno 5-odstotno raztopino neumiljivih snovi, pripravljenih v delu 1 v etilacetatu (4.10), ter z uporabo 100-μl mikrobrizgalke (3.3) nanesite 0,3 ml raztopine na tanko in homogeno progo na nižjem koncu (2 cm) kromatografske plošče (4.5). Vzporedno s progo nanesite 2 do 3 μl materialne referenčne raztopine (4.11), tako da se po razvijanju sterolni, triterpenski dialkoholni in alkoholni pasovi lahko identificirajo.

Ploščo vstavite v razvijalno komoro (3.1). Temperaturo okolja je treba vzdrževati med 15 in 20 °C (opomba 4). Komoro takoj zaprite s pokrovom in pustite, da poteka eluiranje, dokler fronta topila ne doseže razdalje 1 cm od vrhnjega roba plošče. Vzemite ploščo iz razvijalne komore in odparite topilo s tokom vročega zraka ali tako, da ploščo nekaj časa pustite v digestoriju.

Opomba 4:

Višja temperatura lahko negativno vpliva na ločevanje.

Rahlo in enakomerno napršite ploščo z raztopino 2,7-diklorofluorosceina (4.12) ter pustite, da se posuši. Če se plošča opazuje pod ultravijolično svetlobo (3.2), se sterolni, triterpenski dialkoholni in alkoholni pasovi lahko identificirajo tako, da se poravnajo s pikami, dobljenimi iz referenčne raztopine (4.11). S črnim svinčnikom označite meje pasov vzdolž roba fluorescence (glej ploščo za tankoplastno kromatografijo na sliki 1).

S kovinsko žličko odstrgajte silikagel na označeni površini. Odstranjen, v fin prah zdrobljeni material vnesite v filtrirni lij (3.4). Dodajte 10 ml vročega etilacetata (4.10), s kovinsko žličko previdno zmešajte in (po potrebi v vakuumu) filtrirajte, tako da filtrat zberete v erlenmajerici (3.5), ki je pritrjena na filtrirni lij.

Ostanek v erlenmajerici trikrat izperite z etilnim etrom (4.3) (vsakokrat približno z 10 ml), tako da zberete filtrat v isti erlenmajerici, ki je pritrjena na lij. Odparite filtrat do prostornine 4 do 5 ml, prenesite preostanek raztopine v predhodno stehtano 10-ml epruveto (3.6), odparite do suhega z rahlim segrevanjem v blagem toku dušika, ponovno dolijte nekaj kapelj acetona (4.6) in spet odparite do suhega. Ostanek v epruveti je sestavljen iz sterolnih in triterpenskih dialkoholnih ali alkoholnih in triterpenskih dialkoholnih frakcij.

6.   LOČEVANJE ALKOHOLNIH FRAKCIJ S HPLC

Neumiljiva snov, pridobljena v delu 1, se raztopi v 3 ml mobilne faze (4.14); filtrirajte raztopino s filtrom za brizgalke (3.10) in shranite.

Vbrizgajte 200 μL filtrirane neumiljive raztopine v HPLC (3.8).

Izvedite ločevanje s HPLC pri 0,8 ml/min, ne upoštevajte eluata prvih 5 minut in zberite v 25-ml erlenmajericah (3.11) med 5. in 10. minuto eluat za alifatske in triterpenske alkohole ter med 11. in 25. minuto eluat za sterole ter eritrodiole in uvaole (opomba 5).

Ločevanje se lahko spremlja z UV-detektorjem pri valovni dolžini 210 nm ali z detektorjem lomnega količnika (glej sliko 6).

Frakcije se odparijo do suhega in pripravijo za kromatografsko analizo.

Opomba 5:

Previdno nadzorujte tlak črpalke HPLC, saj ga lahko etilni eter poveča; prilagodite pretok tako, da bo tlak pod nadzorom.

DEL 3

ANALIZA FRAKCIJ ALKOHOLNIH SPOJIN S PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1.   PODROČJE UPORABE

Ta del vsebuje splošne smernice za uporabo kapilarne kolonske plinske kromatografije pri določitvi kakovostne in količinske sestave alkoholnih spojin, izoliranih v skladu z metodo iz dela 2 te metode.

2.   PRINCIP

Frakcije, zbrane iz neumiljivih snovi z uporabo TLC ali HPLC, se derivatizirajo v trimetilsililne etre in analizirajo s kapilarno kolonsko plinsko kromatografijo z vbrizgavanjem z deljenjem vzorca in s plamensko-ionizacijskim detektorjem.

3.   OPREMA

Običajna laboratorijska oprema in zlasti:

3.1	10-ml epruveta s koničnim dnom in steklenim zamaškom.

3.2

Plinski kromatograf, primeren za uporabo s kapilarno kolono, s sistemom za vbrizgavanje z deljenjem vzorca, ki ga sestavljajo: 3.2.1 termostatirana komora za kolone, ki lahko ohranja želeno temperaturo do ± 1 °C natančno; 3.2.2 temperaturno nastavljiv injektor z uparjalnim elementom iz persilaniziranega stekla in sistemom za vbrizgavanje z deljenjem vzorca; 3.2.3 plamensko-ionizacijski detektor; 3.2.4 sistem za zajemanje podatkov, ki je primeren za uporabo s plamensko-ionizacijskim detektorjem (3.10.3) in omogoča ročno integracijo.

3.3	Kvarčna kapilarna kolona dolžine 20 do 30 m, notranjega premera 0,25 do 0,32 mm, pokrita s 5 % difenil- in 95 % dimetilpolisiloksana (stacionarna faza SE-52 ali SE-54 ali podobno) enakomerne debeline med 0,10 in 0,30 μm.

3.4	10-μl mikrobrizgalka za plinsko kromatografijo z nesnemljivo iglo, primerno za vbrizgavanje z deljenjem vzorca.

4.   REAGENTI

4.1	Brezvodni piridin kromatografske čistoče.

4.2	Heksametil disilazan čistoče za analizo.

4.3	Trimetilklorosilan čistoče za analizo.

4.4	Vzročne raztopine sterolnih trimetilsililnih etrov. Pripravite jih tik pred uporabo iz sterolov in eritrodiola iz olj, ki jih vsebujejo.

4.5	Standardne raztopine trimetilsililnih etrov alifatskih alkoholov od C20 do C28. Pripravijo se lahko iz mešanic čistih alkoholov, ko so potrebne.

4.6	Nosilni plin: vodik ali helij plinskokromatografske čistoče.

4.7	Pomožni plini: vodik, helij, dušik in zrak plinskokromatografske čistoče.

4.8	Reagent za sililiranje, sestavljen iz mešanice piridina, heksametildisilizana in trimetilklorosilana v razmerju 9: 3: 1 (V/V/V).

4.9	N-heksan kromatografske čistoče.

5.   PRIPRAVA TRIMETILSILILNIH ETROV

Reagent za sililiranje (4.8) (opomba 6), v razmerju 50 μl za vsak miligram alkoholne spojine, dodajte v epruveto (3.1), ki vsebuje frakcijo alkoholne spojine, tako da se izognete kakršnemu koli vnosu vlage (opomba 7).

Opomba 6:

Raztopine, pripravljene za uporabo, se dobijo v prodaji. Na voljo so tudi drugi reagenti za sililiranje, kot je na primer bis-trimetilsilil trifluoroacetamid + 1-odstoten trimetilklorosilan, ki ga je treba razredčiti z enako količino brezvodnega piridina. Piridin se lahko zamenja z enako količino acetonitrila.

Opomba 7:

Rahla opalescenca, ki lahko nastane, je normalna in ne povzroča nobenih nepravilnost. Tvorjenje belega flokulata ali pojav rožnate obarvanosti sta znaka prisotnosti vlage ali pokvarjenosti reagenta. V takem primeru je treba preskus ponoviti (le če se uporabi heksametildisilizan/trimetilklorosilan).

Zamašite epruveto (3.1) in jo previdno pretresite (ne da bi jo prevračali), dokler niso sestavine popolnoma raztopljene. Pustite jo pri sobni temperaturi najmanj 15 minut, nato pa nekaj minut centrifugirajte. Prozorna raztopina je pripravljena za plinskokromatografsko analizo.

6.   PLINSKOKROMATOGRAFSKA ANALIZA

6.1   Predhodni postopki, kondicioniranje kapilarne kolone

Kolono (3.3) pritrdite na plinski kromatograf, in sicer vstopni del na injektor z deljenjem vzorca, izhodnega pa na detektor.

Opravite splošne preglede plinskega kromatografa (tesnjenje tokokroga plinov, učinkovitost detektorja, učinkovitost sistema za vbrizgavanje z deljenjem vzorca in sistema beleženja itd.).

Če kolono uporabljate prvič, je priporočljivo, da jo kondicionirate, in sicer tako, da skozi kapilarno kolono spustite blag tok plina, nato pa vključite plinski kromatograf in začnete postopno segrevanje do temperature najmanj 20 °C nad delovno temperaturo (opomba 8). To temperaturo vzdržujte najmanj dve uri, nato pa vzpostavite delovne pogoje (nastavitev pretoka plina in deljenja vzorca, vžig plamena, priključitev na računalniški sistem, prilagoditev temperature kolone, detektorja in injektorja itd.) in beležite signal z občutljivostjo, ki je najmanj dvakrat večja od tiste, ki je predvidena za analize. Potek bazne linije mora biti linearen, brez kakršnih koli vrhov, in ne sme imeti odklona. Negativen premočrtni odklon pomeni slabo tesnjenje med kolono in instrumentom, pozitiven odklon pa slabo kondicionirano kolono.

Opomba 8:

Temperatura kondicioniranja mora vedno biti najmanj 20 °C nižja od najvišje temperature, določene za uporabljeno stacionarno fazo.

6.2   Delovni pogoji

Optimizirajte program temperature in pretok nosilnega plina tako, da dobite kromatograme, podobne tistim s slik 3 do 6.

Preskušeni so bili naslednji parametri, ki so se izkazali kot uporabni:

6.2.1   Alifatski alkoholi

Program peči	180 °C (8 min.) → 260 °C (pri 5 °C/min.) → 260 °C (15 min.)
Temperatura injektorja	280 °C
Temperatura detektorja	290 °C
Linearna hitrost nosilnega plina	helij (20 do 30 cm/s); vodik 30 do 50 cm/s)
Delilno razmerje	1:50 do 1:100
Vbrizgana količina	0,5 do 1 μl raztopine TMSE

6.2.2   Steroli in triterpenski dialkoholi

Program peči	260 ± 5 °C, izotermična
Temperatura injektorja	280–300 °C
Temperatura detektorja	280–300 °C
Linearna hitrost nosilnega plina	helij (20 do 30 cm/s); vodik 30 do 50 cm/s)
Delilno razmerje	1:50 do 1:100
Vbrizgana količina	0,5 do 1 μl raztopine TMSE

Ti pogoji se lahko spremenijo glede na značilnosti kolone in plinskega kromatografa, tako da se dobijo kromatogrami, ki izpolnjujejo naslednje zahteve:

—	retenzijski čas alkohola C26 je 18 ± 5 minut;

—	vrh alkohola C22 je 80 ± 20 % vrednosti celotne skale za oljčno olje in 40 ± 20 % vrednosti celotne skale za olje iz oljčnih tropin;

—	retenzijski čas vrha β-sitosterola bi moral biti 20 ± 5 minut;

—	vrh za kampesterol bi moral biti: za oljčno olje (povprečna vsebnost 3 %) 20 ± 5 % celotne skale;

—

vsi prisotni steroli morajo biti ločeni. Poleg tega, da so ločeni, morajo biti vrhovi tudi popolnoma razdvojeni, tj. signal vrha se mora pred začetkom novega vrha vrniti na bazno linijo. Nepopolna resolucija je sprejemljiva pod pogojem, da se vrh pri TRR 1,02 (sitostanol) lahko količinsko opredeli pravokotnico.

6.3   Analizni postopek

Z 10 μl mikrobrizgalko (3.4) odmerite 1 μl heksana, 0,5 μl zraka in 0,5 do 1 μl vzorčne raztopine. Dvignite bat mikrobrizgalke, tako da se igla izprazni. Iglo potisnite skozi membrano injektorja in po eni do dveh sekundah raztopino hitro vbrizgajte in potem po približno petih sekundah iglo počasi izvlecite. Uporabi se lahko tudi avtomatski injektor.

Beležite, dokler TMSE ustreznih prisotnih alkoholnih spojin ne eluirajo popolnoma. Bazna linija mora še naprej izpolnjevati zahteve za ustrezne delovne pogoje (6.2.1 ali 6.2.2).

6.4   Identifikacija vrhov

Identificirajte posamezne vrhove na podlagi retenzijskih časov in s primerjavo z mešanico alifatskih in triterpenskih alkoholnih ali sterolnih in triterpenskih dialkoholnih TMSE, analiziranih v enakih pogojih. Kromatogram frakcij alifatskih in triterpenskih alkoholov je prikazan na sliki 3, ustrezni kromatogrami za sterole in triterpenske dialkohole pa so prikazani na sliki 2.

Alifatski alkoholi eluirajo v naslednjem zaporedju: C20-ol (I.S.), C22-ol, C23-ol, C24-ol, C25-ol, C26-ol, C27-ol in C28-ol.

Steroli in triterpenski dialkoholi eluirajo v naslednjem zaporedju: holesterol, brasikasterol, ergosterol, 24-metilen holesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, klerosterol, β-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, eritrodiol in uvaol.

6.5   Kvantitativna ocena

Območja vrhov 1-eikozanola in alifatskih alkoholov C22, C24, C26 in C28 se izračunajo s sistemom za zajemanje podatkov. Za odzivni faktor 1-eikozanola je treba šteti, da je enak 1.

Z računalniškim sistemom izračunajte površine vrhov za α-holestanol ter sterole in triterpenske dialkohole. Ne upoštevajte vrhov za tiste spojine, ki niso vključene v tabelo 1 (ergosterol se ne računa). Za odzivni faktor α-holestanola je treba šteti, da je enak 1.

Izračunajte koncentracijo vsake posamezne alkoholne spojine v mg/kg maščobe:

pri čemer:

Ax	=	površina vrha za alkoholno spojino x, izračunana z računalniškim sistemom;
As	=	površina vrha za 1-eikozanol/α-holestanol, izračunana z računalniškim sistemom;
ms	=	masa dodanega 1-eikozanola/α-holestanola, v miligramih;
m	=	masa vzorca, uporabljenega za določanje, v gramih.

7.   IZRAŽANJE REZULTATOV

Zabeležite posamezne koncentracije alifatskih in triterpenskih alkoholov kot mg/kg maščobe in njihovo vsoto kot „skupno vsebnost alifatskih alkoholov“. Skupna vsebnost je vsota C22, C24, C26 in C28.

Sestavo vsake posamezne alkoholne spojine bi bilo treba izraziti na eno decimalno mesto natančno.

Skupno koncentracijo sterola je treba izraziti brez decimalk.

Izračunajte delež za vsak posamezni sterol iz razmerja med ustrezno površino vrha in površino vseh vrhov za sterol:

pri čemer:

Ax	=	površina vrha za sterol x;
ΣA	=	površina vseh vrhov za sterol.

Navidezni β-sitosterol: Δ5,23-stigmastadienol + klerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5,24-stigmastadienol.

Izračunajte delež eritrodiola in uvaola:

pri čemer:

AEr	=	površina vrha za eritrodiol, izračunana z računalniškim sistemom;
AUv	=	površina vrha za uvaol, izračunana z računalniškim sistemom;
Σ AT	=	površina vseh vrhov za sterol + eritrodiol + uvaol, izračunana z računalniškim sistemom.

Poleg izračuna relativnega deleža posameznih sterolov in triterpenskih dialkoholov ter skupne koncentracije sterolov je treba izračunati koncentracijo eritrodiola in uvaola ter njuno vsoto v mg/kg maščobe po naslednjih enačbah:

pri čemer:

AEr	=	površina vrha za eritrodiol, izračunana z računalniškim sistemom;
AUv	=	površina vrha za uvaol, izračunana z računalniškim sistemom;
As	=	površina vrha za α-holestanol, izračunana z računalniškim sistemom;
ms	=	masa dodanega α-holestanola, v miligramih;
m	=	masa vzorca, uporabljenega za določanje, v gramih.

Dodatek

1 Ogljikovodiki 2 α-tokoferol 3 Prenoli 4 Triterpenski alkoholi 5 Alifatski alkoholi 6 Metilsteroli 7 Steroli 8 Triterpenski dialkoholi

Slika 1 – TLC neumiljive frakcije iz olja iz oljčnih tropin, eluirane dvakrat s heksanom:dietil etrom (65:35), razvite s SSO4H2 (50 %) in segrete. Pasovi, s katerih je treba odstrgati silikagel, so v pravokotniku; 1 so pasovi za alifatske alkohole in 2 so pasovi za sterole in triterpenske dialkohole.

Tabela I – Relativni retenzijski časi sterolov

Vrh	Identifikacija		Relativni retenzijski čas
			Kolona SE 54	Kolona SE 52
1	Holesterol	Δ-5-holesten-3β-ol	0,67	0,63
2	Holestanol	5α-holestan-3β-ol	0,68	0,64
3	Brasikasterol	[24S]-24-metil-Δ-5,22-holestadien-3β-ol	0,73	0,71
*	Ergosterol	[24S]-24-metil-Δ-5,7,22 holestatrien-3β-ol	0,78	0,76
4	24-metilen-holesterol	24-metilen-Δ-5,24-holestadien-3β-o1	0,82	0,80
5	Kampesterol	(24R)-24-metil-Δ-5-holesten-3β-ol	0,83	0,81
6	Kampestanol	(24R)-24-metil-holestan-3β-ol	0,85	0,82
7	Stigmasterol	(24S)-24-etil-Δ-5,22-holestadien-3β-ol	0,88	0,87
8	Δ-7-kampesterol	(24R)-24-metil-Δ-7-holesten-3β-ol	0,93	0,92
9	Δ-5,23-stigmastadienol	(24R,S)-24-etil-Δ-5,23-hoIestadien-3β-ol	0,95	0,95
10	Klerosterol	(24S)-24-etil-Δ-5,25-holestadien-3β-ol	0,96	0,96
11	β-sitosterol	(24R)-24-etil-Δ-5-holesten-3β-ol	1,00	1,00
12	Sitostanol	24-etil-holestan-3β-ol	1,02	1,02
13	Δ-5-avenasterol	(24Z)-24-etiliden-Δ-holesten-3β-ol	1,03	1,03
14	Δ-5,24-stigmastadienol	(24R,S)-24-etil-Δ-5,24-holestadien-3β-ol	1,08	1,08
15	Δ-7-stigmastenol	(24R,S)-24-etil-Δ-7-holesten-3β-ol	1,12	1,12
16	Δ-7-avenasterol	(24Z)-24-etiliden-Δ-7-holesten-3β-ol	1,16	1,16
17	Eitrodiol	5α-olean-12-en-3β,28-diol	1,41	1,41
18	Uvaol	Δ12-ursen-3β,28-diol	1,52	1,52

Slika 2 - Kromatografski profil GC-FID sterola in triterpenskih dialkoholov iz rafiniranega oljčnega olja. (1) holesterol, (2) α-holestanol (I.S.), (3) 24-metilenholesterol, (4) kampesterol, (5) kampestanol, (6) stigmasterol, (7) Δ5,23-stigmastadienol, (8) klerosterol, (9) β-sitosterol, (10) sitostanol, (11) Δ5-avenasterol, (12) Δ5,24-stigmastadienol, (13) Δ7-stigmastenol, (14) Δ7-avenasterol, (15) eritrodiol, (16) uvaol.

Slika 3 - Kromatografski profil GC-FID sterola in triterpenskih dialkoholov iz lampantnega oljčnega olja. (1) holesterol, (2) α-holestanol (I.S.), (3) brasikasterol, (4) 24-metilenholesterol, (5) kampesterol, (6) kampestanol, (7) stigmasterol, (8) Δ7-kampesterol, (9) Δ5,23-stigmastadienol, (10) klerosterol, (11) β-sitosterol, (12) sitostanol, (13) Δ5-avenasterol, (14) Δ5,24-stigmastadienol, (15) Δ7-stigmastenol, (16) Δ7-avenasterol, (17) eritrodiol, (18) uvaol.

Slika 4 - Kromatografski profil GC-FID alifatskih alkoholov in triterpenskih alkoholov iz oljčnega olja. (I.S.) C20-ol, (1) C22-ol, (2) C24-ol, (3) C26-ol, (4) C28-ol, (5) triterpenski alkoholi.

Slika 5 - Kromatografski profil GC-FID alifatskih alkoholov in triterpenskih alkoholov iz rafiniranega oljčnega olja in oljčnega olja, dobljenega po drugem centrifugiranju. (I.S.) C20-ol, (1) C22-ol, (2) C24-ol, (3) C26-ol, (4) C28-ol, (5) triterpenski alkoholi.

Slika 6 - Kromatogram HPLC neumiljive frakcije oljčnega olja, ločene s HPLC z uporabo UV-detektorja. (1) Alifatski in triterpenski alkoholi; (2) steroli in triterpenski dialkoholi.