«ANNEXES

SOMMAIRE

Annexe I	Caractéristiques des huiles d'olive
Annexe I bis	Échantillonnage des huiles d'olive ou des huiles de grignons d'olive livrées en conditionnement primaire
Annexe I ter	Diagramme des procédures de vérification de la conformité d'un échantillon d'huile d'olive avec la catégorie déclarée
Annexe II	Détermination des acides gras libres, méthode à froid
Annexe III	Détermination de l'indice de peroxyde
Annexe IV	Détermination de la teneur en cires par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire
Annexe VII	Détermination du pourcentage de 2-glycéryl monopalmitate
Annexe IX	Analyse spectrophotométrique dans l'ultraviolet
Annexe X	Détermination des esters méthyliques d'acides gras par chromatographie en phase gazeuse
Annexe XI	Détermination de la teneur en solvants halogénés volatils de l'huile d'olive
Annexe XII	Méthode du conseil oléicole international pour l'évaluation organoleptique des huiles d'olive vierges
Annexe XV	Teneur en huile des grignons d'olive
Annexe XVI	Détermination de l'indice d'iode
Annexe XVII	Méthode de détermination des stigmastadiènes dans les huiles végétales
Annexe XVIII	Détermination de l'écart entre la teneur réelle et la teneur théorique en triglycérides à ECN 42
Annexe XIX	Détermination de la composition stérolique, et de la teneur en stérols et de la teneur en composés alcooliques par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire
Annexe XX	Méthode de détermination de la teneur en cires, en esters méthyliques d'acides gras et en esters éthyliques d'acides gras par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire
Annexe XXI	Résultats des contrôles de conformité réalisés sur les huiles d'olive visés à l'article 8, paragraphe 2

«ANNEXE I

CARACTÉRISTIQUES DES HUILES D'OLIVE

Caractéristiques de qualité

Esters éthyliques d'acides gras (mg/kg)		≤ 35	—	—	—	—	—	—	—
Évaluation organoleptique	Médiane du fruité (Mf)	Mf > 0,0	Mf > 0,0	—	—	—	—	—	—
	Médiane du défaut (Md) (*)	Md = 0,0	Md ≤ 3,5	Md> 3,5 (1)
Delta-K		≤ 0,01	≤ 0,01	—	≤ 0,16	≤ 0,15	—	≤ 0,20	≤ 0,18
K268 ou K270		≤ 0,22	≤ 0,25	—	≤ 1,25	≤ 1,15	—	≤ 2,00	≤ 1,70
K232		≤ 2,50	≤ 2,60	—	—	—	—	—	—
Indice de peroxyde (mEq O2/kg)		≤ 20,0	≤ 20,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0
Acidité (%) (*)		≤ 0,80	≤ 2,0	> 2,0	≤ 0,30	≤ 1,00	—	≤ 0,30	≤ 1,00
Catégorie		1. Huile d'olive vierge extra	2. Huile d'olive vierge	3. Huile d'olive lampante	4. Huile d'olive raffinée	5. Huile d'olive composée d'huiles d'olive raffinées et d'huiles d'olive vierges	6. Huile de grignons d'olive brute	7. Huile de grignons d'olive raffinée	8. Huile de grignons d'olive

Caractéristiques de pureté

2-glycéril monopalmitate (%)

≤ 0,9 si acide palmitique total en % ≤ 14,00 %

≤ 1,0 si acide palmitique total en % > 14,00 %

≤ 0,9 si acide palmitique total en % ≤ 14,00 %

≤ 1,0 si acide palmitique total en % > 14,00 %

≤ 0,9 si acide palmitique total en % ≤ 14,00 %

≤ 1,1 si acide palmitique total en % > 14,00 %

≤ 0,9 si acide palmitique total en % ≤ 14,00 %

≤ 1,1 si acide palmitique total en % > 14,00 %

≤ 0,9 si acide palmitique total en % ≤ 14,00 %

≤ 1,0 si acide palmitique total en % > 14,00 %

≤ 1,4

≤ 1,4

≤ 1,2

Écart: ECN42 (CLHP) et ECN42 (calcul théorique)

≤ |0,20|

≤ |0,20|

≤ |0,30|

≤ |0,30|

≤ |0,30|

≤ |0,60|

≤ |0,50|

≤ |0,50|

Stigmastadiènes (mg/kg) (3)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,50

—

—

—

—

—

Somme des isomères translinoléiques + translinoléniques (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,10

≤ 0,35

≤ 0,35

Somme des isomères transoléiques (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,40

Composition en acides gras (2)

Lignocérique (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

Béhénique (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,30

Eicosénoïque (%)

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

Arachidique (%)

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

Linolénique (%)

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

Myristique (%)

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

Catégorie

1. Huile d'olive vierge extra

2. Huile d'olive vierge

3. Huile d'olive lampante

4. Huile d'olive raffinée

5. Huile d'olive composée d'huiles d'olive raffinées et d'huiles d'olive vierges

6. Huile de grignons d'olive brute

7. Huile de grignons d'olive raffinée

8. Huile de grignons d'olive

Cires mg/kg (**)		C42 + C44 + C46 ≤ 150	C42 + C44 + C46 ≤ 150	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (6)	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (7)	C40 + C42 + C44 + C46 > 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350
Érythrodiol et uvaol (%) (*)		≤ 4,5	≤ 4,5	≤ 4,5 (6)	≤ 4,5	≤ 4,5	> 4,5 (7)	> 4,5	> 4,5
Stérols totaux (mg/kg)		≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 2 500	≥ 1 800	≥ 1 600
Composition en stérols	Delta-7-stigmasténol (4) (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
	β-sitostérol apparent (5) (%)	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0
	Stigmastérol (%)	< Camp.	< Camp.	-	< Camp.	< Camp.	-	< Camp.	< Camp.
	Campestérol (4) (%)	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0
	Brassicastérol (%)	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,2	≤ 0,2	≤ 0,2
	Cholestérol (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
Catégorie		1. Huile d'olive vierge extra	2. Huile d'olive vierge	3. Huile d'olive lampante	4. Huile d'olive raffinée	5. Huile d'olive composée d'huiles d'olive raffinées et d'huiles d'olive vierges	6. Huile de grignons d'olive brute	7. Huile de grignons d'olive raffinée	8. Huile de grignons d'olive

Remarques:

a)	Les résultats des analyses doivent être exprimés en indiquant le même nombre de décimales que ceux prévus pour chaque caractéristique. Le dernier chiffre doit être augmenté d'une unité si le chiffre suivant dépasse 4.

b)	Il suffit qu'une seule caractéristique ne corresponde pas aux valeurs indiquées pour que l'huile change de catégorie ou soit déclarée non conforme aux fins du présent règlement.

c)	Pour l'huile d'olive lampante, les deux caractéristiques de qualité marquées d'un astérisque (*) peuvent différer simultanément des limites définies pour cette catégorie.

d)

Les caractéristiques marquées de deux astérisques (**) indiquent, pour l'huile de grignons d'olive brute, qu'il est possible que les deux limites applicables diffèrent simultanément des valeurs indiquées. Pour l'huile de grignons d'olive et l'huile de grignons d'olive raffinée, l'une des limites applicables peut différer des valeurs indiquées.

Appendice

Schémas décisionnels

Schéma décisionnel relatif au campestérol pour les huiles d'olive vierges et les huiles d'olive vierges extra:

Les autres paramètres sont conformes aux limites définies dans le présent règlement.

Schéma décisionnel relatif au delta-7-stigmasténol pour:

—	les huiles d'olive vierges et les huiles d'olive vierges extra

Les autres paramètres sont conformes aux limites définies dans le présent règlement.

—	les huiles de grignons d'olive (brutes et raffinées)

Les autres paramètres sont conformes aux limites définies dans le présent règlement.

«ANNEXE I ter

DIAGRAMME DES PROCÉDURES DE VÉRIFICATION DE LA CONFORMITÉ D'UN ÉCHANTILLON D'HUILE D'OLIVE AVEC LA CATÉGORIE DÉCLARÉE

Tableau général

Tableau 1 — Huile d'olive vierge extra — Critères de qualité

Tableau 2 – Huile d'olive vierge – Critères de qualité

Tableau 3 — Huile d'olive vierge extra et huile d'olive vierge — Critères de pureté

Tableau 4 – Huile d'olive lampante – Critères de pureté

Tableau 5 – Huile d'olive raffinée – Critères de qualité

Tableau 6 – Huile d'olive (constituée d'huiles d'olive raffinées et d'huiles d'olive vierges) – critères de qualité

Tableau 7 – Huile d'olive raffinée et huile d'olive constituée d'huiles d'olive raffinées et d'huiles d'olive vierges – critères de pureté

Tableau 8 – Huile de grignons d'olive brute – Critères de pureté

Tableau 9 – Huile de grignons d'olive raffinée – Critères de qualité

Tableau 10 – Huile de grignons d'olive – Critères de qualité

Tableau 11 — Huile de grignons d'olive raffinée et huile de grignons d'olive — Critères de pureté

«ANNEXE XIX

DÉTERMINATION DE LA COMPOSITION STÉROLIQUE, DE LA TENEUR EN STÉROLS ET DE LA TENEUR EN COMPOSÉS ALCOOLIQUES PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE SUR COLONNE CAPILLAIRE

1.   CHAMP D'APPLICATION

La méthode décrit le procédé de détermination de la teneur en chaque composé alcoolique et en composés alcooliques totaux des huiles d'olive et des huiles de grignons d'olive ainsi que des mélanges de ces deux huiles.

Les composés alcooliques présents dans les huiles d'olive et huiles de grignons d'olive comprennent des alcools aliphatiques, des stérols et des diols triterpéniques.

2.   PRINCIPE

Saponification des huiles, additionnées d'α-cholestanol et de 1-eicosanol comme étalons internes, avec de l'hydroxyde de potassium en solution dans de l'éthanol, puis extraction de l'insaponifiable au moyen d'éther éthylique.

Les différentes fractions des composés alcooliques sont séparées de l'insaponifiable soit par chromatographie en couche mince sur plaque de gel de silice basique (méthode de référence), soit par CLHP sur colonne de gel de silice. La fraction issue de la séparation sur gel de silice est transformée en triméthyl-silyl-éthers, qui sont ensuite analysés par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire.

PARTIE 1

PRÉPARATION DE L'INSAPONIFIABLE

1.   CHAMP D'APPLICATION

La présente partie décrit la préparation et l'extraction de l'insaponifiable. Elle comprend la préparation et l'extraction de l'insaponifiable des huiles d'olive et huiles de grignons d'olive.

2.   PRINCIPE

Une prise d'essai est saponifiée par ébullition sous reflux avec une solution éthanolique d'hydroxyde de potassium. L'insaponifiable est extrait avec de l'éther diéthylique.

3.   APPAREILLAGE

Le matériel courant de laboratoire, et notamment les éléments suivants:

3.1.	ballon de 250 ml équipé d'un réfrigérant à reflux à embouts rodés,

3.2.	ampoule à décanter de 500 ml,

3.3.	flacons de 250 ml,

3.4.	microseringues de 100 μl et 500 μl,

3.5.	ampoule cylindrique filtrante à filtre poreux G 3 (porosité 15 à 40 μm) d'environ 2 cm de diamètre et 5 cm de hauteur, appropriée pour la filtration sous vide, avec embout rodé mâle,

3.6.	fiole conique de 50 ml avec embout rodé femelle adaptable à l'ampoule filtrante (3.5),

3.7.	tube à fond conique de 10 ml, avec bouchon hermétique en verre,

3.8.	dessiccateur au dichlorure de calcium.

4.   RÉACTIFS

4.1.	Hydroxyde de potassium (titre minimum 85 %).

4.2.

Hydroxyde de potassium en solution éthanolique à environ 2 M. Dissoudre, tout en refroidissant, 130 g d'hydroxyde de potassium (4.1) dans 200 ml d'eau distillée, puis compléter jusqu'à un litre avec de l'éthanol (4.7). Conserver cette solution dans des bouteilles en verre sombre bien fermées pendant 2 jours au maximum.

4.3.	Éther éthylique pour analyses.

4.4.	Sulfate de sodium anhydre pour analyses.

4.5.	Acétone pour chromatographie.

4.6.	Éther éthylique pour chromatographie.

4.7.	Éthanol pour analyses.

4.8.	Acétate d'éthyle pour analyses.

4.9.	Étalon interne, α-cholestanol, de pureté supérieure à 99 % (la pureté doit être vérifiée par analyse chromatographique en phase gazeuse).

4.10.

Solution étalon interne d'α-cholestanol à 0,2 % (m/V) dans de l'acétate d'éthyle (4.8).

4.11.

Solution de phénolphtaléine, 10 g/l dans de l'éthanol (4.7).

4.12.

Solution de 1-eicosanol à 0,1 % (m/V) dans de l'acétate d'éthyle (étalon interne).

5.   MODE OPÉRATOIRE

À l'aide d'une microseringue de 500 μl (3.4), introduire dans le ballon de 250 ml (point 3.1) un volume de la solution étalon interne d'α-cholestanol (4.10) et un volume de la solution de 1-eicosanol (4.12) contenant une quantité de cholestanol et d'eicosanol correspondant approximativement à 10 % de la teneur en stérols et en alcools de l'échantillon. Par exemple, pour 5 g d'échantillon d'huile d'olive, ajouter 500 μl de la solution d'α-cholestanol (4.10) et 250 μl de la solution de 1-eicosanol (4.12). Pour les huiles de grignons d'olive, ajouter 1 500 μl de solution d'α-cholestanol (4.10) et de 1-eicosanol (4.12). Laisser évaporer complètement sous un léger courant d'azote dans un bain d'eau tiède. Après refroidissement du ballon, peser 5,00 ± 0,01 g d'échantillon filtré et sec dans le même ballon.

Remarque 1:

les huiles et les graisses animales ou végétales contenant de grandes quantités de cholestérol peuvent présenter un pic dont le temps de rétention est identique à celui du cholestanol. En pareil cas, la fraction stérolique devra être analysée deux fois, avec et sans étalon interne.

Ajouter 50 ml de solution éthanolique 2M d'hydroxyde de potassium (4.2) et un peu de poudre de ponce; mettre en place le réfrigérant à reflux et porter à ébullition jusqu'à la saponification (la solution devient limpide). Continuer à chauffer pendant 20 minutes, puis verser 50 ml d'eau distillée du haut du réfrigérant. Débrancher le réfrigérant et laisser refroidir le ballon jusqu'à environ 30 °C.

Transvaser le contenu du ballon quantitativement dans une ampoule à décanter de 500 ml (3.2) en pratiquant plusieurs lavages à l'eau distillée (50 ml). Ajouter environ 80 ml d'éther éthylique (4.6) et agiter énergiquement durant environ 60 secondes. Décompresser régulièrement en retournant le décanteur et en ouvrant le robinet. Laisser reposer jusqu'à séparation complète des deux phases (Remarque 2). Transvaser ensuite le plus complètement possible la solution savonneuse dans un deuxième décanteur. Pratiquer encore deux extractions sur la phase hydro-alcoolique, selon les mêmes modalités, en utilisant 60 à 70 ml d'éther éthylique (4.6).

Remarque 2:

les émulsions peuvent être éliminées par l'ajout de petites quantités d'éthanol (4.7).

Verser les trois extraits d'éther dans une ampoule à décanter contenant 50 ml d'eau. Laver à l'eau (50 ml) jusqu'à ce que l'eau de lavage ne prenne plus de teinte rosée à l'ajout d'une goutte de solution de phénolphtaléine (4.11). Après élimination de l'eau de lavage, filtrer sur du sulfate de sodium anhydre (4.4) dans un flacon de 250 ml préalablement pesé, en lavant l'ampoule et le filtre avec de petites quantités d'éther éthylique (4.6).

Évaporer le solvant par distillation dans un évaporateur rotatif, à 30 oC et sous vide. Ajouter 5 ml d'acétone (4.5) et éliminer complètement le solvant volatil sous un léger courant d'azote. Sécher le résidu à l'étuve à 103 ± 2 °C pendant 15 min. Faire refroidir dans un dessiccateur et peser à 0,1 mg près.

PARTIE 2

SÉPARATION DES FRACTIONS DES COMPOSÉS ALCOOLIQUES

1.   OBJET

Fractionnement de l'insaponifiable, préparé dans la partie 1, en ses différents composés alcooliques, alcools aliphatiques, stérols et dioles triterpéniques (érythrodiol et uvaol).

2.   PRINCIPE

Fractionnement de l'insaponifiable par chromatographie en couche mince (méthode de référence), révélation des plaques et raclage et extraction des bandes correspondantes. Une autre méthode de séparation consiste à procéder par CLHP sur colonne de gel de silice avec détecteur UV, en collectant les différentes fractions. Les alcools aliphatiques et les alcools triterpéniques, d'un côté, ainsi que les stérols et les dioles triterpéniques, de l'autre, sont isolés conjointement.

3.   APPAREILLAGE

Le matériel courant de laboratoire, et notamment les éléments suivants:

3.1.	équipement complet pour chromatographie en couche mince, avec plaques de verre de 20 × 20 cm,

3.2.	lampe à lumière ultraviolette d'une longueur d'onde de 366 ou 254 nm,

3.3.	microseringues de 100 μl et 500 μl,

3.4.	ampoule cylindrique filtrante à filtre poreux G 3 (porosité 15 à 40 μm) d'environ 2 cm de diamètre et 5 cm de hauteur, appropriée pour la filtration sous vide, avec embout rodé mâle,

3.5.	fiole conique de 50 ml avec embout rodé femelle adaptable à l'ampoule filtrante (3.4),

3.6.	tube à essai à fond conique de 10 ml, avec bouchon hermétique en verre,

3.7.	dessiccateur au dichlorure de calcium.

3.8.	Système CLHP constitué des éléments suivants: 3.8.1. pompe binaire, 3.8.2. injecteur manuel ou automatique muni d'une boucle d'injection de 200 μl, 3.8.3. dégazeur en ligne, 3.8.4. détecteur UV-VIS ou IR,

3.9.	colonne CLHP (25 cm x 4 mm de diamètre interne) avec gel de silice 60 (granulométrie 5 μm),

3.10.

filtre à seringues, 0,45 μm.

3.11.

Fiole conique de 25 ml.

4.   RÉACTIFS

4.1.	Hydroxyde de potassium (titre minimum 85 %).

4.2.

Hydroxyde de potassium en solution éthanolique à environ 2 M. Dissoudre, tout en refroidissant, 130 g d'hydroxyde de potassium (4.1) dans 200 ml d'eau distillée, puis compléter jusqu'à un litre avec de l'éthanol (4.9). Conserver cette solution dans des bouteilles en verre sombre bien fermées pendant 2 jours au maximum.

4.3.	Éther éthylique pour analyses.

4.4.	Hydroxyde de potassium en solution éthanolique à environ 0,2 M. Dissoudre 13 g d'hydroxyde de potassium (4.1) dans 20 ml d'eau distillée, puis compléter jusqu'à un litre avec de l'éthanol (4.9).

4.5.	Plaques de verre (20 cm × 20 cm) recouvertes de gel de silice sans indicateur de fluorescence, de 0,25 mm d'épaisseur (disponibles dans le commerce déjà prêtes à l'emploi).

4.6.	Acétone, de qualité chromatographique.

4.7.	n-Hexane pour chromatographie.

4.8.	Éther éthylique pour chromatographie.

4.9.	Éthanol pour analyses.

4.10.

Acétate d'éthyle pour analyses.

4.11.

Solution de référence pour la chromatographie en couche mince: solution à 5 % de cholestérol, phytostérols, alcools et érythrodiol dans de l'acétate d'éthyle (4.10).

4.12.

Solution éthanolique à 0,2 % de dichloro-2′,7′ fluorescéine. Ajouter quelques gouttes d'une solution alcoolique 2M d'hydroxyde de potassium (4.2) pour la rendre légèrement basique.

4.13.

Mélange 65:35 (v/v) de n-Hexane (4.7) et éther éthylique (4.8).

4.14.

Phase mobile pour CLHP: mélange 1:1 (v/v) de n-Hexane (4.7) et éther éthylique (4.8).

5.   MÉTHODE DE RÉFÉRENCE: SÉPARATION DES COMPOSÉS ALCOOLIQUES PAR CHROMATOGRAPHIE EN COUCHE MINCE (CCM)

Préparation des plaques basiques de chromatographie en couche mince. Enfoncer les plaques de gel de silice (4.5) dans environ 4 cm de solution éthanolique d'hydroxyde de potassium 0,2 M (4.4) pendant 10 secondes, puis les laisser sécher dans une hotte pendant deux heures avant de les placer dans une étuve à 100 °C pendant une heure.

Sortir les plaques de l'étuve et les conserver dans un dessiccateur au chlorure de calcium (3.7) jusqu'au moment de l'emploi (les plaques ainsi traitées doivent être employées dans les quinze jours).

Introduire le mélange hexane/éther éthylique (4.13) (Remarque 3) dans la cuve de développement, à une profondeur d'environ 1 cm. Fermer la cuve à l'aide du couvercle approprié et laisser ainsi pendant au moins une demi-heure, dans un endroit frais, de façon que l'équilibre liquide/vapeur s'établisse. Il est possible de placer sur les surfaces internes de la cuve des bandes de papier filtre qui plongent dans l'éluant: cette précaution permet de réduire d'un tiers environ les temps de migration du front du liquide et d'obtenir une élution plus uniforme des composants.

Remarque 3:

Afin d'avoir des conditions d'élution parfaitement reproductibles, le mélange doit être renouvelé à chaque essai. Un solvant n-hexane/éther éthylique 50:50 (V/V) peut également être utilisé.

Préparer une solution à 5 % environ d'insaponifiable préparé dans la partie 1 dans l'acétate d'éthyle (4.10) et, à l'aide de la microseringue de 100 μl (3.3), déposer 0,3 ml de cette solution en une ligne continue fine et uniforme à l'extrémité inférieure (2 cm) de la plaque chromatographique (4.5). À la hauteur de cette ligne, déposer 2 à 3 μl de la solution de référence (4.11) afin de pouvoir repérer les bandes des stérols, des diols triterpéniques et des alcools après migration.

Placer la plaque dans la cuve de développement (3.1). La température ambiante doit être maintenue entre 15 et 20 °C (Remarque 4). Fermer aussitôt la cuve avec le couvercle et laisser éluer jusqu'à ce que le front de solvant arrive à environ 1 cm du bord supérieur de la plaque. Sortir ensuite la plaque de la cuve de développement et faire évaporer le solvant dans un courant d'air chaud ou bien en laissant la plaque sous hotte pendant un petit moment.

Remarque 4:

des températures plus élevées pourraient être moins favorables à la séparation.

Vaporiser la plaque légèrement et uniformément avec la solution de dichloro-2′ -7′ fluorescéine (point 4.12), puis laisser sécher. Sur la plaque observée sous une lampe à rayonnement ultra-violet (3.2), les bandes des stérols, diols triterpéniques et alcools peuvent être identifiées par alignement avec les taches obtenues à l'aide de la solution de référence (4.11). Délimiter les bandes avec un crayon noir en suivant les bords de la fluorescence (voir plaque chromatographique, figure 1).

À l'aide d'une spatule métallique, racler le gel de silice présent dans la zone délimitée. Le matériau retiré, finement broyé, est introduit dans l'ampoule filtrante (3.4); Ajouter 10 ml d'acétate d'éthyle chaud (4.10), mélanger soigneusement avec la spatule métallique et filtrer (sous vide, si nécessaire). Recueillir le filtrat dans la fiole conique (3.5) reliée à l'ampoule filtrante.

Laver le résidu dans l'ampoule par trois fois à l'éther éthylique (4.3) (environ 10 ml à chaque fois) et recueillir le filtrat dans la même fiole adaptée à l'ampoule filtrante. Évaporer le filtrat jusqu'à un volume de 4 à 5 ml, transférer la solution résiduelle dans le tube de 10 ml (3.6) pesé au préalable, laisser évaporer complètement en chauffant légèrement sous léger courant d'azote, reprendre avec quelques gouttes d'acétone (point 4.6) et laisser de nouveau évaporer complètement. Le résidu contenu dans le tube est constitué de la fraction des stérols et diols triterpéniques ou de la fraction des alcools et alcools triterpéniques.

6.   SÉPARATION DE LA FRACTION ALCOOLIQUE PAR CLHP

Dissoudre dans 3 ml de phase mobile (4.14) l'insaponifiable obtenu comme indiqué dans la partie 1, filtrer la solution avec un filtre à seringues (3.10) et réserver.

Injecter dans l'équipement de CLHP (3.8) 200 μl de solution insaponifiable filtrée.

Procéder à la séparation par CLHP à un débit de 0,8 ml/mn, éliminer l'éluat des 5 premières minutes, recueillir l'éluat dans des fioles coniques de 25 ml (3.11) entre les 5 et 10 premières minutes pour les alcools aliphatiques et triterpéniques et entre les 11 et 25 premières minutes pour les stérols ainsi que pour l'érythrodiol et l'uvaol (Remarque 5).

La séparation peut être contrôlée au moyen d'un détecteur UV à une longueur d'ondes de 210 nm ou d'un détecteur à indice de réfraction (voir figure 6).

Les fractions sont évaporées jusqu'à dessiccation puis préparées pour l'analyse chromatographique.

Remarque 5:

Étant donné que l'éther éthylique peut augmenter la pression, il est nécessaire de surveiller attentivement la pression de la pompe de l'équipement CLHP et d'adapter le débit pour maintenir la pression sous contrôle.

PARTIE 3

ANALYSE CHROMATOGRAPHIQUE EN PHASE GAZEUSE DES FRACTIONS DES COMPOSÉS ALCOOLIQUES

1.   OBJET

La présente partie donne des directives générales pour la détermination par chromatographie en phase gazeuse par colonne capillaire de la composition qualitative et quantitative des composés alcooliques isolés selon la procédure indiquée dans la partie 2 de la présente méthode.

2.   PRINCIPE

Les fractions obtenues à partir de l'insaponifiable par chromatographie en couche mince ou par CLHP sont transformées en triméthylsilyléthers, qui sont ensuite analysés par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire avec dispositif d'injection à débit divisé et détecteur à ionisation de flamme.

3.   APPAREILLAGE

Le matériel courant de laboratoire, et notamment les éléments suivants:

3.1.	tube à essai à fond conique de 10 ml, avec bouchon hermétique en verre;

3.2.

appareil de chromatographie en phase gazeuse pouvant être utilisé sur une colonne capillaire avec dispositif d'injection à débit divisé, composé des éléments suivants: 3.2.1. un four thermostaté pour les colonnes, pouvant maintenir la température souhaitée avec une précision de ± 1 °C; 3.2.2. un ensemble d'injection thermoréglable avec élément vaporisateur en verre persilylaté et système à débit divisé; 3.2.3. un détecteur à ionisation de flamme; 3.2.4. un système d'acquisition des données pouvant être utilisé avec l'analyseur FID (3.10.3.), avec possibilité d'intégration manuelle.

3.3.	Colonne capillaire en silice fondue d'une longueur de 20 à 30 m, d'un diamètre interne compris entre 0,25 et 0,32 mm, recouverte de 5 % diphényle - 95 % diméthylpolysiloxane (phase stationnaire SE-52 ou SE-54 ou équivalent) jusqu'à obtention d'une épaisseur uniforme comprise entre 0,10 et 0,30 μm.

3.4.	Microseringue d'une capacité de 10 μl, pour chromatographie en phase gazeuse, avec aiguille soudée, convenant pour l'injection à débit divisé.

4.   RÉACTIFS

4.1.	Pyridine anhydre pour chromatographie.

4.2.	Disilazane d'hexaméthyle pour analyses.

4.3.	Triméthylchlorosilane pour analyses.

4.4.	Solutions échantillons des triméthylsilyléthers des stérols. À préparer au moment de l'emploi à partir des stérols et de l'érythrodiol tirés des huiles qui les contenaient.

4.5.	Solution étalon de triméthylsilyléthers des alcools aliphatiques de C20 à C28. À préparer au moment de l'emploi à partir de mélanges d'alcools purs.

4.6.	Gaz vecteur: hydrogène ou hélium pur, pour chromatographie en phase gazeuse.

4.7.	Gaz auxiliaires: hydrogène, hélium, azote et air, pour chromatographie en phase gazeuse.

4.8.	Réactif de silylation, constitué d'un mélange 9: 3: 1 (V/V/V) de pyridine/hexaméthyldisilazane/triméthylchlorosilane.

4.9.	n-Hexane, de qualité chromatographique.

5.   PRÉPARATION DES TRIMÉTHYL-SILYL-ÉTHERS

Ajouter le réactif de silylation (4.8) (Remarque 6), à raison de 50 μl par milligramme de composé alcoolique, dans le tube (3.1) contenant la fraction de composé alcoolique, en évitant toute absorption d'humidité (Remarque 7).

Remarque 6:

des solutions prêtes à l'emploi sont disponibles dans le commerce. D'autres réactifs silylants sont également disponibles, tels que, par exemple, le bistriméthylsilyltrifluoracétamide + 1 % de triméthylchlorosilane à diluer par un même volume de pyridine anhydre. La pyridine peut être remplacée par la même quantité d'acétonitrile.

Remarque 7:

la formation éventuelle d'une légère opalescence est normale et n'est la cause d'aucune anomalie. La formation d'une floculation blanche ou l'apparition d'une coloration rose sont l'indice de la présence d'humidité ou d'altération du réactif. En pareil cas, l'essai doit être répété (uniquement en cas d'utilisation d'hexaméthyldisilazane ou de triméthylchlorosilane).

Boucher le tube (3.1), agiter soigneusement (sans retourner) jusqu'à solubilisation complète des composés. Laisser reposer pendant au moins 15 minutes à température ambiante, puis centrifuger pendant quelques minutes. La solution limpide est prête pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse.

6.   ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE

6.1.   Opérations préliminaires, conditionnement de la colonne capillaire

Installer la colonne (3.3) dans le chromatographe, en reliant l'extrémité d'entrée à l'injecteur à débit divisé et l'extrémité de sortie au détecteur.

Effectuer les contrôles habituels du système de chromatographie en phase gazeuse (étanchéité du circuit des gaz, efficacité du détecteur, efficacité du système diviseur et du système d'enregistrement, etc.).

Si la colonne est utilisée pour la première fois, il est conseillé de procéder à son conditionnement: faire passer un léger flux de gaz à travers cette colonne, puis mettre le chromatographe en marche et chauffer graduellement jusqu'à atteindre une température excédant d'au moins 20 °C la température de travail (Remarque 8). Maintenir cette température pendant au moins deux heures, puis mettre l'ensemble du système de chromatographie en mode de fonctionnement (réglage des débits gazeux et du système diviseur, allumage de la flamme, raccordement avec l'enregistreur électronique, réglage de la température de la colonne, du détecteur et de l'injecteur, etc.), puis enregistrer le signal avec une sensibilité au moins deux fois supérieure à celle prévue pour l'analyse. Le tracé de la ligne de base obtenue doit être linéaire, exempt de pic de quelque nature que ce soit et ne doit pas présenter de dérive. Une dérive rectiligne négative indique une étanchéité imparfaite des connexions de la colonne, une dérive positive indique un conditionnement insuffisant de la colonne.

Remarque 8:

la température de conditionnement doit être toujours inférieure d'au moins 20 °C à la température maximale prévue pour la phase stationnaire utilisée.

6.2.   Conditions d'utilisation

Optimiser le programme de température et le débit du gaz vecteur de manière à obtenir des chromatogrammes similaires à ceux des figures 3 à 6.

Les paramètres suivants ont été testés et jugés utiles:

6.2.1.   Alcools aliphatiques

Programme de température du four	180 °C (8 mn) → 260 °C (gradient de 5 °C/mn) → 260 °C (15 mn)
Température de l'injecteur	280 °C
Température du détecteur	290 °C
Vitesse linéaire du gaz vecteur	Hélium (20 à 30 cm/s); Hydrogène (30 à 50 cm/s)
Rapport de division	de 1/50 à 1/100
Volume injecté	de 0,5 à 1 μl de solution de triméthyl-silyl-éthers.

6.2.2.   Stérols et diols triterpéniques

Programme de température du four	260 ± 5 °C, conditions isothermiques
Température de l'injecteur	280 – 300 °C
Température du détecteur	280 – 300 °C
Vitesse linéaire du gaz vecteur	Hélium (20 à 30 cm/s); Hydrogène (30 à 50 cm/s)
Rapport de division	de 1/50 à 1/100
Volume injecté	de 0,5 à 1 μl de solution de triméthyl-silyl-éthers.

Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques de la colonne et de l'appareil de chromatographie en phase gazeuse, de façon à obtenir des chromatogrammes satisfaisant aux conditions suivantes:

—	le temps de rétention de l'alcool en C26 doit être de 18 ± 5 minutes.

—	le pic de l'alcool en C22 doit être 80 % ± 20 % fond d'échelle pour l'huile d'olive et 40 % ± 20 % fond d'échelle pour l'huile de grignons d'olive.

—	le temps de rétention du ß-sitostérol doit être de 20 mn ± 5 mn;

—	le pic du campestérol doit être: pour l'huile d'olive (teneur moyenne 3 %) 20 % ± 5 % fond d'échelle.

—

tous les stérols présents doivent être séparés. Les pics doivent être non seulement séparés mais aussi complètement résolus, c'est-à-dire que le tracé du pic doit rejoindre la ligne de base avant la sortie du pic suivant. Une résolution incomplète est toutefois tolérée à condition toutefois que le pic à RRT 1,02 (sitostanol) soit quantifiable en utilisant la perpendiculaire.

6.3.   Procédure d'analyse

À l'aide de la microseringue de 10 μl (3.4), prélever 1 μl d'hexane, aspirer 0,5 μl d'air, puis 0,5 à 1 μl de la solution échantillon. Tirer à nouveau le piston de la seringue de façon que l'aiguille soit vide. Introduire l'aiguille à travers la membrane de l'injecteur et, après une à deux secondes, injecter rapidement et extraire ensuite l'aiguille lentement, au bout de cinq secondes environ. Un injecteur automatique peut également être employé.

Procéder à l'enregistrement jusqu'à élution complète des triméthylsilyéthers des composés alcooliques présents. La ligne de base doit continuer de satisfaire aux conditions opératoires correspondantes (6.2.1 ou 6.2.2).

6.4.   Identification des pics

L'identification des différents pics est effectuée sur la base des temps de rétention et par comparaison avec le mélange des alcools aliphatiques et alcools triterpéniques, d'une part, et des stérols et des diols triterpéniques, d'autre part, analysés dans les mêmes conditions. La figure 3 représente un chromatogramme des alcools aliphatiques et triterpéniques et la figure 2 les chromatogrammes correspondants des stérols et des diols triterpéniques.

Les alcools aliphatiques sont élués dans l'ordre suivant: C20-ol (S.I.), C22-ol, C23-ol, C24-ol, C25-ol, C26-ol, C27-ol et C28-ol.

Les stérols et les diols triterpéniques sont élués dans l'ordre suivant: cholestérol, brassicastérol, ergostérol, 24-méthylène-cholestérol, campestérol, campestanol, stigmastérol, Δ7-campestérol, Δ5,23-stigmastadiénol, clérosterol, ß-sistostérol, sitostanol, Δ5-avenastérol, Δ5,24-stigmastadiénol, Δ7-stigmasténol, Δ7-avenastérol, érythrodiol et uvaol.

6.5.   Évaluation quantitative

Procéder, au moyen d'un système d'acquisition des données, au calcul de l'aire des pics du 1-eicosanol et des alcools aliphatiques C22, C24, C26 et C28. Le coefficient de réponse pour le 1-eicosanol doit être considéré comme étant égal à 1.

Procéder au calcul des aires des pics de l'α-cholestanol, des stérols et des diols triterpéniques à l'aide du système d'intégration. Ne pas tenir compte des pics des composés qui ne figurent pas dans le tableau 1 (l'aire du pic de l'ergostérol ne doit pas être calculée). Le coefficient de réponse pour l'α-cholestanol doit être considéré comme étant égal à 1.

Calculer la concentration de chaque composé alcoolique, en mg/kg de matière grasse, comme suit:

où:

Ax	=	aire du pic du composé alcoolique x, en unités d'intégration;
As	=	aire du pic du 1-eicosanol/α-cholestanol, en unités d'intégration;
ms	=	masse de 1-eicosanol/α-cholestanol ajoutée, en milligrammes;
m	=	masse de l'échantillon utilisé pour la détermination, en grammes.

7.   EXPRESSION DES RÉSULTATS

Déclarer les concentrations de chaque alcool aliphatique et alcool triterpénique en mg/kg de matière grasse et la somme des différentes concentrations en tant que «teneur totale en alcools aliphatiques». La teneur totale est la somme de C22, C24, C26 et C28.

La composition de chacun des composés alcooliques est exprimée par des nombres à une décimale.

La teneur en stérols totaux est exprimée par un nombre entier.

Calculer le pourcentage de chaque stérol à partir du rapport entre l'aire du pic correspondant et la somme des aires des pics des stérols:

où:

Ax	=	aire du pic du stérol x;
ΣA	=	somme des aires des pics des stérols.

β-sitostérol apparent: Δ5,23-stigmastadiénol + clérostérol + β-sitostérol + sitostanol + Δ5-avenastérol + Δ5,24-stigmastadiénol.

Calculer le pourcentage d'érytrodiol et d'uvaol:

où:

AEr	=	aire du pic d'érythrodiol, en unités d'intégration;
AUv	=	aire du pic d'uvaol, en unités d'intégration.
Σ ΑΤ	=	somme des aires des pics des stérols, de l'érythrodiol et de l'uvaol, en unités d'intégration.

En plus du pourcentage relatif de chaque stérol et diol triterpénique et de la concentration totale en stérols, calculer la concentration d'érythrodiol et d'uvaol et ainsi que la somme de ces concentrations, en mg/kg de matière grasse, au moyen des formules suivantes:

où:

AEr	=	aire du pic d'érythrodiol, en unités d'intégration;
AUv	=	aire du pic d'uvaol, en unités d'intégration.
As	=	aire du pic d'α-cholestanol, en unités d'intégration;
ms	=	masse d'α-cholestanol ajoutée, en milligrammes;
m	=	masse de l'échantillon utilisé pour la détermination, en grammes.

Appendice

1 Hydrocarbures 2 α-tocophérol 3 Prénols 4 Alcools triterpéniques 5 Alcools aliphatiques 6 Méthyl-stérols 7 Stérols 8 Diols triterpéniques

Figure 1- Chromatographie en couche mince de la fraction insaponifiable d'huile de grignons d'olive éluée deux fois au moyen d'un mélange 65:35 d'héxane et d'éther diéthylique, révélé avec H2SO4 (50 %) et chauffé. Les bandes à racler sont celles délimitées par les rectangles: 1 désigne les bandes des alcools aliphatiques et 2 celles des stérols et des diols triterpéniques.

Tableau I - Temps de rétention relatifs des stérols

Pic	Identification		Temps de rétention relatifs
			Colonne SE 54	Colonne SE 52
1	Cholestérol	Δ-5-cholestén-3ß-ol	0,67	0,63
2	Cholestanol	5α-cholestan-3ß-ol	0,68	0,64
3	Brassicastérol	[24S]-24-méthyl-Δ-5,22-cholestadién-3β-ol	0,73	0,71
*	Ergostérol	[24S]-24-méthyl-Δ-5,7,22-cholestatrién-3β-ol	0,78	0,76
4	24-méthylène-cholestérol	24-méthylène-Δ-5,24-cholestadién-3ß-o1	0,82	0,80
5	Campestérol	(24R)-24-méthyl-Δ-5-cholestén-3ß-ol	0,83	0,81
6	Campestanol	(24R)-24-méthyl-cholestan-3ß-ol	0,85	0,82
7	Stigmastérol	(24S)-24-éthyl-Δ-5,22-cholestadién-3ß-ol	0,88	0,87
8	Δ-7-campestérol	(24R)-24-méthyl-Δ-7-cholestén-3ß-ol	0,93	0,92
9	Δ-5,23-stigmastadiénol	(24R,S)-24-éthyl-Δ-5,23-choIestadién-3ß-ol	0,95	0,95
10	Clérostérol	(24S)-24-éthyl-Δ-5,25-cholestadién-3ß-ol	0,96	0,96
11	ß-sitostérol	(24R)-24-éthyl-Δ-5-cholestén-3ß-ol	1,00	1,00
12	Sitostanol	24-éthyl-cholestan-3ß-ol	1,02	1,02
13	Δ-5-avénastérol	(24Z)-24-éthylidène-Δ-cholestén-3ß-ol	1,03	1,03
14	Δ-5,24-stigmastadiénol	(24R,S)-24-éthyl-Δ-5,24-cholestadién-3ß-ol	1,08	1,08
15	Δ-7-stigmasténol	(24R,S)-24-éthyl-Δ-7-cholestén-3ß-ol	1,12	1,12
16	Δ-7-avénastérol	(24Z)-24-éthylidène-Δ-7-cholestén-3ß-ol	1,16	1,16
17	Érythrodiol	5-α-oléan-12-én-3β,28-diol	1,41	1,41
18	Uvaol	Δ12-ursen-3β,28-diol	1,52	1,52

Figure 2 - Profil de chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme des stérols et des diols triterpéniques de l'huile d'olive raffinée. 1) Cholestérol, 2) α-cholestanol (I.S.), 3) 24-méthylencholestérol, 4) campestérol, 5) campestanol, 6) stigmastérol, 7) Δ5,23-stigmastadiénol, 8) clérostérol, 9) β-sitostérol, 10) sitostanol, 11) Δ-5-avénastérol, 12) Δ5,24-stigmastadiénol, 13) Δ7-stigmasténol, 14) Δ7-avénastérol, 15) érythrodiol, 16) uvaol.

Figure 3 - Profil de chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme des stérols et des diols triterpéniques de l'huile d'olive lampante. 1) Cholestérol, 2) α-cholestanol, 3) brassicastérol, 4) 24-méthylencholestérol, 5) campestérol, 6) campestanol, 7) stigmastérol, 8) Δ7-campestérol, 9) Δ5,23-stigmastadiénol, 10) clérostérol, 11) β-sitostérol, 12) sitostanol, 13) Δ-5-avénastérol, 14) Δ5,24-stigmastadiénol, 15) Δ7-stigmasténol, 16) Δ7-avénastérol, 17) érythrodiol, 18) uvaol.

Figure 4 - Profil de chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme des alcools aliphatiques et des alcools triterpéniques de l'huile d'olive. (I.S.) C20-ol, 1) C22-ol, 2) C24-ol, 3) C26-ol, 4) C28-ol, 5) alcools triterpéniques.

Figure 5 - Profil de chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme des alcools aliphatiques et des alcools triterpéniques d'une huile d'olive raffinée et d'une huile d'olive de deuxième centrifugation. (I.S.) C20-ol, 1) C22-ol, 2) C24-ol, 3) C26-ol, 4) C28-ol, 5) alcools triterpéniques.

Figure 6 - Profil CLHP d'une fraction insaponifiable d'huile d'olive, séparée par CLHP au moyen d'un détecteur UV. 1) Alcools aliphatiques et alcools triterpéniques; 2) Stérols et diols triterpéniques.