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REGOLAMENTO ( CEE ) N . 1058/77 DELLA COMMISSIONE

del 18 maggio 1977

relativo alle caratteristiche degli oli d ' oliva e di taluni prodotti contenenti olio d ' oliva e recante modifica della nomenclatura della tariffa doganale comune per quanto riguarda l ' olio d ' oliva

LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE ,

visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea ,

visto il regolamento n . 136/66/CEE del Consiglio , del 22 settembre 1966 , relativo all ' attuazione di un ' organizzazione comune dei mercati nel settore dei grassi ( 1 ) , modificato da ultimo dal regolamento ( CEE ) n . 1707/73 ( 2 ) , in particolare l ' articolo 13 , paragrafo 4 , e l ' articolo 18 , paragrafo 3 ,

visto il regolamento n . 162/66/CEE del Consiglio , del 27 ottobre 1966 , relativo agli scambi di grassi tra la Comunità e la Grecia ( 3 ) , in particolare l ' articolo 3 , paragrafo 4 , e l ' articolo 9 ,

visto il regolamento ( CEE ) n . 443/72 del Consiglio , del 29 febbraio 1972 , relativo ai prelievi applicabili all ' olio d ' oliva che ha subito un processo di raffinazione e ad alcuni prodotti contenenti olio d ' oliva ( 4 ) , in particolare l ' articolo 8 ,

considerando che attualmente tutti gli oli d ' oliva vergini sono inclusi nella sottovoce 15.07 A II a ) della tariffa doganale comune ; che per tutti questi prodotti viene quindi fissato un unico prelievo ; che , per conseguire l ' obiettivo prefisso del prelievo all ' importazione , occorre fissare il medesimo per i diversi tipi di olio vergine , distinguendo a tal fine gli oli d ' oliva secondo le loro caratteristiche fisico-chimiche ; che occorre pertant ritoccare la nomenclatura della tariffa doganale comune ;

considerando che la nomenclatura tariffaria risultante dall ' applicazione del regolamento n . 136/66/CEE è riprodotta nella tariffa doganale comune allegata al regolamento ( CEE ) n . 950/68 ( 5 ) , modificato da ultimo dal regolamento ( CEE ) n . 874/77 ( 6 ) ;

considerando che , ai fini di un corretto funzionamento del regime di prelievi applicabile all ' importazione delle sanse di olive , è opportuno prevedere un metodo unico per la determinazione del relativo tenore d ' olio ;

considerando che il regolamento ( CEE ) n . 618/72 della Commissione , del 29 marzo 1972 , relativo alle caratteristiche degli oli d ' oliva e di alcuni prodotti contenenti olio d ' oliva ( 7 ) , è stato ripetutamente modificato , in particolare dal regolamento ( CEE ) n . 3366/75 ( 8 ) , che , date le nuove modifiche da introdurre nel regolamento ( CEE ) n . 618/72 , si è ritenuto opportuno abrogarlo e inserire in un nuovo regolamento il complesso delle disposizioni ;

considerando che le misure previste dal presente regolamento sono conformi al parere del comitato di gestione per i grassi ,

HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO :

Articolo 1

1 . È considerato olio d ' oliva ai sensi della sottovoce 15.07 A della tariffa doganale comune unicamente l ' olio proveniente dal trattamento delle olive , escluso l ' olio d ' oliva riesterificato e qualsiasi miscuglio di olio d ' oliva con degli oli di altra natura .

La presenza di olio d ' oliva riesterificato o di oli di altra natura viene accertata con i metodi indicati rispettivamente negli allegati VII e VIII .

2 . Appartengono alle sottovoci 15.07 A I a ) , 15.07 A I b ) e 15.07 A I c ) della tariffa doganale comune gli oli che presentano le caratteristiche di cui all ' allegato I , punti 1 , 2 e 3 . Per la determinazione di tali caratteristiche si applicano i metodi indicati negli allegati IV , V e VI .

3 . Appartengono alla sottovoce 15.07 A II a ) della tariffa doganale comune gli oli che presentano le caratteristiche di cui all ' allegato I , punto 4 .

4 . Non appartengono alla sottovoce 15.17 A della tariffa doganale comune i prodotti della voce 15.17 aventi le caratteristiche riportate nell ' allegato II .

Articolo 2

1 . Il metodo di determinazione del tenore d ' olio d ' oliva delle sanse e degli altri residui dell ' estrazione dell ' olio d ' oliva della sottovoce 23.04 A figura nell ' allegato IX .

2 . Il tenore di olio d ' oliva di cui al paragrafo 1 è espresso in percentuale del suo peso rispetto a quello della materia secca .

Articolo 3

La tariffa doganale comune allegata al regolamento ( CEE ) n . 950/68 è modificata come segue :

1 . Nella nota complementare 1 del capitolo 15 , la voce « 15.07 » è modificata in « sottovoce 15.07 D » .

2 . Le note complementari 2 , 3 e 4 del capitolo 15 sono sostituite dalle note complementari 2 , 3 e 4 contenute nell ' allegato III del presente regolamento .

3 . Il testo della sottovoce 15.07 A è modificato come segue :

N . della tariffa doganale comune * Designazione delle merci * Aliquota dei dazi * autonomi % o prelievi ( P ) * convenzionali % *

1 * 2 * 3 * 4 *

15.07 * A . Olio d ' oliva : * * *

* I . non trattato : * * *

* a ) Olio d ' oliva vergine * 20 ( P ) * - *

* b ) Olio d ' oliva vergine lampante * 20 ( P ) * - *

* c ) altro * 20 ( P ) * - *

* II . altro : * * *

* a ) ottenuto dal trattamento degli oli delle sottovoci 15.07 A I a ) o 15.07 A I b ) , anche tagliato con olio d ' oliva vergine * 20 ( P ) * - *

* b ) non nominato * 20 ( P ) * - *

Articolo 4

In tutti gli atti comunitari , ogni eventuale richiamo alle sottovoci 153.07 A II o 15.07 A I a ) e b ) della tariffa doganale comune è da intendersi riferito , secondo le caratteristiche del prodotto in questione , rispettivamente alle sottovoci 15.07 A I a ) , b ) e c ) e 15.07 A II a ) e b ) della tariffa doganale comune .

Articolo 5

Il regolamento ( CEE ) n . 618/72 della Commissione , del 29 marzo 1972 , è abrogato .

Articolo 6

Il presente regolamento entra in vigore il quarantatreesimo giorno successivo alla sua pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee .

Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri .

Fatto a Bruxelles , il 18 maggio 1977 .

Per la Commissione

Il Vicepresidente

Finn GUNDELACH

( 1 ) GU n . 172 del 30 . 9 . 1966 , pag . 3025/66 .

( 2 ) GU n . L 175 del 29 . 6 . 1973 , pag . 5 .

( 3 ) GU n . 197 del 29 . 10 . 1966 , pag . 3393/66 .

( 4 ) GU n . L 54 del 3 . 3 . 1972 , pag . 3 .

( 5 ) GU n . L 172 del 22 . 7 . 1968 , pag . 1 .

( 6 ) GU n . L 106 del 29 . 4 . 1977 , pag . 20 .

( 7 ) GU n . L 78 del 31 . 3 . 1972 , pag . 5 .

( 8 ) GU n . L 333 del 30 . 12 . 1975 , pag . 13 .

ALLEGATO I

CARATTERISTICHE DEGLI OLI D ' OLIVA

1 . È considerato « olio d ' oliva vergine » , ai sensi della sottovoce 15.07 A I a ) della tariffa doganale comune , l ' olio d ' oliva naturale ottenuto unicamente mediante processi meccanici , ivi compresa la pressione , ad esclusione di qualsiasi miscela con olio d ' oliva ottenuto in modo diverso , che presenti le seguenti caratteristiche :

a ) un tenore in acidi grassi liberi , espresso in acido oleico , non superiore al 3 % ;

b ) un coefficiente di estinzione K270 [ coefficiente di assorbimento sotto uno spessore di 1 cm di una soluzione costituita da 1 g di olio in 100 ml di isottano ( 2,2,4-trimetilpentano ) misurata alla lunghezza d ' onda di 170 nm ] non superiore a 0,25 e , dopo trattamento del campione d ' olio su allumina attivata , non superiore a 0,11 ;

c ) una variazione del coefficiente di etinzione , in prossimità di 270 nm , non superiore a 0,01 .

Take variazione è definita dall ' espressione seguente :

*K = Km - 0,5 ( Km - 4 + Km + 4 )

nella quale :

Km designa il coefficiente di estinzione alla lunghezza d ' onda del massimo della curva di assorbimento in prossimità di 270 nm ,

Km - 4 e Km + 4 designano i coefficienti di estinzione alle lunghezze d ' onda rispettivamente inferiori di 4 nm a quella di Km ;

d ) esito negativo delle reazioni di Bellier e di Vizern modificata , eseguite conformemente ai metodi riportati all ' allegato V , punti A e B ;

e ) esito negativo della ricerca dei saponi effettuata conformemente al metodo riportato all ' allegato VI .

2 . Viene considerato « olio d ' oliva vergine lampante » , ai sensi della sottovoce 15.07 A I b ) della tariffa doganale comune , indipendentemente dalla sua acidita , l ' olio di oliva che presenti le caratteristiche seguenti :

a ) un coefficiente di estinzione K270 superiore a 0,25 e , dopo trattamento del campione su allumina attivata , non superiore a 0,11 .

Alcuni oli aventi un tenore in acidi grassi liberi , espresso in acido oleico , superiore al 3 % , dopo passaggio su allumina attivata possono avere un coefficiente di estinzione K270 superiore a 0,11 . In tal caso , dopo neutralizzazione e decolorazione , effettuata in laboratorio , conformemente al metodo riportato all ' allegato IV , essi debbono presentare le caratteristiche seguenti :

- un coefficiente di estinzione K270 non superiore ad 1,10 ,

- una variazione del coefficiente di estinzione in prossimità di 270 nm , superiore a 0,01 e non superiore a 0,16 .

b ) esito negativo delle reazini di Bellier e di Vizern modificata , eseguite conformemente ai metodi riportati all ' allegato V , punti A e B ;

c ) esito negativo della ricerca dei saponi , effettuata conformemente al metodo riportato all ' allegato VI .

3 . Sono considerati come rientranti nella sottovoce 15.07 A I c ) della tariffa doganale comune gli oli , e particolarmente gli oli di sansa , che presentino le caratteristiche seguenti :

a ) tenore in acidi grassi liberi , espresso in acido oleico , superiore al 3 % ;

b ) esito positivo della reazione di Bellier e/o di Vizern modificata , eseguite conformemente ai metodi riportati all ' allegato V , punti A e B ;

c ) esito negativo della ricerca dei saponi effettuata conformemente al metodo riportato all ' allegato VI .

4 . È considerato come rientrante nella sottovoce 15.07 A II a ) della tariffa doganale comune l ' olio d ' oliva ottenuto dal trattamento degli oli delle sottovoci 15.07 A I a ) e 15.07 A I b ) , anche se tagliato con olio d ' oliva vergine , che presenti le seguenti caratteristiche :

a ) un tenore in acidi grassi liberi , espresso in acido oleico , non superiore al 3 % ;

b ) esito positivo della ricerca dei saponi , effettuata conformemente al metodo riportato all ' allegato VI .

oppure :

- un coefficiente di estinzione K270 superiore al 0,25 e non superiore ad 1,10 e , dopo trattamento del campione d ' olio su allumina attivata , superiore a 0,11

ed

- una variazione del coefficiente d ' estinzione in prossimità dei 270 nm superiore a 0,01 e non superiore a 0,16 .

Tale variazione è definita dall ' espressione seguente :

*K = Km - 0,5 ( Km - 4 + Km + 4 )

nella quale :

Km designa il coefficiente di estinzione alla lunghezza d ' onda del massimo della curva di assorbimento in prossimità di 270 nm ,

Km - 4 e Km + 4 designano i coefficienti di estinzione alle lunghezze d ' onda rispettivamente inferiori di 4 nm a quella di Km ;

c ) esito negativo delle reazioni di Bellier e di Vizern modificata , eseguite conformemente ai metodi riportati all ' allegato V , punti A e B .

ALLEGATO II

PRODOTTI DELLA SOTTOVOCE 15.17 A

Sono esclusi dalla sottovoce 15.17 A :

a ) i residui provenienti dalla lavorazione delle sostanze grasse contenenti dell ' olio per il quale l ' indice di iodio , determinato secondo il metodo di Vijs senza catalizzatore , è inferiore a 70 o superiore a 100 ;

b ) i residui provenienti dalla lavorazione delle sostanze grasse contenenti dell ' olio per il quale l ' indice di iodio è compreso tra 70 e 100 , ma la cui superficie del picco corrispondente al volume di ritenzione del *B-sitosterolo determinata conformemente alle disposizioni dell ' allegato VIII del regolamento di cui alla seguente nota complementare 4 rappresenta meno del 93 % della superficie totale dei picchi degli steroli .

ALLEGATO III

NOTE COMPLEMENTARI 2 , 3 E 4 DEL CAPITOLO 15 DELLA TARIFFA DOGANALE COMUNE

2 . A . È considerato olio d ' oliva ai sensi della sottovoce 15.07 A solo l ' olio proveniente esclusivamente dal trattamento delle olive , escluso l ' olio d ' oliva riesterificato e qualsiasi miscela di olio d ' oliva con oli di altra natura .

B . Sono considerati oli di oliva non trattati gli oli definiti qui di seguito ai punti I , II e III :

I . È considerato « olio di oliva vergine » , ai sensi della sottovoce 15.07 A I a ) della tariffa doganale comune , l ' olio d ' oliva naturale ottenuto unicamente mediante processi meccanici , ivi compresa la pressione , ad esclusione di qualsiasi miscela con olio d ' oliva ottenuto in modo diverso , che presenti le seguenti caratteristiche :

a ) un tenore in acidi grassi liberi , espresso in acido oleico , non superiore al 3 % ;

b ) un coefficiente di estinzione K270 [ coefficiente di assorbimento sotto uno spessore di 1 cm di una soluzione costituita da 1 g di olio in 100 ml di isottano ( 2,2,4-trimetilpentano ) misurata alla lunghezza l ' onda di 270 nm ] non superiore a 0,25 e , dopo trattamento del campione d ' olio su allumina attivata , non superiore a 0,11 ;

c ) una variazione del coefficiente di etinzione , in prossimità di 270 nm , non superiore a 0,01 .

Take variazione è definita dall ' espressione seguente :

*K = Km - 0,5 ( Km - 4 + Km + 4 )

nella quale :

Km designa il coefficiente di estinzione alla lunghezza d ' onda del massimo della curva di assorbimento in prossimità di 270 nm ,

Km - 4 e Km + 4 designano i coefficienti di estinzione alle lunghezze d ' onda rispettivamente inferiori di 4 nm a quella di Km ;

d ) esito negativo delle reazioni di Bellier e di Vizern modificata ;

e ) esito negativo della ricerca dei saponi .

II . Viene considerato « olio d ' oliva lampante » , ai sensi della sottovoce 15.07 A I b ) della tariffa doganale comune , indipendentemente dalla sua acidita , l ' olio d ' oliva che presenti le caratteristiche seguenti :

a ) un coefficiente di estinzione K270 superiore a 0,25 e , dopo trattamento del campione su allumina attivata , non superiore a 0,11 .

Alcuni oli aventi un tenore in acidi grassi liberi , espresso in acido oleico , superiore al 3 % , dopo passaggio su allumina attivata possono avere un coefficiente di estinzione K270 superiore a 0,11 . In tal caso , dopo neutralizzazione e decolorazione , effettuata in laboratorio , essi debbono presentare le caratteristiche seguenti :

- un coefficiente di estinzione K270 non superiore ad 1,10 ,

- una variazione del coefficiente di estinzione , in prossimità di 270 nm , superiore a 0,01 e non superiore a 0,16 .

b ) esito negativo delle reazini di Bellier e di Vizern modificata ;

c ) esito negativo della ricerca dei saponi .

III . Sono considerati come rientranti nella sottovoce 15.07 A I c ) gli oli , e particolarmente gli oli di sansa , che presentano le caratteristiche seguenti :

a ) tenore in acidi grassi liberi , espresso in acido oleico , superiore al 3 % ;

b ) esito positivo della reazione di Bellier e/o di Vizern modificata ;

c ) esito negativo della ricerca dei saponi .

C . È considerato come rientrante nella sottovoce 15.07 A II a ) della tariffa doganale comune l ' olio d ' oliva ottenuto dal trattamento degli oli delle sottovoci 15.07 A I a ) e 15.07 A I b ) , anche se tagliato con olio d ' oliva vergine , che presenti le seguenti caratteristiche :

a ) un tenore in acidi grassi liberi , espresso in acido oleico , non superiore al 3 % ;

b ) esito positivo della ricerca dei saponi ,

oppure :

- un coefficiente di estinzione K270 superiore al 0,25 e non superiore ad 1,10 e , dopo trattamento del campione d ' olio su allumina attivata , superiore a 0,11

ed

- una variazione del coefficiente d ' estinzione in prossimità dei 270 nm superiore a 0,01 e non superiore a 0,16 .

Tale variazione è definita dall ' espressione seguente :

*K = Km - 0,5 ( Km - 4 + Km + 4 )

nella quale :

Km designa il coefficiente di estinzione alla lunghezza d ' onda del massimo della curva di assorbimento in prossimità di 270 nm ,

Km - 4 e Km + 4 designano i coefficienti di estinzione alle lunghezze d ' onda rispettivamente inferiori di 4 nm a quella di Km ;

c ) esito negativo delle reazioni di Bellier e di Vizern modificata .

Sono esclusi dalla sottovoce 15.17 A :

a ) i residui provenienti dalla lavorazione delle sostanze grasse contenenti dell ' olio per il quale l ' indice di iodio , determinato secondo il metodo di Wijs senza catalizzatore , è inferiore a 70 o superiore a 100 ;

b ) i residui provenienti dalla lavorazione delle sostanze grasse contenenti dell ' olio per il quale l ' indice di iodio è compreso tra 70 e 100 , ma la cui superficie del picco corrispondente al volume di ritenzione del beta-sitosterolo determinata conformemente alle disposizioni dell ' allegato VIII del regolamento di cui alla seguente nota complementare 4 rappresenta meno del 93 % della superficie totale dei picchi degli steroli .

4 . I metodi di analisi per la determinazione delle caratteristiche dei prodotti di cui sopra sono quelli previsti agli allegati del regolamento ( CEE ) n . 1058/77 .

ALLEGATO IV

I . TRATTAMENTO DEL CAMPIONE CON ALLUMINA ATTIVATA

1 . Introdurre 30 g di allumina basica , ottenuta mediante il procedimento descritto al paragrafo 2 , in una colonna da cromatografia del diametro di circa 35 mm e della lunghezza di 450 mm , munita di un tubo di deflusso del diametro di circa 10 mm .

Pigiare meccanicamente l ' allumina , lasciando cadere adagio la colonna mantenuta in posizione verticale , ripetutamente , su una superficie di legno . Introdurre nella colonna così preparata 100 ml di una soluzione al 10 % di olio nell ' esano .

Raccogliere l ' eluato ed evaporare il solvente sotto vuoto a una temperatura inferiore ai 25° .

Sull ' olio così ottenuto la determinazione del coefficiente di estinzione a 270 nm deve essere effettuata immediatamente .

2 . L ' allumina basica di attività Brockmann I ( 0 % di acqua ) si ottiene riscaldando per tre ore a 380 - 400° allumina basica ( per cromatografia ) di granulometria compresa tra 30 et 130 *m ( 80 *m di media ) . Aggiungere a 100 g del prodotto suddetto 5 ml di acqua distillata per ottenere allumina basica di una attività Brockmann compresa tra II e III . Agitare con frequenza e lasciare riposare per una notte in un recipiente chiuso ermeticamente .

Verifica dell ' attività dell ' allumina

Introdurre 30 g di allumina basica ( ottenuta nella maniera sopraindicata ) in una colonna per cromatografia del diametro di circa 35 mm e della lunghezza di 450 mm ; far passare attraverso questa colonna , alle condizioni specificate dal metodo , una miscela di 95 % di olio vergine con coefficiente di estinzione K270 inferiore a 0,18 e di 5 % di un olio d ' arachide trattato durante la raffinazione con terre decoloranti e avente un coefficiente di estinzione K270 eguale o superiore a 4 . Se la miscela presenta un coefficiente di estinzione superiore a 0,11 , l ' allumina è accettabile . Se l ' eluzione dei trieni coniugati non si è prodotta su questa allumina , bisogna utilizzare un ' allumina più idratata , dopo aver verificato che essa soddisfi le esigenze del testo precedente .

II . NEUTRALIZZAZIONE E DECOLORAZIONE DELL ' OLIO D ' OLIVA IN LABORATORIO

A . NEUTRALIZZAZIONE DELL ' OLIO

1 . Apparecchiatura

- bicchiere da 300 ml a forma alta ,

- centrifuga da laboratorio con provette da 100 ml ,

- bicchiere da 250 ml ,

- palloncini da 100 ml ,

- imbuto separatore da 1 litro .

2 . Reattivi

- soluzione acquosa di idrossido di sodio al 12 % ,

- soluzione etilalcolica all ' 1 % di fenolftaleina ,

- esano puro per analisi ,

- alcool isopropilico per analisi .

3 . Modo di operare

a ) Olio con acidità , espressa in acido oleico , inferiore al 30 %

In un bicchiere da 300 ml a forma alta si pongono 50 g di olio greggio e si riscalda a 65° su bagnomaria . Sotto lenta agitazione si aggiunge una quantità di soluzione di idrossido di sodio al 12 % corrispondente all ' acidità libera dell ' olio , con un eccesso del 5 % . Si prosegue l ' agitazione per 5 minuti , mantenendo la temperatura a 65° .

Si trasferisce il tutto in provette da centrifuga aventi capacità di 100 mo e si separano le paste saponose per centrifugazione . Si versa l ' olio decantato in un bicchiere da 250 ml e si lava con 50 - 60 ml di acqua distillata bollente eliminando per sifonamento lo strato acquoso . Si ripetono i lavaggi sino alla completa rimozione delle tracce di saponi redidui ( scomparsa della colorazione rosea alla fenolftaleina ) .

Si centrifuga l ' olio per eliminare le piccole quantità di acqua residua .

b ) Oli con acidità , espressa in acido oleico , superiore al 30 %

In un imbuto separatore da 1 litro si pongono 50 g di olio greggio , 200 ml di esano , 100 ml di alcool isopropilico e una quantità della soluzione di idrossido di sodio al 12 % , corrispondente all ' acidità libera dell ' olio , con un eccesso dello 0,3 % .

Si agita energicamente per 1 minuto . Si aggiungono 100 ml di acqua distillata , si agita nuovamente e si lascia a riposo . Dopo stratificazione , si allontana lo strato inferiore contenente i saponi . In molti casi fra i due strati ( oleoso superiore , acquoso inferiore ) , si forma uno strato intermedio , costituito da mucillagini e di sostanze insolubili che devono parimenti essere allontanate .

Si procede quindi al lavaggio della soluzione esanica dell ' olio neutro con porzioni di 50 - 60 ml di una soluzione di alcool isopropilico/acqua distillata 1/1 ( v/v ) fino a scomparsa della colorazione rosea alla fenolftaleina .

Si allontana quindi completamente l ' esano per distillazione sotto vuoto ( ad esempio in evaporatore rotativo ) .

B . DECOLORAZIONE DELL ' OLIO NEUTRALIZZATO

1 . Apparecchiatura

- pallone da 250 ml a 3 coli , con attachi a smeriglio per l ' inserimento di :

) un termometro con divisioni in gradi , permettente misure fino a 90° ;

b ) un agitatore meccanico con velocità di rotazione di 250 - 300 giri/minuto equipaggiato per funzionare sotto vuoto ;

c ) un raccordo per la pompa a vuoto ;

- pompa a vuoto , in grado di dare pressioni redisue di 15 - 30 milibar e relativo manometro .

2 . Modo di operare

Nel pallone a 3 coli si pesano circa 100 g dell ' olio neutralizzato . Si inseriscono il termometro e l ' agitatore ; si opera il collegamento con la pompa per vuoto e si riscalda fino a 90° agitando , si mantiene tale temperatura , sempre agitando , sino a quando l ' olio in esame non risulti completamente deacquificato ( 30 minuti circa ) .

Si interrmpe quindi il vuoto e si aggiungono 2 - 3 g di terra attivata . Si stabilisce il collegamento con il nuoto fino a raggiungere una pressione residua di 15 - 30 milibar , sempre matenendo la temperatura a 90° , si agita per 30 minuti intorno ai 250 giri/minuto .

Si filtra poi a caldo in stufa termostatica ( 50 - 60° ) .

ALLEGATO V

RICERCA DELLA PRESENZA DI OLIO DI SANSA NEGLI OLI D ' OLIVA

A . METODO DETTO « DI BELLIER »

1 . Apparecchiatura

- matraccio da 100 ml munito di refrigeratore a riflusso ,

- pipetta , graduata in decimi , da 5 ml ,

- sistema per riscaldare , che consenta di raggiungere la temperatura di circa 80° ,

- termometro da 15 - 60° .

2 . Reattivi

- soluzione di idrossido di potassio ( 42,5 g di KOH sciolti in 72 ml di acqua distillata il tutto portato a 500 ml con alcool etilico a 95° ) ,

- soluzione di alcool etilico , titolo 70° ,

- soluzione acquosa di acido acetico , all ' 1 + 2 ( in volume ) , dosata in modo che 1,5 ml neutralizzino esattamente 5 ml della soluzione idroalcolica di idrossido di potassio in presenza di fenolftaleina .

3 . Preparazione del campione

L ' olio è privato dell ' acqua mediante decantazione e filtrazione su filtro di carta effettuate a una temperatura lievemente superiore al punto di fusione di alcuni costituenti concreti che avrebbero potuto separarsi dalla sostanza grassa fluida .

4 . Modo da operare

Introdurre nel matraccio 1 ml circa di olio preparato come indicato al paragrafo 3 . Aggiungere 5 ml di soluzione di idrossido di potassio . Adattare il refrigerante a riflusso e portare ad ebollizione per 10 minuti agitando ogni tanto , lasciare raffreddare sino a temperatura ambiente . Aggiungere 1,5 ml di soluzione acquosa di acido acetico e 50 ml di soluzione di alcool eticolo , precedentemente portata alla temperatura di 50° . Mescolare agitando , introdurre in termometro e lasciar raffreddare , osservando l ' aspetto della soluzione non appena questa raggiunge la temperatura di 45° . La formazione di un precipitato fioccoso a una temperatura superiore a 40° indica che la reazione è positiva . In assenza del precipitato fioccoso caratteristico , mantenere il liquido a temperatura ambiente , che deve essere compresa tra i 20° e i 22° , per almeno 24 ore o , se necessarrio , per 48 ore . Osservare nuovamente la soluzione : la formazione di un precipitato fioccoso che galleggia nel mezzo del liquido indica egualmente che la reazione è positiva .

Espressione dei risultati

Ricerca dell ' olio di sansa ( metodo di Bellier ) : positiva o negativa .

B . METODO DI VIZERN MODIFICATO

Si isola l ' insaponificabile dell ' olio da analizzare e si studia il suo comportamento in soluzione nell ' alcool ad 85° in determinate condizioni .

1 . Materiale

- palloni da 300 ml , in vetro resistente agli alcali , muniti di refrigerante a riflusso ,

- imbuti separatori da 500 ml o da 1 000 ml ,

- becher da 300 ml e da 250 ml ,

- cilindro in vetro .

2 . Reattivi

- soluzione alcoolica di idrossido di potassio 2N ,

- etere di petrolio ,

- alcool etilico al 50 % ,

- alcool etilico a 96° , misurato all ' alcoolometro ,

- acqua ossigenata a 10 volumi ,

- alcool etilico ad 85° , misurato all ' alcoolometro .

3 . Modo di operare

Pesare circa 5 g del campione da analizzare in un pallone da 300 ml . Aggiungere 50 ml della soluzione alcoolica di idrossido di potassio 2N . Montare i refrigerante a riflusso e portare a leggera ebollizione . Agitare dopo un ' ora di riscaldamento , raffreddare a 30 - 35 °C e travasare in un imbuto separatore utilizzando 50 ml d ' acqua distillata .

Lavare accuratamente il pallone con 50 ml di etere di petrolio ; ripetere più volte l ' operazione . Travasare l ' etere di petrolio in un imbuto separatore . Agitare energicamente il contenuto per poco più di un minuto . Dopo decantazione , eliminare la fase acquosa travasandola in un secondo imbuto separatore . Aggiungere ancora 50 ml di etere di petrolio , agitare energicamente il contenuto un pol più di un minuto e lasciar decantare . La fase acquosa è travasata in un terzo imbuto separatore , nel quale si aggiungono ancora 50 ml di etere di petrolio . Successivamente , agitare energicamente e lasciar decantare .

Raccogliere in un imbuto separatore gli estratti eterei provenienti dalle diverse estrazioni dell ' insaponificabile e lavare almeno tre volte con alcool al 50 % ( 50 ml per volta ) , finchù il liquido di lavaggio non manifesti più reazione basica alla fenolftaleina .

Filtrare la soluzione dell ' insaponificabile in un pallone da 300 ml , lavare il filtro con etere di petrolio ed eliminare il solvente per distillazione . Aggiungere 10 ml di alcool a 96° e , dopo riscaldamento moderato ( circa 40 °C ) , filtrare in un becher da 100 ml . Lavare il pallone da 300 ml con10 ml di alcool a 96° e filtrare poi nel secondo becher .

Nel becher da 100 ml , contenente gli estratti alcoolici dell ' insaponificabile , aggiungere 5 ml di acqua ossigenata a 10 volumi ; riscaldare a bagnomaria fino ad evaporazione completa . Aggiunger ancora 20 ml di alcool a 96 °C e 5 ml d ' acqua ossigenata ; lasciar di nuovo evaporare completamente .

Ritirare il becher dal bagnomaria ed aggiungere 20 ml di alcool d 85° . Riscaldare prudentementte a bagnomaria , facendo molta attenzione a non provocare perdite di alcool per non diminuire la concentrazione . Si tratta di un fattore molto importante , che non va trascurato .

Filtrare su carta , raffreddare ed esaminare il comportamento della soluzione in capo ad un ' ora , e poi quattro ore . Se , dopo un ' ora , la soluzione è assolutamente trasparente , l ' analisi è negativa , vale a dire non vi è olio di sansa .

Se dopo un ' ora la soluzione è torbida , ripetere l ' osservazione quattro ore dopo .

Se in capo a quattro ore la soluzione è ancora torbida , ma non presenta fiocchi , l ' analisi è ancora negativa . Al contrario , se si osserva la formaizone di fiocchi , l ' analisi è positiva e si è in presenza di olio di sansa .

Espressione dei risultati

Ricerca dell ' olio di sansa ( metodo Vizern modificato ) : positiva o negativa .

Osservazioni

Gli oli d ' oliva danno una soluzione trasparente o al massimo leggermente opalina durante tutto il saggio . Gli oli di sansa , puri o miscelati , presentano dei fiocchi caratteristici che restano in sospensione come piccole nuvole e che finiscono per depositarsi in capo a parecchie ore di riposo .

ALLEGATO VI

RICERCA DEI SAPONI , INTESA AD EVIDENZIARE L ' ALCALINITÀ

Principio del metodo

Evidenziamento dei saponi alcalini attraverso l ' azione sul blu di bromofenolo .

Reattivi

- soluzione all ' 1 % di blu di bromofenolo nell ' etanolo al 96 % ( v/v ) ;

- acetone distillato di recente , addizionato del 2 % d ' acqua ( v/v ) .

L ' acetone contenente il 2 % d ' acqua deve presentare una colorazione gialla o giallo-verdastra in presenza di qualche goccia della soluzione di blu di bromofenolo .

Materiale

provetta da 150 mm x 15 mm .

Modo di operare

Introdurre nella provetta 10 ml di acetone ed una goccia di soluzione di bromofenolo ; la soluzione dovrebbe virare al giallo . Altrimenti , sciacquare la provetta ed il tappo con acetone , fino a scomparsa della colorazione azzurra . Introdurre 10 g d ' olio nella provetta , tapparla con un tappo pulito , agitare e lasciar riposare . Un viraggio verso l ' azzurro nello strato superiore d ' acetone indica la presenza di sapone .

Espressione dei risultati

I risultati sono espressi come positivi o negativi .

ALLEGATO VII

RICERCA DELLA PRESENZA DEGLI OLI RIESTERIFICATI

Il metodo ha lo scopo di determinare negli oli e grassi la composizione della frazione di acidi grassi esterificati in posizione 2 ( posizione * , o posizione interna ) del glicerolo ; gli oli d ' oliva riesterificati contengono una maggiore quantità di acido palmitico in posizione * rispetto agli oli di oliva non riesterificati .

Principio

Questo metodo è fondato sull ' idrolisi parziale e specifica dei trigliceridi per opera della lipasi pancreatica , con formazione preferenziale di mono-2 gliceridi . Detta idrolisi conduce ad una miscela che racchiude , accanto ai trigliceridi non idrolizzati , dei digliceridi , dei mono-2 gliceridi e degli acidi grassi liberi . Tale miscela viene frazionata per cromatografia su strato sottile , ed i monogliceridi vengono isolati . Questi monogliceridi sono metanolizzati , e gli esteri metilici ottenuti sono analizzati per via gascromatografica .

Il prodotto analizzato dev ' essere considerato addizionato di olio riesterificato allorchù la percentuale di acido palmitico riscontrato nella posizione 2 dei trigliceridi è superiore al 2 % .

1 . Materiale

- imbuto separatore da 500 ml ,

- colonna di vetro per cromatografia , avente 1 3 mm di diametro interno e 400 mm di lunghezza , provvista di lastra in vetro sinterizzato e di rubinetto ,

- pallone da 250 ml a collo largo ,

- pallone da 100 ml ,

- provetta da centrifuga da 10 ml con tappo smerigliato ,

- siringa ipodermica da 1 ml , provvista di ago sottile ,

- pallone da 25 ml , con refrigerazione ad aria di circa 1 m di lunghezza , con raccordo smerigliato ,

- bicchiere da 50 ml ,

- buretta da 5 ml graduata in 1/20 ml ,

- stratificatore per cromatografia su strato sottile , con lastre di vetto di 20 x 20 cm ,

- microsiringa che eroga gocce di 3-4 *l ,

- vasca per cromatografia su strato sottile ,

- evaporatore rotante ,

- stufa regolabile a 103°C ± 2°C ,

- termostato regolabile tra 30°C e 45°C a ± 0,5°C ,

- agitatore elettrico vibrante che consenta una agitazione energica della provetta da centrifuga ,

- polverizzatore per cromatografia su strato sottile ,

- lampada a raggi ultravioletti per l ' esame della lastre cromatografiche ,

- agitatore da laboratorio , di tipo opportuno per la dispersione e la miscelazione di materiali eterogenei ,

- pH metro ,

- agitatore ad elica ,

- cronometro .

2 . Reattivi

- soluzione acquosa di idrossido di sodio al 12 % ( m/v ) ,

- soluzione all ' 1 % ( m/v ) di fenolftaleina in etanolo a 95 % ( v/v ) ,

- etere etilico , esente da perossidi ,

- alcole isopropilico oppure alcole etilico al 95 % ( v/v ) , per analisi ,

- allumina attivata per cromatografia , neutra , con grado di attività Brockmann I , di recente attività per due ore a 260°C e conservata in un essiccatore ,

- esano , o in mancanza , etere di petrolio ( Eb = 30-50°C ) , per cromatografia ,

- acido formico almeno al 98 % ( m/m ) ,

- lipasi pancreatica di attività adeguata ( nota 1 , nota 2 ) ,

- soluzione tampone : soluzione acquosa 1 M di tris-idrossimetilamminometano portata a pH 8 con acido cloridrico 6 N ( controllo potenziometrico ) ,

- soluzione acquosa all ' 0,1 % ( m/v ) di colato di sodio ( qualità enzimatica ) ,

- soluzione di acido cloridrico 6 N ,

- solvente di sviluppo : esano ( o , in sua mancanza , etere di petrolio ) / etere etilico / acido formico 70/30/1 ( v/v/v ) ,

- soluzione acquosa di gomma arabica al 10 % ( m/v ) ,

- soluzione acquosa di cloruro di calcio ( CaCl2 ) al 22 % ( m/v ) ,

- soluzione alcoolica allo 0,2 % ( m/v ) di dicloro-2'-7'-fluoresceina , leggermente alcalinizzata per aggiunta di una goccia di idrossido di sodio 1 N per 100 ml ,

- silice in polvere con legante di qualità per cromatografia su strato sottile ,

- soluzione acquosa di colato di sodio al 20 % ( m/v ) ,

- soluzione acquosa di idrossido di sodio 0,1 N ,

- olio vegetale neutralizzato .

3 . Preparazione del campione

Campione di acidità inferiore al 3 % : neutralizzazione diretta su allumina secondo il paragrafo 3.2 .

Campione di acidità superiore al 3 % : neutralizzazione con alcali in presenza di solvente secondo il paragrafo 3.1 , poi passagio su allumina secondo il paragrafo 3.2 .

3.1 . Neutralizzazione con alcali in presenza di solvente

Versare in un matraccio di decantazione da 500 ml circa 10 g di olio grezzo , 100 ml di esano o , in mancanza , di etere di petrolio , 50 ml di alcole isopropilico o di alcole etilico al 95 % , qualche goccia della soluzione di fenolftaleina e una quantità della soluzione di idrossido di sodio al 12 % corrispondente all ' acidità libera dell ' olio , più un eccesso dello 0,3 % . Agitare energicamente per un minuto ; aggiungere 50 ml di acqua distillata , agitare nuovamente e lasciar riposare .

Dopo decantazione , eliminare lo strato inferiore contenete i saponi . Eliminare gli eventuali strati intermedi ( muscillagini e sostanze insolubili ) . Lavare la soluzione esanica dell ' olio neutralizzato con porzioni successive di 25 o 30 ml di una soluzione di alcole isopropilico o etilico e di acqua distillata 1/1 ( v/v ) fino a scomparsa della colarazione rosa della fenolftaleina .

Eliminare la massima parte dell ' esano mediante distillazione sotto vuoto ed essiccare l ' olio a 30-40°C sotto vuoto in corrente d ' azoto puro fino alla eliminazione totale del solvente .

3.2 . Passaggio su allumina

Preparare una sospensione di 15 g di allumina attivata in 50 ml di esano , o , in mancanza , di etere di petrolio , e versare agitando in una colonna di vetro per cromatografia . Regolarizzare la ripartizione dell ' allumina e lasciar defluire il solvente fino ad 1-2 mm al di sopra del livello superiore dell ' assorbente . Versare cautamente nella colonna una soluzione preparata circa 15 minuti prima disciogliendo 5 g di olio in 25 ml di esano , o , in mancanza , di etere di petrolio , e raccogliere in un pallone da 100 ml la totalità del liquido che esce dalla colonna .

Eliminare per distillazione sotto vuoto la maggior parte del solvente , poi essiccare l ' olio a 30-40°C sotto vuoto , in corrente di azoto puro , fino ad eliminazione totale del solvente .

4 . Preparazione delle lastre cromatografiche

In un pallone di 250 ml a collo largo mettere 30 g di silice in polvere con legante e 60 ml di acqua distillata ed agitare fino ad ottenimento di una poltiglia ben omogenea . Degassare mantenendo sotto il vuoto della pompa per 1 minuto .

Stratificare nelle condizioni usuali la poltiglia sulle lastre per mezzo dell ' apparecchio stratificatore , regolando lo spessore dello strato a 0,25 mm .

La quantità della suddetta poltiglia è sufficiente per la preparazione di 5 lastre di 20 x 20 cm .

Lasciare asciugare le lastre all ' aria per circa 15 minuti , quindi essiccarle in una stufa a 103°C ± 2°C per due ore .

Conservare le lastre cosi preparate in un essiccatore .

$5 . Metodo operativo

5.1 . Idrolisi ad opera della lipasi pancreatica

In una provetta da centrifuga da 10 ml pesare circa 0,1 g del campione preparato .

Aggiungere 20 mg di lipasi e 2 ml di soluzione tampone . Agitare accuratamente e con cautela , poi aggiungere 0,5 ml della soluzione di colato di sodio allo 0,1 % e 0,2 ml della soluzione di cloruro di calcio . Chiudere la provetta con il tappo smerigliato , agitare con cautela ( evitando di bagnare il tappo ) e mettere immediatamente la provetta nel termostato regolato a 40°C ± 0,5°C , agitando esattamente per un minuto .

Prelevare la provetta del termostato ed agitare energicamente per due minuti esatti .

Raffreddare immediatamente in corrente d ' acqua ; aggiungere 1 ml di acido cloridrico 6 N ed 1 ml di etere etilico . Tappare ed agitare energicamente . Lasciar riposare e prelevare la fase organica superiore con la siringa .

5.2 . Separazione dei monogliceridi mediante cromatografia su strato sottile

Deporre l ' estratto sulla lastra cromatografica a circa 1,5 cm dal bordo inferiore , in linea continua ed uniforme , per ottenere la linea di partenza più sottile possibile .

Introdurre la lastra nella camera di sviluppo ben satura e sviluppare con l ' apposito solvente fino ad 1 cm dal bordo superiore . Lo sviluppo della lastra deve avvenire alla temperatura di circa 20°C .

Essiccare la lastra all ' aria , alla temperatura della vasca , e polverizzare la soluzione di dicloro-2°-7° fluorosceina . Delimitare la banda dei monogliceridi ( Rf = 0,035 circa ) alla luce U.V . , recuperarli mediante una spatola metallica ( evitando di prelevare i componenti che restano sulla linea di partenza ) e raccogliere la silice nel pallone di metilazione da 25 ml .

Trasformare i monogliceridi in esteri metilici , trattando direttamente alle condizioni del metodo generale di preparazione degli esteri metilici degli metilici degli acidi grassi indicati al punto 7.3 la silice precedentemente raccolta , poi procedere alla cromatografia in fase gassosa degli esteri secondo il metodo indicato al punto 7.4 .

6 . Espressione dei risultati

Calcolare la composizione degli acidi grassi in posizione 2 in percentuale con una cifra decimale ( nota 3 ) .

7 . Note

7.1 . Controllo dell ' attività lipasica

Preparare un ' emulsione di olio agitando , in un miscelatore adeguato , per circa 10 minuti , una miscela costituita da 165 ml della soluzione di gomma arabica al 10 % , 15 g di ghiaccio tritato e 20 ml di un oli precedentemente neutralizzato .

In un bicchiere di 50 ml mettere successivamente 10 ml dell ' emulsione precedentemente descritta , 0,3 ml di soluzione di colato di sodio al 20 % e 20 ml di acqua distillata .

Sistemare il bicchiere in un termostato regolato a 37°C ± 0,5°C ed introdurre nel bicchiere gli elettrodi di un pH metro ed un agitatore ad elica .

Mediante una buretta da 5 ml aggiungere goccia a goccia una soluzione di idrossido di sodio 0,1 N fino ad ottenimento di un pH di 8,5 .

Aggiungere un volume opportuno di una sospensione di lipasi in polvere nell ' acqua ( vedi qui di seguito ) . Quando il pH indica un pH di 8,3 mettere in funzione il cronometro ed aggiungere la soluzione di idrossido di sodio 0,1 N al ritmo necessario per mantenere il pH al valore di 8,3 . Prendere nota , ogni minuto , del volume di soluzione alcalina consumato .

Riportare i valori ottenuti su un sistema di assi coordinati , portando sulle ascisse i tempi e sulle ordinate i ml di soluzione alcalina consumata per mantenere il pH costante . Si deve ottenere un grafico lineare .

La sospensione di lipasi citata la paragrafo precedente è una sospensione all ' 1 % in peso nell ' acqua . Per ciascuna prova prendere il quantitativo di tale sospensione necessario a che in 4-5 minuti si consumi 1 ml circa di soluzione alcalina . Normalmente questo risultato viene ottenuto con 1-5 mg di polvere .

L ' unità lipasi viene definita come la quantità di enzima che libera 10 *-equivalenti di acido per minuto .

Attività A della polvere usata , misurata in unità lipasi per mg :

A = V x 10 / m

dove :

V = numero di ml di soluzione di idrossido di sodio 0,1 N per minuto , calcolato al grafico ,

m = massa della polvere da analizzare , in mg .

La lipasi usata deve avere un ' attività compresa tra 0,8 e 2 unità lipasi per mg .

7.2 . Preparazione della lipasi

In commercio esistono lipasi aventi un ' attività lipasica soddisfacente . È possibile altresì prepararle in laboratorio nel modo seguente :

Raffreddare , a 0°C 5kg di pancreas fresco suino ; liberate dal grasso solido e dal tessuto connettivo che li circondano e triturate in un mulino a lame per ottenere una pasta fluida . Agitare questa pasta a freddo per 4-6 ore con 2,5 litri di acetone anidro , poi centrifugare . Estrarre il residuo altre tre volte con lo stesso volume di acetone , due volte con una miscela di acetone-etere etilico 1/1 ( v/v ) e due volte con etere etilico .

Essiccare il residuo sotto vuoto per 48 ore , allo scopo di ottenere una polvere stabile , che dev ' essere conservata in frigorifero .

7.3 . Preparazione degli esteri metilici degli acidi grassi

Secondo il metodo definito all ' allegato VI , titolo II , del regolamento ( CEE ) n . 72/77 della Commissione , del 13 gennaio 1977 , recante modifica del regolamento ( CEE ) n . 1470/68 relativo al prelievo ed alla riduzione dei campioni nonchù alla determinazione del tenore in olio , impurità ed umidità dei semi oleosi ( 1 ) .

7.4 . Gascromatografia degli esteri metilici degli acidi grassi

Secondo il metodo definito all ' allegato VI , titolo III , del regolamento ( CEE ) n . 72/77 .

ALLEGATO VIII

RICERCA DELLA PRESENZA DI ALTRI OLI NELL ' OLIO D ' OLIVA : ANALISI DELLA FRAZIONE STEROLICA DELLE SOSTANZE GRASSE

Principio

Analisi per gascromatografia della frazione sterolica separata per cromatografia su strato sottile a partire dall ' insaponificabile essiccato con precauzione per brevissimo tempo .

Apparecchiatura

1 . apparecchiatura per la cromatografia su strato sottile , comprendente in particolare quattro placche di vetro 20 x 20 x 0,4 cm e due placche da 20 x 5 x 0,4 cm e una microsiringa da 0,1 ml ,

2 . beuta da 50 ml ,

3 . filtri porosi , porosità 3 , diametro 15 mm ,

4 . pallone da 100 ml ,

5 . provetta da centrifuga , a fondo conico , da 10 ml , munita di tappo smerigliato ,

6 . pipette graduate , da 1 ml e da 5 ml ,

7 . gascromatografi con rivelatore a ionizzazione di fiamma e iniettatore d ' argento o di vetro , oppure munito di un sistema di iniezione diretta nella colonna e raccordato ad un registratore ,

8 . colonna da gascromatografia di vetro o di acciaio inossidabile a forma di « U » o di spirale , della lunghezza di 1-2 m e del diametro interno di 3-4 mm - fase stazionaria di gomma di silicone [ tipo metile ( 2 ) ] stabile sino ad almeno 300° che impregni al tasso del 2-4 % una terra di diatomee calcinata , lavata con acidi e silanizzata , di granulometria 80/100 o 100/200 mesh .

Nota : Poichù taluni tipi di acciaio inossidabile potrebbero condurre a risultati erronei a causa della deteriorazione degli steroli , si raccomanda di utilizzare il vetro ,

9 . microsiringa da 5 o 10 *l .

Reattivi

1 . cloroformio per cromatografia ,

2 . benzolo per cromatografia ,

3 . eptano ,

4 . gel di silice ( per esempio Kieselgel G ) ,

5 . soluzione di riferimento per la cromatografia su lastra , costituita da colesterolo al 5 % in cloroformio ,

6 . acetone per cromatografia ,

7 . soluzione allo 0,1 % , in alcool assoluto , del sale sodico della 2'7'-diclorofluoresceina ,

8 . piridina ,

9 . esametildisilazano ,

10 . trimetilclorosilano ,

11 . soluzione per la prova di sensibilità ; 1 mg di colesterolo in 1 ml di n-pentano ;

12 . soluzione per la prova di risoluzione dei picchi : 0,9 mg di fitosteroli di olio di colza e 0,1 mg di colesterolo in 1 ml n-pentano . Gli steroli debbono essere di recente preparazione , secondo la procedura descritta al punto B « modo di operare » ,

13 . soluzione per la prova di riferimento : 1 mg di fitosteroli di olio di girasole in 1 ml di n-pentano , di recente preparazione come descritto al punto B del « modo di operare » .

Preparazione delle placche per cromatografia

Collocare sullo stratificatore nell ' ordine una placca 20 x 5 x 0,5 cm , quattro placche 20 x 20 x 0,4 cm e una placca 20 x 5 x 0,4 cm .

In un pallone da 500 ml a collo largo mettere 40 g di gel di silicio e circa 80 ml di acqua . Agitare la bacchetta di vetro ed eventualmente con agitatore meccanico di vetro fino ad ottenere una sospensione omogenea .

Eliminare i gas eventualmente presenti facendo il vuoto con una pompa ad acqua per almeno 1 minuto . Si porta poi la sospensione regolando la spessore a 0,5 mm e si ricoprono uniformemente le placche . Si lasciano asciugare la placche all ' aria per quindici minuti circa e quindi si essiccano a 105°C per 2 ore . Le placche così preparate si conservano in essiccatori a vuoto .

MODO DI OPERARE

A . Preparazione dell ' insaponificabile

Introduzione

Si designano sotto il nome di « insaponificabile » le sostanze solubili nel grasso , le quali , dopo saponificazione , sono insolubili nell ' acqua e solubili nel solvente adoperato per il dosaggio . L ' insaponificabile comprende i costituenti naturali delle sostanze grasse ( steroli , alcoli , idrocarburi ) , come pure le sostanze organiche non volatili a 100°C ( oli minerali ) , estranee alle sostanze grasse , ma che possono eventualmente essere contenute in esse . Quale solvente si adoperano l ' etere di petrolio oppure l ' etere etilico . Va tenuto presente che i risultati ottenuti con i due solventi sono diversi , nella maggioranza dei casi , e che con l ' etere etilico si trovano dei tenori percentuali più elevati . Per l ' olio d ' oliva , tenuto conto delle condizioni climatiche nelle quali si trova la maggioranza dei laboratori di analisi , l ' etere di petrolio è stato riconosciuto come il solvente da adoperarsi .

Metodo all ' etere di petrolio

Materiale

- pallone da 150 ml circa , che possa adattato ad un refrigerante a riflusso ,

- imbuto separatore da 500 ml circa ,

- stufa regolata a 103°C ± 2°C .

Reattivi

- soluzione etanolica di KOH , 2N all ' incirca , nell ' etanolo al 95 % ( v/v ) . Il reattivo non dovrà avere un colore più scuro del giallo paglierino ,

- etere di petrolio con intervallo di distillazione 40-60°C , con numero di bromo inferiore ad 1 , esente da residuo .

Modo di operare

Pesare esattamente in un pallone , con l ' approssimazione di 0,01 g , 5 g circa di sostanza grassa . Aggiungere 50 ml della soluzione etanolica circa 2N di KOH . Adattare al refrigerante a riflusso . Riscaldare per un ' ora a leggera ebollizione . Sospendere il riscaldamento . Aggiungere dall ' alto del refrigerante 50 ml circa di acqua distillata ed agitare .

Travasare dopo raffreddamento in un imbuto separatore e sciacquare a più riprese il pallone con un totale di 50 ml circa di etere di petrolio .

Agitare energicamente per un minuto .

Lasciar riposare fino a separazione completa delle due fasi e raccogliere la soluzione saponosa in un secondo imbuto separatore . Se , eccezionalmente , dovesse formarsi un ' emulsione , romperla mediante addizione di piccole quantità di etanalo o di soluzione concentrata di idrossido di potassio .

Rieterare per altre due volte l ' estrazione della soluzione saponosa , impiegando ogni volta circa 50 ml di etere di petrolio . Riunire in uno stesso imbuto separatore le tre frazioni ottenute con l ' etere di petrolio e lavarle a tre riprese con circa 50 ml di etanolo al 50 % ( v/v ) .

Dall ' alto dell ' imbuto , travasare quantitativamente la soluzione di etere di petrolio , in più riprese se necessario , entro un pallone di 250 ml , tarato ( effettuando piccoli lavaggi dell ' imbuto con etere di petrolio ) .

Il solvente viene eliminato riscaldandolo prudentemente sotto vuoto , i residui vengono asciugati ad una temperatura inferiore ai 50° sotto vuoto , allo scopo di evitare delle ossidazioni indesiderabili .

B . Separazione della frazione sterolica per cromatografia su strato sottile

Nella camera di sviluppo si introduce la miscela eptano/acetone 85/15 o benzolo/acetone 95/5 ( v/v ) fino all ' altezza di circa 1 cm ; si chiude con il coperchio e si lascia e sù per almeno 3 ore , in modo che si stabilisca l ' equilibrio liquido-vapore . È anche consigliabile fissare sulle superfici interne della camera delle striscie di carta da filtro che peschino nell ' eluente . Questa precauzione offre il vantaggio di ridurre di circa 1/3 la durata di migrazione del fronte del liquido e di fare eluire si componenti in modo più uniforme .

Si prepara nel frattempo una soluzione al 5 % di insaponificabile estratto all ' esere di petrolio nel cloroformio . Si prelevano circa 0,3 ml della soluzione così ottenuta e li si depositano con l ' aiuto della microsiringa di 0,1 ml sulla placca cromatografica a circa 1,5 cm dal bordo inferiore , in banda continua ed uniforme in modo da ottenere una linea di partenza la più sottile possibile . Con la tecnica consueta si deposita ad una estremità della lastra qualche *l della soluzione di riferimento contenente colesterolo , allo scopo di identificare l ' Rf della frazione sterolica .

Si pone la placca nella camera di sviluppo , preparata come sopra detto . La temperatura dell ' ambiente deve essere intorno ai 20° .

Si chiude con il coperchio e si eluisce fino a che il fronte del solvente sia arrivato ad 1 cm circa dal bordo superiore della placca . Si rimuove la placca della camera di sviluppo e si lascia evaporare il solvente in correte di aria calda .

La placca viene spruzzata uniformemente e con cautela mediante la soluzione alcolica del sale sodico della 2'7'-diclorofluoresceina . Esaminando la placca all ' ultravioletto , si individua la posizione degli steroli , in base all ' allineamento con la macchia di colesterolo , proveniente dalla soluzione di riferimento .

Recuperare la banda degli steroli raschiandola con una spatola metallica . Introdurre il gel di silice separato in un becher da 50 ml assiema a 15 ml di cloroformio caldo , agitare , trasferire la totalità del gel di silice sul filtro poroso e filtrare . Lavare tre volte il filtro , impiegando ogni volta una porzione da 15 ml di cloroformio caldo , raccogliendo il filtrato in un pallone de 100 ml .

Evaporare la soluzione cloroformica fino al volume di 4-5 ml è versare nel tubo da centrifuga a tappo smerigliato , tarato in precedenza . Portare a secco evaporando il solvente per leggero riscaldamento in corrente di azoto e pesare la frazione sterolica così ottenuta .

C . Analisi gascromatografica degli steroli

1 . Preparazione dei trimetilsilileteri ( TMSE )

Per ciascun mg di sterole , aggiungere nella provetta 0,02 ml di reattivo per la silanizzazione , composto da una miscela di piridina-esametildisilazano-trimetilclorosilano 9/3/1 ( v/v/v ) avendo cura di evitare ogni traccia di umidità . Sistemare la provetta in un essiccatore per circa 30 minuti , poi chiudere e centrifugare per qualche minuto . Prelevare soluzione restante la successiva analisi .

2 . Condizioni dell ' analisi per gascromatografia

Temperatura della colonna : 220-250° .

Temperatura del sistema di iniezione , se riscaldato separatamente : 20-40 ° al di sotto della temperatura della colonna . Emissione di azoto : 30-60 ml/minuto . Disgiungere il rivelatore ed equilibrare le nuove colonne in queste condizioni durante 16-24 ore . Collegare il rivelatore , accendere la fiamma e regolare la portata di idrogeno , di ossigeno o di aria in modo da ottenere un ' altezza della fiamma e una sensibilità idonee . Far funzionare il rivelatore , far svolgere la carta ad una velocità appropriata e azzerare l ' attenuatore . Quando la linea di base è stabile , l ' apparecchio è pronto per l ' uso .

3 . Prova di sensibilità

Prelevare 5 ml della soluzione per la prova di sensibilità , evaporare il solvente , trattare come indicato al punto 1 : iniettare 0,1-0,2 *l della soluzione così preparata ( TMSE ) . Sul cromatogramma deve apparire il solo picco del colesterolo .

Regolare l ' attenuatore in modo da poter impiegare quasi tutta la scala del registratore .

4 . Prova di risoluzione dei picchi

Prelevare 5 ml della soluzione così preparata .

Evaporare il solvente e trattare come indicato al punto 1 .

Iniettare da 0,1 a 0,2 *l della soluzione del test di risoluzione ( TMSE )

I picchi di colesterolo , brassicasterolo , campesterolo e di *-sitosterolo debbono apparire sul cromatogramma . Misurare le distanze di ritezione ( distanza dal punto d ' iniezione al punto dell ' altezza massima del picco ) dei picchi dCH per il colesterolo , dB per il brassicasterolo , dC per il campesterolo e dS per il *-sitosterolo e la larghezza di ritenzione tra le intersezioni con la linea di base delle tangenti ai punti di inflessione situate sui lati anteriore e posteriore del picco ) *CH per il colesterolo e *B per il brassicasterolo . La risoluzione dei picchi , espressa con la formula :

PR = 2 ( dB - dCH / *B + *CH

deve essere almeno uguale a 1 .

Calcolare i tempi di ritenzione relativi ( colesterolo = 1,00 ) per il brassicasterolo , il campesterolo e il *-sitosterolo .

5 . Prova di riferimento

Prelevare 5 ml della soluzione della prova di riferimento , evaporare il solvente , trattare come indicato al punto 1 , iniettare da 0,1 a 0,2 *l della soluzione così preparata ( TMSE ) . I picchi di campesterolo , di stigmasterolo , di *-sitosterolo e di *7 stigmastenolo debbono comparire sul cromatogramma .

Misurare le distanze di ritenzione dei picchi , dC per il campesterolo , dST per lo stimasterolo dS per il *-sitosterolo e dST7 per il *7 stigmastenolo .

Si calcolino i tempi di ritenzione relativa , che sono approssimativamente .

$colesterolo : * 1,0 , *

brassicasterolo : * 1,1 , *

campesterolo : * 1,3 , *

stigmasterolo : * 1,4 , *

*-sitosterolo : * 1,6 ( 3 ) , *

*7 stigmastenolo : * 1,8 ( 4 ) *

6 . Analisi

Iniettare daz 0,1 a 0,2 *l della soluzione TMSE degli steroli da analizzare e registrare il cromatogramma .

C . Espressioni dei risultati

Ai fini dell ' interpretazione della composizione della frazione sterolica analizzata , non sono da rilevare picchi aventi tempi di ritenzione diversi da quelli determinati sperimentalmente per i 6 steroli sopra elencati .

Il tenore in % di *-sitosterolo è dato dalla formula :

Area del picco del *-sitosterolo / Somma delle aree dei sei picchi degli steroli x 100

Il contenuto in *-sitosterolo non dovrà essere inferiore al 93 % rispetto alla composizione in % degli steroli totali .

( 1 ) GU n . L 12 del 15 . 1 .1977 , pag . 11 .

( 2 ) Per esempio , SE 30 .

( 3 ) Se altri steroli , come *6 avenasterolo , hanno in queste condizioni lo stesso volume di ritenzione dell *-sitosterolo , essi sono computati come *-sitosterolo

( 4 ) Se altri steroli hanno in queste condizioni lo stesso volume di ritenzione del *7 stigmastenolo , essi sono computati come *7 stigmastenolo

ALLEGATO IX

METODO DI DETERMINAZIONE DEL TENOREE IN OLIO D ' OLIVA DELLE SANSE

Materiale

- apparecchio da estrazione appropriato , munito di un pallone da 200-250 ml ,

- bagno a riscaldamento elettrico ( bagno a sabbia , bagno ad acqua , ecc . ) o piastra riscaldante ,

- bilancia analitica ,

- stufa regolata su un massimo di 80°C ,

- stufa a riscaldamento elettrico , provvista di un dispositivo di termoregolazione regolato su 103 ± 2°C è tale da consentire una insufflazione d ' aria o una depressione ,

- frantoio meccanico facile da pulire , che permette la trantumazione dei noccioli senza riscaldamento e senza modificazione sensibile del loro tenore in acqua e in olio ,

- ditale da estrazione e cotone idrofilo o carta da filtro , esenti da sostanze estraibili con esano ,

- essiccatore ,

- setaccio a maglie da 1 mm di diametro ,

- pietra pomice in granuli , previamente essiccata .

Reattivo

n-esano tecnico , il cui tesiduo all ' evaporazione completa dev ' essere inferiore a 0,002 g/100 ml .

MODO DI OPERARE

Preparazione del campione per l ' analisi

Frantumare il campione contrattuale , se necessario , el frantoio meccanico ben pulito in precedenza , allo scopo di ridurlo in particelle che attraversino completamente il setaccio .

Utilizzare 1/22 circa del campione per completare la pulizia del trantoio , scartare il prodotto di questa maciazione , frantumare il resto , raccoglierlo , mescolarlo con cura e analizzarlo immediatamente .

Quantità di sostanza da analizzare

Immediatamente dopo la fine della frantumazione , pesare con l ' approssimazione di 0,01 g circa 10 g del campione .

Preparazione del ditale da estrazione

Porre la sostanza destinata all ' analisi nella cartuccia , che va tappata con il tampone di cotone idrofilo . Nel caso che si utilizzi una carta da filtro , impacchettare le sanse frantumate in tale carta .

Preessiccazione

Se la sansa e molto umida ( tenore in acqua ed in sostanze volatili superiore al 10 % ) , effettuare un ' essiccazione preliminare ponendo per un tempo conveniente il ditale riempito ( o la carta da filtro ) nella stufa riscaldata ad un massimo di 80°C , per ricondurre il tenore in acqua ed in materie volatili al di sotto del 10 % .

Preparazione del pallone

Pesare con l ' approvissimazione di 1 mg il pallone contenente 1-2 granuli di pomice , previamente essiccato in stufa a 103 ± 2°C e poi raffreddato per almeno un ' ora in essiccatore .

Prima estrazione

Porre nell ' apparecchio da estrazione il ditale ( o la carta da filtro ) contenente la sostanza da analizzare . Versare nel pallone la quantità necessaria di esano . Adottare il pallone all ' apparecchio da estrazione e porre il tutto sul bagno a riscaldamento elettrico . Effettuare il riscaldamento in condizioni tali che la portata del riflusso sia di almeno tre gocce al secondo ( ebollizioone moderata , non tumultuosa ) .

Dopo quattro ore di estrazione , lasciar raffreddare . Togliere il ditale dall ' apparecchio di estrazione e porlo in una corrente d ' aria , al fine di eliminare la maggior parte del solvente che lo impregna .

Seconda estrazione

Vuotare il ditale nel microfrantoio e mascinare il più finemente possibile . Reintrodurre quantitativamente la miscela nel ditale e rimettere questo nell ' apparecchio da estrazione .

Ricominciare l ' estrazione per altre due ore , utilizzando lo stesso pallone che contiene la prima sostanza estratta .

La soluzione ottenuta nel pallone da estrazione dev ' essere limpida . Se così non fosse , filtrarla su carta , lavando più volte il primo pallone e la carta da filtro con esano . Raccogliere filtrato e solvente di lavaggio in un secondo pallone , previamente essiccato e tarato con l ' approssimazione di 1 mg .

Eliminazione del solvente e pesata dell ' estratto

Eliminare la maggior parte del solvente distillato su bagno a riscaldamento elettrico . Eliminare le ultime tracce di solvente riscaldando il pallone in stufa a 103 ± 2°C per 20 minuti . Facilitare questa eliminazione sia insufflando ogni tanto dell ' aria o , preferibilmente , del gas inerte , sia operando sotto pressione ridotta .

Lasciar raffreddare il pallone in essiccatore per almeno un ' ora , poi pesarlo con l ' approssimazione di 1 mg .

Riscaldare di nuovo per 10 minuti nelle stesse condizioni , poi raffreddare in essiccatore e pesare .

La differenza tra i risultati di queste due pesate dev ' essere inferiore od uguale a 10 mg . In caso contrario , riscaldare di nuovo per periodi di 10 minuti , seguiti da raffreddamento e pesata , finchù la differenza di massa sia uguale tutt ' al più a 10 mg . Adottare per il calcolo il valore dato dall ' ultima pesata .

Effettuare due determinazioni sullo stesso campione .

ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Modo di calcolo e formula

a ) L ' estratto , espresso come massa percentuale sul prodotto tal quale , e dato dalla formula :

S = m : x 100 / m :

nella quale :

S = percentuale in massa sul prodotto tal quale ,

m : = massa in grammi della quantità di sostanza prelevata per l ' analisi ,

m : = massa in grammi dell ' estratto dopo essiccazione .

Prendere come risultato la media aritmetica delle due determinaizioni , se le condizioni di ripetibilita sono adempiute .

Esprimere il risultato con una sola citrà decimale .

b ) L ' estratto viene riferito alla sostanza secca utilizzando la formula seguente :

S x 100 / 100 - U = estratto in % grasso/secco

dove :

S = percentuale in massa di estratto sul prodotto tal quale ( vedi lettera a ) ,

U = suo tenore in acqua e in sostanze volatili .

Ripetibilità

La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate simultaneamente o in rapida successione dallao stesso analista non deve eccedere i 0,2 g di estratto ottenuto con l ' esano per ogni 100 g di campione .

In caso contrario , ripetere l ' analisi su due altri quantitativi di sostanza . Se ancora questa volta la differenza eccede gli 0,2 g , assumere come risultato la media aritmetica delle quattro determinazioni effettuate .