“BIJLAGEN

INHOUDSOPGAVE

Bijlage I	Kenmerken van olijfolie
Bijlage I bis	Bemonstering van olijfolie of olie uit perskoeken van olijven die worden geleverd in onmiddellijke verpakkingen
Bijlage I ter	Stroomschema om na te gaan of een monster olijfolie overeenstemt met de opgegeven categorie
Bijlage II	Bepaling van vrije vetzuren, koude methode
Bijlage III	Bepaling van het peroxidegetal
Bijlage IV	Bepaling van het wasgehalte met behulp van gaschromatografie met capillaire kolommen
Bijlage VII	Bepaling van het percentage glycerol-2-monopalmitaat
Bijlage IX	Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied
Bijlage X	Gaschromatografische bepaling van methylesters van vetzuren
Bijlage XI	Bepaling van het gehalte aan gehalogeneerde oplosmiddelen
Bijlage XII	Methode van de Internationale Olijfolieraad voor de organoleptische beoordeling van olijfolie van de eerste persing
Bijlage XV	Bepaling van het oliegehalte van de afvallen van olijven
Bijlage XVI	Bepaling van het joodgetal
Bijlage XVII	Methode voor de bepaling van stigmastadiënen in plantaardige oliën
Bijlage XVIII	Bepaling van het verschil tussen het werkelijke en het theoretische gehalte aan triacylglycerolen met ECN 42
Bijlage XIX	Bepaling van de sterolsamenstelling en het sterolgehalte en van de alcoholische verbindingen met behulp van capillaire gaschromatografie
Bijlage XX	Methode voor de bepaling van het gehalte aan wassen, methylesters van vetzuren en ethylesters van vetzuren met behulp van capillaire gaschromatografie
Bijlage XXI	Resultaten van de conformiteitscontroles van olijfoliën als bedoeld in artikel 8, lid 2

“BIJLAGE I

KENMERKEN VAN OLIJFOLIE

Kwaliteitskenmerken

Ethylesters van vetzuren (mg/kg)		≤ 35	—	—	—	—	—	—	—
Organoleptische beoordeling	Mediaan “fruitig” (Mf)	Mf > 0,0	Mf > 0,0	—	—	—	—	—	—
	Mediaan voor de gebreken (Md) (*)	Md = 0,0	Md ≤ 3,5	Md > 3,5 (1)
Delta-K		≤ 0,01	≤ 0,01	—	≤ 0,16	≤ 0,15	—	≤ 0,20	≤ 0,18
K268 of K270		≤ 0,22	≤ 0,25	—	≤ 1,25	≤ 1,15	—	≤ 2,00	≤ 1,70
K232		≤ 2,50	≤ 2,60	—	—	—	—	—	—
Peroxidegetal (mEq O2/kg)		≤ 20,0	≤ 20,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0
Zuurgraad (%) (*)		≤ 0,80	≤ 2,0	> 2,0	≤ 0,30	≤ 1,00	—	≤ 0,30	≤ 1,00
Categorie		1. Extra olijfolie van de eerste persing	2. Olijfolie van de eerste persing	3. Olijfolie voor verlichting	4. Geraffineerde olijfolie	5. Olijfolie bestaande uit geraffineerde olijfolie en olijfolie van de eerste persing	6. Ruwe olie uit perskoeken van olijven	7. Geraffineerde olie uit perskoeken van olijven	8. Olie uit perskoeken van olijven

Zuiverheidskenmerken

Glycerol-2-monopalmitaat (%)

≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14,00 %

≤ 1,0 als % palmitinezuur totaal > 14,00 %

≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14,00 %

≤ 1,0 als % palmitinezuur totaal > 14,00 %

≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14,00 %

≤ 1,1 als % palmitinezuur totaal > 14,00 %

≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14,00 %

≤ 1,1 als % palmitinezuur totaal > 14,00 %

≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14,00 %

≤ 1,0 als % palmitinezuur totaal > 14,00 %

≤ 1,4

≤ 1,4

≤ 1,2

Verschil: ECN42 (HPLC) en ECN42 (theoretische berekening)

≤ |0,20|

≤ |0,20|

≤ |0,30|

≤ |0,30|

≤ |0,30|

≤ |0,60|

≤ |0,50|

≤ |0,50|

Stigmastadiënen (mg/kg) (3)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,50

—

—

—

—

—

Totaal translinolzuur en translinoleenzuurisomeren (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,10

≤ 0,35

≤ 0,35

Totaal transoliezuurisomeren (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,40

Vetzuursamenstelling (2)

Lignocerinezuur (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

Beheenzuur (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,30

Eicosaanzuur (%)

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

Arachidezuur (%)

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

Linoleenzuur (%)

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

Myristinezuur (%)

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

Categorie

1. Extra olijfolie van de eerste persing

2. Olijfolie van de eerste persing

3. Olijfolie voor verlichting

4. Geraffineerde olijfolie

5. Olijfolie bestaande uit geraffineerde olijfolie en olijfolie van de eerste persing

6. Ruwe olie uit perskoeken van olijven

7. Geraffineerde olie uit perskoeken van olijven

8. Olie uit perskoeken van olijven

Was (mg/kg) (**)		C42 + C44 + C46 ≤ 150	C42 + C44 + C46 ≤ 150	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (6)	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (7)	C40 + C42 + C44 + C46 > 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350
Erytrodiol en uavol (%) (**)		≤ 4,5	≤ 4,5	≤ 4,5 (6)	≤ 4,5	≤ 4,5	> 4,5 (7)	> 4,5	> 4,5
Totaal sterolen (mg/kg)		≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 2 500	≥ 1 800	≥ 1 600
Sterolsamenstelling	Delta-7-stigmastenol (4) (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
	App β-sitosterol (5) (%)	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0
	Stigmasterol (%)	< Camp.	< Camp.	-	< Camp.	< Camp.	-	< Camp.	< Camp.
	Campesterol (4) (%)	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0
	Brassicasterol (%)	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,2	≤ 0,2	≤ 0,2
	Cholesterol (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
Categorie		1. Extra olijfolie van de eerste persing	2. Olijfolie van de eerste persing	3. Olijfolie voor verlichting	4. Geraffineerde olijfolie	5. Olijfolie bestaande uit geraffineerde olijfolie en olijfolie van de eerste persing	6. Ruwe olie uit perskoeken van olijven	7. Geraffineerde olie uit perskoeken van olijven	8. Olie uit perskoeken van olijven

Opmerkingen:

(a)	De resultaten van de analyses moeten worden opgegeven met hetzelfde aantal decimale cijfers als in de normen voor elk kenmerk. De laatste significante decimaal wordt naar boven afgerond als de volgende decimaal hoger is dan 4.

(b)	Om olie in een andere categorie in te delen of niet-conform in de zin van deze verordening te verklaren, volstaat het dat een van de kenmerken niet aan de vastgestelde normen beantwoordt.

(c)	Voor olijfolie voor verlichting mogen beide met een asterisk (*) aangegeven kwaliteitskenmerken tegelijkertijd afwijken van de voor die categorie vastgestelde grenswaarden.

(d)

Bij de kenmerken met dubbele asterisk (**) geldt voor ruwe olie uit perskoeken van olijven dat beide relevante grenswaarden tegelijkertijd mogen afwijken van de vermelde waarden. Voor olie uit perskoeken van olijven en geraffineerde olie uit perskoeken van olijven mag een van de relevante grenswaarden afwijken van de vermelde waarden.

Aanhangsel

Beslissingsschema's

Beslissingssschema betreffende campesterol voor olijfolie van de eerste persing en extra olijfolie van de eerste persing:

De andere parameters moeten aan de in deze verordening vastgestelde grenswaarden voldoen.

Beslissingsschema betreffende delta-7-stigmastenol voor:

—	Olijfolie van de eerste persing en extra olijfolie van de eerste persing

De andere parameters moeten aan de in deze verordening vastgestelde grenswaarden voldoen.

—	Olie uit perskoeken van olijven (ruw en geraffineerd)

De andere parameters moeten aan de in deze verordening vastgestelde grenswaarden voldoen.

“BIJLAGE I ter

STROOMSCHEMA OM NA TE GAAN OF EEN MONSTER OLIJFOLIE OVEREENSTEMT MET DE OPGEGEVEN CATEGORIE

Algemene tabel

Tabel 1 — extra olijfolie van de eerste persing — kwaliteitscriteria

Tabel 2 — olijfolie van de eerste persing — kwaliteitscriteria

Tabel 3 — extra olijfolie van de eerste persing en olijfolie van de eerste persing — zuiverheidscriteria

Tabel 4 — olijfolie voor verlichting — zuiverheidscriteria

Tabel 5 — geraffineerde olijfolie — kwaliteitscriteria

Tabel 6 — olijfolie (bestaande uit een mengsel van geraffineerde olijfolie en olijfolie van de eerste persing) — kwaliteitscriteria

Tabel 7 — geraffineerde olijfolie en olijfolie die bestaat uit een mengsel van geraffineerde olijfolie en olijfolie van de eerste persing — zuiverheidscriteria

Tabel 8 — ruwe olie uit perskoeken van olijven — zuiverheidscriteria

Tabel 9 — geraffineerde olie uit perskoeken van olijven — kwaliteitscriteria

Tabel 10 — olie uit perskoeken van olijven — kwaliteitscriteria

Tabel 11 — geraffineerde olie uit perskoeken van olijven en olie uit perskoeken van olijven — zuiverheidscriteria

“BIJLAGE XIX

BEPALING VAN DE STEROLSAMENSTELLING EN HET STEROLGEHALTE EN VAN DE ALCOHOLISCHE VERBINDINGEN MET BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE

1.   TOEPASSINGSGEBIED

Deze methode beschrijft een werkwijze voor de bepaling van het individuele en het totale gehalte aan alcoholische verbindingen van olijfolie en olie uit perskoeken van olijven en van mengsels van deze twee soorten olie.

Tot de alcoholische verbindingen van olijfolie en olie uit perskoeken van olijven behoren alifatische alcoholen, sterolen en triterpeendialcoholen.

2.   PRINCIPE

De oliën, waaraan α-cholestanol en 1-eicosanol als interne standaarden zijn toegevoegd, worden verzeept met ethanolische kaliumhydroxideoplossing, waarna de onverzeepbare bestanddelen worden geëxtraheerd met ethylether.

De verschillende fracties van de alcoholische verbindingen worden van de onverzeepbare bestanddelen gescheiden met behulp van dunnelaagchromatografie op basische platen met silicagel (referentiemethode) of HPLC met een silicagelkolom. De fractie die na de scheiding op silicagel is opgevangen, wordt omgezet in trimethylsilylethers en via gaschromatografie met capillaire kolommen geanalyseerd.

DEEL 1

BEREIDING VAN DE ONVERZEEPBARE BESTANDDELEN

1.   TOEPASSINGSGEBIED

Dit deel omvat een beschrijving van de bereiding en de extractie van de onverzeepbare bestanddelen. Het heeft betrekking op de bereiding en de extractie van de onverzeepbare bestanddelen van olijfolie en olie uit perskoeken van olijven.

2.   PRINCIPE

Een proefeenheid wordt verzeept door onder terugvloeikoeling te koken met een ethanolische kaliumhydroxideoplossing. De onverzeepbare bestanddelen worden geëxtraheerd met di-ethylether.

3.   APPARATUUR

De gebruikelijke laboratoriumuitrusting en in het bijzonder het volgende:

3.1.	Rondbodemkolf van 250 ml, voorzien van een refluxkoeler met slijpstukken.

3.2.	Scheitrechter van 500 ml.

3.3.	Kolven van 250 ml.

3.4.	Micro-injectiespuiten van 100 μL en 500 μL.

3.5.	Filterkroes G3 (porositeit 15-40 μm) met een diameter van ongeveer 2 cm en een hoogte van ongeveer 5 cm, geschikt om onder vacuüm te filtreren en voorzien van een slijpstuk 12/21 (uitwendig).

3.6.	Erlenmeyer van 50 ml, voorzien van een slijpstuk 12/21 (inwendig), waarmee deze op de filterkroes kan worden aangesloten (3.5).

3.7.	Conisch afgeronde centrifugebuis van 10 ml, afsluitbaar.

3.8.	Met calciumchloride gevulde exsiccator.

4.   REAGENTIA

4.1.	Kaliumhydroxideoplossing met een minimumgehalte van 85 %.

4.2.	Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 2 M in ethanol. Los 130 g kaliumhydroxide (4.1) onder koeling op in 200 ml gedistilleerd water en vul aan tot 1 liter met ethanol (4.7). Bewaar de oplossing maximaal twee dagen in goed afgesloten flessen van donker glas.

4.3.	Ethylether, p.a.

4.4.	Natriumsulfaat, p.a., watervrij.

4.5.	Aceton, voor chromatografische doeleinden.

4.6.	Ethylether, voor chromatografische doeleinden.

4.7.	Ethanol, p.a.

4.8.	Ethylacetaat, p.a.

4.9.	Interne standaard: α-cholestanol, zuiverheid meer dan 99 % (zuiverheid moet worden gecontroleerd door gaschromatografische analyse).

4.10.

α-cholestanoloplossing (interne standaard), 0,2 % (m/v) oplossing in ethylacetaat (4.8).

4.11.

Fenolftaleïne-oplossing, 10 g/l in ethanol (4.7).

4.12.

1-eicosanol, 0,1 % (m/v) oplossing in ethylacetaat (interne standaard).

5.   WERKWIJZE

Breng in de kolf van 250 ml (3.1) met behulp van de injectiespuit van 500 μl (3.4) een hoeveelheid α-cholestanoloplossing (interne standaard) (4.10) en een hoeveelheid 1-eicosanol (4.12) in die een hoeveelheid cholestanol en eicosanol bevat die overeenkomt met ongeveer 10 % van het sterol- en het alcoholgehalte van het monster. Bijvoorbeeld: voeg voor een monster olijfolie van 5 g 500 μl α-cholestanoloplossing (4.10) en 250 μl 1-eicosanoloplossing (4.12) toe. Voor olie uit perskoeken van olijven: voeg 1 500 μl α-cholestanoloplossing (4.10) en 1 500 μl 1-eicosanoloplossing (4.12) toe. Damp met behulp van een lichte stikstofstroom droog in een warmwaterbad. Weeg na afkoeling van de kolf in dezelfde kolf 5,00 ± 0,01 g van het gedroogde gefiltreerde monster af.

Opmerking 1:

Dierlijke of plantaardige oliën en vetten die een aanmerkelijke hoeveelheid cholesterol bevatten, kunnen een piek vertonen met dezelfde retentietijd als cholestanol. Is dit het geval, dan moet de sterolfractie tevens zonder interne standaard worden geanalyseerd.

Voeg 50 ml 2 M ethanolische kaliumhydroxideoplossing (4.2) met wat puimsteen toe, bevestig de refluxkoeler en verhit tot zachtjes koken tot de verzeping heeft plaatsgevonden (de oplossing wordt helder). Verhit verder gedurende 20 minuten, voeg dan 50 ml gedistilleerd water toe via de bovenkant van de koeler, verwijder de koeler en laat de kolf afkoelen tot ongeveer 30 °C.

Breng de inhoud van de kolf kwantitatief over in een 500 ml scheitrechter (3.2), met behulp van meerdere porties gedistilleerd water (50 ml). Voeg ongeveer 80 ml ethylether (4.6) toe, schud krachtig gedurende ongeveer 60 seconden, waarbij u regelmatig de druk laat ontsnappen door de scheitrechter om te keren en de plugkraan te openen. Laat de oplossing staan tot de twee fasen volledig gescheiden zijn (opmerking 2). Laat de zeepoplossing daarna zo volledig mogelijk in een tweede scheitrechter lopen. Herhaal de extractie van de water-alcohollaag twee keer op dezelfde manier en gebruik hierbij telkens 60-70 ml ethylether (4.6).

Opmerking 2:

Eventuele emulsies kunnen worden vernietigd door kleine hoeveelheden ethanol (4.7) toe te voegen.

Verzamel de drie etherextracten in een scheitrechter met 50 ml water. Ga verder met wassen met water (50 ml) tot het waswater niet meer roze kleurt na toevoeging van een druppel fenolftaleïne-oplossing (4.11). Verwijder het waswater en filtreer over watervrij natriumsulfaat (4.4) in een van tevoren gewogen kolf van 250 ml, was de trechter en het filter na met kleine hoeveelheden ethylether (4.6).

Verdamp het oplosmiddel in een rotatieverdamper bij 30 °C onder vacuüm. Voeg 5 ml aceton (4.5) toe en verwijder het vluchtige oplosmiddel volledig in een lichte stikstofstroom. Droog het residu in de oven bij 103 ± 2 °C gedurende 15 min. Laat afkoelen in de exsiccatoren en weeg tot de dichtstbijzijnde 0,1 mg.

DEEL 2

SCHEIDING VAN DE FRACTIES VAN DE ALCOHOLISCHE VERBINDINGEN

1.   TOEPASSINGSGEBIED

De volgens deel 1 bereide onverzeepbare bestanddelen worden gefractioneerd in de verschillende alcoholische verbindingen, namelijk alifatische alcoholen, sterolen en triterpeendialcoholen (erytrodiol en uvaol).

2.   PRINCIPE

De onverzeepbare bestanddelen kunnen worden gefractioneerd met behulp van gewone dunnelaagchromatografie (referentiemethode), waarbij de platen worden ontwikkeld en de overeenkomstige banden worden afgeschraapt en geëxtraheerd. Als alternatieve scheidingsmethode kan worden gebruikgemaakt van HPLC in een silicagelkolom met een uv-detector, waarna de verschillende fracties worden opgevangen. De alifatische en triterpeenalcoholen en de sterolen en triterpeendialcoholen worden samen afgezonderd.

3.   APPARATUUR

De gebruikelijke laboratoriumuitrusting en in het bijzonder het volgende:

3.1.	Volledige uitrusting voor dunnelaagchromatografie met 20 × 20 cm glasplaten.

3.2.	Ultravioletlamp met een golflengte van 366 of 254 nm.

3.3.	Micro-injectiespuiten van 100 μL en 500 μL.

3.4.	Filterkroes G3 (porositeit 15-40 μm) met een diameter van ongeveer 2 cm en een hoogte van ongeveer 5 cm, geschikt om onder vacuüm te filtreren en voorzien van een slijpstuk 12/21 (uitwendig).

3.5.	Erlenmeyer van 50 ml, voorzien van een slijpstuk 12/21 (inwendig), waarmee deze op de filterkroes kan worden aangesloten (3.4).

3.6.	Conisch afgeronde centrifugebuis van 10 ml, afsluitbaar.

3.7.	Met calciumchloride gevulde exsiccator.

3.8.	HPLC-systeem bestaande uit: 3.8.1. Binaire pomp. 3.8.2. Manuele of automatische injector, voorzien van een injectielus van 200 μL. 3.8.3. Inline ontgasser. 3.8.4. UV-VIS- of IR-detector.

3.9.	HPLC-kolom (25 cm × 4 mm i.d.) met silicagel 60 (korrelgrootte 5 μm).

3.10.

Spuitfilter van 0,45 μm.

3.11.

Erlenmeyer van 25 ml.

4.   REAGENTIA

4.1.	Kaliumhydroxideoplossing met een minimumgehalte van 85 %.

4.2.	Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 2 M in ethanol. Los 130 g kaliumhydroxide (4.1) onder koeling op in 200 ml gedistilleerd water en vul aan tot 1 liter met ethanol (4.9). Bewaar de oplossing maximaal twee dagen in goed afgesloten flessen van donker glas.

4.3.	Ethylether, p.a.

4.4.	Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 0,2 M in ethanol. Los 13 g kaliumhydroxide (4.1) op in 20 ml gedistilleerd water en vul aan tot 1 liter met ethanol (4.9).

4.5.	Glasplaten (20 × 20 cm) gecoat met silicagel, zonder fluorescentie-indicator, met een dikte van 0,25 mm (deze zijn gebruiksklaar in de handel te verkrijgen).

4.6.	Aceton, voor chromatografische doeleinden.

4.7.	n-hexaan, voor chromatografische doeleinden.

4.8.	Ethylether, voor chromatografische doeleinden.

4.9.	Ethanol, p.a.

4.10.

Ethylacetaat, p.a.

4.11.

Dunnelaagchromatografische (TLC) referentieoplossing: cholesterol, fytosterolen, alcoholen en een 5 %-oplossing van erytrodiol in ethylacetaat (4.10).

4.12.

2,7-dichloorfluoresceïne, 0,2 % oplossing in ethanol. Deze oplossing moet licht basisch worden gemaakt door toevoeging van enkele druppels 2 M alcoholische kaliumhydroxideoplossing (4.2).

4.13.

Mengsel van n-hexaan (4.7)/ethylether (4.8) met een 65:35-verhouding (v/v).

4.14.

HLPC-mobiele fase n-hexaan (4.7)/ethylether (4.8) (1:1) (v/v).

5.   REFERENTIEMETHODE: SCHEIDING VAN DE ALCOHOLISCHE VERBINDINGEN MET BEHULP VAN DUNNELAAGCHROMATOGRAFIE (TLC) MET BASISCHE PLATEN

Bereiding van de basische platen voor dunnelaagchromatografie: dompel de silicagelplaten (4.5) gedurende 10 seconden ongeveer 4 cm in de 0,2 M ethanolische kaliumhydroxideoplossing (4.4), laat de platen gedurende twee uur in een zuurkast drogen en plaats ze ten slotte gedurende één uur in een stoof bij 100 °C.

Verwijder de platen uit de stoof en bewaar ze tot het moment van gebruik in een met calciumchloride gevulde exsiccator (3.7) (op deze manier bereide platen moeten binnen 15 dagen worden gebruikt).

Breng een mengsel van hexaan/ethylether (4.13) (opmerking 3) in de ontwikkeltank, tot een hoogte van ongeveer 1 cm. Sluit de tank af met een geschikt deksel en laat hem gedurende minstens een halfuur staan op een koele plaats zodat een vloeistof-dampevenwicht kan worden bereikt. Stroken filtreerpapier, hangend in de loopvloeistof, kunnen tegen de binnenkant van de tank worden bevestigd. Dit bekort de benodigde ontwikkeltijd met ongeveer een derde en zorgt tevens voor een meer uniforme en regelmatige elutie van de componenten.

Opmerking 3:

Bij elke bepaling dient de loopvloeistof te worden ververst om volkomen reproduceerbare elutiecondities te verwezenlijken. Als alternatief kan een mengsel van n-hexaan/ethylether, 50:50 (v/v), worden gebruikt.

Bereid een oplossing van ongeveer 5 % van de volgens deel 1 bereide onverzeepbare bestanddelen in ethylacetaat (4.10) en breng hiervan aan de onderkant van de chromatografische plaat (2 cm) (4.5) met behulp van de 100 μl micro-injectiespuit (3.3) 0,3 ml aan in een dunne uniforme lijn. Breng op dezelfde hoogte tevens 2-3 μl aan van de referentieoplossing (4.11) zodat de sterol-, triterpeendialcohol- en alcoholbanden na de ontwikkeling kunnen worden geïdentificeerd.

Plaats de plaat in de ontwikkeltank (3.1). De omgevingstemperatuur dient te liggen tussen 15 en 20 °C (opmerking 4). Sluit de tank onmiddellijk af met het deksel en laat elueren tot het vloeistoffront tot ongeveer 1 cm van de bovenkant van de plaat is gekomen. Verwijder de plaat uit de tank en laat de loopvloeistof verdampen in een hete luchtstroom of door de plaat gedurende korte tijd in een zuurkast te zetten.

Opmerking 4:

Een hogere temperatuur kan de scheiding verergeren.

Besproei de plaat licht en uniform met de 2,7-dichloorfluoresceïneoplossing (4.12) en laat drogen. De sterol-, triterpeendialcohol- en alcoholbanden kunnen door bekijken onder een ultravioletlamp (3.2) worden geïdentificeerd aangezien deze op dezelfde hoogte liggen als de vlek van de referentieoplossing (4.11). Markeer de grenzen van de banden aan de zijkanten van de fluorescentie met een zwart potlood (zie de plaat voor dunnelaagchromatografie in afbeelding 1).

Schraap met een metalen spatel de silicagel in het gemarkeerde gebied af. Breng het afgeschraapte, fijngemaakte materiaal over in de filterkroes (3.4). Voeg 10 ml heet ethylacetaat (4.10) toe, meng zorgvuldig met de metalen spatel en filtreer, indien nodig onder vacuüm. Verzamel het filtraat in de erlenmeyer (3.5), verbonden aan de filterkroes.

Was het residu in de filterkroes driemaal met ethylether (4.3) (telkens ongeveer 10 ml), vang het filtraat op in dezelfde kolf die is verbonden aan de kroes. Damp het filtraat in tot een volume van 4-5 ml, breng de resterende oplossing over in de van tevoren gewogen 10 ml centrifugebuis (3.6), damp droog door voorzichtige verwarming in een zachte stikstofstroom, voeg enkele druppels aceton (4.6) toe, damp weer droog. Het in de centrifugebuis aanwezige materiaal bestaat uit de sterol- en triterpeendialcoholfracties of de alcohol- en triterpeenalcoholfracties.

6.   SCHEIDING VAN DE ALCOHOLFRACTIE MET BEHULP VAN HPLC

Los de volgens deel 1 verkregen onverzeepbare bestanddelen op in 3 ml van de mobiele fase (4.14), filter de oplossing met een spuitfilter (3.10) en zet opzij.

Injecteer 200 μl van de gefilterde onverzeepbare oplossing in de HPLC (3.8).

Pas HPLC-scheiding toe bij een loopsnelheid van 0,8 ml/min, gooi het eluaat van de eerste 5 minuten weg en vang het eluaat tussen 5 en 10 minuten voor alifatische en triterpeenalcoholen en tussen 11 en 25 minuten voor sterolen en erytrodiol en uavol op in erlenmeyers van 25 ml (3.11) (opmerking 5).

De scheiding kan worden gecontroleerd met een uv-detector bij een golflengte van 210 nm of een refractieve indexdetector (zie figuur 6).

De fracties worden drooggedampt en klaargemaakt voor de chromatografische analyse.

Opmerking 5:

Controleer zorgvuldig de druk van de HPLC-pomp, de ethylether kan de druk immers doen toenemen. Pas de doorloopsnelheid aan om de druk onder controle te houden.

DEEL 3

GASCHROMATOGRAFISCHE ANALYSE VAN DE FRACTIES VAN DE ALCOHOLISCHE VERBINDINGEN

1.   TOEPASSINGSGEBIED

Dit deel bevat richtsnoeren voor de kwalitatieve en kwantitatieve gaschromatografische bepaling met capillaire kolom van de alcoholische verbindingen die overeenkomstig de in deel 2 vermelde methode zijn afgezonderd.

2.   PRINCIPE

De met behulp van TLC of HPLC van de onverzeepbare bestanddelen verzamelde fracties worden gederivatiseerd tot trimethylsilylethers en via capillaire gaschromatografie met splitinjectie en een vlamionisatiedetector geanalyseerd.

3.   APPARATUUR

De gebruikelijke laboratoriumuitrusting en in het bijzonder het volgende:

3.1.	Conisch afgeronde centrifugebuis van 10 ml, afsluitbaar.

3.2.

Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom, voorzien van een splitsysteem bestaande uit: 3.2.1. Een gethermostatiseerde ruimte waarmee de kolommen op de gewenste temperatuur kunnen worden gehouden met een nauwkeurigheid van ± 1 °C; 3.2.2. een temperatuurgeregelde injectie-eenheid met een gepersilaniseerd glazen verdampingselement en splitsysteem; 3.2.3. een vlamionisatiedetector (FID); 3.2.4. een gegevensverzamelsysteem dat geschikt is voor gebruik met de FID (3.10.3), geschikt voor handmatige integratie.

3.3.	Fused-silica capillaire kolom met een lengte van 20-30 m, inwendige diameter 0,25-0,32 mm, inwendig gecoat met 5 % difenyl-95 % simethylpolysiloxaan (SE-52 of SE-54 stationaire fase of equivalent) in een uniforme dikte tussen 0,10 en 0,30 μm.

3.4.	Gaschromatografische micro-injectiespuit van 10 μl met een geharde naald voor splitinjectie.

4.   REAGENTIA

4.1.	Pyridine, watervrij, voor chromatografische doeleinden.

4.2.	Hexamethyldisilazaan, p.a.

4.3.	Trimethylchloorsilaan, p.a.

4.4.	Standaardoplossingen van steroltrimethylsilylethers. Direct vóór gebruik te bereiden uit sterolen en erytrodiol verkregen uit oliën die deze bevatten.

4.5.	Standaardoplossingen van de trimethylsilylethers van de C20-C28 alifatische alcoholen. Deze kunnen direct vóór gebruik worden bereid uit een mengsel van zuivere alcoholen.

4.6.	Draaggas: waterstof of helium, gaschromatografisch zuiver.

4.7.	Hulpgassen: waterstof, helium, stikstof en lucht, gaschromatografisch zuiver.

4.8.	Silyleringsreagens, bestaande uit een mengsel van pyridine/hexamethyldisilazaan/trimethylchloorsilaan 9:3:1 (v/v/v).

4.9.	n-hexaan, voor chromatografische doeleinden.

5.   BEREIDING VAN DE TRIMETHYLSILYLETHERS

Voeg aan de in de centrifugebuis (3.1) aanwezige alcoholische verbindingen een hoeveelheid silyleringsreagens (4.8) (opmerking 6) toe, waarbij voor elke mg alcoholische bestanddelen 50 μl wordt toegevoegd. Vermijd hierbij bevochtiging (opmerking 7).

Opmerking 6:

Deze oplossing is kant-en-klaar in de handel verkrijgbaar. Andere silyleringsreagentia zijn ook beschikbaar, zoals bijvoorbeeld bistrimethylsilyltrifluoaceetamide + 1 % trimethylchloorsilaan, wat moet worden verdund met een gelijk volume watervrije pyridine. Pyridine kan worden vervangen door dezelfde hoeveelheid acetonitril.

Opmerking 7:

De lichte opaalachtige weerschijn die kan worden gevormd, is normaal en veroorzaakt geen afwijking. De vorming van witte vlokken of de verschijning van een roze kleur zijn aanwijzingen voor de aanwezigheid van vocht of van veroudering van het reagens. In deze gevallen moet opnieuw worden begonnen (alleen wanneer hexamethyldisilizaan/trimethylchloorsilaan wordt gebruikt).

Sluit de centrifugebuis (3.1), schud voorzichtig (zonder de buis om te draaien) tot de verbindingen volledig zijn opgelost. Laat ten minste 15 minuten staan bij kamertemperatuur en centrifugeer enkele minuten. De heldere oplossing is gereed voor de gaschromatografische analyse.

6.   GASCHROMATOGRAFISCHE ANALYSE

6.1.   Voorbereidende werkzaamheden, conditionering van de capillaire kolom

Bevestig de kolom (3.3) in de gaschromatograaf, waarbij het inlaatstuk wordt aangesloten aan het splitsysteem en het uiteinde aan de detector.

Voer de gebruikelijke controle uit van het gaschromatografische systeem (lekken in de gasvoorziening, detectorefficiëntie, efficiëntie van het splitsysteem en van het recordersysteem enz.).

Indien de kolom voor de eerste keer wordt gebruikt, is het aangeraden deze te conditioneren. Laat een kleine gasstroom door de kolom gaan, zet de gaschromatografische eenheid aan en verwarm geleidelijk tot een temperatuur van ten minste 20 °C boven de bij de analyse gebruikelijke temperatuur (opmerking 8). Houd deze temperatuur aan gedurende ten minste twee uur, stel vervolgens de hele apparatuur in gebruik (regeling van de gassnelheid en het splitsysteem, ontsteking van de vlam, aansluiting van het computersysteem, regeling van de temperatuur van de kolomruimte, de detector en de injector enz.) en registreer het signaal met een gevoeligheid die ten minste twee keer groter is dan gebruikelijk bij de analyse. De basislijn moet lineair zijn, zonder enige piek en mag niet verlopen. Een rechtlijnig negatief verloop vormt een indicatie voor lekkage bij de kolomverbindingen; een positief verloop wijst op een onvoldoende conditionering van de kolom.

Opmerking 8:

De temperatuur van het conditioneren moet altijd ten minste 20 °C lager zijn dan de maximumtemperatuur die voor de gebruikte stationaire fase is aangegeven.

6.2.   Bedrijfsomstandigheden

Optimaliseer het temperatuurprogramma en het debiet van het draaggas zodanig dat chromatogrammen worden verkregen die vergelijkbaar zijn met die in de figuren 3 tot en met 6.

De volgende parameters zijn getest en nuttig bevonden:

6.2.1.   Alifatische alcoholen

Ovenprogramma	180 °C (8 min.) → 260 °C (5 °C/min) → 260 °C (15 min.)
Injectortemperatuur	280 °C
Detectortemperatuur	290 °C
Lineaire snelheid van het draaggas	Helium (20-30 cm/s); waterstof (30-50 cm/s)
Splitverhouding	van 1:50 tot 1:100
Geïnjecteerd volume	0,5-1 μl TMSE-oplossing

6.2.2.   Sterolen en triterpeendialcoholen

Ovenprogramma	260 ± 5 °C, isothermische omstandigheden
Injectortemperatuur	280-300 °C
Detectortemperatuur	280-300 °C
Lineaire snelheid van het draaggas	Helium (20-30 cm/s); waterstof (30-50 cm/s)
Splitverhouding	van 1:50 tot 1:100
Geïnjecteerd volume	0,5-1 μl TMSE-oplossing

Deze omstandigheden kunnen worden gewijzigd, afhankelijk van de karakteristieken van de kolom en de gaschromatograaf zodat chromatogrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen:

—	De retentietijd van de C26-alcohol moet ongeveer 18 ± 5 minuten zijn.

—	De piek van de C22-alcohol moet de volgende grootte hebben: voor olijfolie 80 ± 20 % volle schaaluitslag en voor olie uit perskoeken van olijven 40 ± 20 % volle schaaluitslag.

—	De retentietijd van de ß-sitosterolpiek moet ongeveer 20 ± 5 minuten zijn.

—	De campesterolpiek moet de volgende grootte hebben: voor olijfolie (gemiddeld gehalte 3 %) 20 ± 5 % volle schaaluitslag.

—

Alle aanwezige sterolen moeten gescheiden zijn. Daarnaast moeten andere pieken volledig gescheiden zijn, dat wil zeggen dat het signaal tussen pieken volledig naar de basislijn moet terugkeren. Onvolledige scheiding kan echter getolereerd worden mits de piek met een relatieve retentietijd van 1,02 (sitostanol) met behulp van een loodlijn kan worden gekwantificeerd.

6.3.   Bepaling

Zuig in de 10 μl microinjectiespuit (3.4) 1 μl hexaan, 0,5 μl lucht en ten slotte 0,5-1,0 μl monsteroplossing. Trek de plunjer van de spuit zover uit dat de naald leeg is. Penetreer met de naald het membraan van de injector en injecteer snel na 1-2 seconden, verwijder daarna voorzichtig na ongeveer 5 seconden de naald. Er kan ook een automatische injector worden gebruikt.

Neem het chromatogram op tot de TMSE van de aanwezige overeenkomstige alcoholische verbindingen volledig zijn geëlueerd. De basislijn moet blijven voldoen aan de eisen van de overeenkomstige bedrijfsomstandigheden (6.2.1 of 6.2.2).

6.4.   Identificatie van de pieken

Identificeer de individuele pieken op basis van de retentietijden en door een vergelijking met de mengsels van TMSE van de alifatische en triterpeenalcoholen en van de sterolen en triterpeendialcoholen die onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd. In figuur 3 wordt een chromatogram van de fractie van alifatische en triterpeenalcoholen getoond en in figuur 2 worden het overeenkomstige chromatogram voor sterolen en triterpeendialcoholen getoond.

De alifatische alcoholen worden geëlueerd in de volgende volgorde: C20-ol (I.S.), C22-ol, C23-ol, C24-ol, C25-ol, C26-ol, C27-ol en C28-ol.

De sterolen en triterpeendialcoholen worden geëlueerd in de volgende volgorde: cholesterol, brassicasterol, ergosterol, 24-methyleencholesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, Δ7-campesterol, Δ5,23-stigmastadienol, clerosterol, β-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, erytrodiol en uvaol.

6.5.   Berekening

Bereken met een gegevensverzamelsysteem de piekoppervlakten van 1-eicosanol en de alifatische alcoholen C22, C24, C26 en C28. De responsfactor van 1-eicosanol wordt op 1 gesteld.

Bereken met behulp van het computersysteem het oppervlak van de pieken van het α-cholestanol en de sterolen en triterpeendialcoholen. Houd geen rekening met pieken van stoffen die niet (ergosterol hoeft niet te worden berekend) op de lijst van tabel 1 voorkomen. De responsfactor van α-cholestanol wordt op 1 gesteld.

Bereken de concentratie van elke individuele alcoholische verbinding in mg/kg vethoudend materiaal als volgt:

waarbij:

Ax	=	piekoppervlak van alcoholisch bestanddeel x, in computersysteemeenheden
As	=	oppervlak van de 1-eicosanol/α-cholestanolpiek, in computersysteemeenheden
ms	=	massa van het toegevoegde 1-eicosanol/α-cholestanol, in milligram
m	=	massa van het onderzochte monster, in gram

7.   WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

Geef de gehaltes van de individuele alifatische en triterpeenalcoholen op in mg/kg vethoudend materiaal en hun som als “totaalgehalte aan alifatische alcoholen”. Het totaalgehalte is de som van C22, C24, C26 en C28.

De samenstelling van alle individuele alcoholische verbindingen moet worden uitgedrukt met één cijfer na de komma.

De totale concentratie van sterolen moet worden uitgedrukt zonder cijfers na de komma.

Het percentage van elk individueel sterol wordt berekend door de verhouding te bepalen tussen het betrokken piekoppervlak en de som van de piekoppervlakken van de sterolen:

waarbij:

Ax	=	piekoppervlak van sterol x
ΣA	=	som van de piekoppervlakken van alle sterolen

Kennelijke β-sitosterol: Δ5,23-stigmastadienol + clerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5,24-stigmastadienol

Berekenen van het percentage erytrodiol en uvaol:

waarbij:

AEr	=	oppervlak van erytrodiol in computersysteemtellingen
AUv	=	oppervlak van uvaol in computersysteemtellingen
Σ ΑΤ	=	totale oppervlak voor sterolen + erytrodio + uavol in computersysteemtellingen

Naast de berekening van het relatieve percentage van individuele sterolen en triterpeendialcoholen en van de totale concentratie van sterolen, moeten ook de concentratie van erytrodiol en van uavol, en de som daarvan, uitgedrukt in mg/kg vethoudend materiaal, worden berekend, volgens de volgende formule:

waarbij:

AEr	=	piekoppervlak van erytrodiol in computersysteemtellingen
AUv	=	oppervlak van uvaol in computersysteemtellingen
As	=	oppervlak van de α-cholestanolpiek, in computersysteemeenheden
ms	=	massa van het toegevoegde α-cholestanol, in milligram
m	=	massa van het onderzochte monster, in gram

Aanhangsel

1 koolwaterstoffen 2 α-tocoferol 3 prenolen 4 triterpeenalcoholen 5 alifatische alcoholen 6 methyl-sterolen 7 sterolen 8 triterpeendialcoholen

Figuur 1 — TLC van de onverzeepbare fractie van olie uit perskoeken van olijven, tweemaal geëlueerd met hexaan:di-ethylether (65:35), ontwikkeld met SO4H2 (50 %) en verwarmd. De af te schrapen banden liggen in rechthoek 1 voor alifatische alcoholen en in rechthoek 2 voor sterolen en triterpeendialcoholen.

Tabel I — relatieve retentietijden voor de sterolen

Piek	Identificatie		Relatieve retentietijd
			SE 54-kolom	SE 52-kolom
1	Cholesterol	Δ5-cholesteen-3ß-ol	0,67	0,63
2	Cholestanol	5α-cholestaan-3ß-ol	0,68	0,64
3	Brassicasterol	[24S]-24-methyl-Δ5,22-cholestadieen-3β-ol	0,73	0,71
*	Ergosterol	[24S]-24-methyl-Δ-5,7,22 cholestatrieen-3β-ol	0,78	0,76
4	24-methyleencholesterol	24-methyleen-Δ5,24-cholestadieen-3ß-ol	0,82	0,80
5	Campesterol	(24R)-24-methyl-Δ5-cholesteen-3ß-ol	0,83	0,81
6	Campestanol	(24R)-24-methyl-cholestaan-3ß-ol	0,85	0,82
7	Stigmasterol	(24S)-24-ethyl-Δ5,22-cholestadieen-3ß-ol	0,88	0,87
8	Δ7-campesterol	(24R)-24-methyl-Δ7-cholesteen-3ß-ol	0,93	0,92
9	Δ5,23-stigmastadienol	(24S)-24-ethyl-Δ5,23-cholestadieen-3ß-ol	0,95	0,95
10	Clerosterol	(24S)-24-ethyl-Δ5,25-cholestadieen-3ß-ol	0,96	0,96
11	ß-sitosterol	(24R)-24-ethyl-Δ5-cholesteen-3ß-ol	1,00	1,00
12	Sitostanol	24-ethyl-cholestaan-3ß-ol	1,02	1,02
13	Δ5-avenasterol	(24Z)-24-ethylideen-Δ-cholesteen-3ß-ol	1,03	1,03
14	Δ-5,24-stigmastadienol	(24R,S)-24-ethyl-Δ5,24-cholestadieen-3ß-ol	1,08	1,08
15	Δ7-stigmastenol	(24R,S)-24-ethyl-Δ7-cholesteen-3ß-ol	1,12	1,12
16	Δ-7-avenasterol	(24Z)-24-ethylideen-Δ7-cholesteen-3ß-ol	1,16	1,16
17	Erytrodiol	5α-oleaan-12-en-3β,28-diol	1,41	1,41
18	Uvaol	Δ12-urseen-3β,28-diol	1,52	1,52

Figuur 2 — Met behulp van GC-FID verkregen chromatografisch profiel van sterolen en triterpeendialcoholen van geraffineerde olijfolie. (1) Cholesterol, (2) α-cholestanol (I.S.), (3) 24-methyleencholesterol, (4) campesterol, (5) campestanol, (6) stigmasterol, (7) Δ5,23-stigmastadienol, (8) clerosterol, (9) β-sitosterol, (10) sitostanol, (11) Δ5-avenasterol, (12) Δ5,24-stigmastadienol, (13) Δ7-stigmastenol, (14) Δ7-avenasterol, (15) erytrodiol, (16) uvaol.

Figuur 3 — Met behulp van GC-FID verkregen chromatografisch profiel van sterolen en triterpeendialcoholen van een olijfolie voor verlichting. (1) Cholesterol, (2) α-cholestanol (I.S.), (3) brassicasterol, (4) 24-methyleencholesterol, (5) campesterol, (6) campestanol, (7) stigmasterol, (8) Δ7-campesterol, (9) Δ5,23-stigmastadienol, (10) clerosterol, (11) β-sitosterol, (12) sitostanol, (13) Δ5-avenasterol, (14) Δ5,24-stigmastadienol, (15) Δ7-stigmastenol, (16) Δ7-avenasterol, (17) erytrodiol, (18) uvaol.

Figuur 4 — Met behulp van GC-FID verkregen chromatografisch profiel van alifatische en triterpeenalcoholen van olijfolie. (I.S.) C20-ol, (1) C22-ol, (2) C24-ol, (3) C26-ol, (4) C28-ol, (5) triterpeenalcoholen.

Figuur 5 — Met behulp van GC-FID verkregen chromatografisch profiel van alifatische en triterpeenalcoholen van een geraffineerde olijfolie en een bij de tweede centrifugering verkregen olijfolie. (I.S.) C20-ol, (1) C22-ol, (2) C24-ol, (3) C26-ol, (4) C28-ol, (5) triterpeenalcoholen.

Figuur 6 — HPLC-chromatogram van de onverzeepbare fractie van een olijfolie, gescheiden met behulp van HPLC met een uv-detector. (1) Alifatische en triterpeenalcoholen; (2) sterolen en triterpeendialcoholen