---

PŘÍLOHA

▼M6

Poznámka:

Před použitím jakékoli z následujících zkušebních metod ke zkoušení vícesložkové látky, látky s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexního reakčního produktu nebo biologického materiálu (UVCB) nebo směsi a v případě, že její použitelnost ke zkoušení vícesložkové látky, UVCB nebo směsí není v příslušné zkušební metodě uvedena, je třeba zvážit, zda je metoda přiměřená pro zamýšlené použití v právních předpisech.

Jestliže se zkušební metoda použije ke zkoušení vícesložkové látky, UVCB nebo směsi, měly by být pokud možno k dispozici dostatečné informace o jejím složení, jako např. chemická identita jejích složek, jejich kvantitativní výskyt a vlastnosti složek.

▼M9

---

ČÁST 0

MEZINÁRODNÍ ZKUŠEBNÍ METODY UZNANÉ ZA VHODNÉ PRO ZÍSKÁVÁNÍ INFORMACÍ O PODSTATNÝCH VLASTNOSTECH LÁTEK PRO ÚČELY NAŘÍZENÍ (ES) č. 1907/2006

▼M10

TABULKA 1: ZKUŠEBNÍ METODY PRO STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH VLASTNOSTÍ LÁTKY

▼M9

TABULKA 2: ZKUŠEBNÍ METODY PRO STANOVENÍ TOXIKOLOGICKÝCH VLASTNOSTÍ

TABULKA 3: ZKUŠEBNÍ METODY PRO STANOVENÍ EKOTOXIKOLOGICKÝCH VLASTNOSTÍ

▼B

---

ČÁST A: METODY PRO STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH VLASTNOSTÍ

OBSAH
A.1	BOD TÁNÍ/BOD TUHNUTÍ
A.2	BOD VARU
A.3	RELATIVNÍ HUSTOTA
A.4	TLAK PAR
A.5	POVRCHOVÉ NAPĚTÍ
A.6	ROZPUSTNOST VE VODĚ
A.8	ROZDĚLOVACÍ KOEFICIENT
A.9	BOD VZPLANUTÍ
A.10	HOŘLAVOST (PEVNÉ LÁTKY)
A.11	HOŘLAVOST PLYNŮ
A.12	HOŘLAVOST (PŘI STYKU S VODOU)
A.13	PYROFORICKÉ VLASTNOSTI PEVNÝCH LÁTEK A KAPALIN
A.14	VÝBUŠNÉ VLASTNOSTI
A.15	BOD SAMOZÁPALU (KAPALINY A PLYNY)
A.16	RELATIVNÍ TEPLOTA SAMOZÁPALU PEVNÝCH LÁTEK
A.17	OXIDAČNÍ VLASTNOSTI (PEVNÉ LÁTKY)
A.18	POČETNĚ PRŮMĚRNÁ MOLEKULOVÁ HMOTNOST A DISTRIBUCE MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI POLYMERŮ
A.19	OBSAH NÍZKOMOLEKULÁRNÍCH LÁTEK V POLYMERECH
A.20	CHOVÁNÍ POLYMERŮ PŘI ROZPOUŠTĚNÍ NEBO EXTRAKCI VE VODĚ
A.21	OXIDAČNÍ VLASTNOSTI (KAPALINY)
A.22	DÉLKOVĚ VÁŽENÝ STŘEDNÍ GEOMETRICKÝ PRŮMĚR VLÁKEN
A.23.	ROZDĚLOVACÍ KOEFICIENT (OKTAN-1-OL/VODA): METODA POMALÉHO MÍCHÁNÍ
A.24.	ROZDĚLOVACÍ KOEFICIENT (N-OKTANOL/VODA), METODA VYSOKOÚČINNÉ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE (HPLC)
A.25	DISOCIAČNÍ KONSTANTY VE VODĚ (TITRAČNÍ METODA – SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA – KONDUKTOMETRICKÁ METODA)

A.1   BOD TÁNÍ/BOD TUHNUTÍ

1.   METODA

Většina dále popsaných metod je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1). Jejich základní principy jsou uvedeny v literatuře (2) a (3).

1.1   ÚVOD

Popsané metody a přístroje jsou určeny ke stanovení bodu tání látek bez omezení z hlediska stupně jejich čistoty.

Výběr metody závisí na povaze látky, která má být zkoumána. Omezením bude tedy skutečnost, zda lze danou látku rozmělnit na prášek snadno, obtížně nebo zda ji nelze rozmělnit.

U některých látek je vhodnější stanovení bodu tuhnutí nebo krystalizace a normalizované metody pro tato stanovení jsou v této metodě rovněž uvedeny.

Nelze-li vzhledem ke zvláštním vlastnostem látky dobře stanovit žádný z uvedených parametrů, může byt vhodné stanovit bod tekutosti.

1.2   DEFINICE A JEDNOTKY

Bod tání je definován jako teplota, při níž dochází za atmosférického tlaku k přechodu z pevného do kapalného skupenství a která za ideálních podmínek odpovídá bodu tuhnutí.

Vzhledem k tomu, že u mnoha látek dochází k fázovému přechodu v rozmezí teplot, je toto rozmezí často nazýváno rozmezím bodu tání.

Přepočet jednotek (K na oC)

t = T – 273,15

t

:

Celsiova teplota, stupně Celsia ( oC)

T

:

termodynamická teplota, kelvin (K)

1.3   REFERENČNÍ LÁTKY

Při zkoumání nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

Některé kalibrační látky jsou uvedeny v literatuře (4).

1.4   PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Stanovuje se teplota (teplotní rozmezí) fázového přechodu z pevného do kapalného skupenství nebo z kapalného do pevného skupenství. V praxi se při zahřívání/ochlazování vzorku zkoušené látky za atmosférického tlaku stanoví teploty počátku tání/tuhnutí a konce tání/tuhnutí. Je popsáno pět typů metod, jmenovitě kapilární metoda, metody používající zahřívací bloky, metody stanovení bodu tuhnutí, metody termické analýzy a stanovení bodu tekutosti (vyvinuto pro minerální oleje).

V některých případech může být vhodné měřit bod tuhnutí místo bodu tání.

1.4.1   Kapilární metoda

1.4.1.1   Zařízení pro stanovení bodu taní s kapalinovou lázní

Malé množství jemně rozmělněné látky se vpraví do kapiláry a zhutní se. Kapilára se zahřívá spolu s teploměrem, přičemž se rychlost nárůstu teploty během tání nastaví na méně než 1 K/min. Stanoví se teploty počátku a konce tání.

1.4.1.2   Zařízení pro stanovení bodu tání s kovovým blokem

Provádí se podobně jako v bodě 1.4.1.1 s tím rozdílem, že kapilára a teploměr jsou umístěny v kovovém vyhřívaném bloku a pozorují se otvory v bloku.

1.4.1.3   Detekce fotočlánkem

Vzorek v kapiláře se automaticky zahřívá v kovovém válci. Otvorem ve válci prochází látkou světelný paprsek na přesně kalibrovaný fotočlánek. Při tání mění většina látek optické vlastnosti a z neprůhledných se mění na průhledné. V tomto okamžiku vzroste intenzita světla dopadajícího na fotočlánek a do zařízení odečítajícího teplotu platinového odporového teploměru umístěného v topné komůrce je vyslán signál k zastavení zaznamenávání. Tato metoda není vhodná pro některé silně zbarvené látky.

1.4.2   Zahřívací bloky

1.4.2.1   Koflerův zahřívací stolek

Koflerův zahřívací stolek je tvořen dvěma kovovými částmi s různou teplotní vodivostí, je vyhříván elektricky a je konstruován tak, že teplotní gradient je po jeho délce téměř lineární. Teplota stolku se může měnit od 283 do 573 K; stolek je vybaven speciálním zařízením pro odečítání teploty, tvořeným jezdcem s ukazatelem a stupnici navrženou pro daný stolek. Pro stanovení bodu tání se látka nanese v tenké vrstvě přímo na povrch stolku. Během několika sekund se vytvoří ostrá dělicí linie mezi kapalnou a pevnou fázi. Teplota v místě dělicí linie se odečte po nastavení ukazatele na tuto dělicí linii.

1.4.2.2   Tavící mikroskop

Pro stanovení bodu tání velmi malých množství látek se používají různé typy mikroskopů s ohřívacím stolkem. Většina ohřívacích stolků využívá k měření teploty citlivé termočlánky, používají se však i rtuťové teploměry. Typický přístroj pro stanovení bodu tání pomocí mikroskopu s ohřívacím stolkem má ohřívací komoru s kovovou deskou, na kterou se umístí vzorek na podložním sklíčku. Ve středu kovové desky je otvor, kterým může procházet světelný paprsek odražený osvětlovacím zrcátkem mikroskopu. Při měřeních se ohřívací komora přikryje skleněnou destičkou, aby se omezila cirkulace vzduchu v místě, kde se nachází vzorek.

Ohřev vzorku se kontroluje regulačním odporem. Pro velmi přesná měření opticky anisotropních látek lze používat polarizované světlo.

1.4.2.3   Menisková metoda

Tato metoda se používá především pro polyamidy.

Vizuálně se stanoví teplota, při které se zřetelně posune meniskus silikonového oleje uzavřeného mezi ohřívacím blokem a skleněnou krycí destičkou umístěnou na vzorku zkoušeného polyamidu.

1.4.3   Metoda stanovení bodu tuhnutí

Vzorek se vloží do speciální zkumavky, která se umístí do přístroje pro stanovení bodu tuhnutí. Během ochlazování se vzorek nepřetržitě pomalu míchá a ve vhodných intervalech se odečítá teplota. Jakmile je teplota po několik odečtů konstantní (po odpovídající korekci teploměru), je zaznamenána jako bod tuhnutí.

Podchlazení je nutno zabránit udržováním rovnováhy mezi pevnou a kapalnou fází.

1.4.4   Termická analýza

1.4.4.1   Diferenční termická analýza (DTA)

Při této technice se zaznamenává teplotní rozdíl mezi látkou a referenčním materiálem, jež jsou podrobeny stejnému řízenému teplotnímu programu. Jestliže u vzorku dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna zaznamenána jako endotermická (tání) nebo exotermická (tuhnutí) odchylka od základní linie záznamu teploty.

1.4.4.2   Diferenční skenovací kalorimetrie (DSC)

Při této technice se látka a referenční materiál podrobí stejnému řízenému teplotnímu programu a zaznamenává se rozdíl energie absorbované látkou a referenčním materiálem jako funkce teploty. Tato energie je energií potřebnou k zachování nulového teplotního rozdílu mezi látkou a referenčním materiálem. Jestliže u vzorku dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna zaznamenána jako endotermická (tání) nebo exotermická (tuhnutí) odchylka od základní linie záznamu tepelného toku.

1.4.5   Bod tekutosti

Metoda byla vyvinuta pro minerální oleje a je vhodná pro měření olejovitých látek s nízkým bodem tání.

Po počátečním zahřátí se vzorek určitou rychlostí ochlazuje a v intervalech po 3 K se stanovuje jeho tekutost. Nejnižší teplota, při níž je ještě pozorován pohyb látky, se zaznamená jako bod tekutosti.

1.5   KRITERIA JAKOSTI

Použitelnost a přesnost různých metod stanovení bodu tání/rozmezí bodu tání jsou uvedeny v této tabulce.

TABULKA: POUŽITELNOST METOD

1.6   POPIS METOD

Postupy téměř všech těchto zkušebních metod jsou popsány v národních a mezinárodních normách (viz doplněk 1).

1.6.1   Kapilární metody

Při pomalém vzestupu teploty lze u jemně práškovitých látek obvykle rozlišit stupně tání znázorněné na obrázku 1.

Obrázek 1

Text obrazu

Během stanovení bodu tání se zaznamenávají teploty počátku tání a konečné fáze.

1.6.1.1.   Zařízení pro stanovení bodu tání s kapalinovou lázní

Na obrázku 2 je znázorněna normalizovaná skleněná aparatura pro stanovení bodu tání (JIS K 0064); všechny rozměry jsou uvedeny v milimetrech.

Obrázek 2

Text obrazu

Kapalinová lázeň:

Je třeba zvolit vhodnou kapalinu. Volba kapaliny závisí na bodu tání, který má být stanoven, např. kapalný parafin pro stanovení bodu tání nižšího než 473 K, silikonový olej pro stanovení bodu tání nižšího než 573 K.

Pro stanovení bodu tání vyššího než 523 K lze použít směs tří hmotnostních dílů kyseliny sírové a dvou hmotnostních dílů síranu draselného. S tímto typem směsi je třeba pracovat s náležitou opatrností.

Teploměr:

Měly by se používat pouze teploměry, které splňují požadavky norem ASTM E 171, DIN 12770, JIS K 8001 nebo rovnocenných norem.

ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Postup:

Suchá látka se jemně rozetře v třecí misce a vpraví se do kapiláry zatavené na jednom konci, a to tak, aby po zhutnění byla kapilára naplněna do výšky přibližně 3 mm. Má-li se dosáhnout stejnoměrného zhutnění, nechá se kapilára dopadnout z výšky přibližně 700 mm skleněnou trubicí na hodinové sklíčko.

Naplněná kapilára se vloží do lázně tak, aby se střední část rtuťové baňky teploměru dotýkala kapiláry v místě, kde se nachází vzorek. Kapilára se obvykle vkládá do lázně při teplotě asi o 10 K nižší, než je bod tání.

Lázeň se zahřívá tak, aby vzestup teploty činil přibližně 3 K/min. Lázeň se míchá. Asi 10 K pod očekávaným bodem tání se růst teploty upraví na nejvýše 1 K/min.

Výpočet:

Bod tání se vypočte takto:

T = TD + 0,00016 (TD – TE)n

kde:

T

=

korigovaný bod tání v K

TD

=

odečet teploty na teploměru D v K

TE

=

odečet teploty na teploměru E v K

n

=

počet stupňů, o něž rtuťový sloupec teploměru D vyčnívá z kapaliny.

1.6.1.2   Zařízení pro stanovení bodu tání s kovovým blokem

Přístroj:

Je tvořen:

Teploměr:

Viz normy uvedené v 1.6.1.1. Je rovněž možné použít termoelektrické měřicí přístroje srovnatelné přesnosti.

Obrázek 3

Text obrazu

1.6.1.3   Detekce fotočlánkem

Přístroj a postup:

Přístroj se skládá z kovové komory s automatickým ohřívacím zařízením. Tři kapilární trubičky se naplní podle bodu 1.6.1.1 a umístí se do ohřívací komory.

Pro kalibraci přístroje je k dispozici několik lineárních režimů růstu teploty, přičemž vhodný lineární růst teploty se elektricky nastaví předem zvolenou konstantou. Zaznamenávací zařízení ukazují teplotu v ohřívací komoře a teplotu látky v kapilárách.

1.6.2   Zahřívací bloky

1.6.2.1   Koflerův zahřívací stolek

Viz doplněk.

1.6.2.2   Tavící mikroskop

Viz doplněk.

1.6.2.3   Menisková metoda (pro polyamidy

Viz doplněk.

V oblasti bodu tání by měla být rychlost ohřevu menší než 1 K/min.

1.6.3   Metody stanovení bodu tuhnutí

Viz doplněk.

1.6.4   Termická analýza

1.6.4.1   Diferenční termická analýza

Viz doplněk.

1.6.4.2   Diferenční skenovací kalorimetrie

Viz doplněk.

1.6.5   Stanovení bodu tekutosti

Viz doplněk.

2.   DATA

V některých případech je nutno provést korekci teploměru.

3.   ZPRÁVY

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:

Jako bod tání se uvede střední hodnota alespoň dvou měření, jejichž výsledky leží v rozmezí odhadnuté přesnosti (viz tabulky).

Leží-li rozdíl teplot počáteční a konečné fáze tání v mezích přesnosti metody, uvede se jako bod tání konečná teplota, v opačném případě se uvedou obě teploty.

Jestliže se látka před dosažením bodu tání rozkládá nebo sublimuje, uvede se teplota, při které dochází k pozorovanému jevu.

Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a fyzikální stav látky.

4.   LITERATURA

Doplněk

Další technické podrobnosti je možné zjistit například v těchto normách:

1.   Kapilární metody

1.1   Zařízení pro stanovení bodu tání s kapalinovou lázní

1.2   Přístroje pro stanovení bodu tání s kovovým blokem

2.   Zahřívací bloky

2.1   Koflerův zahřívací stolek

2.2   Tavicí mikroskop

2.3   Menisková metoda (pro polyamidy)

3.   Metody stanovení bodu tuhnutí

4.   Termická analýza

4.1   Diferenční termická analýza

4.2   Diferenční skenovací kalorimetrie

5.   Stanovení bodu tekutosti

A.2   BOD VARU

1.   METODA

Většina dále popsaných metod je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1). Jejich základní principy jsou uvedeny v literatuře (2) a (3).

1.1   ÚVOD

Popsané metody a zařízení lze použít pro kapaliny a látky s nízkým bodem tání, pokud nepodléhají chemickým reakcím pod bodem varu (např. autooxidaci, přesmyku, rozkladu atd.). Metody lze použít jak pro čisté kapalné látky, tak pro kapalné látky obsahující nečistoty.

Přednost mají metody využívající detekci fotočlánkem a metody termické analýzy, protože umožňují stanovení jak bodu tání, tak bodu varu. Tato měření mohou být navíc prováděna automaticky.

„Dynamická metoda“ má tu výhodu, že ji lze použít i ke stanovení tlaku par a přitom není třeba korigovat bod varu na normální tlak (101,325  kPa), neboť tento tlak lze během měření nastavit manostatem.

Poznámky:

Vliv nečistot na stanovení bodu varu závisí ve velké míře na jejich povaze. Jestliže vzorek obsahuje těkavé nečistoty, které mohou ovlivnit výsledky, může být látky přečištěna.

1.2   DEFINICE A JEDNOTKY

Standardní bod varu je definován jako teplota, při které je tlak par dané kapaliny roven 101,325  kPa.

Jestliže se měření bodu varu neprovádí za normálního tlaku, lze závislost tlaku par na teplotě popsat Clausiovou-Clapeyronovou rovnicí:

kde:

P

=

tlak par látky v Pa,

ΔHV

=

výparné teplo v Jmol-1

R

=

univerzální molární plynová konstanta = 8,314 Jmol-1 K-1

T

=

termodynamická teplota v K

Bod varu se uvádí s ohledem na okolní tlak při měření.

Přepočty

Tlak (jednotka: kPa)

100 kPa

=

1 bar = 0,1 Mpa (jednotka „bar“ je nadále přípustná, její používání se však nedoporučuje)

133 Pa

=

1 mm Hg = 1 torr (jednotky „mm Hg“ a „torr“ nejsou povoleny)

1 atm

=

standardní atmosféra = 101 325 Pa (jednotka „atm“ není povolena).

Teplota (jednotka:K)

t = T – 273,15

t

:

Celsiova teplota, stupeň Celsia ( oC)

T

:

termodynamická teplota, kelvin (K)

1.3   REFERENČNÍ LÁTKY

Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

Některé kalibrační látky jsou uvedeny v doplňku.

1.4   PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Pět metod stanovení bodu varu (teplotního rozmezí bodu varu) je založeno přímo na měření teploty varu, další dvě využívají termální analýzy.

1.4.1   Stanovení ebuliometrem

Ebuliometry byly původně vyvinuty pro stanovení molekulové hmotnosti na základě zvýšení teploty varu, jsou však vhodné také pro přesná měření bodu varu. Velmi jednoduchý přístroj je popsán v normě ASTM D 112072 (viz doplněk). V tomto přístroji se kapalina zahřívá za rovnovážných podmínek při atmosférickém tlaku, dokud nezačne vřít.

1.4.2   Dynamická metoda

Metoda zahrnuje měření teploty kondenzace páry vhodným teploměrem umístěným za varu ve zpětném toku (refluxu). U této metody lze měnit tlak.

1.4.3   Destilační metoda pro stanovení bodu varu

Metoda zahrnuje destilaci kapaliny a měření teploty kondenzace páry, přičemž se stanovuje také množství destilátu.

1.4.4   Postup podle Siwoloboffa

Vzorek se zahřívá ve zkumavce, která je ponořena do tepelné lázně. Do zkumavky se vzorkem je zasunuta zatavená kapilára, v jejíž spodní části se nachází vzduchová bublinka.

1.4.5   Detekce fotočlánkem

Při použití principu unikajících bublinek podle Siwoloboffa se provádí automatické fotoelektrické měření.

1.4.6   Diferenční termická analýza

Při této technice se zaznamenává teplotní rozdíl mezi látkou a referenčním materiálem jako funkce teploty, přičemž látka a referenční materiál se podrobí témuž řízenému teplotnímu programu. Jestliže u studované látky dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna indikována jako endotermická odchylka (var) od základní linie záznamu teploty.

1.4.7   Diferenční skenovací kalorimetrie

Při této technice se látka a referenční materiál podrobí stejnému řízenému teplotnímu programu a zaznamenává se rozdíl energie absorbované látkou a referenčním materiálem jako funkce teploty. Tato energie je energií potřebnou k zachování nulového teplotního rozdílu mezi látkou a referenčním materiálem. Jestliže u vzorku dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna indikována jako endotermická odchylka (var) od základní linie záznamu tepelného toku.

1.5   KRITERIA JAKOSTI

Použitelnost a přesnost různých metod používaných pro stanovení bodu/teplotního rozmezí bodu varu jsou uvedeny v tabulce 1.

1.6   POPIS METOD

Postupy některých zkušebních metod jsou popsány v mezinárodních a národních normách (viz doplněk).

1.6.1   Ebuliometr

Viz doplněk.

1.6.2   Dynamická metoda

Viz metoda A.4 pro stanovení tlaku par.

Zaznamená se teplota varu naměřená při tlaku 101,325  kPa.

1.6.3   Destilační metoda (stanovení rozmezí bodu varu)

Viz doplněk.

1.6.4   Postup podle Siwoloboffa

Vzorek se zahřívá ve zkumavce o průměru přibližně 5 mm v přístroji pro stanovení bodu tání (obrázek 1).

Na obrázku 1 je znázorněn normalizovaný přístroj pro stanovení bodu varu (JIS K 0064) (přístroj je skleněný, všechny rozměry jsou uvedeny v milimetrech).

Obrázek 1

Text obrazu

Do zkumavky se vloží kapilára (varná kapilára) zatavená asi 1 cm nad spodním koncem. Zatavená část kapiláry musí ležet pod hladinou kapaliny. Zkumavka obsahující kapiláru se upevní buď pryžovou páskou k teploměru, nebo pomocí bočního držáku (viz obrázek 2).

Kapalina pro lázeň se volí podle bodu varu. Pro teploty do 573 K lze použít silikonový olej. Parafinový olej lze použít pouze do 473 K. Kapalina v lázni se zahřívá tak, aby vzestup teploty byl zpočátku asi 3 K/min. Lázeň se míchá. Asi 10 K před očekávaným bodem tání se zahřívání sníží tak, aby nárůst teploty byl nejvýše 1 K/min. Krátce před dosažením bodu varu začnou z varné kapiláry rychle unikat bublinky.

Bodu varu je dosaženo, když při ochlazování náhle ustane unikáni bublinek a kapalina začne v kapiláře stoupat. Příslušný údaj na teploměru je bodem varu látky.

Modifikovanou metodou (obrázek 3) se bod varu stanovuje v kapiláře pro stanovení bodu tání. Ta se vytáhne do tenké špičky dlouhé asi 2 cm (a) a do ni se nasaje malé množství vzorku. Otevřený konec tenké části kapiláry se zataví tak, aby na konci byla malá vzduchová bublinka. Při zahřívání v aparatuře pro stanoveni bodu táni (b) se vzduchová bublinka rozpíná. Bod varu odpovídá teplotě, při které sloupeček látky dosáhne hladiny kapalinové lázně (c).

1.6.5   Detekce fotočlánkem

Vzorek se zahřívá v kapiláře ve vyhřívaném kovovém bloku.

Otvory v bloku se vede světelný paprsek tak, aby procházel látkou na přesně kalibrovaný fotočlánek.

Při zvyšování teploty vzorku stoupají z kapiláry jednotlivé vzduchové bublinky. Při dosažení bodu varu počet bublinek značně vzroste. To vede ke změně intenzity světla zaznamenané fotočlánkem a vyvolá signál v měřicím přístroji, kterým se zastaví zaznamenávání teploty měřené platinovým odporovým teploměrem umístěným v bloku.

Tato metoda je zvláště vhodná, protože umožňuje stanovení teplot nižších než laboratorní teplota až do 253,15  K (–20 oC) bez jakékoli úpravy přístroje. Pouze je třeba umístit přístroj v chladicí lázni.

1.6.6   Termická analýza

1.6.6.1   Diferenční termická analýza

Viz doplněk.

1.6.6.2   Diferenční skenovací kalorimetrie

Viz doplněk.

2.   DATA

Při malých odchylkách od normálního tlaku (nejvýše ± 5 kPa) se hodnoty teploty varu přepočítávají na normalizovanou teplotu Tn pomocí Sidneyovy-Youngovy rovnice:

Tn = T + (fT × Δp)

kde:

Δp

=

(101,325 – p) [pozor na znaménko]

P

=

naměřený tlak v kPa

fT

=

velikost změny teploty varu v závislosti na změně tlaku v K/kPa

T

=

naměřená teploty varu v K

Tn

=

teplota varu korigovaná na normální tlak v K

Teplotní korekční faktory fT a rovnice pro jejich aproximaci jsou uvedeny pro řadu látek ve zmíněných mezinárodních a národních normách.

Například metoda podle DIN 53171 uvádí přibližné korekce pro rozpouštědla obsažená v nátěrových hmotách:

3.   ZPRÁVY

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:

Jako bod varu se uvede střední hodnota alespoň dvou měření, jejichž výsledky leží v rozmezí odhadnuté přesnosti (viz tabulka 1).

Uvedou se naměřené teploty varu a jejich střední hodnota a dále hodnota tlaku v kPa, při kterém byla měření provedena. Tlak by se měl pokud možno blížit normálnímu tlaku.

Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a fyzikální stav látky.

4.   LITERATURA

Doplněk

Další technické podrobnosti je možné zjistit například v těchto normách:

1.   Ebuliometr

2.   Destilační postupy (teplotní rozmezí bodu varu)

3.   Diferenční termická analýza a diferenční skenovací kalorimetrie

A.3   RELATIVNÍ HUSTOTA

▼M9

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

▼M1

A.4   TLAK PAR

▼M9

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

▼B

A.5   POVRCHOVÉ NAPĚTÍ

1.   METODA

Popsané metody jsou založeny na Pokynech OECD pro zkoušení (1). Základní principy jsou uvedeny v literatuře (2).

1.1   ÚVOD

Popsané metody jsou určeny pro měření povrchového napětí vodných roztoků.

Před provedením těchto zkoušek je vhodné mít k dispozici předběžné informace o rozpustnosti látky ve vodě, o její struktuře, o hydrolýze a o kritické koncentraci pro tvorbu micel.

Níže uvedené metody jsou použitelné pro většinu chemických látek bez omezení z hlediska stupně jejich čistoty.

Měření povrchového napětí metodou prstencového tenziometru je omezeno na vodné roztoky s dynamickou viskozitou nižší než přibližně 200 mPa/s.

1.2   DEFINICE A JEDNOTKY

Povrchová volná enthalpie vztažená na jednotku povrchu se nazývá povrchové napětí.

Povrchové napětí se vyjadřuje těchto jednotkách:

N/m (v soustavě SI) nebo

mN/m (odvozená jednotka v soustavě SI)

1 N/m= 103 dyn/cm

1 mN/m = 1 dyn/cm ve staré soustavě CGS

1.3   REFERENČNÍ LÁTKY

Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

Referenční látky, které pokrývají široké rozpětí hodnot povrchového napětí, jsou uvedeny v literatuře (1, 3).

1.4   PODSTATA METOD

Metody jsou založeny na měření největší síly, kterou je nutné působit ve svislém směru na třmínek nebo prstenec, který se dotýká povrchu zkoumané kapaliny umístěné v měřicí nádobě, aby se od tohoto povrchu oddělil, nebo na destičku, která se svým okrajem dotýká povrchu, aby se vzniklý film vytáhl nahoru.

Látky, jejichž rozpustnost ve vodě dosahuje hodnoty alespoň 1 mg/1, se zkoušejí ve vodných roztocích při jedné koncentraci.

1.5   KRITERIA JAKOSTI

Přesnost těchto metod je pravděpodobně vyšší, než je požadováno pro účely hodnocení stavu životního prostředí.

1.6   POPIS METOD

Připraví se roztok látky v destilované vodě. Koncentrace roztoku by měla být 90 % koncentrace nasyceného roztoku látky ve vodě; pokud tato koncentrace přesáhne 1 g/l, použije se k měření roztok o koncentraci 1 g/l. Látky, jejichž rozpustnost je menší než 1 mg/l, není nutné zkoušet.

1.6.1   Destičková metoda

Viz ISO 304 a NF T 73060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

1.6.2   Třmínková metoda

Viz ISO 304 a NF T 73060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

1.6.3   Prstencová metoda

Viz ISO 304 a NF T 73060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

1.6.4   Harmonizovaná prstencová metoda OECD

1.6.4.1.   Aparatura

Pro toto měření jsou vhodné komerční tenziometry. Skládají se z těchto částí:

1.6.4.1.1    Pohyblivý stolek pro vzorek

Pohyblivý stolek pro vzorek slouží jako podložka pro termostatovanou měřicí nádobu, ve které je kapalina, která má být zkoušena. Spolu se systémem měření síly je upevněn na stojanu.

1.6.4.1.2    Systém měření síly

Systém měření síly je umístěn nad stolkem pro vzorek (viz obrázek). Chyba měření síly nemá překročit ± 10–6 N, což odpovídá chybě ± 0,1  mg při měřeni hmotnosti. Ve většině případů je měřicí stupnice komerčních tenziometrů dělena v mN/m, takže je možné povrchové napětí odečítat přímo v mN/m s přesností na 0,1 mN/m.

1.6.4.1.3    Měřicí tělísko (prstenec)

Prstenec je obvykle zhotoven z platino-iridiového drátu o průměru asi 0,4  mm a středním obvodu 60 mm. Prstenec z drátu je zavěšen vodorovně na upevňovací vidlici z drátu a na kovové tyčince, která tvoří spojení k systému měření síly (viz obrázek).

Obrázek

Měřicí tělísko

(všechny rozměry jsou uvedeny v milimetrech)

Text obrazu

1.6.4.1.4    Měřicí nádoba

Měřicí nádobou pro zkušební roztok je termostatovaná skleněná nádoba. Má být konstruována tak, aby teplota zkoumané kapaliny i plynné fáze nad jejím povrchem zůstala během měření konstantní a aby se vzorek nemohl odpařovat. Vhodná je válcová skleněná nádoba o vnitřním průměru nejméně 45 mm.

1.6.4.2   Příprava aparatury

1.6.4.2.1    Čištění

Skleněné nádoby je třeba pečlivě vyčistit. Pokud je to nutné, měly by se vymýt horkou kyselinou chromsírovou a následně koncentrovanou kyselinou fosforečnou (83 až 98 % hmot. H3PO4), pečlivě vypláchnout tekoucí vodou a nakonec omýt redestilovanou vodou do neutrální reakce a následně vysušit nebo vypláchnout vzorkem kapaliny, která má být měřena.

Prstenec je třeba nejprve pečlivě umýt vodou, aby se odstranily všechny látky rozpustné ve vodě. Poté se krátce ponoří do kyseliny chromsírové, opláchne se v redestilované vodě do neutrální reakce a nakonec se krátce ohřeje nad methanolovým plamenem.

Poznámka:

Znečištění látkami, které se nerozpouštějí ani nerozkládají kyselinou chromsírovou ani kyselinou fosforečnou, jako například silikony, je nutné odstraňovat vhodnými organickými rozpouštědly.

1.6.4.2.2    Kalibrování aparatury

Validace aparatury spočívá v ověření nuly a v nastavení přístroje tak, aby jeho data umožňovala spolehlivé stanovení v mN/m.

Poloha:

Přístroj musí být nastaven do vodorovné polohy, např. pomocí libely položené na základovou desku tenziometru a nastavením stavěcích šroubů základnové desky.

Nastavení nuly:

Po upevnění prstence na aparatuře a před ponořením do kapaliny je třeba nastavit nulu ukazatele tenziometru a zkontrolovat rovnoběžnost prstence s hladinou kapaliny. K tomu je možné použít hladiny kapaliny jako zrcadla.

Kalibrace:

Vlastní kalibraci před měřením je možné provést dvěma postupy:

1.6.4.3   Příprava vzorků

Připraví se vodné roztoky zkoušených látek o požadované koncentraci, které nesmějí obsahovat nerozpuštěné složky.

Roztoky musí být udržovány při konstantní teplotě (± 0,5 oC). Protože se povrchové napětí roztoku v měřicí nádobě v čase mění, provedou se měření v různých časech a sestrojí se křivka závislosti povrchového napětí na čase. Nedochází-li k žádným dalším změnám, bylo dosaženo rovnovážného stavu.

Měření je ovlivňováno znečištěním prachem nebo plynnými látkami. Práce musí být tedy prováděny pod ochranným krytem.

1.6.5   Zkušební podmínky

Měření se provádí přibližně při 20 oC a udržuje se tolerance ± 0,5 oC.

1.6.6   Postup zkoušky

Roztoky, které mají být měřeny, se převedou do pečlivě vyčištěné měřicí nádoby, přičemž je třeba dbát na to, aby nedošlo k pěnění, a nádoba se poté postaví na stolek zkušební aparatury. Horní část stolku s měřicí nádobou se vysune tak vysoko, aby se prstenec ponořil pod povrch roztoku, který má být měřen. Horní část stolku se následně postupně a rovnoměrně sníží (rychlostí přibližně 0,5  cm/min), aby došlo k oddělení prstence od povrchu, a to až do dosažení maximální hodnoty síly. Film kapaliny lpící na prstenci se od něho nesmí odtrhnout. Po ukončení měření se prstenec opět ponoří pod povrch a postup se opakuje až do dosažení konstantní hodnoty povrchového napětí. Při každém stanovení se začne zaznamenávat čas v okamžiku plnění roztoku do měřicí nádoby. Odečty se provedou vždy v okamžiku, kdy je dosaženo maximální síly nutné pro oddělení prstence od povrchu kapaliny.

2.   DATA

Za účelem výpočtu povrchového napětí se hodnota odečtená na přístroji v mN/m nejprve vynásobí kalibračním faktorem Φa nebo Φb (podle použitého postupu kalibrace). Získá se tak hodnota, která však platí pouze přibližně, a vyžaduje proto korekci.

Harkins a Jordan (4) empiricky stanovili korekční faktory pro hodnoty povrchového napětí měřeného prstencovou metodou, které závisí na rozměrech prstence, hustotě kapaliny a jejím povrchovém napětí.

Vzhledem k tomu, že je zdlouhavé stanovovat pro každé jednotlivé měření korekční faktor z tabulek Harkinse a Jordana, lze pro výpočet povrchového napětí vodných roztoků použít zjednodušenou metodu, která spočívá v odečtu korigovaných hodnot povrchového napětí přímo z tabulky. (Pro odečtené hodnoty, které leží mezi hodnotami uvedenými v tabulce, se provede interpolace.)

Tabulka byla sestavena na základě korekcí podle Harkinse a Jordana. Je obdobou tabulky podle normy DIN 53914 pro vodu a vodné roztoky (hustota p = 1 g/cm3); platí pro běžný komerční prstenec o rozměrech R = 9,55  mm (střední poloměr prstence) a r = 0,185  mm (poloměr drátu prstence). Tabulka udává korigované hodnoty pro měření povrchového napětí získané po kalibraci závažími nebo vodou.

Jiným řešením je vypočítat povrchové bez předchozí kalibrace podle rovnice:

kde:

F

=

síla udaná měřicím systémem při oddělení filmu,

R

=

poloměr prstence,

f

=

korekční faktor (1).

3.   ZPRÁVY

3.1   PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:

3.2   INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Vzhledem k tomu, že povrchové napětí vody je 72,75 mN/m při 20 oC, měly by být látky vykazující za podmínek této metody povrchové napětí menší než 60 mN/m považovány za povrchově aktivní materiály.

4.   LITERATURA

▼M4

A.6   ROZPUSTNOST VE VODĚ

ÚVOD

VÝCHOZÍ ÚVAHY

DEFINICE A JEDNOTKY

REFERENČNÍ CHEMICKÉ LÁTKY

POPIS METOD

Zkušební podmínky

Předběžná zkouška

Sloupcová eluční metoda

Podstata

Aparatura

Obrázek 1

Rozměry v mm

Obrázek 2

Obrázek 3

Postup s použitím oběhového čerpadla

Postup s použitím vyrovnávací nádoby

Baňková metoda

Podstata

Aparatura

Postup

Analytické stanovení

ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ

Údaje

Sloupcová eluční metoda

Baňková metoda

Protokol o zkoušce

Sloupcová eluční metoda

Baňková metoda

LITERATURA:

▼B

A.8   ROZDĚLOVACÍ KOEFICIENT

▼M9

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

▼B

A.9   BOD VZPLANUTÍ

▼M9

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

▼B

A.10   HOŘLAVOST (PEVNÉ LÁTKY)

▼M9

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

▼B

A.11   HOŘLAVOST PLYNŮ

▼M9

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

▼B

A.12   HOŘLAVOST (PŘI STYKU S VODOU)

▼M9

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

▼B

A.13   PYROFORICKÉ VLASTNOSTI PEVNÝCH LÁTEK A KAPALIN

▼M11

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro dané sledované vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

▼B

A.14   VÝBUŠNÉ VLASTNOSTI

1.   METODA

1.1   ÚVOD

Tato metoda umožňuje stanovit, zda u pevné nebo pastovité látky existuje nebezpečí výbuchu, je-li podrobena působení plamene (citlivost na působení tepla), nárazu nebo tření (citlivost na mechanické podněty), a zda u kapalné látky existuje nebezpečí výbuchu, je-li podrobena působení plamene nebo nárazu.

Metoda sestává ze tří částí:

Metoda poskytuje data pro stanovení pravděpodobnosti vyvolání výbuchu určitými běžnými podněty. Metoda neslouží ke zjištění, zda je látka schopna vybuchnout za jakýchkoli podmínek.

Metoda je vhodná pro zjištění, zda u látky existuje nebezpečí výbuchu (citlivost na působení tepla a mechanická citlivost) za určitých podmínek specifikovaných ve směrnici. Je založena na řadě typů zařízení, která jsou široce používána v mezinárodním měřítku (1) a která obvykle poskytují vypovídající výsledky. Připouští se, že tato metoda není definitivní. Lze použít jiné než specifikované zařízení, za předpokladu, že je mezinárodně uznané a že lze výsledky vhodným způsobem srovnat s výsledky poskytnutými specifikovaným zařízením.

Zkouška nemusí být provedena, jestliže z dostupných termodynamických informací (např. ze slučovacího tepla nebo disociačního tepla) a/nebo z nepřítomnosti určitých reakčních skupin (2) ve struktuře s jistotou vyplývá, že látka nemá schopnost rychle se rozkládat za vývoje plynů nebo za uvolňování tepla (tzn. materiál nepředstavuje žádné riziko výbuchu). Zkouška mechanické citlivosti na tření se nevyžaduje u kapalin.

1.2   DEFINICE A JEDNOTKY

Výbušná látka:

Látka, která může vybuchnout působením plamene nebo která je citlivá na náraz nebo tření ve specifikovaném zařízení (nebo je mechanicky citlivější než 1,3-dinitrobenzen v alternativním zařízení).

1.3   REFERENČNÍ LÁTKY

1,3-dinitrobenzen, technický krystalický výrobek, prosetý na sítu o velikosti oka 0,5  mm, pro metody citlivosti na tření a na náraz.

Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (označovaný jako RDX nebo hexogen nebo cyklonit – CAS 121-82-4) rekrystalizovaný z vodného cyklohexanonu, prosetý za mokra na sítě 250 μm a zachycený na sítě 150 μm, sušený 4 hodiny při 103 ± 2 oC pro druhou sérii zkoušek citlivosti na tření a na náraz.

1.4   PODSTATA METODY

Pro zjištění bezpečných podmínek pro provedení tří zkoušek citlivosti jsou nezbytné předběžné zkoušky.

1.4.1   Zkoušky bezpečného zacházení (3)

Z bezpečnostních důvodů se před provedením hlavních zkoušek podrobí velmi malé neuzavřené vzorky látky (přibližně 10 mg) zahřívání v plameni plynového hořáku, nárazu v jakémkoli vhodném zařízení a tření za použití paličky proti podložce nebo jiného zařízení pro zkoušení citlivosti natření. Účelem předběžných zkoušek je zjistit, zda je látka tak citlivá a výbušná, že by měly být předepsané zkoušky citlivosti, zvláště zkouška citlivosti na působení tepla, prováděny za zvláštních bezpečnostních opatření, aby nedošlo k poranění osoby provádějící zkoušky.

1.4.2   Citlivost na působení tepla

Metoda spočívá v zahřívání látky v ocelové trubce uzavřené clonami s různými průměry otvorů s cílem zjistit, zda může za podmínek intenzivního zahřívání a při definovaném utěsnění vybuchnout.

1.4.3   Mechanická citlivost (na náraz)

Metoda spočívá ve vystavení látky nárazu specifikovaným závažím puštěným ze specifikované výšky.

1.4.4   Mechanická citlivost (na tření)

Metoda spočívá ve vystavení pevných nebo pastovitých látek tření mezi standardními povrchy za specifikovaných podmínek zatížení a vzájemného pohybu.

1.5   KRITÉRIA JAKOSTI

Nejsou stanovena.

1.6   POPIS METODY

1.6.1   Citlivost na působení tepla (na působení plamene)

1.6.1.1   Zařízení

Zařízení je tvořeno ocelovou trubkou na jedno použití s opakovaně použitelným uzavíracím zařízením (obrázek 1), instalovanou v ohřívacím a ochranném zařízení. Každá trubka je hlubokotažená z ocelového plechu (viz doplněk) a má vnitřní průměr 24 mm, délku 75 mm a tloušťku stěny 0,5  mm. Na otevřeném konci trubky je příruba sloužící k uzavření trubky sestavou clony. Sestava je tvořena clonou se středovým otvorem odolnou vůči tlaku, připevněnou k trubce pomocí dvoudílného šroubového spoje (matice a závitové příruby). Matice a závitová příruba jsou zhotoveny z chrommanganové oceli (viz doplněk), která je do 800 oC nejiskřivá. Clony mají tloušťku 6 mm, jsou vyrobeny ze žáruvzdorné oceli a tvoří řadu podle velikosti otvorů.

1.6.1.2   Zkušební podmínky

Látka se obvykle zkouší ve stavu, v jakém byla obdržena, ačkoliv v některých případech, např. je-li lisovaná, litá nebo jiným způsobem zhutněná, může být nezbytné ji před provedením zkoušky rozdrtit.

U pevných látek se hmotnost látky, která má být použita v každé zkoušce, stanoví zkouškou ve dvou etapách. Zvážená trubka se naplní 9 cm látky a látka se po celém průřezu trubky stlačí silou 80 N. Z bezpečnostních důvodů nebo v případech, kdy může stlačováním dojít ke změně fyzikální formy vzorku, lze použít jiný způsob plnění, například je-li látka velmi citlivá na tření, není vhodné ji stlačovat. Je-li látka stlačitelná, přidá se a stlačuje další množství látky, dokud není trubka zaplněna do úrovně 55 mm od horního okraje. Stanoví se celkové množství látky použité pro naplnění do úrovně 55 mm od horního okraje a přidají se další dva podíly látky, přičemž se každý stlačí silou 80 N. Látka se poté podle potřeby buď přidá a stlačí, nebo se odebere tak, aby byla trubka naplněna do úrovně 15 mm od horního okraje. Provede se druhá zkouška, přičemž se začne s třetinou hmotnosti po stlačení zjištěné v první etapě. Přidají se další dva podíly, stlačí se silou 80 N a podle potřeby se látka přidá nebo odebere do úrovně 15 mm od horního okraje trubky. Množství pevné látky zjištěné ve druhé etapě se použije pro každý pokus; naplnění se provede se třemi stejnými množstvími a každé z nich se stlačí na objem 9 cm bez ohledu na potřebnou sílu (pro usnadnění lze k tomuto účelu použít rozpěrné kroužky).

Kapaliny a gely se naplní do trubky do výšky 60 mm, přičemž je třeba věnovat zvláštní pozornost gelům, aby se v nich netvořily dutiny. Na trubku se zdola navleče závitová příruba, vloží se vhodná clona a po nanesení maziva na bázi disulfidu molybděničitého se matice utáhne. Je důležité se přesvědčit, zda nějaká látka nezůstala zachycena mezi přírubou a clonou nebo v závitech.

K zahřívání se použije propan odebíraný z průmyslové tlakové lahve s regulátorem tlaku (60 až 70 mbar) přes průtokoměr a rovnoměrně rozdělený rozdělovacím potrubím do čtyř hořáků (ověří se vizuálně pozorováním plamenů hořáků). Hořáky se umístí kolem zkušební komory, jak je znázorněno na obrázku 1. Čtyři hořáky mají celkovou spotřebu přibližně asi 3,2 litru propanu za minutu. Lze použít jiné palivo a hořáky, avšak rychlost ohřevu musí být taková, jak je uvedeno na obrázku 3. Rychlost ohřevu se musí u všech zařízení pravidelně kontrolovat za použití trubek naplněných dibutylftalátem, jak je znázorněno na obrázku 3.

1.6.1.3   Provedení zkoušek

Každá zkouška se provádí do roztržení trubky nebo dokud doba ohřevu nedosáhne 5 minut. Výsledek zkoušky, při níž došlo k roztržení trubky na tři nebo více úlomků, z nichž některé mohou být vzájemně spojeny úzkými proužky kovu, jak je znázorněno na obrázku 2, se hodnotí jako výbuch. Výsledek zkoušky, při níž vzniklo méně úlomků nebo k roztržení nedošlo, se nehodnotí jako výbuch.

Nejprve se provede série tří zkoušek s clonou o průměru otvoru 6,0  mm, a pokud nedojde k výbuchu, provede se druhá série tří zkoušek s clonou o průměru otvoru 2,0  mm. Dojde-li k výbuchu u kterékoli zkušební série, nevyžadují se další zkoušky.

1.6.1.4   Hodnocení

Výsledek zkoušky se považuje za pozitivní, dojde-li k výbuchu při jedné z výše uvedených zkušebních sérií.

1.6.2   Mechanická citlivost (na náraz)

1.6.2.1   Zařízení (obrázek 4)

Základními částmi typických zařízení s padacím kladivem je blok z lité oceli s podstavcem, kovadlina, sloup, vodicí lišty, padací závaží, uvolňovací zařízení a držák vzorku. Ocelová kovadlina o průměru 100 mm a výšce 70 mm je přišroubována k horní straně bloku z lité oceli o délce 230 mm, šířce 250 mm a výšce 200 mm se základovou litinovou deskou o délce 450 mm, šířce 450 mm a výšce 60 mm. Sloup tvořený bezešvou taženou ocelovou trubkou je připevněn držákem přišroubovaným na zadní stranu bloku z lité oceli. Čtyři šrouby ukotvují zařízení k betonovému bloku o rozměrech 60 × 60 × 60 cm takovým způsobem, že jsou vodicí lišty dokonale svislé a padací závaží padá volně. Používá se závaží o hmotnosti 5 a 10 kg z pevné oceli. Úderová hlava každého závaží je z tvrzené oceli HRC 60 až 63 a má minimální průměr 25 mm.

Zkoušený vzorek se uzavře do zkušebního zařízení tvořeného dvěma plnými souosými válci umístěnými nad sebou a vodicím pouzdrem tvořeným dutým ocelovým válcem. Plné ocelové válce o průměru 10 (– 0,003 , – 0,005 ) mm a výšce 10 mm mají vyleštěné plochy, zakulacené hrany (s poloměrem zakřivení 0,5  mm) a tvrdost HRC 58 až 65. Dutý válec musí mít vnější průměr 16 mm, vyleštěný vyvrtaný otvor o průměru 10 (+ 0,005 , + 0,010 ) mm a výšku 13 mm. Sestavené zkušební zařízení se umístí na výměnnou ocelovou mezipodložku (o průměru 26 mm a výšce 26 mm), která je vystředěna kroužkem s otvory pro odvod dýmů.

1.6.2.2   Zkušební podmínky

Objem vzorku by měl být 40 mm3 nebo by měl být vhodný pro alternativní zařízení. Pevné látky se zkoušejí v suchém stavu a připravují se tímto způsobem:

Látky dodávané obvykle ve formě pasty se zkoušejí pokud možno v suchém stavu nebo po odstranění maximálního možného množství ředidla. Kapalné látky se zkoušejí při mezeře 1 mm mezi horním a dolním ocelovým válcem.

1.6.2.3   Provedení zkoušek

Provede se série šesti zkoušek spuštěním závaží o hmotnosti 10 kg z výšky 0,40  m (40 J). Dojde-li během těchto šesti zkoušek při 40 J k výbuchu, musí se provést další série šesti zkoušek spuštěním závaží o hmotnosti 5 kg z výšky 0,15  m (7,5  J). U jiných zařízení se vzorek porovnává se zvolenou referenční látkou za použití stanoveného postupu (např. technikou up-and-down atd).

1.6.2.4   Hodnocení

Výsledek zkoušky se považuje za pozitivní, jestliže dojde k výbuchu (vzplanutí nebo třesk jsou rovnocenné výbuchu) alespoň jednou při kterékoli zkoušce se specifikovaným zařízením nebo je-li vzorek citlivější než 1,3 -dinitrobenzen nebo RDX v alternativní zkoušce citlivosti na náraz.

1.6.3   Mechanická citlivost (na tření)

1.6.3.1   Zařízení (obrázek 5)

Třecí zařízení je tvořeno základovou deskou z lité oceli, na které je upevněno třecí zařízení. To je tvořeno nepohyblivým porcelánovým kolíkem a pohyblivou porcelánovou destičkou. Porcelánová destička je upevněna na saních vedených dvěma vodicími lištami. Saně jsou připojeny k elektromotoru ojnicí, excentrickou vačkou a vhodným ozubeným převodem tak, že porcelánová destička vykonává pod porcelánovým kolíkem pohyb tam a zpět na dráze o délce 10 mm. Porcelánový kolík lze zatížit silou buď 120 N, nebo 360 N.

Rovné porcelánové destičky jsou vyrobeny z bílého technického porcelánu (o drsnosti 9 až 32 um) a mají délku 25 mm, šířku 25 mm a výšku 5 mm. Válcový porcelánový kolík je rovněž vyroben z bílého technického porcelánu, má délku 15 mm, průměr 10 mm a zdrsněné kulové plochy s poloměrem zakřivení 10 mm.

1.6.3.2   Zkušební podmínky

Objem vzorku by měl být 10 mm3 nebo by měl být vhodný pro alternativní zařízení.

Pevné látky se zkoušejí v suchém stavu a připravují se tímto způsobem:

Látky dodávané obvykle ve formě pasty se zkoušejí pokud možno v suchém stavu. Nelze-li látku připravit v suchém stavu, zkouší se pasta (po odstranění maximálního možného množství ředidla) ve formě proužku o tloušťce 0,5  mm, šířce 2 mm a délce 10 mm připraveného v tvarovací formě.

1.6.3.3   Provedení zkoušek

Porcelánový kolík se přiloží na zkoušený vzorek a zatíží se. Při provádění zkoušky musí být rýhy v porcelánové destičce orientovány příčně ke směru pohybu. Je nutné dbát na to, aby kolík spočíval na vzorku, aby pod kolíkem leželo dostatečné množství zkoušeného materiálu a také aby se destička pohybovala pod kolíkem správně. U pastovitých látek se pro nanesení látky na destičku používá měrka o tloušťce 0,5  mm s otvorem 2 × 10 mm. Porcelánová destička se musí pohybovat pod porcelánovým kolíkem po dráze 10 mm tam a zpět za 0,44  s. Každá část povrchu destičky a kolíku se smí použít pouze jednou; dva konce každého kolíku slouží pro dva pokusy a každá ze dvou stran destičky slouží pro tři pokusy.

Série šesti zkoušek se provede se zatížením 360 N. Získá-li se během těchto šesti zkoušek pozitivní výsledek, musí se provést další série šesti zkoušek se zatížením 120 N. U jiných zařízení se vzorek porovnává se zvolenou referenční látkou za použití stanoveného postupu (např. technikou up-and-down atd).

1.6.3.4   Hodnocení

Výsledek zkoušky se považuje za pozitivní, jestliže dojde k výbuchu (praskání, třesk nebo vzplanutí jsou rovnocenné výbuchu) alespoň jednou při kterékoli zkoušce se specifikovaným zařízením pro stanovení citlivosti na tření nebo splňuje-li ekvivalentní kritéria alternativní zkoušky citlivosti na tření.

2.   DATA

Látka se v zásadě považuje ve smyslu této směrnice za nebezpečnou z hlediska výbuchu, jestliže jsou získány pozitivní výsledky ve zkoušce citlivosti na působení tepla, ve zkoušce citlivosti na náraz nebo na tření.

3.   ZPRÁVY

3.1   PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:

3.2   INTERPRETACE A VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ

V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny všechny výsledky, které jsou považovány za chybné, anomální nebo nereprezentativní. Má-li být kterýkoli z těchto výsledků vyloučen, mělo by být uvedeno vysvětlení a výsledky jakéhokoli alternativního nebo doplňkového zkoušení. Pokud nelze anomální výsledek vysvětlit, musí být přijat tak, jak byl dosažen, a musí být použit k odpovídající klasifikaci látky.

4.   LITERATURA

Doplněk

příklad materiálové specifikace pro zkoušku citlivosti na působení tepla (viz DIN 1623)

Obrázek 1

Zařízení pro zkoušku citlivosti na působení tepla

(všechny rozměry v mm)

Text obrazu

Obrázek 2

Zkouška citlivosti na působení tepla

(příklady roztržení trubky)

Text obrazu

Obrázek 3

Kalibrace rychlosti ohřevu pro zkoušku citlivosti na působení tepla

Text obrazu

Křivka závislosti teploty na čase získaná při zahřívání dibutyl-ftalátu (27 cm3) v uzavřené trubce (s clonou 1,5  mm) při průtoku propanu 3,2 litry za minutu. Teplota byla měřena chromel/alumelovým termočlánkem o průměru 1 mm, zapouzdřeným v korozivzdorné oceli a umístěným 43 mm pod okrajem trubky. Rychlost zahřívání mezi 135 oC a 285 oC by měla být 185 až 215 K/min.

Obrázek 4

Zařízení pro zkoušku citlivosti na mráz

(všechny rozměry v mm)

Text obrazu

Obrázek 4

Pokračování

Text obrazu

Obrázek 5

Zařízení pro zkoušku citlivosti na tření

Text obrazu

A.15   BOD SAMOZÁPALU (KAPALINY A PLYNY)

▼M9

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

▼B

A.16   RELATIVNÍ TEPLOTA SAMOZÁPALU PEVNÝCH LÁTEK

▼M9

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

▼B

A.17   OXIDAČNÍ VLASTNOSTI (PEVNÉ LÁTKY)

▼M9

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

▼B

A.18   POČETNĚ PRŮMĚRNÁ MOLEKULOVÁ HMOTNOST A DISTRIBUCE MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI POLYMERŮ

1.   METODA

Tato gelově permeační chromatografická metoda je replikou metody OECD TG 118 (1996). Základní principy a další technické informace jsou uvedeny v odkaze (1).

1.1   ÚVOD

Vlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že není možné popsat jedinou metodu a přesně stanovit podmínky separace a hodnocení, které by pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se při separaci polymerů. Zejména pro složité polymerní systémy není gelově permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použitelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami (viz příloha). V takových případech by měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodnění použité metody.

Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1). Podrobné informace o provádění experimentů a o hodnocení údajů lze nalézt v uvedené normě DIN. V případě, že jsou nezbytné úpravy experimentálních podmínek, musí být změny zdůvodněny. Mohou být použity jiné normy, jsou-li na ně uvedeny úplné odkazy. V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu o známé polydisperzitě a metoda může být upravena tak, aby byla vhodná pro určité polymery, např. ve vodě rozpustné polymery a polymery s dlouhými větvemi.

1.2   DEFINICE A JEDNOTKY

Početně průměrná molekulová hmotnost Mna hmotnostně průměrná molekulová hmotnost Mw se stanoví pomocí těchto rovnic:

kde:

Hi je výška signálu detektoru nad základní čarou pro retenční objem Vi,

Mi je molekulová hmotnost frakce polymeru s retenčním objemem Vi a

n je počet údajů.

Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou polydisperzity systému, je dána poměrem Mw/Mn.

1.3   REFERENČNÍ LÁTKY

Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. k tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými průměrnými molekulovými hmotnostmi Mn a Mw a se známou distribucí molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a standardů identické.

Stanovený vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických podmínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouštědel), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém kolon.

Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními hodnotami a označují se jako „molekulové hmotnosti ekvivalentní polystyrenu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se jiné standardy, např. poly(ethylenglykol), poly(ethylenoxid), poly(methyl-methakrylát), poly(akrylová kyselina), musí být použití zdůvodněno.

1.4   PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Distribuce molekulové hmotnosti vzorku i průměrné molekulové hmotnosti (Mn, Mw) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž se vzorek dělí podle hydrodynamických objemů jednotlivých složek (2).

Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou do pórů, zatímco velké molekuly nikoli. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají do některých pórů a jsou eluovány později. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu pronikají do všech pórů. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec.

V ideálním případě závisí separace pouze na velikosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se alespoň některým rušivým adsorpčním jevům. Nestejnoměrné plnění kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2).

Detekce se provádí například měřením indexu lomu nebo UV absorpce a výsledkem je jednoduchá distribuční křivka. Má-li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu polymery se známou molekulovou hmotností a v ideálním případě v podstatě podobnou strukturou, např. různými polystyrenovými standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodloužením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní zlomek různých molekulových hmotností a na vodorovné ose je vynesen logaritmus molekulové hmotnosti.

1.5   KRITÉRIA JAKOSTI

Opakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3  %. Je-li chromatogram hodnocen v závislosti na čase a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1), musí být požadovaná opakovatelnost zajištěna korekcí vnitřním standardem. Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech standardů. V případě polystyrenových standardů jsou typickými hodnotami:

(Mp je molekulová hmotnost standardu odpovídající maximu píku)

1.6   POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

1.6.1   Příprava standardních roztoků polystyrenu

Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným mícháním ve zvoleném eluentu. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.

Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30 cm × 7,8  mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 μl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalibrací kolony.

1.6.2   Příprava roztoku vzorku

Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným třepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,2 až 2 um.

Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v závěrečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostní koncentrace nerozpuštěných částic vyjádřené v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 hodin.

1.6.3   Přístroje a pomůcky

Musí být zajištěno, aby byl systém GPC inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).

1.6.4   Vstřikování a systém dávkování rozpouštědla

Určený objem roztoku vzorku se vnese na kolonu buď dávkovačem, nebo ručně v ostře ohraničené zóně. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním vnesení) může způsobit změny v pozorované distribuci molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být opatřen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.

1.6.5   Kolona

Podle typu vzorku se k charakterizaci polymeru použije jednoduchá kolona nebo několik za sebou řazených kolon. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, vylučovací meze). Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo, teplota a průtok (1, 2, 3).

1.6.6   Teoretická patra

Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. Při použití THF jako eluentu to zahrnuje vnesení roztoku ethylbenzenu nebo jiné vhodné nepolární rozpuštěné látky na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán touto rovnicí:

kde,

N

=

je počet pater v maximu,

Ve

=

je eluční objem píku,

W

=

šířka píku na základní čáře,

W1/2

=

šířka píku v polovině výšky.

1.6.7   Separační účinnost

Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roh také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z tohoto vztahu

kde,

Ve, Mx

=

je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotností Mx,

Ve,(10.Mx)

=

je eluční objem pro polystyren s 10krát větší molekulovou hmotností.

Rozlišení systému je obecně definováno tímto vztahem:

kde,

Ve1, Ve2

=

Jsou eluční objemy dvou standardů polystyrenu v maximu píku,

W1, W2

=

jsou šířky píků na základní čáře,

M1, M2

=

jsou molekulové hmotnosti odpovídající maximu píků (měly by se lišit faktorem 10).

Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4).

1.6.8   Rozpouštědla

Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 99,5  % čistotu). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho dopravou čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.

1.6.9   Kontrola teploty

Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a veden) by měla být konstantní a měla by být v souladu s volbou rozpouštědla.

1.6.10   Detektor

Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detektoru co nejmenší. Neměl by být větší než 10 μl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. k detekci se obvykle používá diferenciálního refraktometru. Vyžadují-li to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/vis, IR detektory a viskozitní detektory atd.

2.   ÚDAJE A PŘEDKLÁDANÍ ZPRAV

2.1   ÚDAJE

Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování údajů, měla by být použita norma DIN (1).

Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně.

Pro každé měření musí být uvedeny hodnoty Mn, Mw, Mw/Mn a Mp. Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu.

Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního standardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log Mp (přičemž Mp je výška maxima píku kalibračního standardu). Pro jeden řád hodnot molekulové hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje alespoň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se určí hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Početně a hmotnostně průměrné molekulové hmotnosti se obecně určí elektronickým zpracováním údajů založeným na rovnicích v bodě 1.2. Při manuálním zpracování údajů do číselné formy lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3).

Distribuční křivka musí být znázorněna ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost v procentech proti log M). V grafickém znázornění by měl mít jeden řád molekulové hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. U integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ose přibližně 10 cm.

2.2   PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:

2.2.1   Zkoušená látka:

2.2.2   Přístrojové vybavení:

2.2.3   Kalibrace systému:

2.2.4   Hodnocení:

3.   LITERATURA

Doplněk

Příklady jiných metod stanovení početně průměrné molekulové hmotnosti (Mn) polymerů

Gelově permeační chromatografie (GPC) je preferovanou metodou stanovení Mn, zejména tehdy, je-li k dispozici sada standardů, jejichž struktura je srovnatelná se strukturou polymeru. Vyskytnou-li se praktické obtíže při použití GPC nebo očekává-li se, že látka nevyhoví regulativním kritériím na Mn, (což je třeba potvrdit), jsou k dispozici alternativní metody, jako jsou:

1.   Využití koligativních vlastností

spočívá v měření zvýšení bodu varu (ebulioskopie) nebo snížení bodu tuhnutí (kryoskopie) rozpouštědla po přidání polymeru. Metoda je založena na skutečnosti, že vliv rozpuštěného polymeru na bod varu nebo bod tuhnutí závisí na molekulové hmotnosti polymeru (1, 2).

Použitelnost: Mn < 20 000 .

spočívá v měření tlaku par zvolené referenční kapaliny před přidáním a po přidání známého množství polymeru (1, 2).

Použitelnost: Mn < 20 000 (teoretická; v praxi však má omezený význam).

spočívá na principu osmózy, tj. přirozené snahy molekul rozpouštědla proniknout polopropustnou membránou ze zředěného do koncentrovaného roztoku a dosáhnout rovnováhy. Při zkoušce je koncentrace zředěného roztoku nulová, zatímco koncentrovaný roztok obsahuje polymer. Pronikáním rozpouštědla membránou dochází ke tlakovému rozdílu, který závisí na koncentraci a molekulové hmotnosti polymeru (1, 3, 4).

Použitelnost: Mn od 20 000 do 200 000 .

spočívá ve srovnání rychlosti vypařování aerosolu čistého rozpouštědla s alespoň třemi aerosoly obsahujícími polymer v různých koncentracích (1, 5, 6).

Použitelnost: Mn < 20 000 .

2.   Analýza koncových skupin

Použití této metody vyžaduje znalost jak celkové struktury polymeru, tak povahy koncových skupin řetězce (které musí být odlišitelné od hlavního řetězce například metodou NMR nebo titrací nebo derivatizací). Stanovení počtu koncových skupin polymeru může vést k hodnotě molekulové hmotnosti (7, 8, 9).

Použitelnost: Mn až do 50 000 (s klesající spolehlivostí).

3.   Literatura

A.19   OBSAH NÍZKOMOLEKULÁRNÍCH LÁTEK V POLYMERECH

1.   METODA

Tato gelově permeační chromatografická metoda je replikou metody OECD TG 119 (1996). Základní principy a další technické informace jsou uvedeny v odkazech.

1.1   ÚVOD

Vlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že není možné popsat jedinou metodu a přesně stanovit podmínky separace a hodnocení, které by pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se při separaci polymerů. Zejména pro složité polymerní systémy není gelově permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použitelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami (viz příloha). V takových případech by měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodnění použité metody.

Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1). Podrobné informace o provádění experimentů a o hodnocení údajů lze nalézt v uvedené normě DIN. V případě, že jsou nezbytné úpravy experimentálních podmínek, musí být změny zdůvodněny. Mohou být použity jiné normy, jsou-li na ně uvedeny úplné odkazy. V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu o známé polydisperzitě a metoda může být upravena tak, aby byla vhodná pro určité polymery, např. ve vodě rozpustné polymery a polymery s dlouhými větvemi.

1.2   DEFINICE A JEDNOTKY

Nízká molekulová hmotnost je konvenčně definována jako molekulová hmotnost pod 1 000 .

Početně průměrná molekulová hmotnost Mn a hmotnostně průměrná molekulová hmotnost Mw se stanoví pomocí těchto rovnic:

kde,

Hi

=

je výška signálu detektoru nad základní čarou pro retenční objem Vi,

Mi

=

je molekulová hmotnost frakce polymeru pro retenční objem Vi a n je počet údajů.

Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou polydisperzity systému, je dána poměrem Mw/Mn.

1.3   REFERENČNÍ LÁTKY

Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. K tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými průměrnými molekulovými hmotnostmi Mn a Mw a se známou distribucí molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a standardů identické.

Stanovený vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických podmínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouštědel), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém kolon.

Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními hodnotami a označují se jako „molekulové hmotnosti ekvivalentní polystyrenu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se jiné standardy, např. poly(ethylenglykol), poly(ethylenoxid), poly(methyl-methakrylát), poly (akrylová kyselina), musí být použití zdůvodněno.

1.4   PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Distribuce molekulové hmotnosti vzorku i průměrné molekulové hmotnosti (Mn, Mw) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž se vzorek dělí podle hydrodynamických objemů jednotlivých složek (2).

Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou do pórů, zatímco velké molekuly nikoliv. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají do některých pórů a jsou eluovány později. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu pronikají do všech pórů. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec.

V ideálním případě závisí separace pouze na velikosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se alespoň některým rušivým adsorpčním jevům. Nestejnoměrné plnění kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2).

Detekce se provádí například měřením indexu lomu nebo UV absorpce a výsledkem je jednoduchá distribuční křivka. Má-li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu polymery se známou molekulovou hmotností a v ideálním případě v podstatě podobnou strukturou, např. různé polystyrenové standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodloužením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní zlomek různých molekulových hmotností a na vodorovné ose je vynesen logaritmus molekulové hmotnosti.

Obsah molekul o nízké hmotnosti se odečte z této kalibrační křivky. Výpočet může být správný pouze tehdy, je-li odezva nízkomolekulárních látek hmotnostně ekvivalentní polymeru jako celku.

1.5   KRITERIA JAKOSTI

Opakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3  %. Je-li chromatogram hodnocen v závislosti na čase a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1), musí být požadovaná opakovatelnost zajištěna korekcí vnitřním standardem. Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech standardů. V případě polystyrenových standardů jsou typickými hodnotami:

(Mp je molekulová hmotnost standardu odpovídající maximu píku)

1.6   POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

1.6.1   Příprava standardních roztoků polystyrenu

Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným mícháním ve zvoleném eluentu. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.

Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30 × 7,8  mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 μl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalibrací kolony.

1.6.2   Příprava roztoku vzorku

Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným třepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,2 až 2 um.

Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v závěrečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostní koncentrace nerozpuštěných částic vyjádřené v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 hodin.

1.6.3   Korekce na obsah nečistot a přísad

Korekce obsahu frakce s M < 1 000 v důsledku příspěvku od přítomných nepolymerních specifických složek (např. nečistot a/nebo přísad) je obvykle nezbytná, není-li naměřený obsah < 1 %. Dosáhne se toho přímou analýzou roztoku polymeru nebo eluátu GPC.

V případech, kdy je eluát po průchodu kolonou pro další analýzu příliš zředěný, musí být zkoncentrován. Může být nezbytné odpařit eluát do sucha a opět jej rozpustit. Zkoncentrování eluátu musí být provedeno za podmínek, při nichž je zajištěno, že nedojde ke změnám v eluátu. Zpracování eluátu po GPC závisí na analytické metodě použité ke kvantitativnímu stanovení.

1.6.4   Přístroje a pomůcky

Aparatura pro GPC sestává z těchto částí:

Musí být zajištěno, aby byl systém GPC inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).

1.6.5   Vstřikování a systém dávkování rozpouštědla

Určený objem roztoku vzorku se vnese na kolonu buď dávkovačem nebo ručně v ostře ohraničené zóně. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním vnesení) může způsobit změny v pozorované distribuci molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být opatřen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.

1.6.6   Kolona

Podle typu vzorku se k charakterizaci polymeru použije jednoduchá kolona nebo několik za sebou řazených kolon. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, vylučovací meze). Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo, teplota a průtok (1, 2, 3).

1.6.7   Teoretická patra

Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. Při použití THF jako eluentu to zahrnuje vnesení roztoku ethylbenzenu nebo jiné vhodné nepolární rozpuštěné látky na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán touto rovnicí:

kde,

N

=

je počet pater v maximu,

Ve

=

je eluční objem píku,

W

=

šířka píku na základní čáře,

W1/2

=

šířka píku v polovině výšky.

1.6.8   Separační účinnost

Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roh také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z tohoto vztahu:

kde,

Ve, Mx

=

je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotností Mx

Ve,(10.Mx)

=

je eluční objem pro polystyren s 10krát větší molekulovou hmotností. Rozlišení systému je obecně definováno tímto vztahem:

kde,

kde,

Ve1, Ve2

=

jsou eluční objemy dvou standardů polystyrenu v maximu píku,

W1, W2

=

jsou šířky píků na základní čáře,

M1, M2

=

jsou molekulové hmotnosti odpovídající maximu píků (měly by se lišit faktorem 10).

Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4).

1.6.9   Rozpouštědla

Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 99,5  % čistotu). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho dopravou čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.

1.6.10   Kontrola teploty

Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a vedení) by měla být konstantní a měla by být v souladu s volbou rozpouštědla.

1.6.11   Detektor

Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detektoru co nejmenší. Neměl by být větší než 10 μl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. K detekci se obvykle používá diferenciálního refraktometru. Vyžadují-li to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/vis, IR detektory a viskozitní detektory atd.

2.   ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

2.1   ÚDAJE

Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování údajů, měla by být použita norma DIN (1).

Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně. Ve všech případech je důležité stanovit také údaje ze slepých pokusů zpracovaných za stejných podmínek jako vzorek.

Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu.

Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního standardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log Mp (přičemž Mp je výška maxima píku kalibračního standardu). Pro jeden řád hodnot molekulové hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje alespoň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se určí hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Při stanovení se část křivky odpovídající molekulovým hmotnostem nižším než 1 000 podle potřeby koriguje na nečistoty a přísady. Eluční křivky se obvykle hodnotí pomocí elektronického zpracování údajů. Při manuálním zpracování údajů do číselné formy lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3).

Jestliže je v koloně zachycen nerozpustný polymer, je jeho molekulová hmotnost pravděpodobně vyšší než molekulová hmotnost rozpuštěné frakce, a pokud by tato skutečnost nebyla zohledněna, došlo by k nadhodnocení obsahu molekul o nízké hmotnosti. Návod na korigování obsahu molekul o nízké hmotnosti na obsah nerozpuštěného polymeru je uveden v příloze.

Distribuční křivka musí být znázorněna ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost v procentech proti log M). V grafickém znázornění by měl mít jeden řád molekulové hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. U integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ose přibližně 10 cm.

2.2   PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:

2.2.1   Zkoušená látka:

2.2.2   Přístrojové vybavení:

2.2.3   Kalibrace systému:

2.2.4   Informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností v polymeru:

2.2.5   Hodnocení:

3.   LITERATURA

Doplněk

Korekce obsahu nízkomolekulárních látek na přítomnost nerozpuštěného polymeru

Je-li ve vzorku přítomen nerozpuštěný polymer, dochází ke ztrátě hmotnosti během analýzy GPC. Nerozpuštěné polymery jsou nevratně zachyceny v koloně nebo na filtru při filtraci vzorku, zatímco rozpustný podíl vzorku kolonou projde. V případě, že lze odhadnout nebo změřit přírůstek indexu lomu (dn/dc) polymeru, lze odhadnout ztrátu hmotnosti vzorku na koloně. V takovém případě se korekce provede pomocí externí kalibrace standardními materiály o známé koncentraci a známé hodnotě dn/dc, čímž se kalibruje refraktometr. V příkladě uvedeném dále je jako standard použit poly(methyl-methakrylát) (PMMA).

Při externí kalibraci pro analýzu polyakrylátů se analyzuje metodou GPC standard PMMA známé koncentrace v tetrahydrofuranu a výsledné údaje se použijí pro nalezení konstanty refraktometru podle rovnice:

K = R/(C × V × dn/dc)

kde:

K

=

je konstanta refraktometru (μV/s/ml),

R

=

je odečet pro standard PMMA (μV/s),

C

=

je koncentrace standardu PMMA (mg/ml),

V

=

je vstříknutý objem (ml) a

dn/dc

=

je přírůstek indexu lomu pro PMMA v tetrahydrofuranu (ml/mg).

Pro standard PMMA jsou typické tyto údaje:

R

=

2 937 891

C

=

1,07  mg/ml

V

=

0,1  ml

dn/dc

=

9 × 10–5 ml/mg

Výsledná hodnota K = 3,05  × 1011 se poté použije pro výpočet teoretické odezvy detektoru v případě, že detektorem prošlo 100 % vstříknutého polymeru.

A.20   CHOVÁNÍ POLYMERŮ PŘI ROZPOUŠTĚNÍ NEBO EXTRAKCI VE VODĚ

▼M9

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

▼B

A.21   OXIDAČNÍ VLASTNOSTI (KAPALINY)

▼M9

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

▼M1

A.22   DÉLKOVĚ VÁŽENÝ STŘEDNÍ GEOMETRICKÝ PRŮMĚR VLÁKEN

1.   METODA

1.1   ÚVOD

Tato metoda popisuje postup měření délkově váženého středního geometrického průměru (DVGSP) umělých minerálních vláken (UMV). Jelikož DVGSP statistického souboru bude s pravděpodobností 95 % mezi hladinami významnosti 95 % (DVGSP ± dvě střední směrodatné chyby) vzorku, ohlášená hodnota (testová hodnota) bude nižší hladina významnosti 95 % vzorku (tj. DVGSP – 2 dvě střední směrodatné chyby). Metoda je založena na aktualizaci (červen 1994) návrhu průmyslového postupu HSE (Výkonný výbor pro zdraví a bezpečnost) dohodnutého na schůzce HSE a ECFIA (Evropská asociace odvětví keramických vláken) v Chesteru dne 26. září 1993 a vyvinutého druhou mezilaboratorní zkouškou (1, 2). Tato měřicí metoda může být použita pro charakterizaci průměru vláken sypkých látek či výrobků obsahujících UMV, včetně vysokotavných keramických vláken (VKV), umělých skelných vláken (USV), krystalických a polykrystalických vláken.

Délkové vážení je způsobem kompenzace vlivu rozlomení dlouhých vláken při odběru vzorků či při manipulaci s vlákny na rozložení jejich průměru. Pro měření rozložení velikosti průměrů UMV jsou použita geometrická statistická data (geometrický průměr), jelikož tyto průměry obvykle mají rozložení velikosti blížící se normálnímu.

Měření délky a průměru je jak únavné, tak dlouhé, ovšem pokud se měří pouze ta vlákna, která se dotýkají nekonečně tenké čáry na zorném poli rastrovacího elektronového mikroskopu, pak je pravděpodobnost výběru daného vlákna přímo úměrná jeho délce. Jelikož tím se zohledňuje délka při délkově vážených výpočtech, jediné vyžadované měření je měření průměru a DVGSP-2SE může být vypočten uvedeným způsobem.

1.2   DEFINICE

Částice: objekt s poměrem délky k šířce menším než 3:1.

Vlákno: objekt s poměrem délky k šířce (charakteristický poměr) nejméně 3:1.

1.3   PLATNOST A OMEZENÍ

Metoda je určena pro pohled na rozdělení průměrů o středním průměru mezi 0,5 μm a 6 μm. Větší průměry mohou být měřeny pomocí menších zvětšení rastrového elektronového mikroskopu, ale tato metoda bude stále více limitována vzhledem k rozdělení jemných vláken a je-li střední průměr menší než 0,5 μm, doporučujeme měření transmisním elektronovým mikroskopem (TEM).

1.4   Princip měřicí metody

Z vláknové pokrývky či z volných sypkých vláken se odebere několik reprezentativních jádrových vzorků. Sypká vlákna jsou délkově omezena pomocí procesu drcení a reprezentativní podíl vzorku se rozpustí ve vodě. Poměrné podíly se vyloučí a přefiltrují přes polykarbonátový filtr o rozměrech pórů 0,2 μm a připraví se na pozorování pomocí technik rastrovacího elektronového mikroskopu (SEM). Průměry vláken se měří při zvětšení obrazovky × 10 000 nebo vyšším ( 1 ) pomocí čárové zadržovací metody, aby se získal nezaujatý odhad středního průměru. Vypočte se nižší hladina významnosti 95 % (na základě jednostranného testu), a tím se získá odhad nejnižších hodnot geometrického středního průměru vláken materiálu.

1.5   Popis měřicí metody

1.5.1   Bezpečnostní opatření

Je nutno minimalizovat vystavení osob zvířeným vláknům a při manipulaci se suchými vlákny je nutno používat digestoř či suchou skříň. Je nutno periodicky provádět monitoring osobní expozice pro určení efektivity kontrolních metod. Při manipulaci s UMV je nutno nosit jednorázové rukavice pro omezení podráždění kůže a pro zabránění křížové kontaminaci.

1.5.2   Přístroje/zařízení

1.5.3   Postup měření

1.5.3.1   Odběr vzorků

U pokrývek a roun se používá odběrač vzorků velikosti 25 mm či korkovrt pro odebírání vzorků z řezu. Vzorky by měly být rovnoměrně rozprostřeny po šířce a z malé délky pokrývky, nebo by měly být odebrány z náhodných ploch, je-li k dispozici pokrývka o velké délce. Stejné zařízení může být použito pro odběr náhodných vzorků z volných vláken. Je-li to možné, mělo by být odebráno šest vzorků tak, aby byly zohledněny prostorové odchylky v sypkém materiálu.

Těchto šest jádrových vzorků je nutno rozdrtit v lisovadle o průměru 50 mm tlakem 10 MPa. Materiál se rozmíchá stěrkou a znovu se stlačí tlakem 10 MPa. Poté se materiál vyjme z lisovadla a umístí v utěsněné skleněné láhvi.

1.5.3.2   Příprava vzorku

Je-li to nutné, organické pojivo může být odstraněno umístěním vláken do pece o teplotě 450 °C po dobu jedné hodiny.

Vytvarujte vzorek do kužele a rozčtvrťte jej (to by mělo být provedeno uvnitř prachové skříně).

Přidejte stěrkou malé množství vzorku (< 0,5 g) do 100 ml čerstvé destilované vody, která byla přefiltrována přes membránový filtr 0,2 μm (je možno použít jiný zdroj velmi čisté vody, ukáže-li se být uspokojivý). Řádně rozmíchejte vzorek pomocí ultrazvukové sondy provozované s výkonem 100 W a vyladěné tak, aby se objevila kavitace (není-li sonda k dispozici, postupujte takto: opakovaně vzorek protřepte a otočte jej na dobu 30 sekund; po dobu pěti minut vystavte vzorek ultrazvuku v ultrazvukové lázni; poté opět několikrát protřepte a otočte vzorek po dobu dalších 30 sekund).

Ihned po promíchání vláken odeberte několik poměrných dílů (např. tři poměrné části o 3, 6 a 10 ml) pomocí široké pipety (o objemu 2–5 ml).

Vakuově přefiltrujte každý poměrný díl přes polykarbonátový filtr 0,2 μm s pomocí podpůrného filtru MEC o velikosti pórů 5 μm pomocí skleněného filtračního tunelu 25 mm s válcovou nádrží. Přibližně 5 ml filtrované destilované vody by mělo být umístěno do tunelu a poměrný díl by měl být pomalu pipetován do vody, okraj pipety se drží pod prohnutou čočkou. Po pipetování musí být pipeta a nádrž řádně propláchnuta, jelikož tenká vlákna mají snahu ulpívat dále na povrchu.

Opatrně odstraňte filtr a oddělte jej od podpůrného filtru před jeho umístěním do obalu za účelem jeho vysušení.

Uřízněte čtvrtinu či polovinu filtrované části filtrovaného depozitu pomocí skalpelu typu 24 trhnutím. Opatrně připojte odříznutou část k bloku SEM pomocí lepící uhlíkové pásky či uhlíkového lepidla. Je nutno použít alespoň na třech místech stříbrnou tyčinku pro zlepšení elektrického kontaktu na okrajích filtru a bloku. Je-li lepidlo/stříbrná tyčinka suchá, katodově rozprašte cca 50 nm zlata či zlata/palladia na povrch depozitu.

1.5.3.3   Kalibrace a provoz SEM

1.5.3.3.1   Kalibrace

Kalibrace SEM by měla být zkontrolována minimálně jednou za týden (ideálně jednou denně) pomocí certifikované kalibrační mřížky. Kalibrace musí být kontrolována vůči certifikovanému standardu a není-li naměřená hodnota (SEM) v rozsahu ±2 % hodnoty certifikované, potom musí být kalibrace SEM seřízena a znovu zkontrolována.

SEM by měl být schopen rozlišit alespoň minimální viditelný průměr 0,2 μm pomocí reálné vzorkovací matice při zvětšení × 2 000 .

1.5.3.3.2   Provoz

SEM by měl být provozován při zvětšení 10 000  ( 2 ) za podmínek, které dávají dobré rozlišení při přijatelném snímku při pomalých snímacích rychlostech např. 5 sekund na rámec. I když se provozní požadavky různých SEM mohou lišit, obecně by mělo být použito urychlovací napětí 5–10 keV s nastavením malé velikosti bodu a krátkou pracovní vzdáleností; tím se získá nejlepší viditelnost a rozlišení s materiály o relativně nízkých atomových hmotnostech. Při provádění lineárního příčného pohybu musí být použit sklon 0° pro minimalizaci přeostření, nebo má-li SEM eucentrickou fázi, musí být použita eucentrická pracovní vzdálenost. Menší zvětšení může být použito, neobsahuje-li materiál vlákna o malých průměrech a průměry vláken jsou velké (> 5 μm)

1.5.3.4   Třídění dle rozměrů

1.5.3.4.1   Pozorování při malém zvětšení pro vyhodnocení vzorku

Zpočátku by měl být vzorek pozorován při malém zvětšení pro ujištění se o rozdrcení velkých vláken a pro vyhodnocení hustoty vláken. V případě velkého rozdrcení je doporučeno připravit nový vzorek.

Kvůli statistické přesnosti je nezbytné změřit minimální počet vláken a může se zdát být výhodná vysoká hustota vláken, jelikož pozorováním prázdných polí ztrácíme čas a nijak k analýze nepřispíváme. Ovšem při přetížení filtru je obtížné změřit všechna měřitelná vlákna a jelikož malá vlákna mohou být zakryta vlákny většími, mohou být vynechána.

Je-li hustota vláken větší než 150 vláken na milimetr lineárního příčného posuvu, může dojít k nežádoucímu vlivu nadhodnocení DVGSP. Na druhé straně malá koncentrace vláken zvyšuje dobu analýzy a často je nákladově efektivní připravit vzorek v hustotou vlákna blíže hodnotě optimální, než zůstat u počítání vláken o menších koncentracích. optimální hustota vláken by měla dávat průměrně jedno či dvě počítatelná vlákna na pole z záběru o zvětšení 5 000 . Nicméně optimální hustota bude záviset na velikosti (průměru) vláken, takže je nezbytné, aby obsluha používala odborný úsudek za účelem rozhodnutí, zda je hustota vláken blízko hodnotě optimální či nikoliv.

1.5.3.4.2   Délkové vážení průměrů vláken

Pouze ta vlákna, která se dotýkají (nebo kříží) (nekonečně) tenkou čáru nakreslenou na obrazovce SEM, se započítávají. Z tohoto důvodu je přes střed obrazovky nakreslena horizontální (či vertikální) čára.

Alternativně může být ve středu obrazovky umístěn jediný bod a zahájí se spojité snímání v jednom směru přes filtr. Každé vlákno o charakteristickém poměru větším než 3:1 dotýkající se při procházející tímto bodem má změřený a zaznamenaný průměr.

1.5.3.4.3   Třídění vláken

Doporučuje se měření minimálně 300 vláken. Každé vlákno je měřeno pouze jednou v bodě průsečíku s čárou či bodem nakresleným na snímku (nebo blízko průsečíku, jsou-li okraje vlákna zakrytá). Jestliže se objeví vlákna s nerovnoměrným průřezem, je nutno použít měření reprezentující střední průměr vlákna. Je nutno dbát na definování okraje a měřit nejkratší vzdálenost mezi okraji vlákna. Třídění může být prováděno on-line, nebo off-line na uložených snímcích či fotografiích. Doporučeny jsou poloautomatické snímkovací měřicí systémy, které stahují data přímo do tabulky, jelikož šetří čas, eliminují chyby v přepisech a mohou být zautomatizovány výpočty.

Konce dlouhých vláken by měla být zkontrolovány při malém zvětšení, aby bylo zajištěno, že se nepřesunou zpět do měřicího zorného pole a že budou měřeny pouze jednou.

2.   DATA

2.1   NAKLÁDÁNÍ S VÝSLEDKY

Průměry vláken obvykle nemají normální rozdělení. Ovšem provedením logaritmické transformace je možno získat rozdělení, které se blíží normálnímu.

Vypočtěte aritmetický průměr (střední (mean) lnD) a standardní odchylku (SDlnD) logaritmem o základu e hodnoty (lnD) průměrů vláken (D).

Standardní odchylka je dělena druhou odmocninou počtu měření (n), čímž získáme střední směrodatnou chybu (SElnD).

Odečtěte od průměrné hodnoty dvojnásobek střední směrodatné chyby a vypočtěte exponenciál této hodnoty (průměr mínus dvě střední směrodatné chyby), což dává střední geometrickou hodnotu mínus dvě geometrické směrodatné chyby.

3.   ZPRÁVY

ZPRÁVA O MĚŘENÍ

Zpráva o měření by měla obsahovat minimálně tyto informace:

4.   LITERATURA

▼M4

A.23   ROZDĚLOVACÍ KOEFICIENT (OKTAN-1-OL/VODA): METODA POMALÉHO MÍCHÁNÍ

ÚVOD

VÝCHOZÍ ÚVAHY

Význam a použití

Oblast použití

DEFINICE A JEDNOTKY

Protože se jedná o podíl dvou koncentrací, je bezrozměrný. Nejčastěji se udává jako dekadický logaritmus (log Pow). Hodnota Pow závisí na teplotě a vykazované údaje by měly zahrnovat i teplotu měření.

PODSTATA METODY

POUŽITELNOST ZKOUŠKY

INFORMACE O ZKOUŠENÉ CHEMICKÉ LÁTCE

POPIS METODY

Vybavení a aparatura

Příprava roztoků ke zkoušce

Extrakce a analýza vzorků

Provedení zkoušky

Optimální poměry objemu oktan-1-olu/vody

Zkušební podmínky

Stanovení doby ustavení rovnováhy

Zahájení experimentu

Odběr a zpracování vzorků

ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ

Zpracování výsledků

Prokázání dosažení rovnovážného stavu

Výpočet log Pow

Průměrná hodnota log Pow

Výpočet se provádí takto:

kde:

log Pow,i

=

hodnota log Pow jednotlivé experimentální jednotky i;

log Pow,Av

=

hodnota váženého průměru jednotlivých stanovení log Pow;

wi

=

statistická váha přidělená hodnotě log Pow experimentální jednotky i.

Jako wi se použije reciproká hodnota rozptylu log Pow,i

Písmeno „n“ označuje počet experimentálních jednotek.

Protokol o zkoušce

LITERATURA:

Dodatek 1

Tabulka pro výpočet minimálních objemů vody nutných k detekci zkoušených látek o různých hodnotách log Pow ve vodné fázi

Předpoklady:

Odhad Sw

Odhad So

Výpočet objemů

Legenda k výpočtům:

Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibrační nádoba o objemu 1 litr.

Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibrační nádoba o objemu 2 litry.

Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibrační nádoba o objemu 5 litrů.

Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibrační nádoba o objemu 10 litrů.

Přesahuje 10 % objemu, a to i u ekvilibrační nádoby o objemu 10 litrů.

Dodatek 2

Příklad nádoby se skleněným pláštěm pro experiment používající metodu pomalého míchání k stanovení Pow

▼M6

A.24   ROZDĚLOVACÍ KOEFICIENT (N-OKTANOL/VODA), METODA VYSOKOÚČINNÉ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE (HPLC)

ÚVOD

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) 117 (2004).

VÝCHOZÍ ÚVAHY

PODSTATA METODY

kde tR je retenční čas zkoušené látky a t0 je mrtvý čas, tj. průměrná doba, kterou potřebuje molekula rozpouštědla, aby prošla kolonou. Kvantitativní analytické metody nejsou zapotřebí, nezbytné je pouze stanovení retenčních časů.

kde

a, b

=

lineární regresní koeficienty.

Tato rovnice se získá lineární regresí logaritmu rozdělovacích koeficientů oktanol/voda referenčních látek proti logaritmu kapacitních faktorů referenčních látek.

Vážený průměr log Pow je platný pouze pro látky nebo směsi (např. tálové oleje) skládající se z homologů (např. série alkanů). Při měření směsí lze užitečné výsledy získat za předpokladu, že použitý analytický detektor má stejnou citlivost vůči všem látkám ve směsi a lze je dostatečně rozlišit.

INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE

KRITÉRIA KVALITY

REFERENČNÍ LÁTKY

POPIS METODY

Předběžný odhad rozdělovacího koeficientu

Přístroje a pomůcky

Mobilní fáze

Rozpouštěné látky

Zkušební podmínky

Stanovení mrtvého času t0

Regresní rovnice

STANOVENÍ POW ZKOUŠENÉ LÁTKY

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Závěrečná zpráva

LITERATURA

Dodatek

Metody výpočtu Pow

ÚVOD

Podstata výpočtových metod

Spolehlivost vypočítaných hodnot

π-metoda Fujity-Hansche

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)

kde PhX je aromatický derivát a PhH výchozí látka.

π-metoda je primárně důležitá u aromatických látek. π-hodnoty pro velký počet substituentů lze nalézt v literatuře (4, 5).

Rekkerova metoda

kde ai je číslo vyjadřující, kolikrát se daný fragment vyskytuje v molekule, a fi je přírůstek log Pow fragmentu. Interakční členy je možné vyjádřit jako souhrnný násobek jediné konstanty Cm (tzv. „magické konstanty“). Fragmentové konstanty fi a Cm byly stanoveny ze seznamu 1 054 experimentálních hodnot Pow pro 825 látek pomocí vícenásobné regresní analýzy (6, 8). Stanovení interakčních členů se provede podle stanovených pravidel (6, 8, 9).

Hansch-Leova metoda

kde fi je fragmentová konstanta, Fj korekční člen (faktor), ai a bj odpovídající četnosti výskytu. Seznamy atomových a skupinových fragmentových hodnot a korekčních členů Fj byly získány metodou pokusu a omylu z experimentálních hodnot Pow. Korekční členy byly rozděleny do několika různých tříd (1, 4). Byla vyvinuta sada programů, které berou v úvahu všechna pravidla a korekční členy (3).

KOMBINOVANÁ METODA

Poznámky

LITERATURA O VÝPOČTOVÝCH METODÁCH

▼M7

A.25    DISOCIAČNÍ KONSTANTY VE VODĚ (TITRAČNÍ METODA – SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA – KONDUKTOMETRICKÁ METODA)

ÚVOD

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 112 (1981).

Předpoklady

Pomocné informace

Použití metody

Podklady pro metodu

Tato zkušební metoda je založena na metodách uvedených v odkazech v oddíle „Literatura“ a na předběžném návrhu dokumentu Návod pro oznamování před výrobou, EPA, 18. srpna 1978.

METODA – ÚVOD, ÚČEL, ROZSAH, RELEVANTNOST, POUŽITÍ A OMEZENÍ ZKOUŠKY

Disociace látky ve vodě má význam pro posuzování jejího dopadu na životní prostředí. Závisí na ní forma látky, což určuje její chování a přepravu. Může ovlivňovat absorpci chemické látky do půdy a sedimentů a adsorpci do biologických buněk.

Definice a jednotky

Disociace je reverzibilní rozdělení molekuly na dvě nebo více chemických látek, které mohou mít charakter iontů. Tento proces obecně vyjadřuje rovnice

RX ⇌ R ++ X –

a koncentrační rovnovážná konstanta určující reakci je

Například v konkrétním případě, kde R je vodík (látkou je kyselina), je tato konstanta

nebo

Referenční látky

Následující referenční látky není nutné používat vždy při zkoušení nové chemické látky. Jsou uvedeny především proto, aby bylo možné čas od času provést kalibraci metody a aby bylo možné porovnat výsledky v případě, že se použije jiná metoda.

Bylo by užitečné mít látku s několika hodnotami pK, jak je uvedeno níže v oddíle „Princip zkušební metody“. Takovou látkou by mohla být:

Princip zkušební metody

Popisovaný chemický proces je celkově jen mírně závislý na teplotě v teplotním rozpětí, které je běžné v životním prostředí. Ke stanovení disociační konstanty je nutné změřit koncentrace disociované a nedisociované formy chemické látky. Příslušnou konstantu lze stanovit na základě znalosti stechiometrie disociační reakce uvedené výše v oddíle „Definice a jednotky“. V konkrétním případě popsaném v této zkušební metodě se látka chová jako kyselina nebo jako zásada a stanovení se nejpohodlněji provede určením relativních koncentrací iontové a neiontové formy látky a pH roztoku. Vztah mezi těmito pojmy popisuje rovnice pro výpočet pKa v oddíle „Definice a jednotky“ výše. Některé látky vykazují více než jednu disociační konstantu a lze odvodit obdobné rovnice. Některé z metod zde popsaných jsou vhodné také pro nekyselé/bazické disociace.

Kritéria kvality

Opakovatelnost

Stanovení disociační konstanty by se mělo provést opakovaně (minimálně tři stanovení) s tolerancí ± 0,1 log.

POPIS ZKUŠEBNÍCH POSTUPŮ

Existují dvě základní metody pro stanovení pKa. Jedna zahrnuje titraci známého množství látky se standardní kyselinou nebo případně zásadou; druhá zahrnuje stanovení relativní koncentrace ionizované a neionizované formy a její závislosti na pH.

Příprava

Metody založené na těchto zásadách lze rozdělit na titrační, spektrofotometrické a konduktometrické.

Zkušební roztoky

Při titrační metodě a konduktometrické metodě by chemická látka měla být rozpuštěna v destilované vodě. Při spektrofotometrické a jiných metodách se používají pufrované roztoky. Koncentrace zkoušené chemické látky by neměla přesahovat 0,01 M nebo polovinu saturační koncentrace, podle toho, která z hodnot je nižší, a pro přípravu roztoku by měla být použita nejčistší dostupná forma látky. Je-li látka jen mírně rozpustná, může být před přípravou výše uvedených koncentrací rozpuštěna v malém množství rozpouštědla mísitelného s vodou.

Roztoky by měly být za využití Tyndallova jevu zkontrolovány na přítomnost emulzí, zejména pokud byl použit kosolvent pro zvýšení rozpustnosti. Použijí-li se pufrované roztoky, neměla by koncentrace pufru přesáhnout 0,05 M.

Podmínky zkoušky

Teplota

Teplota by měla být regulována s přesností nejméně ± 1°C. Stanovení by se mělo provádět při 20 °C.

Existuje-li podezření na významnou závislost na teplotě, mělo by být stanovení prováděno alespoň při dvou jiných teplotách. Teplotní intervaly by v tomto případě měly být 10 °C a regulace teploty ± 0,1 °C.

Analýzy

Metoda bude určována povahou látky, která se testuje. Musí být dostatečně citlivá, aby umožňovala stanovení různých druhů chemických látek při každé koncentraci zkušebního roztoku.

Provedení zkoušky

Titrační metoda

Zkušební roztok se testuje titrací se standardním roztokem zásady nebo případně kyseliny, přičemž po každém přidání titračního roztoku se změří pH. Před dosažením bodu ekvivalence by měl být roztok přidán v rostoucích objemech alespoň desetkrát. Je-li rovnováhy dosaženo dostatečně rychle, může se použít záznamový potenciometr. Pro tuto metodu musí být přesně známo celkové množství látky a její koncentrace. Je nutné vyloučit oxid uhličitý. Podrobnosti postupu, preventivní opatření a výpočet jsou uvedeny ve standardních zkouškách, např. v položkách (1), (2), (3) a (4) seznamu literatury.

Spektrofotometrická metoda

Vlnová délka se zjistí, pokud ionizovaná a neionizovaná forma látky má znatelně rozdílné absorpční koeficienty. Absorpční spektrum UV/VIS se zjistí z roztoků o konstantní koncentraci za takové hodnoty pH, kde je látka v podstatě neionizovaná, kde je plně ionizovaná a při několika mezilehlých hodnotách pH. Toho lze dosáhnout buď přidáním podílů koncentrované kyseliny (zásady) do poměrně velkého objemu roztoku látky v mnohosložkovém pufru, nejprve při vysoké (nízké) hodnotě pH (viz položka 5 seznamu literatury), anebo přidáním stejných objemů zásobního roztoku látky např. ve vodě nebo v methanolu ke konstantním objemům různých pufrovaných roztoků, jež pokrývají žádoucí rozpětí hodnot pH. Z hodnot pH a hodnot absorbance při zvolené vlnové délce se vypočítá dostatečný počet hodnot pKa za použití alespoň 5 hodnot pH, kdy je látka ionizována z nejméně 10 % a z méně než 90 %. Další podrobnosti o zkoušce a metoda výpočtu jsou uvedeny v odborné literatuře (1).

Konduktometrická metoda

Pomocí elektrického článku o nízké, známé článkové konstantě se změří vodivost přibližně 0,1 M roztoku látky ve vodivostní vodě. Změří se rovněž vodivost několika přesně připravených zředění tohoto roztoku. Koncentrace se pokaždé sníží na polovinu a celá série by měla pokrývat koncentrace nejméně v rozsahu jednoho řádu. Mezní vodivost při nekonečném zředění se zjistí provedením obdobného pokusu se sodnou solí a extrapolací. Míru disociace pak lze vypočítat z vodivosti každého roztoku pomocí Onsagerovy rovnice, a disociační konstantu je tedy možné vypočítat pomocí Ostwaldova zřeďovacího zákona jako K = α2C/(1 – α), kde C je koncentrace v molech na litr a α je disociovaná frakce. Je nutné vyloučit CO2. Další podrobnosti o zkoušce a metoda výpočtu jsou uvedeny v normách a odborné literatuře (1), (6) a (7).

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Zpracování výsledků

Titrační metoda

Vypočítá se pKa pro 10 měřených bodů na titrační křivce. Vypočítá se střední hodnota těchto hodnot pKa a směrodatná odchylka. Měl by být přiložen graf závislosti hodnot pH na objemu standardní zásady nebo kyseliny spolu s vyjádřením v tabulce.

Spektrofotometrická metoda

Hodnoty absorbance a pH v každém spektru se uvedou v tabulce. Z mezilehlých údajů ve spektrech se vypočítá alespoň pět hodnot pKa a vypočte se rovněž střední hodnota těchto výsledků a směrodatná odchylka.

Konduktometrická metoda

Vypočítá se ekvivalentní vodivost Λ pro každou koncentraci kyseliny a pro každou koncentraci směsi jednoho ekvivalentu kyseliny plus 0,98 ekvivalentu hydroxidu sodného bez uhličitanů. Přebytek kyseliny má zabránit přebytku OH– v důsledku hydrolýzy. Hodnota 1/Λ se vynese do grafu v závislosti na √C a hodnotu Λo soli lze stanovit extrapolací na nulovou koncentraci.

Hodnotu Λo kyseliny lze vypočítat pomocí hodnot H+ a Na+ uvedených v odborné literatuře. Hodnotu pKa je možné vypočítat z α = Λi /Λo a Ka = α2C/(1 – α) pro každou koncentraci. Přesnější hodnoty Ka lze získat provedením úprav na mobilitu a aktivitu. Měla by se vypočítat střední hodnota a směrodatné odchylky z hodnot pKa.

Závěrečná zpráva

Předložit by se měly všechny naměřené údaje a vypočítané hodnoty pKa spolu s metodou výpočtu (nejlépe ve formě tabulky, jak se doporučuje v položce seznamu literatury (1)) a stejně tak i výše popsané statistické parametry. U titračních metod by měly být uvedeny podrobnosti o standardizaci titračních roztoků.

U spektrofotometrické metody by měla být předložena všechna spektra. U konduktometrické metody by měly být uvedeny podrobnosti týkající se stanovení článkové konstanty. Měly by se uvést informace o použitém postupu, analytických metodách a povaze všech použitých pufrů.

Měla by se uvést zkušební teplota (teploty).

LITERATURA

▼B

---

ČÁST B: METODY STANOVENÍ TOXICITY A JINÝCH ÚČINKŮ NA ZDRAVÍ

OBSAH
	OBECNÝ ÚVOD
B.1.a	AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITA – METODA FIXNÍ DÁVKY
B.1.b	AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITA – METODA STANOVENÍ TŘÍDY AKUTNÍ TOXICITY
B.2	AKUTNÍ INHALAČNÍ TOXICITA
B.3	AKUTNÍ TOXICITA (DERMÁLNÍ)
B.4	AKUTNÍ DRÁŽDIVÉ A LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI
B.5	AKUTNÍ DRÁŽDIVÉ/LEPTAVÉ ÚČINKY NA OČI
B.6	SENZIBILIZACE KŮŽE
B.7	STUDIE ORÁLNÍ TOXICITY U HLODAVCŮ – 28DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE
B.8	SUBAKUTNÍ INHALAČNÍ TOXICITA: 28DENNÍ STUDIE
B.9	DERMÁLNÍ TOXICITA (28DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE)
B.10	ZKOUŠKA NA CHROMOZÓMOVÉ ABERACE U SAVCŮ IN VITRO
B.11	ZKOUŠKA NA CHROMOZÓMOVÉ ABERACE V BUŇKÁCH KOSTNÍ DŘENĚ SAVCŮ
B.12	MIKRONUKLEUS TEST V SAVČÍCH ERYTROCYTECH
B.13/14	MUTAGENITA – ZKOUŠKA NA REVERZNÍ MUTACE S BAKTERIEMI
B.17	ZKOUŠKA NA GENOVÉ MUTACE V BUŇKÁCH SAVCŮ IN VITRO S POUŽITÍM GENŮ HPRT A XPRT
B.21	ZKOUŠKY NA TRANSFORMACE SAVČÍCH BUNĚK IN VITRO
B.22	DOMINANTNÍ LETÁLNÍ ZKOUŠKA NA HLODAVCÍCH
B.23	ZKOUŠKA NA CHROMOZOMOVÉ ABERACE VE SPERMATOGONIÍCH SAVCŮ
B.25	ZKOUŠKA NA DĚDIČNOU TRANSLOKACI U MYŠÍ
B.26	ZKOUŠKA SUBCHRONICKÉ ORÁLNÍ STUDIE ORÁLNÍ TOXICITY NA HLODAVCÍCH (90DENNÍ OPAKOVANÁ INHALAČNÍ EXPOZICE NA HLODAVCÍCH)
B.27	ZKOUŠKA SUBCHRONICKÉ ORÁLNÍ TOXICITY STUDIE ORÁLNÍ TOXICITY NA NEHLODAVCÍCH (90DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE)
B.28	STUDIE SUBCHRONICKÉ DERMÁLNÍ TOXICITY (90DENNÍ OPAKOVANÁ KOŽNÍ APLIKACE NA HLODAVCÍCH)
B.29	SUBCHRONICKÁ INHALAČNÍ TOXICITA: 90DENNÍ STUDIE
B.30	STUDIE CHRONICKÉ TOXICITY
B.31	STUDIE PRENATÁLNÍ VÝVOJOVÉ TOXICITY
B.32	STUDIE KARCINOGENITY
B.33	KOMBINOVANÉ STUDIE CHRONICKÉ TOXICITY A KARCINOGENITY
B.34	JEDNOGENERAČNÍ ZKOUŠKA TOXICITY PRO REPRODUKCI
B.35	DVOUGENERAČNÍ STUDIE REPRODUKČNÍ TOXICITY
B.36	TOXIKOKINETIKA
B.37	POZDNÍ NEUROTOXICITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU PO AKUTNÍ EXPOZICI
B.38	POZDNÍ NEUROTOXICITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU – 28DENNÍ OPAKOVANÁ EXPOZICE
B.39	ZKOUŠKA NA NEPLÁNOVANOU SYNTÉZU DNA (UDS) V JATERNÍCH BUŇKÁCH SAVCŮ IN VIVO
B.40	LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI IN VITRO: ZKUŠEBNÍ METODA TRANSKUTÁNNÍHO ELEKTRICKÉHO ODPORU (TER)
B.40.a	LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI IN VITRO: ZKUŠEBNÍ METODA ZA POUŽITÍ REKONSTRUOVANÉ LIDSKÉ EPIDERMIS (RhE)
B.41	ZKOUŠKA FOTOTOXICITY 3T3 NRU IN VITRO
B.42	SENZIBILIZACE KŮŽE: ZKOUŠKA S VYŠETŘENÍM LOKÁLNÍCH LYMFATICKÝCH UZLIN
B.43	ZKOUŠKA NEUROTOXICITY NA HLODAVCÍCH
B.44	ABSORPCE KŮŽÍ: METODA IN VIVO
B.45	ABSORPCE KŮŽÍ: METODA IN VITRO
B.46	DRÁŽDĚNÍ KŮŽE IN VITRO: ZKUŠEBNÍ METODA ZA POUŽITÍ REKONSTRUOVANÉ LIDSKÉ EPIDERMIS
B.47	ZKUŠEBNÍ METODA VYUŽÍVAJÍCÍ ZÁKAL A PROPUSTNOST ROHOVKY SKOTU PRO IDENTIFIKACI I) CHEMICKÝCH LÁTEK VYVOLÁVAJÍCÍCH VÁŽNÉ POŠKOZENÍ OČÍ A II) CHEMICKÝCH LÁTEK, KTERÉ NENÍ NUTNÉ KLASIFIKOVAT JAKO LÁTKY MAJÍCÍ DRÁŽDIVÉ ÚČINKY NA OČI NEBO VYVOLÁVAJÍCÍ VÁŽNÉ POŠKOZENÍ OČÍ
B.48	ZKUŠEBNÍ METODA ODDĚLENÉHO KUŘECÍHO OKA PRO ZJIŠŤOVÁNÍ I) CHEMICKÝCH LÁTEK VYVOLÁVAJÍCÍCH VÁŽNÉ POŠKOZENÍ OČÍ A II) CHEMICKÝCH LÁTEK, KTERÉ NENÍ NUTNÉ KLASIFIKOVAT JAKO LÁTKY MAJÍCÍ DRÁŽDIVÉ ÚČINKY NA OČI NEBO VYVOLÁVAJÍCÍ VÁŽNÉ POŠKOZENÍ OČÍ
B.49	MIKRONUKLEUS TEST V SAVČÍCH BUŇKÁCH IN VITRO
B.50	SENZIBILIZACE KŮŽE: ZKOUŠKA S VYŠETŘENÍM LOKÁLNÍCH LYMFATICKÝCH UZLIN: DA
B.51	SENZIBILIZACE KŮŽE: ZKOUŠKA S VYŠETŘENÍM LOKÁLNÍCH LYMFATICKÝCH UZLIN: BRDU-ELISA
B.52	AKUTNÍ INHALAČNÍ TOXICITA – METODA STANOVENÍ TŘÍDY AKUTNÍ TOXICITY
B.53	STUDIE VÝVOJOVÉ NEUROTOXICITY
B.54	UTEROTROFNÍ BIOLOGICKÁ ZKOUŠKA NA HLODAVCÍCH: KRÁTKODOBÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA ESTROGENNÍCH VLASTNOSTÍ
B.55	HERSHBERGEROVA BIOLOGICKÁ ZKOUŠKA NA POTKANECH: KRÁTKODOBÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA ANDROGENNÍCH/ANTIANDROGENNÍCH VLASTNOSTÍ
B.56	ROZŠÍŘENÁ JEDNOGENERAČNÍ STUDIE TOXICITY PRO REPRODUKCI
B.57	ZKOUŠKA STEROIDOGENEZE H295R
B.58	ZKOUŠKY GENOVÝCH MUTACÍ U SOMATICKÝCH A ZÁRODEČNÝCH BUNĚK TRANSGENNÍCH HLODAVCŮ
B.59	SENZIBILIZACE KŮŽE IN CHEMICO: ZKOUŠKA PŘÍMÉ REAKTIVITY PEPTIDŮ (DPRA)
B.60	SENZIBILIZACE KŮŽE IN VITRO: ZKUŠEBNÍ METODA S VYŠETŘENÍM LUCIFERÁZY ARE-NRF2
B.61	ZKUŠEBNÍ METODA PRŮNIKU FLUORESCEINU KE ZJIŠŤOVÁNÍ LÁTEK S LEPTAVÝMI A SILNĚ DRÁŽDIVÝMI ÚČINKY NA OČI
B.62	ALKALICKÝ KOMETOVÝ TEST IN VIVO NA SAVCÍCH
B.63	SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA NA REPRODUKČNÍ/VÝVOJOVOU TOXICITU
B.64	KOMBINOVANÁ STUDIE TOXICITY PO OPAKOVANÝCH DÁVKÁCH SE SCREENINGOVOU ZKOUŠKOU NA REPRODUKČNÍ/VÝVOJOVOU TOXICITU
B.65	ZKUŠEBNÍ METODA S VYUŽITÍM MEMBRÁNOVÉ BARIÉRY IN VITRO PRO LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI
B.66	ZKOUŠKY IN VITRO FORMOU STABILNĚ TRANSFEKOVANÉ TRANSAKTIVACE SLOUŽÍCÍ K DETEKCI AGONISTŮ A ANTAGONISTŮ ESTROGENOVÝCH RECEPTORŮ
B.67	ZKOUŠKA NA GENOVÉ MUTACE V BUŇKÁCH SAVCŮ IN VITRO S POUŽITÍM GENU THYMIDINKINÁZY
B.68	ZKUŠEBNÍ METODA VYUŽÍVAJÍCÍ KRÁTKODOBOU EXPOZICI IN VITRO PRO IDENTIFIKACI i) CHEMICKÝCH LÁTEK VYVOLÁVAJÍCÍCH VÁŽNÉ POŠKOZENÍ OČÍ A ii) CHEMICKÝCH LÁTEK, KTERÉ NENÍ NUTNÉ KLASIFIKOVAT JAKO LÁTKY MAJÍCÍ DRÁŽDIVÉ ÚČINKY NA OČI NEBO VYVOLÁVAJÍCÍ VÁŽNÉ POŠKOZENÍ OČÍ
B.69	ZKUŠEBNÍ METODA S POUŽITÍM REKONSTRUOVANÉHO EPITELU PODOBNÉHO LIDSKÉ ROHOVCE (RhCE) PRO STANOVENÍ CHEMICKÝCH LÁTEK, KTERÉ NEVYŽADUJÍ KLASIFIKACI A OZNAČENÍ JAKO LÁTKY MAJÍCÍ DRÁŽDIVÉ ÚČINKY NA OČI NEBO VYVOLÁVAJÍCÍ VÁŽNÉ POŠKOZENÍ OČÍ
B.70	ZKOUŠKA IN VITRO S VYUŽITÍM REKOMBINANTNÍCH ESTROGENOVÝCH RECEPTORŮ NA DETEKCI CHEMICKÝCH LÁTEK S VAZEBNOU AFINITOU NA ER
B.71	ANALÝZY SENZIBILIZACE KŮŽE IN VITRO ZAMĚŘENÉ NA KLÍČOVOU UDÁLOST AKTIVACE DENDRITICKÝCH BUNĚK V DRÁZE NEŽÁDOUCÍCH ÚČINKŮ (AOP) VEDOUCÍCH K SENZIBILIZACI KŮŽE

OBECNÝ ÚVOD

A.   CHARAKTERIZACE ZKOUŠENÉ LÁTKY

Složení zkoušené látky, včetně hlavních nečistot, a její relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti, včetně stálosti, by měly být známy před zahájením jakékoli studie toxicity.

Fyzikálně-chemické vlastnosti zkoušené látky poskytují důležité informace pro výběr způsobu podávání, pro návrh každé jednotlivé studie a pro manipulaci se zkoušenou látkou a její uchovávání.

Zahájení studie by měl předcházet vývoj analytické metody pro kvalitativní a kvantitativní stanovení zkoušené látky (pokud možno včetně hlavních nečistot) v dávkovacím médiu a v biologickém materiálu.

Veškeré informace týkající se identifikace, fyzikálně-chemických vlastností, čistoty a chování zkoušené látky by měly být obsaženy v protokolu o zkoušce.

B.   PÉČE O ZVÍŘATA

Při zkoušení toxicity jsou důležité přísná kontrola podmínek prostředí a správná péče o zvířata.

i)   Podmínky chovu

Podmínky chovu v prostorech nebo klecích pro pokusná zvířata by měly vyhovovat testovacím druhům. Pro potkany, myši a morčata jsou vhodnými podmínkami teplota místnosti 22 ± 3 oC a relativní vlhkost 30 až 70 %; pro králíky se doporučuje teplota 20 ± 3 oC a relativní vlhkost 30 až 70 %.

Některé experimentální techniky jsou zvláště citlivé na vliv teploty a v takových případech jsou v popisu zkušební metody uvedeny podrobnosti o vhodných podmínkách. Při všech sledováních toxických účinků by měly být zaznamenávány údaje o teplotě a vlhkosti a měly by být zahrnuty do závěrečné zprávy o studii.

Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Podrobnosti o světelném režimu by měly zaznamenány a uvedeny v konečné zprávě studie.

Není-li v metodě uvedeno jinak, měla by být zvířata chována jednotlivě nebo umístěna v klecích po malých skupinách stejného pohlaví; jsou-li zvířata v klecích po skupinách, nemělo by být chováno v jedné kleci více než pět zvířat.

Ve zprávách o experimentech na zvířatech je důležité uvést typ použité klece a počet zvířat chovaných v každé kleci jak během expozice chemické látce, tak během kterékoli další doby pozorování.

ii)   Podmínky krmení

Strava by měla splňovat veškeré požadavky výživy pro příslušný testovací druh. Pokud jsou zkoušené látky podávány v potravě, může být nutriční hodnota snížena interakcí látky s některou složkou potravy. Možnost takové reakce by měla být zohledněna při interpretaci výsledků zkoušky. Může být použita konvenční laboratorní strava s neomezeným přístupem k pitné vodě. Výběr potravy se může řídit potřebou zajistit vhodné přimíchání zkoušené látky, pokud je podávána touto metodou.

Příměsi v potravě, jejichž vliv na toxicitu je znám, nesmí být přítomny v koncentracích, ve kterých by se vliv projevil.

C.   ALTERNATIVNÍ ZKOUŠKY

Vědeckým cílem Evropské unie je vývoj a validace alternativních metod, které mohou poskytnout stejnou úroveň informací jako současné zkoušky na zvířatech, při nichž se však použije méně zvířat, způsobí méně utrpení nebo se v nich použití zvířat zcela vypouští.

Hned po svém uvedení do praxe musí být tyto metody použity, kdykoli je to možné, pro charakterizaci nebezpečnosti a následnou klasifikaci a označování látek z hlediska jejich nebezpečnosti.

D.   HODNOCENÍ A INTERPRETACE

Při hodnocení a interpretaci zkoušek musí být vzaty v úvahu určité meze, nakolik lze výsledky studií na zvířatech a in vitro extrapolovat na člověka, a proto lze pro potvrzení výsledků zkoušení použít poznatky o nepříznivých účincích na člověka, pokud jsou k dispozici.

E.   LITERATURA

Tyto metody jsou většinou vyvinuty v rámci programu OECD pro zkušební pokyny a měly by být prováděny v souladu s principy správné laboratorní praxe, aby bylo zajištěno co nejširší „vzájemné uznávání údajů“.

Další podobnější informace lze získat v pokynech OECD a v příslušné literatuře publikované jinde.

B.1.a   AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITA – METODA FIXNÍ DÁVKY

1.   METODA

Tato zkušební metoda je rovnocenná metodě OECD TG 420 (2001).

1.1   ÚVOD

Tradiční metody hodnocení akutní toxicity používají jako koncový bod uhynutí zvířat. V roce 1984 navrhla Britská toxikologická společnost nový přístup k testování akutní toxicity založený na podávání řady fixních dávek (1). Tento přístup jako koncový bod nepoužíval uhynutí zvířat, nýbrž se opíral o pozorování jasných příznaků toxicity u jedné z řady fixních dávek. Po provedení britských (2) a mezinárodních (3) validačních studií in vivo byl tento postup v roce 1992 přijat jako zkušební metoda. Následně byly pomocí matematických modelů v řadě studií (4, 5, 6) vyhodnoceny statistické vlastnosti metody fixní dávky. Studie in vivo a modelové studie společně prokázaly, že metoda je reprodukovatelná, vyžaduje méně zvířat, působí menší utrpení než tradiční metody a dokáže látky zařadit podobně jako jiné zkušební metody akutní toxicity.

Poučení týkající se výběru nejvhodnější zkušební metody k danému účelu obsahuje text Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (7). V tomto dokumentu jsou také uvedeny doplňující informace o provádění a analýze zkušební metody B.1.a.

Podstatou metody je použití pouze středně toxických dávek v hlavní studii, dávky, u nichž se očekává, že budou letální, by neměly být podávány. Také není nutné podávat dávky, o nichž je známo, že v důsledku leptavých nebo výrazně dráždivých účinků vyvolávají značnou bolest a utrpení. Umírající zvířata nebo zvířata, která zjevně projevují příznaky bolesti nebo značného a přetrvávajícího utrpení, se humánně utratí a při analýze výsledků se hodnotí jako zvířata uhynulá při zkoušce. Kritéria rozhodování o utracení umírajících nebo značně trpících zvířat a poučení týkající se rozpoznání předvídatelného nebo blížícího se uhynutí jsou předmětem samostatného dokumentu (8).

Metoda poskytuje informace o nebezpečných vlastnostech a umožňuje zařazení a klasifikaci látky podle globálně harmonizovaného systému (GHS) klasifikace chemických látek, které způsobují akutní toxicitu (9).

Zkušební laboratoř by před provedením studie měla vzít v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené látce. Součástí těchto informací je totožnost a chemická struktura látky, výsledky jiných zkoušek toxicity dané látky, in vitro nebo in vivo, toxikologické údaje o strukturně příbuzných látkách a očekávané použití látky. Tyto informace jsou nezbytné k tomu, aby byli všichni zainteresovaní přesvědčeni, že zkouška má význam pro ochranu lidského zdraví a pomůže při výběru vhodné výchozí dávky.

1.2   DEFINICE

Akutní orální toxicita: nepříznivé účinky, které se projeví po orálním podání jedné dávky nebo více dávek látky během 24 hodin.

Opožděný úhyn: znamená, že zvíře během 48 hodin neuhyne ani nejeví známky umírání, ale uhyne později během čtrnáctidenní doby pozorování.

Dávka: množství podané zkoušené látky. Dávka se vyjadřuje jako hmotnost zkoušené látky na jednotku hmotnosti pokusného zvířete (např. mg/kg).

Zjevná toxicita: obecný pojem popisující zřetelné příznaky toxicity, které se projeví po podání zkoušené látky (příklady viz (3)), kdy při podání další vyšší fixní dávky lze u většiny pokusných zvířat očekávat značné bolesti a přetrvávající známky značného utrpení, stavu agónie (kritéria uvádí dokument Humane Endpoints Guidance (8)) nebo pravděpodobné uhynutí.

GHS: Globálně harmonizovaný systém klasifikace chemických látek a směsí. Společný projekt Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj (lidské zdraví a životní prostředí), Odborného výboru OSN pro přepravu nebezpečného zboží (fyzikálně-chemické vlastnosti) a Mezinárodní organizace práce (informace o nebezpečnosti) koordinovaný Meziorganizačním programem pro řádné nakládání s chemikáliemi (IOMC).

Blížící se uhynutí: stav agónie nebo uhynutí je očekáván před další plánovanou dobou pozorování. Příznaky svědčící o tomto stavu u hlodavců mohou zahrnovat křeče, polohu na boku, polohu vleže a třes (více podrobností viz text Humane Endpoint Guidance Document (8)).

LD 50 (střední letální dávka): statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, u níž lze očekávat, že způsobí uhynutí 50 % zvířat, jimž byla podána orální cestou. Hodnota LD 50 se vyjadřuje v hmotnosti zkoušené látky na jednotku hmotnosti pokusného zvířete (mg/kg).

Limitní dávka: označuje nejvyšší přípustnou dávku (2 000 nebo 5 000 mg/kg).

Stav agónie: označuje stav úhynu nebo neschopnost přežít, ani když je zvíře léčeno (více podrobností viz text Humane Endpoint Guidance Document (8)).

Předvídatelný úhyn: přítomnost klinických příznaků svědčících o smrti, přičemž doba úhynu je známá a předchází plánovanému ukončení zkoušky v budoucnosti, např. neschopnost dojít k vodě nebo potravě (více podrobností viz text Humane Endpoint Guidance Document (8)).

1.3   PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Skupinám zvířat stejného pohlaví se postupně podá fixní dávka 5, 50, 300 a 2 000 mg/kg (výjimečně lze uvažovat o další fixní dávce 5 000 mg/kg, viz část 1.6.2). Výchozí úroveň dávky se zvolí na základě orientační studie jako dávka, u níž se očekává, že vyvolá některé příznaky toxicity, aniž způsobí závažné toxické účinky nebo úhyn. Klinické příznaky a stavy spojené s bolestí, utrpením a blížícím se úhynem jsou podrobně popsány v samostatném dokumentu OECD (8). Dalším skupinám zvířat mohou být podány vyšší nebo nižší fixní dávky podle přítomnosti nebo nepřítomnosti příznaků toxicity nebo uhynutí. Podle tohoto postupu se pokračuje, dokud nebude zjištěna dávka vyvolávající zřejmou toxicitu nebo není pozorováno více než jedno uhynutí, anebo pokud nejsou ani při nejvyšší dávce zjištěny žádné účinky nebo pokud dochází k úhynům při nejnižší dávce.

1.4   POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

1.4.1   Výběr druhu zvířat

Upřednostňovaným druhem hlodavce je potkan, avšak lze použít i jiné druhy hlodavců. Obvykle se používají samice (7). Je to proto, že přehled literatury o konvenčních zkouškách LD50 ukazuje, že mezi pohlavími je obvykle malý rozdíl, pokud jde o citlivost, ale v případech, v nichž jsou rozdíly pozorovány, jsou samice obecně nepatrně citlivější (10). Pokud však poznatky o toxikologických nebo toxikokinetických vlastnostech strukturně příbuzných chemických látek naznačují, že citlivější jsou pravděpodobně samci, použije se toto pohlaví. Jestliže se zkouška provádí na samcích, je nutné podat náležité odůvodnění.

Použijí se mladá zdravá dospělá zvířata běžně užívaných laboratorních kmenů. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Každé zvíře musí být na začátku podávání látky 8 až 12 měsíců staré a jeho hmotnost by se měla pohybovat v intervalu ± 20 % střední hmotnosti zvířat, kterým byla podána předchozí dávka.

1.4.2   Podmínky chovu a krmení

Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být 22 oC (± 3 oC). Relativní vlhkost vzduchu by měla být minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 %, kromě doby úklidu místnosti, cílem by měla být hodnota 50–60 %. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní stravu s neomezenou dodávkou pitné vody. Zvířata mohou být chována v klecích ve skupinách podle dávky, ale počet zvířat v kleci nesmí bránit nerušenému pozorování každého zvířete.

1.4.3   Příprava zvířat

Zvířata se náhodně vyberou, pro usnadnění individuální identifikace se označí, a chovají se v klecích minimálně pět dnů před začátkem podávání látky, aby se mohla přizpůsobit laboratorním podmínkám.

1.4.4   Příprava dávek

Zkoušená látka by obecně měla být při všech úrovních zkoušených dávek podávána v konstantním objemu pomocí úpravy koncentrace dávkovaného přípravku. V případech, kdy má být zkoušen kapalný koncový produkt nebo směs, může však být použití nezředěné zkoušené látky, tj. s konstantní koncentrací, pro hodnocení následného rizika této látky užitečnější a je vyžadováno některými kontrolními orgány. Ani v jednom případě nesmí být překročen maximální objem dávky. Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázově podat, závisí na velikosti pokusného zvířete. U hlodavců by objem obvykle neměl přesáhnout 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, avšak u vodních roztoků připadá v úvahu i dávka 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. S ohledem na složení dávkovaného přípravku se ve všech případech, kde je to možné, doporučuje použití vodného roztoku/suspenze/emulze, potom v pořadí podle preference použití roztoku/suspenze/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec případně roztoku v jiných vehikulech. U vehikul jiných než voda musí být známy toxikologické charakteristiky. Dávky musí být připraveny krátce před podáním, pokud není stálost přípravku během doby, kdy bude používán, známa a neukáže se jako přijatelná.

1.5   POSTUP

1.5.1   Podávání dávek

Zkoušená látka se podává sondou v jedné dávce pomocí žaludeční sondy nebo vhodné intubační kanyly. Pokud výjimečně není možné podat dávku najednou, lze ji podat po menších množstvích během nejvýše 24 hodin.

Před podáním zkoušené látky nemají zvířata dostávat potravu (např. potkanům by se neměla podávat přes noc, myším 3–4 hodiny), voda se však ponechává. Po uplynutí doby hladovění se zvířata zváží a podá se jim zkoušená látka. Po podání látky se zamezí přístupu k potravě na dalších 3–4 hodin u potkanů nebo 1–2 hodiny u myší. Podává-li se látka po částech v průběhu určité doby, může být podle délky období nezbytné poskytnout zvířatům potravu a vodu.

1.5.2   Orientační studie

Cílem orientační studie je umožnit výběr vhodné výchozí dávky pro hlavní studii. Zkoušená látka se podává jednotlivým zvířatům postupně podle vývojového diagramu v příloze 1. Orientační studie je ukončena, jakmile lze stanovit výchozí dávku pro hlavní studii (nebo pokud je při nejnižší fixní dávce pozorován úhyn).

Výchozí dávka orientační studie se zvolí z fixních dávek ve výši 5, 50, 300 a 2 000 mg/kg jako dávka, u níž se očekává, že vyvolá zřejmou toxicitu, přičemž toto očekávání je pokud možno založeno na důkazech z údajů získaných in vivo a in vitro ze stejné chemické látky a strukturně příbuzných látek. Pokud takové informace neexistují, výchozí dávka činí 300 mg/kg.

Mezi podáním dávky každému zvířeti se ponechá doba minimálně 24 hodin. Všechna zvířata se pozorují minimálně 14 dnů.

Ve výjimečných případech a pouze je-li to odůvodněno specifickými konkrétními předpisy, lze zvážit použití další nejvyšší úrovně dávky 5 000 mg/kg (viz dodatek 3). S ohledem na dobré zacházení se zvířaty se pokusy na zvířatech v rámci kategorie 5 GHS (2 000 –5 000 mg/kg) nedoporučují a měly by se zvažovat pouze tehdy, pokud existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takového pokusu mají přímý význam pro ochranu lidského zdraví, zdraví zvířat nebo životního prostředí.

V případech, kdy zvíře, u něhož je látka zkoušena v nejnižší fixní úrovni dávky (5 mg/kg), v orientační studii uhyne, obvykle se studie ukončí a látka přiřadí do kategorie 1 GHS (jak je uvedeno v příloze 1). Pokud je však vyžadováno další potvrzení klasifikace, může být proveden tento volitelný doplňkový postup: druhému zvířeti se podá dávka 5 mg/kg. Pokud toto druhé zvíře uhyne, bude kategorie 1 GHS potvrzena a studie okamžitě ukončena. Pokud druhé zvíře přežije, dávka 5 mg/kg se podá maximálně třem dalším zvířatům. Jelikož riziko úhynu bude vysoké, měla by být látka zvířatům podávána postupně, aby bylo zajištěno dobré zacházení se zvířaty. Časový interval mezi dávkami podanými jednotlivým zvířatům by měl být dostatečný na to, aby bylo možné stanovit, zda zvíře, jemuž byla látka podána dříve, pravděpodobně přežije. Pokud dojde k úhynu druhého zvířete, posloupnost podávání se okamžitě ukončí a látka nebude podána žádnému dalšímu zvířeti. Vzhledem k tomu, že výskyt druhého úhynu (bez ohledu na počet zvířat, na nichž byla látka v době ukončení zkoušena) spadá do výsledku A (2 anebo více úhynů), postupuje se podle pravidla klasifikace v příloze 2 s fixní dávkou 5 mg/kg (kategorie 1, pokud se vyskytnou dva a více úhynů nebo kategorie 2, pokud se nevyskytne více než 1 úhyn). Navíc je v příloze 4 uvedeno poučení týkající se klasifikace v rámci systému EU, dokud nebude zaveden nový globálně harmonizovaný systém (GHS).

1.5.3   Hlavní studie

1.5.3.1   Počet zvířat a úrovně dávek

Kroky, podle kterých se má postupovat po provedení zkoušek s výchozí úrovní dávky, jsou uvedeny ve vývojovém diagramu v příloze 2. Bude nutné zvolit jeden ze tří postupů: buď zkoušení ukončit a stanovit odpovídající klasifikační třídu nebezpečnosti, nebo provést zkoušky s vyšší fixní dávkou, nebo zkoušky s nižší fixní dávkou. S ohledem na ochranu zvířat se v hlavní studii znovu nepoužije úroveň dávky, která v orientační studii vedla k uhynutí (viz dodatek 2). Zkušenosti ukázaly, že nejpravděpodobnějším výsledkem u výchozí úrovně dávky bude, že látku lze klasifikovat bez nutnosti dalších zkoušek.

Obvykle se pro každou zkoumanou úroveň dávky použije celkem pět zvířat stejného pohlaví. Mezi těmito pěti zvířaty bude jedno zvíře z orientační studie, jemuž byla podána zvolená úroveň dávky, a další čtyři zvířata (kromě výjimečných případů, kdy úroveň dávky použité v hlavní studii nebyla součástí orientační studie).

Časový interval mezi podáváním jednotlivé výše dávky závisí na době nástupu, trvání a závažnosti příznaků toxicity. Expozice zvířat další dávce bude odložena, dokud nebude jisté, že zvířata, jimž byla podána předchozí dávka, přežila. Mezi jednotlivými dávkami se v případě potřeby doporučuje ponechat dobu 3 nebo 4 dnů, aby bylo umožněno pozorování zpožděné toxicity. Časový interval lze podle potřeby upravit, např. v případě neprůkazné reakce.

Při zvažování použití nejvyšší fixní dávky 5 000 mg/kg se postupuje podle metody popsané v příloze 3 (viz také 1.6.2).

1.5.3.2   Limitní zkouška

Limitní zkouška se používá především tehdy, má-li osoba provádějící zkoušku informace svědčící o tom, že zkoušený materiál je pravděpodobně netoxický, tj. je toxický pouze nad rámec regulačních limitních dávek. Informace o toxicitě zkoušeného materiálu lze získat ze znalostí o podobných zkoušených sloučeninách, směsích nebo produktech s ohledem na totožnost a procento složek, o nichž se ví, že jsou toxikologicky významné. V situacích, kdy existuje jen málo informací nebo vůbec žádné informace o toxicitě nebo kdy se očekává, že zkoušený materiál bude toxický, bude provedena hlavní zkouška.

Podle obvyklého postupu slouží jako limitní zkouška pro tyto pokyny výchozí dávka orientační studie 2 000 mg/kg (nebo výjimečně 5 000 mg/kg), po níž následuje podání této výše dávky dalším čtyřem zvířatům.

1.6   POZOROVÁNÍ

Po podání dávky se zvířata pozorují individuálně minimálně jednou během prvních 30 minut, pravidelně během prvních 24 hodin, přičemž zvláštní pozornost se věnuje prvním 4 hodinám, a poté denně po dobu 14 dnů kromě případů, kdy je nutné zvířata ze studie vyjmout a humánně utratit z důvodu dodržování pravidla dobrého zacházení se zvířaty, nebo je zjištěn jejich úhyn. Doba pozorování by však neměla být stanovena pevně. Bude stanovena podle toxických reakcí, doby jejich nástupu a délky fáze zotavení, a může tedy být podle potřeby prodloužena. Doba, kdy se příznaky toxicity objeví a vymizí, je důležitá zejména v případě tendence ke zpožděným příznakům toxicity (11). Veškerá pozorování se systematicky zaznamenávají, přičemž záznamy se vedou jednotlivě, pro každé zvíře.

Další pozorování budou nutná, jestliže zvířata dále vykazují příznaky toxicity. Pozorování zahrnují změny na kůži, na srsti, na očích, na sliznicích, a rovněž změny dýchání, krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Pozornost je třeba věnovat třesu, křečím, slinění, průjmu, letargii, spánku a kómatu. Vezmou se v úvahu principy a kritéria shrnuté v textu Humane Endpoints Guidance Document (8). Zvířata ve stavu agónie a zvířata se známkami prudkých bolestí nebo s přetrvávajícími příznaky značného utrpení se humánně utratí. Pokud jsou zvířata z humánních důvodů utracena nebo je zjištěn jejich úhyn, je nutné dobu uhynutí zaznamenat co nejpřesněji.

1.6.1   Tělesná hmotnost

Hmotnost jednotlivých zvířat se stanoví krátce před podáním zkoušené látky a nejméně jednou týdně poté. Vypočítají se změny hmotnosti a zaznamenají se. Na konci zkoušky se zvířata, která přežila, zváží a poté humánně utratí.

1.6.2   Patologie

Všechna pokusná zvířata (včetně těch, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena z důvodu dodržování pravidla dobrého zacházení se zvířaty) se pitvají. U každého zvířete se zaznamenají všechny makroskopické patologické nálezy. Lze také zvážit mikroskopické vyšetření orgánů, u nichž jsou patrné makroskopické patologie, u zvířat, která přežila 24 nebo více hodin po prvním podání dávky, protože mohou poskytnout užitečné informace.

2.   ÚDAJE

Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zvíře. Navíc by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, přičemž se u každé zkušební skupiny uvede počet použitých zvířat, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet zvířat uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů, doba uhynutí jednotlivých zvířat, popis, časový průběh a vratnost toxických účinků a pitevní nálezy.

3.   ZPRÁVY

3.1   PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

4.   LITERATURA

DODATEK 1

VÝVOJOVÝ DIAGRAM PRO ORIENTAČNÍ STUDII

Text obrazu