„PRILOZI

SADRŽAJ

Prilog I.	Svojstva maslinova ulja
Prilog I.a	Uzorkovanje ulja od ploda ili komine maslina koje se dostavlja u unutarnjem pakiranju
Prilog I.b	Dijagram toka za provjeru usklađenosti uzorka maslinova ulja s deklariranom kategorijom
Prilog II.	Određivanje slobodnih masnih kiselina, hladna metoda
Prilog III.	Određivanje peroksidnog broja
Prilog IV.	Određivanje sadržaja voska kapilarnom plinskom kromatografijom
Prilog VII.	Određivanje postotka 2-gliceril monopalmitata
Prilog IX.	Spektrofotometrijsko ispitivanje u ultraljubičastom području
Prilog X.	Određivanje metilnih estera masnih kiselina plinskom kromatografijom
Prilog XI.	Određivanje hlapivih halogeniranih otapala u maslinovu ulju
Prilog XII.	Postupak međunarodnog vijeća za masline za organoleptičko ocjenjivanje djevičanskog maslinova ulja
Prilog XV.	Sadržaj ulja u komini maslina
Prilog XVI.	Određivanje jodnog broja
Prilog XVII.	Metoda za određivanje stigmastadiena u biljnim uljima
Prilog XVIII.	Određivanje razlike između stvarne i teoretske količine triacilglicerola s ECN 42
Prilog XIX.	Određivanje sastava i sadržaja sterola i alkoholnih spojeva kapilarnom plinskom kromatografijom
Prilog XX.	Metoda određivanja sadržaja voskova, metil estera masnih kiselina i etil estera masnih kiselina kapilarnom plinskom kromatografijom
Prilog XXI.	Rezultati provjera sukladnosti provedenih na maslinovim uljima iz članka 8. stavka 2.

„PRILOG I.

SVOJSTVA MASLINOVA ULJA

Svojstva kvalitete

Etil esteri masnih kiselina (mg/kg)		≤ 35	—	—	—	—	—	—	—
Organoleptičko ocjenjivanje	Medijan voćnosti (Mv)	Mv > 0,0	Mv > 0,0	—	—	—	—	—	—
	Medijan mana (Mm) (*)	Mm = 0,0	Mm ≤ 3,5	Mm > 3,5 (1)
Delta-K		≤ 0,01	≤ 0,01	—	≤ 0,16	≤ 0,15	—	≤ 0,20	≤ 0,18
K268 ili K270		≤ 0,22	≤ 0,25	—	≤ 1,25	≤ 1,15	—	≤ 2,00	≤ 1,70
K232		≤ 2,50	≤ 2,60	—	—	—	—	—	—
Peroksidni broj (mEq O2/kg)		≤ 20,0	≤ 20,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0
Kiselost (%) (*)		≤ 0,80	≤ 2,0	> 2,0	≤ 0,30	≤ 1,00	—	≤ 0,30	≤ 1,00
Kategorija		1. Ekstra djevičansko maslinovo ulje	2. Djevičansko maslinovo ulje	3. Maslinovo ulje lampante	4. Rafinirano maslinovo ulje	5. Maslinovo ulje koje se sastoji od rafiniranog maslinovog ulja i djevičanskih maslinovih ulja	6. Sirovo ulje komine maslina	7. Rafinirano ulje komine maslina	8. Ulje komine maslina

Svojstva čistoće

2-gliceril monopalmitat (%)

≤ 0,9 ako je ukupni udio palmitinske kiseline ≤ 14,00 %

≤ 1,0 ako je ukupni udio palmitinske kiseline > 14,00 %

≤ 0,9 ako je ukupni udio palmitinske kiseline ≤ 14,00 %

≤ 1,0 ako je ukupni udio palmitinske kiseline > 14,00 %

≤ 0,9 ako je ukupni udio palmitinske kiseline ≤ 14,00 %

≤ 1,1 ako je ukupni udio palmitinske kiseline > 14,00 %

≤ 0,9 ako je ukupni udio palmitinske kiseline ≤ 14,00 %

≤ 1,1 ako je ukupni udio palmitinske kiseline > 14,00 %

≤ 0,9 ako je ukupni udio palmitinske kiseline ≤ 14,00 %

≤ 1,0 ako je ukupni udjel palmitinske kiseline > 14,00 %

≤ 1,4

≤ 1,4

≤ 1,2

Razlika: ECN42 (HPLC) i ECN42 (teoretski izračun)

≤ |0,20|

≤ |0,20|

≤ |0,30|

≤ |0,30|

≤ |0,30|

≤ |0,60|

≤ |0,50|

≤ |0,50|

Stigmastadieni (mg/kg) (3)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,50

—

—

—

—

—

Ukupni translinolni i translinolenski izomeri (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,10

≤ 0,35

≤ 0,35

Ukupni transoleinski izomeri (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,40

Sastav masnih kiselina (2)

Lignocerinska (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

Behenska (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,30

Eikozenska (%)

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

Arahinska (%)

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

Linolenska (%)

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

Miristinska (%)

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

Kategorija

1. Ekstra djevičansko maslinovo ulje

2. Djevičansko maslinovo ulje

3. Maslinovo ulje lampante

4. Rafinirano maslinovo ulje

5. Maslinovo ulje koje se sastoji od rafiniranog maslinovog ulja i djevičanskih maslinovih ulja

6. Sirovo ulje komine maslina

7. Rafinirano ulje komine maslina

8. Ulje komine maslina

Voskovi (mg/kg) (**)		C42 + C44 + C46 ≤ 150	C42 + C44 + C46 ≤ 150	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (6)	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (7)	C40 + C42 + C44 + C46 > 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350
Eritrodiol i uvaol (%) (**)		≤ 4,5	≤ 4,5	≤ 4,5 (6)	≤ 4,5	≤ 4,5	> 4,5 (7)	> 4,5	> 4,5
Ukupni steroli (mg/kg)		≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 2 500	≥ 1 800	≥ 1 600
Sastav sterola	Delta-7-stigmastenol (4) (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
	App β-sitosterol (5) (%)	≥ 93,0	≥> 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0
	Stigmasterol (%)	< Kamp.	< Kamp.	—	< Kamp.	< Kamp.	—	< Kamp.	< Kamp.
	Kampesterol (4) (%)	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0
	Brasikasterol (%)	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,2	≤ 0,2	≤ 0,2
	Kolesterol (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
Kategorija		1. Ekstra djevičansko maslinovo ulje	2. Djevičansko maslinovo ulje	3. Maslinovo ulje lampante	4. Rafinirano maslinovo ulje	5. Maslinovo ulje koje se sastoji od rafiniranog maslinovog ulja i djevičanskih maslinovih ulja	6. Sirovo ulje komine maslina	7. Rafinirano ulje komine maslina	8. Ulje komine maslina

Napomene:

(a)	Rezultati analiza moraju biti izraženi onim brojem decimalnih mjesta kojim je izražena granična vrijednost za pojedino svojstvo. Zadnja znamenka mora se uvećati za jednu jedinicu ako je znamenka koja slijedi veća od 4.

(b)	Ako najmanje jedno od svojstava ne odgovara navedenim vrijednostima, za potrebe ove Uredbe kategorija ulja može se promijeniti ili se ulje može deklarirati kao nesukladno.

(c)	U slučaju maslinovog ulja lampante oba se svojstva kvalitete označena zvjezdicom (*) mogu istodobno razlikovati od graničnih vrijednosti utvrđenih za tu kategoriju.

(d)

Ako je svojstvo označeno s dvije zvjezdice (**), to znači da je za sirovo ulje komine maslina moguće da se istodobno obje relevantne granične vrijednosti razlikuju od navedenih vrijednosti. U slučaju ulja komine maslina i rafiniranog ulja komine maslina, jedna od relevantnih graničnih vrijednosti može se razlikovati od navedenih vrijednosti.

Dodatak

Sheme odlučivanja

Shema odlučivanja koja se odnosi na kampesterol za djevičanska i ekstra djevičanska maslinova ulja:

Drugi parametri moraju biti u skladu s ograničenjima utvrđenima u ovoj Uredbi.

Shema odlučivanja koja se odnosi na delta-7-stigmastenol za:

—	ekstra djevičanska i djevičanska maslinova ulja

Drugi parametri moraju biti u skladu s ograničenjima utvrđenima u ovoj Uredbi.

—	Ulja komine maslina (sirova i rafinirana)

Drugi parametri moraju biti u skladu s ograničenjima utvrđenima u ovoj Uredbi.

„PRILOG I.b

DIJAGRAM TOKA ZA PROVJERU USKLAĐENOSTI UZORKA MASLINOVA ULJA S DEKLARIRANOM KATEGORIJOM

Opća tablica

Tablica 1. – Ekstra djevičansko maslinovo ulje – Kriteriji kvalitete

Tablica 2. – Djevičansko maslinovo ulje – Kriteriji kvalitete

Tablica 3. – Ekstra djevičansko maslinovo ulje i djevičansko maslinovo ulje – Kriteriji čistoće

Tablica 4. – Maslinovo ulje lampante – Kriteriji čistoće

Tablica 5. – Rafinirano maslinovo ulje – Kriteriji kvalitete

Tablica 6. – Maslinovo ulje (koje se sastoji od rafiniranog maslinovog ulja i djevičanskih maslinovih ulja)– Kriteriji kvalitete

Tablica 7. – Maslinovo ulje koje se sastoji od rafiniranog maslinovog ulja i djevičanskih maslinovih ulja– Kriteriji čistoće

Tablica 8. – Sirovo ulje komine maslina – Kriteriji čistoće

Tablica 9. – Rafinirano ulje komine maslina – Kriteriji kvalitete

Tablica 10. – Ulje komine maslina – Kriteriji kvalitete

Tablica 11. – Rafinirano ulje komine maslina i ulje komine maslina – Kriteriji čistoće

„PRILOG XIX.

ODREĐIVANJE SASTAVA I SADRŽAJA STEROLA I ALKOHOLNIH SPOJEVA KAPILARNOM PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM

1.   PODRUČJE PRIMJENE

Metoda opisuje postupak za određivanje udjela pojedinačnih i ukupnih alkoholnih spojeva u maslinovim uljima i uljima komine maslina, te u mješavini tih dvaju ulja.

Alkoholni spojevi u maslinovim uljima i uljima komine maslina sačinjeni su od alifatskih alkohola, sterola i triterpenskih dialkohola.

2.   NAČELO

Ulja s dodatkom α-kolestanola i 1-eikosanola kao internih standarda saponificiraju se otopinom kalijeva hidroksida u etanolu i zatim se neosapunjiva tvar ekstrahira etil eterom.

Različite frakcije alkoholnih spojeva odvajaju se od neosapunjive tvari tankoslojnom kromatografijom na osnovnoj silikagel ploči (referentna metoda) ili HPLC metodom na koloni silikagela. Frakcija koja se dobije odvajanjem silikagelom pretvara se u trimetilsilil etere i zatim analizira kapilarnom plinskom kromatografijom.

DIO 1.

PRIPREMA NEOSAPUNJIVE TVARI

1.   PODRUČJE PRIMJENE

U ovom se dijelu opisuju priprema i ekstrakcija neosapunjive tvari. Uključuje pripremu i ekstrakciju neosapunjive tvari iz maslinovih ulja i ulja komine maslina.

2.   NAČELO

Uzorak za ispitivanje saponificira se vrenjem pod povratnim hladilom s otopinom kalijeva hidroksida u etanolu. Neosapunjiva tvar ekstrahira se s pomoću dietil etera.

3.   OPREMA

Uobičajena laboratorijska oprema, a posebno sljedeće:

3.1	Tikvica s okruglim dnom opremljena povratnim hladilom i nastavcima od brušenog stakla, 250 ml.

3.2	Lijevak za odjeljivanje, 500 ml.

3.3	Tikvice, 250 ml.

3.4	Mikroštrcaljke, 100 μl i 500 μl.

3.5	Cilindrični lijevak za filtriranje s poroznom pločom G 3 (poroznost između 15 i 40 μm) približnog promjera 2 cm i visine 5 cm, primjeren za filtriranje pod vakuumom s muškim spojem od brušenog stakla.

3.6	Erlenmeyerova tikvica sa ženskim spojem od brušenog stakla, 50 ml, koja se može pričvrstiti na lijevak za filtriranje (točka 3.5.).

3.7	Epruveta s konusnim dnom i brtvenim staklenim čepom, 10 ml.

3.8	Eksikator s kalcijevim kloridom.

4.   REAGENSI

4.1	Kalijev hidroksid, minimalne koncentracije 85 %.

4.2	Otopina kalijeva hidroksida u etanolu, približno 2 M. Otopiti 130 g kalijeva hidroksida (točka 4.1.), uz hlađenje, u 200 ml destilirane vode, a zatim nadopuniti etanolom do jedne litre (točka 4.7.). Otopinu treba čuvati najviše dva dana u dobro začepljenim bocama od tamnog stakla.

4.3	Etil eter, analitičke kvalitete.

4.4	Bezvodni natrijev sulfat, analitičke kvalitete.

4.5	Aceton, za kvalitetu kromatografije.

4.6	Etil eter, za kvalitetu kromatografije.

4.7	Etanol analitičke kvalitete.

4.8	Etil acetat analitičke kvalitete.

4.9	Interni standard, α-kolestanol, čistoće veće od 99 % (čistoća se mora provjeriti plinskom kromatografijom).

4.10	Interni standard, otopina α-kolestanola, 0,2 %-tna otopina (m/v) u etil acetatu (točka 4.8.).

4.11	Otopina 10 g/l fenolftaleina u etanolu (točka 4.7.).

4.12	0,1 %-tna (m/v) otopina 1-eikosanola u etil acetatu (interni standard).

5.   POSTUPAK

S pomoću mikroštrcaljke od 500 μl (točka 3.4.) u tikvicu volumena 250 ml (točka 3.1.) injektirati onu količinu otopine α-kolestanola internog standarda (točka 4.10.) i količinu 1-eikosanola (točka 4.12.) koja sadržava količinu kolestanola i eikosanola koja je približno jednaka 10 % sadržaja sterola i alkohola u uzorku. Na primjer, na 5 g uzorka maslinova ulja treba dodati 500 μl otopine α-kolestanola (točka 4.10.) i 250 μl otopine 1-eikosanola (točka 4.12.). U slučaju ulja komine maslina treba dodati 1 500 μl otopine α-kolestanola (točka 4.10.) i otopine 1-eikosanola (točka 4.12.). Upariti do suha pod blagom strujom dušika u toploj vodenoj kupelji. Nakon što se tikvica ohladi, izvagati 5,00 ± 0,01 g suhog filtriranog uzorka u istu tikvicu.

Napomena 1.:

Ulja i masti životinjskog ili biljnog podrijetla koja sadržavaju znatne količine kolesterola mogu dati pik s retencijskim vremenom koje je identično onome kolestanola. U tom slučaju frakcija sterola treba se analizirati dvostruko – s internim standardom i bez njega.

Dodati 50 ml 2 M otopine kalijeva hidroksida u etanolu (točka 4.2.) i malo plovućca, namjestiti povratno hladilo i zagrijavati do točke slabog vrenja dok se ne završi saponificiranje (otopina postane bistra). Nastaviti zagrijavanje još 20 minuta, zatim dodati 50 ml destilirane vode kroz vrh hladila, odvojiti hladilo i ohladiti tikvicu na oko 30 °C.

Kvantitativno prenijeti sadržaj tikvice u lijevak za odjeljivanje od 500 ml (točka 3.2.) s nekoliko obroka destilirane vode (50 ml). Dodati oko 80 ml etil etera (točka 4.6.), snažno protresati oko 60 sekundi, povremeno ispuštajući pritisak okretanjem lijevka za odjeljivanje i otvaranjem zaustavnog pipca. Odložiti dok se dvije faze potpuno ne odvoje (Napomena 2.). Odvojiti sapunastu otopinu što je moguće potpunije u drugi lijevak za odjeljivanje. Provesti još dvije ekstrakcije na vodeno-alkoholnoj fazi na jednak način, uz upotrebu između 60 i 70 ml etil etera (točka 4.6.).

Napomena 2.:

Svaka se emulzija može uništiti dodavanjem malih količina etanola (točka 4.7.).

Kombinirati tri ekstrakta etera u jednom lijevku za odjeljivanje koji sadržava 50 ml vode. Nastaviti ispirati s vodom (50 ml) sve dok se u vodi kojom se ispiralo više ne pojavljuje ružičasto obojenje pri dodavanju kapljica otopine fenolftaleina (točka 4.11.). Nakon uklanjanja vode kojom se ispiralo profiltrirati kroz bezvodni natrijev sulfat (točka 4.4.) u prethodno izvaganoj tikvici od 250 ml, ispirajući lijevak i filtar malim količinama etil etera (točka 4.6.).

Otapalo ispariti destiliranjem pod vakuumom u rotirajućem isparivaču na 30 °C. Dodati 5 ml acetona (točka 4.5.) i potpuno odstraniti hlapivo otapalo pod blagom strujom dušika. Ostatak 15 minuta sušiti u peći na 103 ± 2 °C. Ohladiti u eksikatoru i izvagati uz odstupanje do 0,1 mg.

DIO 2.

ODVAJANJE FRAKCIJA ALKOHOLNIH SPOJEVA

1.   PODRUČJE PRIMJENE

Neosapunjiva tvar pripremljena u dijelu 1. frakcionira se u različitim alkoholnim spojevima, alifatskim alkoholima, sterolima i triterpenskim dialkoholima (eritrodiol i uvaol).

2.   NAČELO

Neosapunjiva tvar može se frakcionirati s pomoću tankoslojne kromatografije (referentna metoda), otkriti te se odgovarajuće vrpce mogu sastrugati i ekstrahirati. Kao alternativna metoda odvajanja može se primijeniti HPLC metoda uz upotrebu silikagel kolone i UV detektora i različitih prikupljenih frakcija. Alifatski i triterpenski alkoholi te steroli i triterpenski dialkoholi izoliraju se zajedno.

3.   OPREMA

Uobičajena laboratorijska oprema, a posebno sljedeće:

3.1	Cjeloviti instrument za analizu tankoslojnom kromatografijom, s pomoću staklenih ploča veličine 20 × 20 cm.

3.2	Ultraljubičasta svjetiljka valne duljine 366 ili 254 nm.

3.3	Mikroštrcaljke, 100 μl i 500 μl.

3.4	Cilindrični lijevak za filtriranje s poroznom pločom G 3 (poroznost između 15 i 40 μm) približnog promjera 2 cm i visine 5 cm, primjeren za filtriranje pod vakuumom s muškim spojem od brušenog stakla.

3.5	Erlenmeyerova tikvica sa ženskim spojem od brušenog stakla, 50 ml koja se može pričvrstiti na lijevak za filtriranje (3.4.).

3.6	Epruveta s konusnim dnom i brtvenim staklenim čepom, 10 ml.

3.7	Eksikator s kalcijevim kloridom.

3.8	HPLC sustav koji se sastoji od sljedećeg: 3.8.1 Binarne pumpe. 3.8.2 Ručnog ili automatiziranog injektora opremljenog petljama za injektiranje od 200 μl. 3.8.3 Linijski otplinjač. 3.8.4 UV-VIS ili IR detektor.

3.9	HPLC kolona (25 cm x 4 mm unutarnjeg promjera) sa silikagelom 60 (veličine čestica 5 μm).

3.10	Filtar za štrcaljke, 0,45 μm.

3.11	Erlenmeyerova tikvica, 25 ml.

4.   REAGENSI

4.1	Kalijev hidroksid, minimalne koncentracije 85 %.

4.2	Otopina kalijeva hidroksida u etanolu, približno 2 M. Otopiti 130 g kalijevog hidroksida (točka 4.1.), uz hlađenje, u 200 ml destilirane vode, a zatim nadopuniti etanolom do jedne litre (točka 4.9.). Otopinu treba čuvati najviše dva dana u dobro začepljenim bocama od tamnog stakla.

4.3	Etil eter, analitičke kvalitete.

4.4	Otopina kalijeva hidroksida u etanolu, približno 0,2 M. Otopiti 13 g kalijeva hidroksida (točka 4.1.) u 20 ml destilirane vode i nadopuniti etanolom do jedne litre (točka 4.9.).

4.5	Staklene ploče dimenzija 20 × 20 cm sa slojem silikagela, bez indikatora fluorescencije, debljine 0,25 ml (na tržištu su dostupne ploče spremne za uporabu).

4.6	Aceton, za kvalitetu kromatografije.

4.7	N-heksan, za kvalitetu kromatografije.

4.8	Etil eter, za kvalitetu kromatografije.

4.9	Etanol analitičke kvalitete.

4.10	Etil acetat analitičke kvalitete.

4.11	Referentna otopina za tankoslojnu kromatografiju: 5 %-tna otopina kolesterola, fitosterola, alkohola i eritrodiola u etil acetatu (točka 4.10.).

4.12	0,2 %-tna otopina 2,7-diklorofluoresceina u etanolu. Može se učiniti blago lužnatim dodavanjem nekoliko kapi otopine 2 mol/l kalijeva hidroksida u alkoholu (točka 4.2.).

4.13	Smjesa n-heksana (točka 4.7.) i etil etera (točka 4.8.) 65:35 (V/V).

4.14	Mobilna faza n-heksana (točka 4.7.) i etil etera (točka 4.8.), 1:1 (V/V).

5.   REFERENTNA METODA: ODVAJANJE ALKOHOLNIH SPOJEVA OSNOVNIM PLOČAMA ZA TANKOSLOJNU KROMATOGRAFIJU (TLC)

Priprema osnovnih ploča za tankoslojnu kromatografiju. Uroniti ili umočiti silikagel ploče (točka 4.5.) do oko 4 cm u otopinu 0,2 mol/l kalijeva hidroksida u etanolu (točka 4.4.) na 10 sekundi, zatim ih ostaviti da se dva sata suše u digestoru i na kraju ih staviti u peć na 100 °C na jedan sat.

Izvaditi ploče iz peći i pohraniti u eksikator s kalcijevim kloridom (točka 3.7.) do upotrebe (ploče obrađene na ovaj način moraju se upotrijebiti u roku od 15 dana).

Staviti smjesu heksana i etil etera (točka 4.13.) (napomena 3.) u komoru za razvijanje, do dubine od oko 1 cm. Zatvoriti komoru odgovarajućim poklopcem i ostaviti tako na najmanje pola sata, na hladnom mjestu, kako bi se uspostavila ravnoteža tekućine i pare. Trake filtar-papira namočene u eluens mogu se postaviti na unutarnje površine komore. Time se skraćuje vrijeme razvijanja za otprilike jednu trećinu i dobiva jednoličnija, pravilna elucija komponenata.

Napomena 3.:

Mješavina za razvijanje trebala bi se zamijeniti za svako ispitivanje da bi se postigli reproducibilni uvjeti elucije. Može se upotrijebiti alternativno otapalo u obliku n-heksana i etil etera u omjeru 50:50 (V/V).

Pripremiti približno 5 %-tnu otopinu neosapunjivih tvari dobivenu u dijelu 1. u etil acetatu (točka 4.10.) i s pomoću mikroštrcaljke od 100 μl (točka 3.3.) nanijeti 0,3 ml te otopine u tankoj i ujednačenoj liniji na donji rub (2 cm) kromatografske ploče (točka 4.5.). U ravnini nanosa nanijeti između 2 i 3 μl referentne otopine tvari (točka 4.11.) tako da se vrpca sterola, triterpenskih dialkohola i alkohola može identificirati nakon razvijanja.

Staviti ploču u komoru za razvijanje (točka 3.1.). Sobnu temperaturu treba održavati između 15 i 20 °C (napomena 4.). Komoru odmah zatvoriti poklopcem i ostaviti da eluira dok prednji dio otapala ne dosegne približno 1 cm od gornjeg ruba ploče. Ploča se zatim vadi iz komore za razvijanje, a otapalo isparuje pod strujom vrućeg zraka ili se ploča ostavlja još neko kraće vrijeme u digestoru.

Napomena 4.:

na višim temperaturama odjeljivanje se može pogoršati.

Blago i jednoliko pošpricati ploču otopinom 2,7-diklorofluoresceina (točka 4.12.) i zatim je ostaviti da se osuši. Kad se ploča promatra pod ultraljubičastom svjetiljkom (točka 3.2.), vrpce sterola, triterpenskih dialkohola i alkohola mogu se identificirati tako što su poravnane s mrljama dobivenima od referentne otopine (točka 4.11.). Označiti rubove trake uz rub fluorescencije crnom olovkom (vidjeti TLC ploču na slici 1.).

Silikagel koji se nalazi u označenom području sastruže se s pomoću metalne spatule. Tako dobiveni fino usitnjeni materijal unijeti u lijevak za filtriranje (3.4.). Dodati 10 ml vrućeg etil acetata (točka 4.10.), pažljivo izmiješati metalnom spatulom i filtrirati (prema potrebi pod vakuumom), skupljajući filtrat u Erlenmeyerovu tikvicu (točka 3.5.) spojenu na lijevak za filtriranje.

Ostatak u tikvici isprati tri puta etil eterom (točka 4.3.) (oko 10 ml svaki put), skupljajući filtrat u istu tikvicu spojenu na lijevak, ispariti filtrat do volumena od 4 do 5 ml, preostalu otopinu prenijeti u prethodno izvaganu epruvetu volumena 10 ml (točka 3.6.), upariti do suha laganim zagrijavanjem pod blagom strujom dušika, ponovno nadopuniti s nekoliko kapi acetona (točka 4.6.) i ponovno upariti do suha. Ostatak u epruveti sastoji se od frakcija sterola i triterpenskih dialkohola ili frakcija alkohola i triterpenskih alkohola.

6.   ODVAJANJE FRAKCIJE ALKOHOLA HPLC METODOM

Otopiti neosapunjivu tvar dobivenu u dijelu 1. u 3 ml mobilne faze (točka 4.14.), otopinu filtrirati filtrom za štrcaljke (točka 3.10.) i čuvati.

Injektirati 200 μl filtrirane neosapunjive otopine u HPLC-u (točka 3.8.).

Izvršiti HPLC odvajanje pri 0,8 ml/min, ostaviti prvih 5 min. te sakupljati u Erlenmeyerovim tikvicama od 25 ml (točka 3.11.) od 5 do 10 min. za alifatske i triterpenske alkohole te od 11 do 25 min. za sterole i eritrodiol i uvaol (napomena 5.).

Odvajanje se može pratiti UV detektorom na valnoj duljini od 210 nm ili detektorom indeksa refrakcije (vidjeti sliku 6.).

Frakcije se uparuju do suha i pripremaju za kromatografsku analizu.

Napomena 5.:

Pozorno kontrolirati tlak HPLC pumpe, etil eter može uzrokovati povećanje tlaka; prilagoditi protok da bi se tlak održavao pod kontrolom.

DIO 3.

ANALIZA FRAKCIJA ALKOHOLNIH SPOJEVA PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM

1.   PODRUČJE PRIMJENE

U ovom se dijelu daju opće smjernice za primjenu kapilarne plinske kromatografije radi utvrđivanja kvalitativnog i kvantitativnog sastava alkoholnih spojeva izoliranih u skladu s metodom utvrđenom u dijelu 2. ove metode.

2.   NAČELO

Frakcije prikupljene iz neosapunjive tvari s pomoću TLC-a ili HPLC-a derivatiziraju se u trimetilsilil etere i analiziraju kapilarnom plinskom kromatografijom uz razdjelno injektiranje i plameno-ionizacijski detektor.

3.   OPREMA

Uobičajena laboratorijska oprema, a posebno sljedeće:

3.1	Epruveta s konusnim dnom i brtvenim staklenim čepom, 10 ml.

3.2

Plinski kromatograf koji se može koristiti s kapilarnom kolonom s razdjelnim sustavom za injektiranje koji se sastoji od: 3.2.1 Termostatska komora za kolone koja može održavati željenu temperaturu s točnošću od ± 1 °C; 3.2.2 Jedinica za injektiranje s mogućnošću podešavanja temperature, s elementom za uparavanje od persilaniziranog stakla i razdjelnim sustavom; 3.2.3 Plameno-ionizacijski detektor (FID); 3.2.4 Sustav za prikupljanje podataka koji se može koristiti s detektorom FID (točka 3.10.3.) i koji se može uključiti ručno.

3.3	Kvarcna kapilarna kolona duljine između 20 i 30 m, unutarnjeg promjera između 0,25 i 0,32 mm, sa slojem 5 % difenila – 95 % dimetilpolisiloksana (SE-52 ili SE-54 ili odgovarajućom stacionarnom fazom), s ujednačenom debljinom filma između 0,10 i 0,30 μm.

3.4	Mikroštrcaljka za plinsku kromatografiju volumena 10 μl s čvrsto učvršćenom iglom primjerenom za razdjelno injektiranje.

4.   REAGENSI

4.1	Bezvodni piridin, za kvalitetu kromatografije.

4.2	Heksametildisilazan analitičke kvalitete.

4.3	Trimetilklorosilan analitičke kvalitete.

4.4	Otopine sterolnih trimetilsilil etera iz uzorka. Treba ih pripremiti neposredno prije korištenja od sterola i eritrodiola dobivenih iz ulja koja ih sadrže.

4.5	Standardne otopine trimetilsilil etera alifatskih alkohola od C20 do C28. Mogu se pripremiti iz mješavina čistih alkohola, neposredno prije upotrebe.

4.6	Plin nosač: vodik ili helij, plinsko-kromatografske čistoće.

4.7	Pomoćni plinovi: vodik, helij, dušik i zrak, plinsko-kromatografske čistoće.

4.8	Reagens za sililaciju koji se sastoji od smjese piridina, heksametildisilazana i trimetilklorosilana u omjeru 9:3:1 (V/V/V).

4.9	N-heksan, za kvalitetu kromatografije.

5.   PRIPREMA TRIMETILSILIL ETERA

Dodati reagens za silaniziranje (točka 4.8.) (napomena 6.), u omjeru od po 50 μl na svaki miligram alkoholnog spoja, u epruvetu (točka 3.1.) koja sadržava frakciju alkoholnog spoja tako da se izbjegne bilo kakva apsorpcija vlage (napomena 7.)

Napomena 6.:

Otopine spremne za upotrebu dostupne su na tržištu. Dostupni su i drugi reagensi za silaniziranje kao što su npr. bistrimetilsilil trifluor acetamid + 1 % trimetilklorosilan koji je potrebno razrijediti istim volumenom bezvodnog piridina. Piridin se može zamijeniti jednakom količinom acetonitrila.

Napomena 7.:

Normalno je da dođe do blage opalescencije koja neće uzrokovati anomalije. Stvaranje bijelog floka ili pojava ružičastog obojenja znakovi su prisutnosti vlage ili propadanja reagensa. U tom slučaju treba ponoviti ispitivanje (samo ako se koristi heksametildisilazan ili trimetilklorosilan).

Epruvetu treba začepiti (točka 3.1.) i pažljivo protresti (bez preokretanja) sve dok se sastojci u potpunosti ne rastope. Ostaviti da odstoji najmanje 15 minuta na sobnoj temperaturi te zatim centrifugirati nekoliko minuta. Bistra otopina spremna je za analizu plinskim kromatografom.

6.   ANALIZA PLINSKIM KROMATOGRAFOM

6.1   Pripremne djelatnosti i kondicioniranje kapilarne kolone

Namjestiti kolonu (točka 3.3.) u plinski kromatograf tako da se početak kolone spoji na razdjelni injektor, a izlazni kraj kolone na detektor.

Provesti opću provjeru stanja jedinice plinskog kromatografa (curenje iz plinskih tokova, učinkovitost detektora, učinkovitost sustava za razdvajanje i sustava za bilježenje itd.).

Ako se kapilarna kolona upotrebljava prvi put, preporučuje se da je se podvrgne kondicioniranju: kroz kolonu se pusti malo plina, a zatim se jedinica plinskog kromatografa uključi i postupno zagrijava dok se ne postigne temperatura koja je najmanje 20 °C iznad radne temperature (napomena 8.). Ta se temperatura treba održavati najmanje dva sata, zatim se cijela jedinica stavlja u radne uvjete (prilagođavanje protoka plina i razdvajanja, paljenja plamena, provjera spoja s računalnim sustavom, prilagođavanje komore za kolonu, temperature detektora i injektora itd.), a zatim se bilježi signal uz osjetljivost koja je najmanje dvostruko viša od razine predviđene za analizu. Bazna linija za praćenje treba biti linearna, bez pikova ikakve vrste i ne smije pokazivati nikakve znakove otklona. Negativan pravocrtni otklon ukazuje na to da je došlo do curenja iz spojeva kolone, a pozitivan otklon ukazuje na to da kolona nije kondicionirana na odgovarajući način.

Napomena 8.:

Temperatura kondicioniranja mora uvijek biti najmanje 20 °C niža od maksimalne temperature utvrđene za primijenjenu stacionarnu fazu.

6.2   Uvjeti rada

Optimizirati temperaturno programiranje i protok plina nosača kako bi se postigli kromatogrami slični onima na slikama od 3. do 6.

Sljedeći su parametri ispitani i utvrđeni kao korisni:

6.2.1   Alifatski alkoholi

Program u peći	180 °C (8 min.) → 260 °C (pri 5 °C/min) → 260 °C (15 min.)
Temperatura injektora	280 °C
Temperatura detektora	290 °C
Linearna brzina plina nosača	helij (od 20 do 30 cm/s); vodik (od 30 do 50 cm/s)
Omjer razdvajanja	Od 1:50 do 1:100
Injektirana količina	Od 0,5 do 1 μl TMSE otopine

6.2.2   Steroli i triterpenski dialkoholi

Program u peći	260 ± 5 °C izotermalno
Temperatura injektora	280–300 °C
Temperatura detektora	280–300 °C
Linearna brzina plina nosača	helij (od 20 do 30 cm/s); vodik (od 30 do 50 cm/s)
Omjer razdvajanja	Od 1:50 do 1:100
Injektirana količina	Od 0,5 do 1 μl TMSE otopine

Prethodno navedeni uvjeti mogu se modificirati u skladu sa svojstvima kolone i svojstvima plinskog kromatografa ne bi li se dobili kromatogrami koji udovoljavaju sljedećim zahtjevima:

—	retencijsko vrijeme alkohola C26 iznosi 18 ± 5 minuta,

—	pik alkohola C22 iznosi 80 ± 20 % vrijednosti pune skale za maslinovo ulje, odnosno 40 ± 20 % vrijednosti pune skale za ulje komine maslina,

—	retencijsko vrijeme pika β-sitosterola trebalo bi iznositi 20 ± 5 minuta,

—	pik kampesterola trebao bi iznositi: za maslinovo ulje (prosječni udio 3 %) 20 ± 5 % vrijednosti pune skale,

—

svi prisutni steroli moraju biti odijeljeni. Osim odjeljivanja, pikovi također moraju biti u potpunosti razdvojeni, odnosno trag pika mora se vratiti na baznu liniju prije no što krene stvarati novi pik. Međutim, nepotpuno razdvajanje tolerira se u slučaju da se pik pri RRT 1,02 (sitostanol) može kvantificirati upotrebom okomice.

6.3   Analitički postupak

S pomoću mikroštrcaljke volumena 10 μl (točka 3.4.) unijeti 1 μl heksana, usisati 0,5 μl zraka te zatim između 0,5 i 1 μl otopine uzorka. Pritom podignuti klip mikroštrcaljke da bi se igla ispraznila. Igla se uvodi kroz membranu injektora; nakon jedne do dvije sekunde otopina se brzo injektira, a nakon približno pet sekundi igla se polako izvlači. Može se upotrijebiti i automatski injektor.

Bilježenje treba provoditi sve dok se TMSE odgovarajućih prisutnih alkoholnih spojeva u potpunosti ne eluira. Bazna linija mora i dalje ispunjavati zahtjeve odgovarajućih uvjeta rada (točka 6.2.1. ili 6.2.2.).

6.4   Identificiranje pikova

Identificirati pojedinačne pikove na temelju retencijskog vremena i uspoređivanjem s mješavinom alifatskih i triterpenskih alkohola ili sterola i triterpenskih dialkohola TMSE, analiziranom u istim uvjetima. Kromatogram frakcije alifatskih i triterpenskih alkohola prikazan je na slici 3., a odgovarajući kromatogrami za sterole i triterpenske dialkohole na slici 2.

Alifatski alkoholi eluiraju se sljedećim redoslijedom: C20-ol (I.S.), C22-ol, C23-ol, C24-ol, C25-ol, C26-ol, C27-ol i C28-ol.

Steroli i triterpenski dialkoholi eluiraju se sljedećim redoslijedom: kolesterol, brasikasterol, ergosterol, 24-metilen kolesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, klerosterol, β-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmasterol, Δ7-avenasterol, eritrodiol i uvaol.

6.5   Kvantitativna ocjena

Površine pikova 1-eikosanola i alifatskih alkohola C22, C24, C26, C28 izračunavaju se s pomoću sustava za prikupljanje podataka. Koeficijent odziva za 1-eikosanol trebao bi biti jednak 1.

Površine pikova α-kolestanola i sterola i triterpenskih dialkohola izračunavaju se s pomoću računalnog sustava. Pikove bilo kojega od spojeva koji nisu uključeni među one navedene u tablici 1. (ergosterol se ne smije izračunavati) ne treba uzimati u obzir. Koeficijent odziva za α-kolestanol treba biti jednak 1.

Izračunati koncentraciju svakog pojedinačnog alkoholnog spoja u mg/kg masnog materijala kako slijedi:

pri čemu je:

Ax	=	površina pika alkoholnog spoja x, u izračunima računalnog sustava.
As	=	površina pika 1-eikosanola/α-kolestanola, u izračunima računalnog sustava.
ms	=	masa dodanog 1-eikosanola/α-kolestanola, u miligramima.
m	=	masa uzorka upotrijebljenog za određivanje, u gramima.

7.   IZRAŽAVANJE REZULTATA

Koncentracije pojedinačnih alifatskih i triterpenskih alkohola iskazuju se kao mg/kg masnog materijala, a njihov zbroj kao ‚ukupni sadržaj alifatskih alkohola’. Ukupni je sadržaj zbroj C22, C24, C26 i C28.

Sastav svakog pojedinačnog alkoholnog spoja trebao bi se iskazivati do jednog decimalnog mjesta.

Ukupna koncentracija trebala bi se iskazivati bez ijednog decimalnog mjesta.

Izračunati postotak svakog pojedinačnog sterola iz omjera površine relevantnog pika prema ukupnoj površini pikova za sterole:

pri čemu je:

Ax	=	površina pika za sterol x.
ΣΑ	=	ukupna površina pikova za sterole.

β-sitosterol: Δ5,23-stigmastadienol + klerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5,24-stigmastadienol.

Izračunavanje postotka eritrodiola i uvaola:

pri čemu je:

AEr	=	površina eritrodiola u izračunima računalnog sustava.
AUv	=	površina uvaola u izračunima računalnog sustava.
Σ AT	=	ukupna površina sterola + eritrodiola + uvaola u izračunima računalnog sustava.

Osim izračuna relativnog postotka pojedinačnih sterola i triterpenskih dialkohola te ukupne koncentracije sterola, potrebno je izračunati koncentraciju eritrodiola i uvaola te njihov zbroj, u mg/kg masnog materijala, na sljedeći način:

pri čemu je:

AEr	=	površina pika eritrodiola u izračunima računalnog sustava.
AUv	=	površina uvaola u izračunima računalnog sustava.
As	=	površina pika α-kolestanola; u izračunima računalnog sustava.
ms	=	masa dodanog α-kolestanola, u miligramima.
m	=	masa uzorka upotrijebljenog za određivanje, u gramima.

Dodatak

1. Ugljikovodici 2. α-tokoferol 3. Prenoli 4. Triterpenski alkoholi 5. Alifatski alkoholi 6. Metil steroli 7. Steroli 8. Triterpenski dialkoholi

Slika 1. – TLC neosapunjive frakcije ulja komine maslina dvaput eluirane heksanom: dietil eter (65:35), razvijen s pomoću SO4H2 (50 %) i zagrijan. Vrpce koje treba sastrugati su one unutar pravokutnika, pod brojem 1 su vrpce alifatskih alkohola, a pod brojem 2 one sterola i triterpenskih dialkohola.

Tablica I. – Relativna retencijska vremena za sterole

Pik	Identifikacijska oznaka		Relativno retencijsko vrijeme
			SE 54 kolona	SE 52 kolona
1.	Kolesterol	Δ-5-kolesten-3ß-ol	0,67	0,63
2.	Kolestanol	5α-kolestan-3ß-ol	0,68	0,64
3.	Brasikasterol	[24S]-24-methil-Δ-5,22-kolestadien-3β-ol	0,73	0,71
*	Ergosterol	[24S]-24-methil-Δ-5,7,22 kolestatrien-3β-ol	0,78	0,76
4.	24-metilen-kolesterol	24-metilen-Δ-5,24-kolestadien-3ß-o1	0,82	0,80.
5.	Kampesterol	(24R)-24-metil-Δ-5-kolesten-3ß-ol	0,83	0,81
6.	Kampestanol	(24R)-24-metil-kolestan-3ß-ol	0,85	0,82
7.	Stigma-sterol	(24S)-24-etil-Δ-5,22-kolestadien-3ß-ol	0,88	0,87
8.	Δ-7-kampesterol	(24R)-24-metil-Δ-7-kolesten-3ß-ol	0,93	0,92
9.	Δ-5,23-stigmastadienol	(24R,S)-24-etil-Δ-5,23-kolestadien-3ß-ol	0,95	0,95
10.	Klerosterol	(24S)-24-etil-Δ-5,25-kolestadien-3ß-ol	0,96	0,96
11.	ß-sitosterol	(24R)-24-etil-Δ-5-kolesten-3ß-ol	1,00	1,00
12.	Sitostanol	24-etil-kolestan-3ß-ol	1,02	1,02
13.	Δ-5-avenasterol	(24Z)-24-etiliden-Δ-kolesten-3ß-ol	1,03	1,03
14.	Δ-5,24-stigmastadienol	(24R,S)-24-etil-Δ-5,24-kolestadien-3ß-ol	1,08	1,08
15.	Δ-7-stigmastenol	(24R,S)-24-etil-Δ-7-kolesten-3ß-ol	1,12	1,12
16.	Δ-7-avenasterol	(24Z)-24-etiliden-Δ-7-kolesten-3ß-ol	1,16	1,16
17.	Eritrodiol	5α-olean-12-en-3β,28-diol	1,41	1,41
18.	Uvaol	Δ12-ursen-3β,28-diol	1,52	1,52

Slika 2. – GC-FID kromatografski profil sterola i triterpenskih dialkohola u rafiniranom maslinovu ulju. (1) Kolesterol, (2) α-kolestanol (I.S.), (3) 24-metilenkolesterol, (4) kampesterol, (5) kampestanol, (6) stigmasterol, (7) Δ5,23-stigmastadienol, (8) klerosterol, (9) β-sitosterol, (10) sitostanol, (11) Δ5-avenasterol, (12) Δ5,24-stigmastadienol, (13) Δ7-stigmastenol, (14) Δ7-avenasterol, (15) eritrodiol, (16) uvaol.

Slika 3. – GC-FID kromatografski profil sterola i triterpenskih dialkohola u maslinovu ulju lampante. (1) Kolesterol, (2) α-kolestanol, (3) brasikasterol, (4) 24-metilenkolesterol, (5) kampesterol, (6) kampestanol, (7) stigmasterol, (8) Δ7-kampesterol, (9) Δ5,23-stigmastadienol, (10) klerosterol, (11) β-sitosterol, (12) sitostanol, (13) Δ5-avenasterol, (14) Δ5,24-stigmastadienol, (15) Δ7-stigmastenol, (16) Δ7-avenasterol, (17) eritrodiol, (18) uvaol.

Slika 4. – GC-FID kromatografski profil alifatskih alkohola i triterpenskih dialkohola u maslinovu ulju. (I.S.) C20-ol, (1) C22-ol, (2) C24-ol, (3) C26-ol, (4) C28-ol, (5) triterpenski alkoholi.

Slika 5. – GC-FID kromatografski profil alifatskih alkohola i triterpenskih dialkohola u rafiniranom maslinovu ulju i maslinovu ulju koje je podvrgnuto dvostrukom centrifugiranju. (I.S.) C20-ol, (1) C22-ol, (2) C24-ol, (3) C26-ol, (4) C28-ol, (5) triterpenski alkoholi.

Slika 6. – HPLC kromatogram neosapunjivog maslinova ulja odvojenog HPLC metodom uz upotrebu UV detektora. (1) Alifatski i triterpenski alkoholi; (2) Steroli i triterpenski dialkoholi